DK164070B - Fremgangsmaade til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympraeparat - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympraeparat Download PDFInfo
- Publication number
- DK164070B DK164070B DK166685A DK166685A DK164070B DK 164070 B DK164070 B DK 164070B DK 166685 A DK166685 A DK 166685A DK 166685 A DK166685 A DK 166685A DK 164070 B DK164070 B DK 164070B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- xylanase
- enzyme
- cellulase
- cellulose
- approx
- Prior art date
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims description 61
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims description 32
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 95
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 95
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 95
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 27
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 22
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241001215623 Talaromyces cellulolyticus Species 0.000 claims description 14
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 claims description 11
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 43
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 42
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 16
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 16
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 15
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 15
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 15
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 15
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 15
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 11
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N tolnaftate Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1OC(=S)N(C)C1=CC=CC(C)=C1 FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004880 tolnaftate Drugs 0.000 description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 6
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 6
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 6
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 5
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 5
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 4
- -1 mercury ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 4
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 2
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 244000130556 Pennisetum purpureum Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002000 Xyloglucan Polymers 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- OCIBBXPLUVYKCH-FYTDUCIRSA-N beta-D-cellohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-FYTDUCIRSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 108010085318 carboxymethylcellulase Proteins 0.000 description 2
- OCIBBXPLUVYKCH-UHFFFAOYSA-N cellopentanose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(OC5C(OC(O)C(O)C5O)CO)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O OCIBBXPLUVYKCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTNIPWXXIGNQQF-XHCCAYEESA-N cellopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@@H](O[C@@H]4[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FTNIPWXXIGNQQF-XHCCAYEESA-N 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N cellotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-ZWSAEMDYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 2
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003124 powdered cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000019814 powdered cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 241000533293 Sesbania emerus Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-ZLBHSGTGSA-N alpha-maltotetraose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-ZLBHSGTGSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000355 copper sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000182 glucono-delta-lactone Substances 0.000 description 1
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
- A23F5/00—Coffee; Coffee substitutes; Preparations thereof
- A23F5/16—Removing unwanted substances
- A23F5/163—Removing unwanted substances using enzymes or microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
- C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
i
DK 164070 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympræparat ved dyrkning af en mikroorganisme i et medium indeholdende carbonkilder og nitrogenkilder og opsamling af 5 cellulase/xylanase fra den opnåede kulturvæske.
I de senere år har udnyttelsen af reproduktiv plantebiomasse som en lovende erstatning for olie for alvor fået betydning. Plantebiomassen indeholder cellulosematerialer, overvejende bestående af cellulose og 10 hemicellulose som de væsentligste polysaccharider. Glukose og pentose, som dannes ved nedbrydning af sådanne cellulosematerialer, er nyttige som næringsmidler og foder, og som vigtige organiske kemikalier. Anstrengelser for at søge efter effektive fremgangsmåder til for-15 sukring af cellulosematerialer fortsættes. Især tiltrækker fremgangsmåden til forsukring ved anvendelse af hydrolytlske enzymer sig stærk interesse.
Effektiv hydrolyse af cellulosematerialer kræver anvendelse af talrige enzymer med forskellig substrat-20 specificitet, fordi cellulosematerialerne er sammensat af forskellige komponenter. Blandt alle disse enzymer er cellulase det vigtigste. Den hydrolytiske evne cel-lulasen udviser på cellulosematerialet øges, når cellu-lasen anvendes sammen med en hemicellulase, såsom xyla-25 nase.
Cellulase er det generiske udtryk for en gruppe enzymer, som katalyserer et enzymatisk reaktionssystem til hydrolyse af cellulose til glukose, cellobiose og cellooligomere. Enzymer i denne gruppe inddeles ved de-30 res virkningsmåde i Cj-enzymer (der specifikt kaldes Avicelase, cellobiohydrolase, FP-ase og exo-3-glucana-se), Cx-enzymer (der specifikt kaldes CMC-ase og endo-β-glucanase), β-glucosidase (der også kaldes cellobia-se), osv. Cellulasen hydrolyserer til sidst cellulose 35 til glukose, som er sukkerkomponenten i cellulose, idet en række af sådanne enzymer udviser et velbalanceret samspil.
DK 164070 B
2
Xylanase er en type hemicellulase. Det virker selektivt på xylan, som er en af hemicelluloserne, der udgør plantecellevægge, og hydrolyserer xylan til dets monosaccharid-komponenter, såsom xylose og xylooligome-5 re, som er polymere af xylose.
Trichoderma reesei, Trichoderma viride og mikroorganismerne af Aspergillus-slægten, Penicillin-slægten osv. har været undersøgt i stort omfang for deres evne til at danne cellulolytiske enzymer, men de er ikke til-10 strækkeligt produktive af sådanne enzymer. De cellulolytiske enzymer, de danner, har ikke tilstrækkelig hy-drolytisk evne og termisk stabilitet, og de er derfor ude af stand til fuldstændigt at hydrolysere cellulosematerialer. Hydrolysaterne, der er opnået med disse 15 cellulolytiske enzymer, indeholder cellobiose og andre oligomere i store mængder.
Opfinderne har afprøvet en lang række mikroorganismer, der forekommer vidt udbredt i naturen, til eftersøgning for et cellulolytisk enzym med stor evne til 20 at hydrolysere krystallinsk cellulose og forsukre cellulosen til glukose. Man har tidligere fundet, at de cellulolytiske enzymer, der dannes af en skimmelsvamp isoleret fra jordbunden og identificeret som værende Acremonium cellulolyticus (FERM BP-495), omfatter en 25 cellulase, som udviser en stærk hydrolytisk evne overfor krystallinsk cellulose og en bemærkelsesværdi stærk β-glucosidase-aktivitet, og som derfor har en overordentlig stor evne til at forsukre cellulose i det væsentlige fuldstændigt til glukose. Disse cellulolytiske 30 enzymer omfatter endvidere en xylanase, som udmærker sig ved sin termostabilitet og har stor evne til at forsukre xylan.
Hovedsigtet med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde af den indledningsvis anførte art til 35 fremstilling af et cellulolytisk enzympræparat, som indeholder en cellulase, der er i stand til at hydrolysere
DK 164070 B
3 cellulose i det væsentlige fuldstændigt til glukose, og en termostabil xylanase, og som indeholder cellulase- og termostabil xylanaseaktivitet i større mængder end ved dyrkning af den ovennævnte kendte stamme.
5 Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindel sen, der er ejendommelig ved, at mikroorganismen er Acremonium cellulolyticus TN FERM BP-685. Denne ny stamme er Tolnaftat-resistent.
Når man fremkalder erhvervet resistens mod Tol-10 naphthat (m,N-dimethyl-thiocarbanilinsyre-0-2-naphthyl-ester) hos den kendte stamme af Acremonium cellulolyticus, forbedres dens evne til at danne cellulolytiske enzymer, og dermed gøres den i stand til at danne cellulase og xylanase i væsentligt forøgede mængder. Ved dyrk-15 ning af den ovennævnte stamme i et kulturmedium indeholdende xylan, kan udbyttet af termostabil xylanase øges selektivt.
Når cellulolytiske enzymer, der indeholder både xylanase og cellulase, anvendes til hydrolyse af et cel-20 lulosemateriale, såsom risstrå, bagasse eller fourage, som indeholder cellulose og hemicelluloser, der hovedsagelig er opbygget af xylan, nedbrydes og fjernes hemi-celluloserne ved hjælp af xylanasen, og som følge deraf sker hydrolysen af cellulosen med øget effektivitet. På 25 denne måde kan råmaterialet, indeholdende hemicelluloser, hydrolyseres fuldstændigt.
Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af tegningen, hvorpå fig. la er en kurve, der viser de optimale pH-da-30 ta, opnået for den termostabile xylanase, der indgår i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede cellulase/ xylanase-enzympræparat, fig. Ib er en kurve, der viser de optimale tempe-35 raturdata for xylanasen, der indgår i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen
DK 164070 B
4 fremstillede cellulase/xylanase-enzym-præparat, fig. 2a er en kurve, der viser pH-stabiliteten for xylanasen, der indgår i det ved 5 fremgangsmåden ifølge opfindelsen frem stillede cellulase/xylanase-enzympræpa-rat, og fig. 2b er en kurve, der viser termostabiliteten af xylanasen, der indgår i det ved frem-10 gangsmåden ifølge opfindelsen fremstille de cellulase/xylanase-enzympræparat.
Først vil fremgangsmåden til forstærkning af resistensen mod Tolnaftat for den vilde stamme af Acremo-nium cellulolyticus (FERM BP-495) blive beskrevet.
15 Acremonium cellulolyticus (FERM BP-495) suspende res i et Czapek-medium (indeholdende 0,3% NaN03, 0,1% K2HP04, 5 X 10_2% MgS04-7H20, 5 x 10"2% KCl, 1 x 10“2%
FeS04 · 7H20 og 1% glukose). Efter tilsætning af nitro-soguanidin (N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin) i en 20 koncentration på indtil 3 x 10~2% inkuberes suspensionen ved stuetemperatur i 0,5 til 3 timer. Den herved opåede kulturvæske centrifugeres til udvinding af cellerne. Cellerne vaskes omhyggeligt med et Czapek-medium, og suspenderes dernæst i det samme medium. En del 25 af suspensionen spredes på et Czapek-agarmedium (indeholdende 0,3% NaN03, 0,1% K2HP04, 5 x 10"2% MgS04 · 7H20, 5 x 10~2% KCl, 1 x 10"3% FeS04 · 7H20, 1% glukose, 1,5% agar, 2,5 x 10_2% Streptomycin og 2,5 x 10_2% penicillin G med pH 5,6), der desuden indeholder 4 x 10“2 30 til 2 x 10 -5% Tolnaftat, og inkuberes ved 30°C. Den Tolnaftat-resistente mutant, som vokser, overføres til et skråglasmedium med samme sammensætning og bevares derpå. I en således opnået Tolnaftat-resistent mutant findes ofte en stamme med øget cellulosedannende evne.
35 Suspensioner af cellerne af den vilde type og den resistente mutant spredes på Czapek-agar-mediet indeholdende
DK 164070 B
5 4 x 10-2 til 1 x 10“2% Tolnaftat og inkuberes ved 30°C.
Under inkubationen udviser den resistente mutant forholdsvis tilfredsstillende vækst, og den vilde type udvisér overhovedet ingen vækst.
5 Den foreliggende stamme adskiller sig fra Acremo- nium cellulolyticus, den oprindelige stamme, ved, at den har resistens mod Tolnaftat og har høj glycanase-aktivi-tet. Den anerkendes således som værende en ny mutant af Acremonium cellulolyticus. Idet denne mutant samtidig 10 danner xylanase og cellulase på lignende måde som dens moderstamme, er den blevet navngivet Acremonium cellulolyticus TN.
Denne stamme blev deponeret ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Tech- 15 nology, Ministry of International Trade & Industry, den 13. oktober 1984 under betegnelsen FERM P-7894, og den blev desuden deponeret ved samme institut i overensstemmelse med Budapesttraktaten den samme dag under betegnelsen FERM BP-685.
20 Data til sammenligning af mængderne af celluloly- tiske enzymer, dannet af moderstammen og TN-stammen af Acremonium cellulolyticus, er vist ved ved hjælp af et eksempel i Tabel l.
25
Tabel 1
Anvendt Dannet enzymmænqde (enheder/ml medium) mikro- 30 organisme Avicelase CMC-ase β-Glucosidase Xylanase
Moderstamme 5,7 69,1 30,9 5,2 TN-stamme 15,0_167_59,4_12,3 35 Det ses af tabellen, at mængderne af cellulolyti ske enzymer, dannet af den Tolnaftat-resistente mutant,
DK 164070 B
6 er ca. tre gange (Avicelase og CMC-ase)og ca. to gange (β-glukosidase og xylanase) så store, som mængderne dannet af moderstammen. De således dannede enzymer udviser væsentlig øget hydrolytisk evne. Ingen tilfælde, hvor 5 en resistent mutant af en mikroorganisme har været dannet med resistens for Tolnaftat som en markør til forøgelse af udbyttet af cellulase og andre enzymer, dannet af mikroorganismen, er fundet i litteraturen forud for denne opfindelse.
10 De mycologiske egenskaber af TN-stammen vises ne denfor. De mycologiske egenskaber af moderstammen vises ikke, idet de overvejende er de samme som for Acremonium cellulolyticus TN.
Vækst: På maltekstraktagar, væksten forløber 15 hurtigt til opnåelse af en diameter på 70 mm i løbet af syv dage ved 30°C. Kolonierne er først hvide og antager senere en let gullig farve. Lufthyfer rejser sig langsomt og antager en dunet fremtoning 20 og danner af og til en lang samling hy fer. I det sidste vækststadium antager bagsiden af kolonierne en rosenrød-brun til rødlig-brun farve.
I det væsentlige samme vækst sker på 25 Czapek-agar, dog med mindre rejsning af lufthyfer. pH-området for vækst er 3,5 til 6,0, idet den optimale pH-værdi er nær 4. Temperaturområdet for vækst er 15 til 43°C, idet den optimale væksttempera-30 tur er nær 30°C.
Morfologi: Hyferne måler 0,5 til 2,5 ym i diameter, er farveløse og indeholder skillevægge.
De har en glat overflade.
Konidier: Den konidiedannende evne er overordent- 35 lig ustabil. I en subkultur på Czapek- agar og på maltekstrakt-agarmedium for-
DK 164070 B
7 svinder konidier hurtigt. Det er observeret, at konidioforer, som er farveløse, under isolering stikker frem fra luft-hyfernes sidevægge. Konidier er halvkugle-5 formede (2,5 5 x 2 4,5 ym), har glat overflade og er uden farve. De er kædet meget løst sammen og har tilbøjelighed til at spredes.
Til fremstilling af cellulase/xylanase-enzympræ-10 paratet ved hjælp af stammen af slægten Acremonium er det nødvendigt, at denne stamme dyrkes aerobt ved temperaturer fra ca. 20 til 40°C i et tidsrum fra ca. 2 til 15 dage i et flydende eller fast medium, der generelt som carbonkilde indeholder cellulose eller et cellulose-15 materiale, såsom Avicel, xyloglucan, bomuld, bagasse eller hvedeklid, og som nitrogenkilde et organisk eller uorganisk nitrogenholdigt stof, såsom nitrat, ammoniumsalt, urinstof, pepton eller gærekstrakt og en lille mængde af et metalsalt.
20 Tilsætning af betain i et forhold fra 0,01 til 1% i det ovennævnte medium frembringer en forøgelse på 10 -50% af mængden af dannede cellulaser, især carboxyme-thylcellulase, β-glucosidase og xylanase.
Tilsætning af lecithin i et forhold fra 0,1 til 25 1% øger på samme måde som tilsætningen af betain mængden af dannede cellulaser, især carboxymethylcellulase og β-glucosidase, med 20 til 30%. Lecithinet skal, for at kunne anvendes effektivt til dette formål, være et produkt stammende fra planter eller dyr, eller det skal væ-30 re et syntetisk produkt. Lecithin stammende fra sojabønner kan fås billigt.
Idet cellulasen og xylanasen er ekstracellulære enzymer, kan de til sidst ved dyrkning i flydende kultur opsamles i form af supernatanten, opnået ved filtrering 35 af kulturvæsken, eller ved dyrkning som fast kultur opsamles i form af en enzymopløsning, opnået ved ekstrak-
DK 164070 B
8 tion af den faste kultur med vand eller en vilkårlig passende uorganisk saltopløsning. Det således opsamlede enzym oparbejdes til sidst til pulverform ved lyofilise-ring.
5 Med hensyn til xylanasen alene kan den, idet den er termos tabil, behandles ved pH 4,9 og ved 65° C i to timer til fjernelse af den samtidig tilstedeværende cel-lulase ved konvertibel udfældning, uden der sker forringelse af xylanasens aktivitet. Som en følge heraf kan 10 en enzymopløsning, som kun har xylanaseaktivitet, let fremstilles.
Nedenfor beskrives de enzymatiske egenskaber af Avicelase, CMC-ase og β-glucosidase, som indgår i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede cel-15 lulase/xylanase-enzympræparat.
A Enzymatiske egenskaber af Avicalase: 1) Aktivitet.
Enzymerne virker direkte på uopløseligt, krystallinsk cellulose, såsom cellulosepulver, Avicel og 20 hygroskopisk vat og danner reducerende sukkerar ter, såsom glukose og cellobiose.
2) pH-værdier, ved hvilke enzymet er aktivt, og optimal pH.
Dette ezym har vist sig at være aktivt i et pH-25 område fra 2 til 8, og dets optimale pH falder nær 4,5.
3) pH-stabilitet.
de pH-værdier, ved hvilke enzymet udviser stabilitet, når man lader det henstå i citrat-phos-30 phatpuffer ved 45°C i 20 timer, har vist sig at ligge i området fra ca. 3,5 til ca. 5.5.
4) Temperaturområde, i hvilket enzymet er aktivt, og har optimal temperatur.
Enzymet har intakt aktivitet ved forhøjede tempe-35 raturer indtil 90°C. Dette enzym har vist sig at have en optimal temperatur for aktiviteten nær
DK 164070 B
9 65°C, når man lader det reagere med 1% Avicel i tilstedeværelse af 0,05 M acetatpuffer (pH 4,5) i 10 minutter.
5) Termisk stabilitet.
5 Når enzymet opvarmes i 0,05 M acetat-puffer (pH
4,5) i 10 minutter, sker der i det væsentlige ingen inaktivering ved temperaturer indtil 60°C.
Det inaktiveres henholdsvis ca. 50% og ca. 80% efter 10 minutters opvarmning til 65°C og 70°C.
10 6) Inhibitorer.
Enzymet inhiberes stærkt af kviksølvioner og kobberioner blandt andre forskellige metalioner. Det inhiberes også til ca. 80% af p-chlor-mercuri-benzoat, en SH-inhibitor, ved en koncentration på 15 1 mM.
7) Rensningsmetode.
Enzymet kan renses ved afsaltning og koncentrering af kulturfiltratet ved hjælp af hule fibre, (Amicon HI-P5), separering af det koncentrerede 20 filtrat ved kolonnekromatografi (NaCl 0 -» 1M gra dient) ved brug af DEAE-Sepharose (CL-6B), og behandling af det separerede filtrat igen ved samme kolonnekromatografisystem (NaCl 0 -» 0,6 M gradient) .
25 8) Molekylvægt.
Enzymets molekylvægt er ca. 60.000, når den bestemmes ved gelfiltreringsmetoden ved brug af en biogel-kolonne (A 0,5 m).
9) Fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten.
30 Aktiviteten af dette enzym bestemmes ved at hælde 0,5 ml af en suspension (pH 4,5), indeholdende Avicel i en koncentration på 0,5% i 0,1 M acetatpuffer sammen med en passende mængde af enzymopløsningen, fortynde den opnåede blanding med de-35 stilleret vand til et totalvolumen på 1,0 ml, op varme den blandede opløsning til 50 °C til frem-
DK 164070 B
10 kaldelse af reaktion af enzymet på Avicel, og måle mængden af reducerende sukker ved Somogyi-Nelson-metoden.
Den mængde af enzymet, som giver reducerende evne 5 ækvivalent med reduktion af 1 pmol glukose pr.
minut, defineres som 1 enhed.
B. Enzymatiske egenskaber af CMC-ase: 1) Multiple former af CMC-ase.
Ved hjælp af pladegel-elektroforese inddeles CMC-10 asen i mindst fire komponenter, som kan skelnes indbyrdes ved hjælp af molekylvægt og isoelek-trisk punkt. CMS-asen I har en molekylvægt på ca. 160.000 og et isoelektrisk punkt på 5,08, II har en molekylvægt på 160.000 og et isoelektrisk 15 punkt på 4,95, III har en molekylvægt på ca.
120.000 og et isoelektrisk punkt på 4,60, og IV en molekylvægt på ca. 120.000 og et isoelektrisk punkt på 4,48. CMC-asen består således af et kompleks af sådanne enzymer.
20 2) Enzymet består af komponenter (CMC-ase I og II), som virker på opløselige cellulosederivater, såsom carboxymethylcellulose (CMC) og hydrolyserer dem til glukose og cellobiose, og komponenter (CMC-ase III og IV), som kun i meget lille mængde 25 danner glukose, og som hydrolyserer cellulose til cellooligo-saccharider med et minimalt indhold af cellobiose.
3) pH-værdier, ved hvilke enzymet er aktivt, og optimal pH-værdi.
30 CMC-ase-komplekset har vist sig at være aktivt i bredt pH-område fra 2 til 8 og have optimal pH ved ca. 4,5.
4) pH-stabilitet.
De pH-værdier, ved hvilke CMC-ase-komplekset, ud-35 viser stabilitet, når man lader det henstå i ci- tratphosphatpuffer ved 45°C i 20 timer, har vist
DK 164070 B
11 sig at falde i området fra ca. 3,5 til ca. 6.
5) Temperaturområde, i hvilket enzymet er aktivt, og optimal temperatur.
CMC-ase-komplekset har intakt aktivitet ved for-5 højede temperaturer indtil 90°C. Det erkendes, at komplekset, har optimal temperatur for aktiviteten omkring 60°C, når man lader det reagerer med 1% CMC i tilstedeværelse af 0,05 M acetatpuffer (pH 4,5) i ti minutter.
10 6) Termisk stabilitet.
Når enzymet opvarmes i 0,05 M acetatpuffer, (pH
4,5) i ti minutter, sker der i det væsentlige ingen inaktivering ved temperaturer indtil ca.
60°C. Enzymet inaktiveres med henholdsvis ca.
15 40% og ca. 70% efter 10 minutters opvarmning til 65 og 70°C.
7) Inhibitorer.
Enzymet inhiberes stærkt af kviksølvioner og kobberioner, begge i koncentrationer på mindst 1 mM 20 blandt forskellige andre metalliske ioner.
8) Rensningsmetode.
Enzymet kan renses og isoleres i isozym-komponen-terne ved afsaltning og koncentrering af kulturfiltratet ved hjælp af hulfibre (Amicon HI-P5), 25 dernæst separering af det koncentrerede filtrat ved kolonnekromatografi (NaCl O -» 1,0 M gradient) ved brug af DEAE-Sepharose (CL-6B), og behandling af det separerede filtrat ved samme kolonne-kromatografiske metode.
30 g) Fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten.
Aktiviteten af dette enzym bestemmes ved at hælde 0,5 ml af en opløsning (pH 4,5) indeholdende 1% CMC i 0,1 M acetatpuffer sammen med en passende mængde enzymopløsning, fortynde den opnåede blan-35 ding med destilleret vand til et totalvolumen på
1,0 ml, opvarme den fortyndede opløsning til 50°C
DK 164070 B
12 til fremkaldelse af reaktion af enzymet på CMC og måle mængden af dannet reducerende sukker ved Somogyi-Nelson-metoden.
Den mængde af enzymet, som giver reducerende evne 5 ækvivalent med reduktion af 1 ymol glukose pr.
minut, defineres som en enhed.
C. Enzymatiske egenskaber af β-glucosidase: 1) Aktivitet.
β-Glucosidasen virker på cellooligosaccharider, 10 .såsom salicin, cellobiose, cellotriose, cellote- traose, cellopentaose og cellohexaose og hydrolyserer dem til glukose. Det virker også på høj-molekulære celluloser, såsom Avicel, men har praktisk taget ingen virkning på CMC og HEC (hy-15 droxyethylcellulose). Dette enzyms Km-værdier i forbindelse med salicin, cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose og cellohexaose er henholdsvis 3,40, 2,26, 1,19, 0,82, 0,52 og 0,51 mM.
20 2) pH-værdier, ved hvilke enzymet er aktivt og opti mal pH-værdi.
Enzymet har vist sig at være aktivt i et pH-områ-de fra 2 til 6, og dets optimale pH-værdi er nær 4,5.
25 3) pH-stabilitet.
De pH-værdier, ved hvilke enzymet udviser stabilitet, når man lader det henstå i citratpuffer ved 45°C i 20 timer, har vist sig at falde i området fra ca. 3,5 til ca. 5.
30 4) Temperaturområde i hvilket enzymet er aktivt og optimal temperatur.
Enzymet udviser intakt aktivitet ved forhøjede temperaturer indtil 90°C. Man har erfaret, at enzymet har sin optimale temperatur for aktivite-35 ten omkring 70°C, når man lader det reagere med 1% salicin i tilstedeværelse af 0,05 M acetatpuf- 13 fer (pH 4,5) i ti minutter.
5) Termisk stabilitet.
Når dette enzym opvarmes i 0,05 M acetatpuffer (pH 4,5) i ti minutter, sker der i det væsentlige 5 ingen inaktivering ved temperaturer indtil ca.
60°C. Det inaktiveres med ca. 40% og ca. 90% eller mere efter ti minutters opvarmning til henholdsvis 70°C og 80°C.
6) Inhibitorer.
10 Enzymet inhiberes stærkt af kviksølv- og kobber ioner. Endvidere virker glucono-δ-lakton som en antagonistisk inhibitor på substratet.
7) rensningsmetode.
Enzymet kan renses til en renhedsgrad svarende 15 til elektroforetisk homogenitet ved afsaltning og koncentrering af kulturfiltratet ved hjælp af hulfibre (Amicon HI-P5), separation af det koncentrerede filtrat ved kolonnekromatografi (NaCl 0 -» lM-gradient) ved brug af DEAE-Sepharose 20 (CL-6B) og udsættelse af den aktive fraktion for kromat-fokusering (pH 6 -► 4) og gelfiltrering ved hjælp af Bio-gel (A 0,5 m).
8) Molekylvægt.
Dette enzyms molekylvægt er ca. 240.000, når den 25 bestemmes ved gelfiltreringsmetoden ved brug af en Bio-gel-kolonne (A 0,5 m).
9) Metode til bestemmelse af aktiviteten.
Dette enzyms aktivitet bestemmes ved at hælde 0,5 ml af en opløsning (pH 4,5), indeholdende sali-30 cin, i en koncentration på 1% i 0,1 M acetatpuf fer sammen med en passende mængde af enzymopløsningen, fortynde den opnåede blanding med destilleret vand til et totalvolumen på 1,0 ml, opvarme reaktionsblandingen til 50°C til fremkaldelse af 35 reaktion af enzymet på salicin, og måle den dan nede mængde reducerende sukker ved Somogyi-Nelson metoden.
DK 164070 B
14
Den mængde af dette enzym, som giver reducerende evne ækvivalent med reduktion af 1 ymol glukose pr. minut, defineres som en enhed.
Nedenfor beskrives de enzymatiske egenskaber af xylana-5 sen, som indgår i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede cellulase/xylanase-enzympræparat.
1) Multiple former af xylanase
Ved hjælp af pladegelelektroforese kan xylanasen adskilles i mindst tre komponenter, som kan 10 skelnes fra hinanden ved hjælp af molekylvægt og isoelektrisk punkt. Xylanasen A har en molekylvægt på ca. 51.000 og et isoelektrisk punkt på ca. 5,05, xylanasen B en molekylvægt på ca. 46.000 og et isoelektrisk punkt på 4,57 og 15 xalanasen C en molekylvægt på ca. 36.000 og et isoelektrisk punkt på 3,55. Xylanasen består således af et kompleks af sådanne komponenter.
2) Virkning.
Xylanasekomplekset virker på opløselig og uoplø-20 selig xylan indeholdt i plantebiomasse og danner xylose og xylooligosaccharider. Når xylanasekomplekset virker på arabinoxylan indeholdende ara-binose, dannes arabinose og oligosaccharider, omfattende arabinose og xylose foruden xylose og 25 xylooligosaccharider. Dette kompleks virker også effektivt på xylobiose og hydrolyserer det til xylose. Slutprodukterne omfatter følgelig hovedsagelig xylose.
3) pH-værdier ved hvilke enzymet er aktivt og opti- 30 mal pH-værdi.
Xylanasekomplekset har vist sig at være aktivt i et pH-område fra 3 til 6 som vist i fig. la), og det optimale pH-værdi har vist sig at være ca. 5.
4) pH-stabilitet.
35 De pH-værdier, ved hvilke xylanasekomplekset, når man lader det henstå i citrat-phosphatpuffer ved
DK 164070 B
15 25°C i 24 timer, udviser stabilitet, har vist sig at falde i området fra ca. 2,5 til ca. 8,5, som vist i fig. 2a).
5) Temperaturområde, i hvilket enzymet er aktivt, og 5 optimal temperatur.
Xylanasekomplekset udviser intakt aktivitet ved forhøjede temperaturer, indtil ca. 90°C. Man har erfaret, at komplekset, når man lader det virke på 0,25% xylan i tilstedeværelse af 0,05 M ace-10 tatpuffer (pH 4,9) i ti minutter, har en optimal temperatur på ca. 80°C som vist i fig. lb).
6) Termisk stabilitet.
Når komplekset opvarmes i 0,1 M acetatpuffer (pH 4,9) i ti minutter, sker der i det væsentlige in-15 gen inaktivering ved temperaturer indtil ca. 70°C
som vist i fig. 2b). Det inaktiveres henholdsvis ca. 60% og ca. 90% efter ti minutters opvarmning til 80°C og 85°C.
7) Inhibitorer.
20 Komplekset inhiberes stærkt af kviksølv- og sølv ioner, begge i koncentrationer på mindst 1 mM blandt forskellige andre metalioner.
8) Oprensningsmetode.
Xylanasekomplekset kan renses til en rensnings-25 grad svarende til elektroforetisk homogenitet og isoleres i tre komponenter ved opvarmning af kul-.· turfiltratet til 65°C i to timer til omdannelse af det urene protein, der findes i kulturfiltra-tet, til et bundfald, fjernelse af bundfaldet fra 30 kulturfiltratet ved centrifugering og analysering af det opnåede kulturfiltrat ved anvendelse af kolonnekromatografi ved brug af DEAE-Sepharose og kromatfokusering.
9) Fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten.
35 Aktiviteten af dette xylanasekompleks bestemmes ved tilsætning af 0,5 ml af en substratopløsning
DK 164070 B
16 (pH 4,5) indeholdende 0,5% xylan (indeholdende ca. 9% arabinose) fremstillet ud fra risstrå med 0,1 M acetatpuffer til en passende mængde kompleks, fortynding af den opnåede blanding med de-5 stilleret vand til et totalvolumen på 1,0 ml, in kuber ing af reaktionsblandingen ved 60°C i ti minutter og måling af den dannede mængde reducerende sukker ved Somogyi-Nelson-metoden.
Den mængde xylanasekompleks, som giver reduceren-10 de evne ækvivalent med reduktion af 1 pmol xylose pr. minut, defineres som en enhed.
Reaktionen til hydrolyse af cellulosemateriale ved anvendelse af et cellulase/xylanase-enzympræparat tilvejebragt ifølge opfindelsen, udføres sædvanligvis 15 ved pH 3-7, fortrinsvis ved pH 4-5, og ved en temperatur i området fra 30 til 65°C. Eksempler på substrater, der er egnede til dette formål, omfatter ikke kun rene cellulosematerialer, såsom pulveriseret cellulose, bomuld og Avicel, men også celluloseholdige stoffer, såsom 20 bagasse, Napier-græs, risstrå, hvedestrå og risskaller.
Inden forsukringen underkastes sådanne cellulosematerialer af vegetabilsk oprindelse en forbehandling, såsom en alkalibehandling, knusning eller bestråling. Det ønskes, at koncentratkoncentrationen er så høj som mulig.
25 Sædvanligvis anvendes substratet i en mængde på 5 til 30%.
Den mængde cellulase/xylanase-enzympræparat, det er nødvendigt at sætte til cellulosematerialet, er i størrelsesordenen 20 enheder/g, beregnet som Avicelase.
30 Det således tilsatte cellulase/xylanase-enzympræparat er virksomt nok til at hydrolysere mere end 80% af cellulosen i det væsentlige fuldstændigt til glukose.
Xylanasen, som findes i cellulase/xylanase-en-zympræparatet dannet af TN-stammen, har sin optimale 35 temperatur for aktiviteten i et højtemperaturområde, og den har stor evne til at forsukre xylan. Når præparatet
DK 164070 B
17 anvendes på et cellulosemateriale, virker xylanasen derfor på det xylan, der er til stede i materialet, og for-sukrer det til xylose. Præparatet kan anvendes i dyrefoder til forbedring af foderets fordøjelighed. Når det 5 anvendes i kaffebønner, har det til formål at fremme ekstraktionen af kaffeessens. Præparatet er endvidere effektivt i den henseende, at da xylanasekomponenten deri hydrolyserer hemicellulosematerialet, der indeslut-ter cellulosen, får cellulasekomponenten lettere adgang 10 til cellulosen, hvorved hydrolysen af cellulosen frem mes.
Nedenfor beskrives opfindelsen mere detailleret ved henvisning til eksempler.
15
Eksempel 1 20 ml af et kulturmedium (pH 4,0) indeholdende 4% cellulose, 1% Bactopepton, 0,6% kaliumnitrat, 0,2% urinstof, 0,16% kaliumchlorid, 0,12% magnesiumsulfat, 1,2% 20 kaliumhydrogenphosphat, 1 x 10“3% zinksulfat, 1 x 10“3% mangansulfat og i x 10“3% kobbersulfat blev placeret i en Erlenmeyer-kolbe med et indre volumen på 200 ml og steriliseret ved en sædvanlig fremgangsmåde. Det steriliserede kulturmedium inokuleredes med en stamme af 25 Acremonium cellulolyticus TN (FERM BP-685) og inkuberedes aerobt ved 30°C i ti dage. Efter afslutning af dyrkningen blev kulturvæsken centrifugeret til udfældning af celler. Den derved opnåede supernatant blev testet for Avicelaseaktivitet, CMC-aseaktivitet, β-gluco-30 sidaseaktivitet og xylanaseaktivitet.
Til sammenligning blev moderstammen, dvs. Acremonium cellulolyticus (FERM BP-495) dyrket på et medium med samme sammensætning og under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. Enzymerne dannet som følge af 35 dyrkningen blev testet for aktivitet. Resultaterne er vist i Tabel 2.
Tabel 2
DK 164070 B
18
Anvendt mikro- Dannet mængde enzym (enheder/ml medium) organisme _ 5 _Avicelase CMC-ase β-qlucosidase xylanase
Moderstamme 7,7 65,1 23,7 8,2 TN-stamme 14,8 158,3 46,4 19,1
Det ses af tabellen, at mængden af enzymer dannet 10 ved hjælp af den Tolnaftat-resistente mutant (TN-stamme) er ca. tre gange så stor med hensyn til CMC-ase og ca. to gange så stor med hensyn til Avicelase, β-glucosidase og xylanase, som mængden dannet af moderstammen.
15
Eksempel 2
Et medium opnået ved tilsætning af betain i en mængde på 0,03% til et medium ifølge eksempel 1, og et medium opnået ved tilsætning af lecithin stammende fra 20 sojabønner i en mængde på 0,5% til mediet ifølge Eksempel 1 blev fremstillet. På disse medier blev Acremonium cellulolyticus TN (FERM BP-685) dyrket aerobt ved 30°C i 12 dage. De opnåede kulturvæsker blev centrifugeret.
De dannede enzymer i supernatanterne blev testet for 25 Avicelase-, CMC-ase-, β-glucosidase- og xylanaseaktivi-tet. Resultaterne er vist i Tabel 3.
Tabel 3 19
Avicelase CMC-ase β-gluco- xylanase __sidase_ 5 enheder/ml enheder/ml enheder/ml enheder/ml
Kontrol 12,7 167 59,4 20,1
Betain tilsat 16,2 251 88,1 27,6
Lecithin " 14,8 305 94,3 22,5 10 Det ses af tabellen, at tilsætningen af betain eller lecithin muliggør, at avicelase, CMC-ase, β-gluco-sidase og xylanase kan fremstilles i mængder, der er større end mængderne, opnået uden denne tilsætning, og at denne effekt er særlig bemærkelsesværdig ved dannelse 15 af CMC-ase og β-glucosidase.
Eksempel 3
Et cellulosemateriale (fremstillet af Sanyo-20 Kokusaku Pulp Co. Ltd., Japan og markedsført under handelsnavnet "KC Flok, W-100") blev testet for forsukring.
Enzymer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev tilsat i varierender mængder, 15, 30 og 60 enheder som Avicelase, hver til 3g's portioner af KC 25 Flok. Således fremstillede prøver blev fortyndet ved tilsætning af vand til et total volumen på 15 ml, og man lod det reagere ved 50°C, idet pH-værdien blev holdt på 5. I reaktionens 95. time blev portioner af de forsuk-rede opløsninger skilt fra og analyseret for reducerende 30 sukkerindhold ved Somogyi-Nelson-metoden og for total-sukkerindholdet ved Anthrone-metoden. Resultaterne er vist i Tabel 4.
Tabel 4
DK 164070 B
20
Anvendt mængde Reducerende Totalsukker Forsuk- enzym (enheder/g) sukker (mg/ml) ringsfor- 5 _(mg/ml)_hold (%) 5 142 191 74,3 10 162 199 81,4 20 178 199 89,4 10 Forsukringsforhold: (Reducerende sukker)/total x 100.
Eksempel 4
Som cellulosemateriale anvendte man et produkt 15 fra James River Co., Berlin, markedsført under varemærket "Solka Flok, BW-200".
Enzymer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev tilsat i en mængde på 40 enheder/g substrat til Solka Flok, anvendt i forskellige mængder på 20 henholdsvis 0,5g og lg. De således fremstillede prøver blev fortyndet til et totalvolumen på 10 ml og underkastet forsukring ved 50°C i 48 timer, idet pH-værdien var 4,5. De forsukrede opløsninger blev analyseret for reducerende sukker og glukoseindhold. Resultaterne er vist 25 i Tabel 5.
DK 164070 B
21
Tabel 5
Koncentra- Reduce- Forsuk- Glukose Glukose- tion af rende suk- ringsfor- (mg/ml) indhold 5 Solka Flok ker (mg/ml) hold (%)_(%) 5 41,6 86,4 37,5 90,6 10 80,0 82,6 67,5 84,3
Glukoseindhold: (Glukose)/(reducerende sukker) x 100 10
Eksempel 5
En basekvældende cellulose (fremstillet ved at holde pulveriseret cellulose neddykket i en 17,5% vandig 15 NaOH-opløsning ved 25°C i fire timer og vaskning af den gennemvædede cellulose med vand) blev suspenderet som et cellulosemateriale i en reaktionsopløsning i slutkoncen-trationer på 9,0, 18,0 og 27,0%. Enzymer, fremstil let ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1, blev tilsat 20 suspensionerne i et fast forhold på fem enheder/g substrat, beregnet som Avicelase. De således fremstillede prøver blev fortyndet til et totalvolumen på 5 ml og underkastet forsukring ved 50°C i 72 timer, idet pH-værdi-en var 4,5. De opnåede forsukrede opløsninger blev ana-25 lyseret for reducerende sukker og totalsukkerindhold. Resultaterne er vist i Tabel 6.
Tabel 6
DK 164070 B
22
Koncentration af Reducerende Total Forsukrings- basekvældende sukker sukker forhold (%) 5 cellulose (%)_(mq/ml)_(mq/ml)_ 9,0 86 87 98,9 18.0 170 173 98,3 27.0 241 260 92,7 10
Eksempel 6
Napier-græs, der var aflignificeret med pereddikesyre, blev suspenderet som et cellulosemateriale i en 15 reaktionsopløsning i slutkoncentrationer på 2, 5 og 7%.
Enzymer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev tilsat i et fast forhold på 20 enheder/g substrat, beregnet som Avicelase. De således fremstillede prøver blev fortyndet til et totalvolumen på 5 ml og un-20 derkastet forsukring ved 50°C i 24 timer, idet pH-værdi-en var 4,5. De opnåede forsukrede opløsninger blev analyseret for reducerende sukker og totalsukkerindhold. Resultaterne er vist i Tabel 7.
25
Tabel 7
Koncentration Reduce- Total Forsuk- Neutral sukker af aflignifi- rende sukker rings- _(_%]_ 30 ceret græs (%) sukker mg/ml forhold Arabi- Xylo- Glu-_mg/ml_(%) nose se kose 2 17 22 78 5,6 24,2 69,0 5 39 54 72 6,1 22,2 68,3 35 7 45 75 60 5,1 12,5 80,4 23
Eksempel 7 I en Erlenmeyer-kolbe med et indre volumen på 200 ml steriliseredes 20 ml af et medium indeholdende 4% cellulose, 1% pepton, 0,6% kaliumsulfat, 0,16% kalium-5 chlorid, 0,16% natriumchlorid, 0,12% magnesiumsulfat, 1,20% kaliumphosphat og 0,001% af hver af zinksulfat, mangansulfat og kobbersulfat (pH 4,0) ved en sædvanlig fremgangsmåde. Mediet blev inokuleret med Acremonium cellulolyticus TN (FERM BP-685), og man lod henstå ved 10 30°C i seks dage til fremkaldelse af aerob vækst. Den opnåede kulturvæske blev centrifugeret til fraskillelse af cellerne. Supernatanten blev testet for xylanase-ak-tivitet. Aktiviteten viste sig at være 15,2 enheder/ml af kulturvæsken. Kulturvæsken viste sig at indeholde 15 167 enheder cellulase som CMC-ase.
Eksempel 8
Samme fremgangsmåde som i eksempel 7 blev fulgt, 20 bortset fra at 2% xyloglucan (produkt fra Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd., Japan, markedsført under varemærket "Glyloid 35") anvendtes i stedet for cellulose, og at den aerobe dyrkning blev fortsat i otte dage. Den opnåede kulturvæske blev centrifugeret. Supernatanten 25 blev analyseret for xylanaseaktivitet. Denne aktivitet viste sig at være 26,4 enheder/ml af kulturvæsken. Kulturvæsken viste sig at indeholde 120 enheder cellulase som CMC-ase.
Supernatanten blev indstillet til pH 4,9 og op-30 varmet til 65°C i to timer. Det bundfald, som opstod under behandlingen, blev fjernet ved centrifugering. Herved opnåedes et enzym som et standardmateriale, udvindingsforholdet af xylanase blev beregnet til 92,4%.
Claims (1)
- DK 164070 B Eksempel 9 Standardenzymet opnået i eksempel 8 blev tilsat i en slutkoncentration på 20 enheder/ml til en vandig 10% xylanaseopløsning, der blev underkastet forsukring ved 5 65° C i 48 timer. En del af den opnåede for sukrede opløsning blev analyseret for reducerende sukkerindhold. Det reducerende sukkerindhold viste sig at være 60 mg/ml som xylose. Denne værdi svarer til 88,2% af den værdi (68 mg/ml), der blev opnået ved hydrolyse af xylan med 10 den samme koncentration med svovlsyre. Når hydrolysatet blev analyseret ved papirfordelingskromatografi, viste det sig fortrinsvis at bestå af xylose ledsaget af en meget lille mængde xylobiose. 15 Fremgangsmåde til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympræparat ved dyrkning af en mikroorganisme i et medium indeholdende carbonkilder og 20 nitrogenkilder og opsamling af cellulase/xylanase fra den opnåede kulturvæske, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Acremonium cellulolyticus TN FERM BP-685.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58185 | 1985-01-07 | ||
| JP58185A JPS61162177A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | セルラ−ゼの生産法 |
| JP60003490A JPS61162181A (ja) | 1985-01-11 | 1985-01-11 | 耐熱性キシラナ−ゼの製造法 |
| JP349085 | 1985-01-11 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK166685D0 DK166685D0 (da) | 1985-04-12 |
| DK166685A DK166685A (da) | 1986-07-08 |
| DK164070B true DK164070B (da) | 1992-05-04 |
| DK164070C DK164070C (da) | 1992-10-12 |
Family
ID=26333596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK166685A DK164070C (da) | 1985-01-07 | 1985-04-12 | Fremgangsmaade til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympraeparat |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4742005A (da) |
| EP (1) | EP0188050B1 (da) |
| DE (1) | DE3583603D1 (da) |
| DK (1) | DK164070C (da) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4742005A (en) * | 1985-01-07 | 1988-05-03 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministry Of International Trade & Industry | Method for production of cellulolytic enzymes and method for saccharification of cellulosic materials therewith |
| US4954447A (en) * | 1988-07-22 | 1990-09-04 | The Regents Of The University Of California | Feraxanase, a highly specific enzyme for hydrolysis of complex polysaccharides |
| US5432075A (en) * | 1989-09-26 | 1995-07-11 | Midwest Research Institute | Low molecular weight thermostable β-D-glucosidase from acidothermus cellulolyticus |
| JP2948471B2 (ja) * | 1994-03-31 | 1999-09-13 | 明治製菓株式会社 | セルラーゼを添加した家畜の飼料 |
| US5437992A (en) * | 1994-04-28 | 1995-08-01 | Genencor International, Inc. | Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp |
| US6099844A (en) * | 1994-08-22 | 2000-08-08 | Triarco Industries, Inc. | Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition |
| US5789227A (en) * | 1995-09-14 | 1998-08-04 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Processing of cellulosic material by a cellulase-containing cell-free fermentate produced from cellulase-producing bacteria, ATCC 55702 |
| DE19628263A1 (de) * | 1996-07-12 | 1998-01-15 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Herstellung von Celluloselösungen in wasserhaltigem Aminoxid |
| WO1998039423A1 (en) * | 1997-03-04 | 1998-09-11 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Mesophilic xylanases |
| EP0983347A4 (en) * | 1997-05-28 | 2002-08-21 | Primary Applic Pty Ltd | IMPROVEMENT OF INDUSTRIAL ENZYMES |
| EP0976838A1 (en) * | 1998-05-06 | 2000-02-02 | Rhone-Poulenc Nutrition Animale | Enzymes mixture |
| US20040005674A1 (en) * | 2002-04-30 | 2004-01-08 | Athenix Corporation | Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose |
| US20090170153A1 (en) * | 2004-07-09 | 2009-07-02 | Ra Energy | Effect of radiation on cellulase enzymes |
| CA2666100A1 (en) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Earnest Stuart | Device and method for treating biomass |
| JP4986038B2 (ja) * | 2007-05-07 | 2012-07-25 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 高加水分解活性セルラーゼおよびヘミセルラーゼの製造方法 |
| US8431551B2 (en) | 2010-01-12 | 2013-04-30 | Albert Duoibes | Nutritional composition made using isolated organic matter |
| CN107920546A (zh) * | 2015-09-04 | 2018-04-17 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 制备咖啡提取物的方法 |
| CN111690633B (zh) * | 2020-07-14 | 2021-03-23 | 云南师范大学 | 一种内切木聚糖酶突变体s45c08及制备方法和应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5832575B2 (ja) * | 1976-02-12 | 1983-07-14 | 協和醗酵工業株式会社 | 畜乳の乳量、乳質の改善用飼料および改善方法 |
| DE2643800C2 (de) * | 1976-09-29 | 1986-10-30 | Fritz Werner Industrie-Ausrüstungen GmbH, 6222 Geisenheim | Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen |
| US4562150A (en) * | 1983-03-09 | 1985-12-31 | Agency Of Industrial Science And Technolgy | Method for manufacture of cellulase |
| US4742005A (en) * | 1985-01-07 | 1988-05-03 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministry Of International Trade & Industry | Method for production of cellulolytic enzymes and method for saccharification of cellulosic materials therewith |
-
1985
- 1985-04-05 US US06/720,416 patent/US4742005A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-10 DE DE8585302505T patent/DE3583603D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-10 EP EP85302505A patent/EP0188050B1/en not_active Expired
- 1985-04-12 DK DK166685A patent/DK164070C/da not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-02-05 US US07/011,043 patent/US4956291A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0188050A3 (en) | 1987-10-21 |
| DE3583603D1 (de) | 1991-08-29 |
| DK166685D0 (da) | 1985-04-12 |
| EP0188050A2 (en) | 1986-07-23 |
| EP0188050B1 (en) | 1991-07-24 |
| DK164070C (da) | 1992-10-12 |
| US4742005A (en) | 1988-05-03 |
| US4956291A (en) | 1990-09-11 |
| DK166685A (da) | 1986-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yamanobe et al. | Isolation of a cellulolytic enzyme producing microorganism, culture conditions and some properties of the enzymes | |
| Rajoka et al. | γ-ray induced mutagenesis of Cellulomonas biazotea for improved production of cellulases | |
| DK164070B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et sammensat cellulase/xylanase-enzympraeparat | |
| US20140329292A1 (en) | Novel fungal enzymes | |
| Odeniyi et al. | Production characteristics and properties of cellulase/polygalacturonase by a Bacillus coagulans strain from a fermenting palm-fruit industrial residue | |
| US7727755B2 (en) | Enzyme and methodology for the treatment of a biomass | |
| KR101410719B1 (ko) | 곰팡이 페니실리움 옥살리쿰 ｋｌ1 균주 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소 생산 방법 | |
| KR20110119961A (ko) | 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법 | |
| JPH047191B2 (da) | ||
| Yoshioka et al. | Production and characterization of thermostable xylanase from Talaromyces byssochlamydoides YH-50 | |
| Dahot et al. | Microbial production of cellulases by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source | |
| US4562150A (en) | Method for manufacture of cellulase | |
| US4106989A (en) | Thermostable cellulase and a method for producing the same | |
| Macris et al. | Enhanced cellobiohydrolase production from Aspergillus ustus and Trichoderma harzianum | |
| US6946277B2 (en) | Method for enhancing cellobiase activity of termitomyces clypeatus using a glycosylation inhibitor | |
| JPH0787970A (ja) | キシラナーゼの製造方法 | |
| US6569646B2 (en) | Process for the production of an enzyme preparation containing xylanase and carboxymethyl cellulase from termitomyces clypeatus having accession no 11CB-411 | |
| Fadel et al. | Studies on activation of amylolytic enzymes production by gamma irradiated Aspergillus niger using some surfactants and natural oils under solid state fermentation | |
| Archana et al. | Screening of cellulolytic bacteria for producing cellulase under solid state fermentation using water hyacinth as a substrate | |
| Shanmugam et al. | Biosynthesis of cellulolytic enzymes by Tricothecium roseum with citric acid mediated induction | |
| KR20110051984A (ko) | 셀룰라아제를 생산하는 스키조필럼 코뮨 및 당화에의 이용 | |
| JPS6362194B2 (da) | ||
| JPS61162179A (ja) | セルラ−ゼの生産改良方法 | |
| JPS6363197B2 (da) | ||
| JPS6117476B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| PBP | Patent lapsed |