KR101410719B1 - 곰팡이 페니실리움 옥살리쿰 kl1 균주 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소 생산 방법 - Google Patents

곰팡이 페니실리움 옥살리쿰 kl1 균주 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페니실리움 옥살리쿰 (Penicillium oxalicum) KL1 (기탁번호 KACC93151P) 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 썩은 나무 부스러기를 포함하는 토양으로부터 분리한 페니실리움 옥살리쿰 KL1 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 목질섬유소분해효소의 경제적인 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 목질섬유소를 당화하여 포도당과 자일로스 등의 단당류를 제조하기 위해 기존 공지의 강력한 효소 생산 미생물보다 여러가지 목질섬유소분해 효소활성이 더 증진된 목질섬유소분해효소를 생산하는 곰팡이 균주인 페니실리움 옥살리쿰 KL1이 제공되며, 이를 사용하여 저가의 천연 섬유질 원료로부터 경제적인 목질섬유소분해효소를 생산하는 방법이 제공되며, 목질섬유소로부터 포도당과 자일로스 등의 단당류를 생산하는 방법이 제공된다. 이 발명에 의해 목질섬유소 기질로부터 산업적으로 유용한 포도당과 자일로스 등의 단당류를 생산하는 데 필요한 효소비용을 크게 절감할 수 있다.

Description

곰팡이 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소 생산 방법{Fungal strain Penicillium oxalicum KL1 and production method of lignocellulose-degrading enzymes using the strain}
본 발명은 미생물 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) KL1 및 이를 이용한 목질섬유소분해효소의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 썩은 나무 부스러기를 포함하는 토양으로부터 분리한 페니실리움 옥살리쿰 KL1 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 목질섬유소분해효소의 제조방법에 관한 것이다.
섬유소분해효소(cellulase)는 전분가공, 가축사료 생산, 곡류 알코올 발효, 맥아 및 맥주제조, 과일과 채소 쥬스 추출, 제지업, 섬유산업, 폐기물처리, 세탁 또는 주방용 세제 등의 다양한 산업에서 널리 사용되고 있다. 특히 근래에 와서는 식물성 목질계 바이오매스를 발효당으로 전환하는 데 있어 이 섬유소분해효소의 중요성이 더욱 증대되고 있는데, 여기에서 생성되는 발효당들은 미생물의 발효에 의해 청정 에너지인 에탄올과 수소와 같은 청정에너지로 전환된다. 목질섬유소(lignocellulose)는 고등식물의 세포벽의 주성분으로 목질부의 대부분을 차지하는 다당류이자, 자연계에서 석탄에 이어 다량으로 존재하는 유기화합물이며, 세계에서 가장 풍부한 신재생 탄소원이다. 목질섬유소분해효소는 섬유소분해효소 뿐 만아니라, 자일라네이즈, 펙티네이즈 등 목질섬유소를 분해하는 여러가지 효소의 혼합물을 일컫는다.
나무나 풀 등의 목질계 원료는 섬유소, 헤미셀룰로스(hemicellulose), 리그닌(lignin)의 주요 다당류들로 구성되어 있는데, 섬유소는 포도당이 β-1,4 결합으로 이루어진 불용성의 섬유성 다당류이고, 헤미셀룰로스는 주성분인 자일란(xylan)과 그외에 아리비난(arabinan), 만난(mannan) 등을 포함한 비셀룰로스성 다당류이며, 리그닌은 complex polyphenolic 구조를 가진 복합다당류이다. 이 다당류들은 단단하고 강도가 큰 특징이 있어 분해가 매우 어렵고 단당류로 분리해 내는데 여러 차례의 공정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 당화 공정은 기존 사용기술로 황산을 이용하거나 근래에 희석산을 이용하는 산 당화가 있으나 이들은 높은 온도에서 실시함에 따라 furfural과 같은 발효 저해제가 형성된다. 목질섬유소를 보다 효율적으로 이용하기 위해서는 섬유소분해효소(cellulase)를 이용한 생물학적 가수분해 방법을 사용해 분해하며 화학적 방법에 비해 많은 화학 약품을 사용하지 않으며 화학 약품 회수나 중화 과정을 필요로 하지 않기 때문에 에너지 절감이나 환경적 측면에서 많은 장점을 지니고 있다. 하지만 반응속도도 늦고 분해율이 낮으며 섬유소의 효소 당화에 있어서 효소 생산비가 차지하는 비중이 60%나 되는 문제점을 지니고 있다. 특히 목질계 원료로부터 바이오에탄올을 경제적으로 생산하기 위해서는 섬유소분해효소를 생산하는 미생물을 개량하는 것은 절대적인 중요성을 가지고 있다. 바이오에탄올 이외의 다른 섬유소 이용 산업분야에서도 기존보다 더 강력한 섬유소분해효소를 생산하는 미생물을 탐색하고 분리하는 것은 항상 요구되고 있는 일이다.
섬유소분해효소는 섬유소의 β-1,4 결합을 가수분해하는 일련의 복합적 효소들이다. 섬유소를 포도당으로 분해하기 위해서는 최소 3개 부류의 효소들이 필요한데, 여기에는 (1) 섬유소를 포도당과 셀로-올리고싸카라이드(cello-oligosaccharide)로 무작위적으로 절단하는 엔도글루카네이즈(endoglucanase)(EC 3.2.1.4), (2) 섬유소 분자의 말단에서부터 차례로 절단하여 이탄당인 쎌로바이오스(cellobiose)를 생산하는 엑소글루카네이즈(exoglucanase)(EC 3.2.1.91) 및 (3) 쎌로바이오스와 쎌로-올리고싸카라이드를 가수분해하여 포도당을 생산하는 베타글로코시데이즈(β-glucosidase)(EC 3.2.1.21) 등이 있다. 또한 헤미셀루로스에서 가장 많은 자일란을 자일로스로 분해하는 효소로서 자일라네이즈(xylanase)가 있다. 단당류 자일로스도 역시 에탄올이나 다른 화학물질 생산 원료로 쓰인다.
또한 순수한 섬유소와 달리 식물세포벽은 다양한 구조와 화학결합을 가진 다당류의 다양한 기질이 얽혀져 있기 때문에 식물성 바이오매스를 분해하는 것은 순수한 섬유소를 분해하는 것보다 매우 훨씬 더 복잡하다. 식물성바이오매스를 분해하기 위해서는 엔도글루카네이즈와 엑소글루카네이즈 외에 베타글루카네이즈, 자일라네이즈, 그리고 펙티네이즈와 같은 다양한 식물세포벽분해 효소들이 필요하다[문헌4]. 베타글루카네이즈는 다른 섬유소분해효소들의 작용을 억제하는 쎌로바이오스를 제거하는 역할을 하며, 자일라네이즈와 펙티네이즈 같은 효소들은 섬유소의 섬유질을 싸고 있는 비섬유소성 다당류를 제거함으로써 섬유소를 노출시켜 섬유소분해를 촉진시켜준다 [문헌4]. 이와 같이 자연계에 있는 섬유소는 비섬유성 다당류를 포함하고 있기 때문에 단순히 섬유소분해효소라고 하기보다는 목질섬유소분해효소(Lignocellulose-degrading enzymes)라고 명칭하는 것이 더 적합하다.
목질섬유소분해효소는 일반적으로 미생물로부터 얻어지고 있으며 지난 40여 년 동안 효과적인 목질섬유소분해효소를 생산하는 균주개발을 위해 많은 노력이 이루어져 왔다. 목질섬유소분해효소를 생산하는 미생물들은 여러 종류가 있으며 여기에는 사상균 (filamentous fungi)이 많이 알려져 있고 특히 트리코더마(Trichoderma) 속과 아스페르질루스(Aspergillus) 속의 곰팡이, 클로스트리디움(Clostridium) 속의 세균 및 썰모모노스포라(Thermomonospora)속의 방선균 등 많은 종류의 미생물들에서 목질섬유소분해효소가 생성된다. 이들 목질섬유소분해효소 생산균주들 중에서 트리코더마 레제이(Trichoderma reesei) 곰팡이는 가장 잘 알려진 목질섬유소분해효소 생산 균주이다. 트리코더마 레제이는 제 2차 세계대전 때 남태평양에서 연합군의 작업복과 텐트를 빠르게 파괴하는 강력한 곰팡이로 최초로 발견되었고, 이때 균주 명은 트리코더마 비리데(T. viride) QM6a이었으나 다시 트리코더마 레제이(T. reesei) QM6a로 개칭되었다. 이 QM6a로부터 돌연변이를 유도하여 섬유소분해 효소 고생산성 돌연변이 균주들이 많이 개발되었는데, 그 중에서도 트리코더마 레제이 Rut C30균주는 가장 강력하고 그 특성이 가장 많이 연구된 균주로 현재까지 알려져 있다[문헌1]. 이 Rut C30는 처음 자연에서 분리된 QM6a보다 FPase활성이 15-20배 증가 되었다고 보고되었다[문헌2]. 현재 당화에 이용되는 산업용 효소는 유럽의 Novozyme과 미국의 Genencor등의 기업에서 주로 생산되고 있으며 Novozyme의 Celluclast 1.5L이나 Genencor의 Accellerase 1500 등이 트리코더마 레제이로부터 생산되는 대표적인 상업용 효소이다. Novozyme의 Celluclast 1.5L은 트리코더마 레제이 QM6a 유래의 여러 차례의 돌연변이주인 ATCC26921로부터 생산된 목질섬유소분해효소이다. Genencor의 Accellerase 1500은 Accellerase 1000을 보완하기 위하여 새로 개발된 상품으로 유전자재조합방법으로 개량한 트리코더마 레제이로부터 생산하며 Accellerase 1000보다 더 에탄올 생산에 있어 경제적인 효소이며, 베타글로코시데이즈가 다른 상업적 효소들보다도 더 활성이 높다.
이처럼 목질계 섬유소 원료 당화에 이용 가능한 효소 개발이 꾸준히 이루어지고는 있지만 실제 상업적으로 이용되는 고활성 효소를 개발하기 위하여 계속적인 노력이 경주되고 있다. 특히 트리코더마 속의 곰팡이가 생산하는 목질섬유소분해효소는 베타글루코시데이즈의 활성이 많이 부족한 것으로 지적되고 있어[문헌 3], 이를 보충하기 위해 아스페르길루스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 Novozyme 188을 첨가하여 사용하고 있다. 베타글루코시데이즈는 섬유소로부터 효소에 의해 분해 생산된 이탄당이 쎌로바이오스 (cellobiose)를 완전 분해하여 단당류인 포도당을 생산하는 효소로서, 쎌로바이오스의 축적은 다른 섬유소 분해효소의 작용을 억제하기 때문에 제거되어야 하며, 이 쎌로바이오스가 포도당으로 분해되어야 포도당으로부터 비로소 에탄올 생산이 이루어지게 하는 중요한 효소이다[문헌4]. 또한 트리코더마 레제이로부터의 목질섬유소분해효소는 상대적으로 효소 비활성 (specific activity)이 낮고, 열안정성이 낮으며, 효소반응산물에 의한 저해에 민감한 점 등이 단점으로 알려져 오고 있다.
[문헌1] Gusakov, 2011, Cell. 29권, 419쪽 16-33 줄
[문헌2] Montenecourt B. S. and Eveleigh D. E. Advances in chemistry series, 1979 181권 298쪽 14-15줄
[문헌 3] Brian et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 102권 1033-1044쪽
[문헌 4] Brian et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97권 287쪽. Abstract.
목질섬유소분해효소를 이용하는 산업분야에서 공정비를 줄이고 기업의 경쟁력을 높이기 위해 기존보다 우수한 목질섬유소분해효소 생산균주의 개발이 필요하다. 특히 목질섬유소를 당화하여 제조된 포도당과 자일로스(xylose) 등의 단당류로부터 연료용 바이오에탄올을 생산하는 공정에서는 목질섬유소분해효소 비용이 전체 에탄올 생산비의 상당한 부분을 차지한다. 따라서 목질섬유소분해 효소비용을 더 줄이기 위해 현재 사용되고 있는 목질섬유소분해효소보다도 더 강한 활성을 가지고 있는 새로운 미생물 균주의 개발이 지속적으로 필요하다.
본 발명에서는 목질섬유소를 당화하여 포도당과 자일로스 등의 단당류를 제조하기 위해 기존의 강력한 효소 생산 미생물인 트리코더마 레제이보다 여러 종류의 목질섬유소분해효소들의 활성이 증진된 곰팡이 균주인 페니실리움 옥살리쿰 KL1(Penicillium oxalicum KL1 ; KACC93151P)을 분리하였고 이로부터 목질섬유소분해효소를 생산하였다.
본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1 (KACC93151P)는 기존의 강력한 효소 생산균주인 트리코더마 레제이 Rut-C30보다 균 배양액 내 모든 여러 목질분해효소 활성이 높았으며 특히 베타글루코시데이즈 활성이 50배, 아비셀레이즈 활성이 6배, 자일라네이즈 활성이 각각 1.5배 더 높았다. 또한 본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1은 현존 여러 회사 효소제품들의 여러 효소 비활성들보다 높았으며, 특히 베타글루코시데이즈 비활성이 2.5 내지 8.3배가 높았다. 따라서 본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1균주를 사용함으로써 섬유소 당화에 필요한 목질섬유소분해효소 비용을 크게 줄여서 기업의 경쟁력을 높일 수 있다.
제1도는 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균체의 고체배지 상의 콜로니 생육 형태.
제2도는 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균사(hyphae)의 현미경적 형태이다.
제3도는 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주의 ITS 염기서열을 네이버 조이닝 법에 의하여 작성한 계통수를 나타낸 것이다.
제4도는 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주의 목질분해효소 비활성(specific activity)을 다른 회사 제품 효소들과 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 도면에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 및 도면에 의하여 한정되는 것은 아니다.
신균주의 분리 및 동정
썩은 나뭇잎을 포함하는 토양을 생리식염수에 넣고 희석한 다음 PDA(potato dextrose agar, Difco, 2% agar 함유)에 도말하고 30℃에 4-6일 동안 배양하여 순수 분리된 균주 KL1을 얻었다. 분리된 균주의 콜로니 생육형태는 도1에 나타낸 바와 같고, 균사는 격벽이 존재하였으며 도2에 나타내었다.
균주의 동정은 유전자 염기서열에 의하였다. 상기 KL1 균주의 ITS rRNA영역, 18S rRNA 유전자, 그리고 26S rRNA 유전자들의 DNA 염기서열의 공지의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 페니실리움 옥살리쿰(Penicillum oxalicum)과 거의 100%의 유사성을 나타내어 페니실리움 옥살리쿰으로 동정하였고, 계통분류학적 분석(도3)에서도, 페니실리움 옥살리쿰 CBS 219.30과 매우 일치하게 위치하였다. 본 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균체의 고체배지 상의 콜로니 생육 형태는 전형적인 페니실리움 옥살리쿰의 콜로니 생육형태와 일치하였다. 따라서 이 분리균을 페니실리움 옥살리쿰 KL1이라 명명하였고, 이를 2012년 04월 18일자로 국립농업과학원 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁번호 KACC93151P로 기탁하였다.
배양 후 여러 가지 목질섬유소분해 효소 생산량 비교
효소 생산 배지로서 [0.15% (NH4)2SO4, 0.1% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.041% MgSO4 7H2O, 0.01% CaCl2, 0.3% yeast extract, 1.5% 보리짚] 100 ㎖를 250 ㎖ flask에 넣고 멸균 후 페니실리움 옥살리쿰 곰팡이 KL1의 콜로니 균체(지름 7 mmm)를 접종한 후 최적배양온도 33℃에서 7일간 150 rpm으로 배양한 후 그 배양액을 12,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 목질분해효소액으로 사용하였다. 대조구로서 트리코더마 레제이 Rut-C30를 위와 같은 조건에서 (단 최적 배양온도는 30℃) 배양하여 균체를 제거한 효소액을 제조하였다. 두 균주의 배양액 내 여러 목질분해효소 활성(Unit/㎖)을 조사하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 본 발명 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주는 트리코더마 레제이 RutC-30보다 모든 효소 활성이 높았으며 특히 베타글루코시데이즈 활성이 50배, 아비셀레이즈 활성이 6배, 자일라네이즈 활성이 각각 1.5배 높았다, 본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1균주를 사용함으로써 목질섬유소의 당화에 필요한 목질섬유소효소비용을 크게 줄일 수 있다.
여기에서 사용된 효소 활성 분석 방법은 다음과 같다. 씨엠씨에이즈(CMCase) 활성(β-1,4-endoglucanase)는 sodium acetate buffer(0.052 M, pH 5.2)에 1%(w/v)의 CMC를 용해한 기질용액 0.5 ㎖과 0.5 ㎖의 효소액을 혼합하여 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후 3,5 dinitrosalicylic acid (DNS)방법으로 환원당(포도당으로 나타냄)량을 측정하였다, 씨엠씨에이즈 효소 활성 1 unit은 1분동안 CMC 기질로부터 1 μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 에프피에이즈 활성(FPase activity, filter paperase activity)은 filter paper(Whatman No. 1, 1 × 6 cm)를 돌돌 말아 sodium acetate buffer(0.052 M, pH 5.2) 0.5 ㎖에 넣고 효소액 0.5 ㎖와 혼합하여 50℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 DNS 방법으로 환원당을 측정하였다. 에프피에이즈 1 unit은 1분 동안 기질로부터 1 μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 베타글루코시데이즈 활성은 sodium acetate buffer(0.052 M, pH 5.2)에 1%(w/v)의 cellobiose(Sigma C7252, USA)를 용해한 기질용액 0.5 ㎖과 0.5 ㎖의 효소액을 혼합하여 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후 DNS 방법으로 환원당을 측정하였다. 베타글루코시데이즈 활성 1 unit은 1분 동안 기질로부터 1 μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 아비쎌레이즈 활성은 sodium acetate buffer(0.052 M, pH 5.2)에 1%(w/v)의 avicel(FMC type PH-101, 50 ㎛)을 녹인 기질액 0.5 ㎖과 0.5 ㎖의 효소액을 혼합하여 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후 DNS 방법으로 환원당을 측정하였다. 아비쎌레이즈 활성 1 unit은 1분 동안 기질로부터 1 μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 자일라네이즈 활성은 sodium acetate buffer(0.052 M, pH 5.2)에 1%(w/v)의 xylan(Birchwood, Sigma X0502, USA)을 녹인 기질액 0.5 ㎖과 0.5 ㎖의 효소액을 혼합하여 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후 DNS 방법으로 환원당을 측정하였다. 자일로스(Sigma, USA)로 작성한 표준곡선과 비교하여 측정된 환원당량을 자일로스 양으로 환산하였다. 자일라네이즈 활성 1 unit은 1분 동안 기질로부터 1 μmol의 자일로스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
배양액내 목질섬유소 분해효소 활성의 균주간 비교
균주 트리코더마 레제이 Rut-C30 페니실리움 옥살리쿰
KL

효소활성
(Unit/㎖)
씨엠씨에이즈 14 14
에프피에이즈 9 12
베타글루코시데이즈 1 58
아비쎌레이즈 1 6
자일라네이즈 30 49
효소 비활성(specific activity) 비교
페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주와 시중에 나와 있는 회사 효소제품의 단백질 양을 측정한 후 목질분해효소 비활성을 비교하였다(도4). 회사 제품은 Novozyme의 Celluclast 1.5L, Novozyme188, Genencor사의 Accellerase 1500이었다.
단백질양 측정은 Bradford 시약을 이용하여 표준물질은 bovine serum albumin(BSA)으로 하였으며 각각의 용액을 적당한 희석배율로 희석하여 Bradford 시약과 혼합 후 상온에서 5분간 방치한 다음 분광광도계로 흡광도 595 nm에서 측정하여 단백질 대비 효소 비활성을 측정하였다.
본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주는 회사제품들보다 여러 효소 비활성이 높았으며, 특히 베타글루코시데이즈는 Celluclast 1.5L, Accellerase 1500, Novozyme 188보다 효소 비활성이 각각 5.8, 2.4, 8.3배 높았고, 자일라네이즈는 3.4, 3.9, 9.6배, 그리고 펙티네이즈는 34.0, 24.2, 16.3배 높았다. 따라서 본 균주 페니실리움 옥살리쿰 KL1 균주는 상대적으로 매우 높은 효소 비활성을 보여 이 균주가 다양한 섬유소 기질에서 당화 효소로서 사용이 유리하다는 것을 확인하였다.
목질섬유소분해효소 생산을 위한 천연 섬유질 원료의 선정
목질섬유소분해효소 생산을 위한 배지에 탄소원으로 첨가되는 고가의 정제된 섬유소를 대체하기 위하여 여러가지 천연 섬유질 원료로서 보리짚, 쌀짚, 팜열매껍질(empty friut bunch,EFB), 갈대, 억새를 기질로 사용하여 목질섬유소분해효소 생산실험을 하였다. 각각의 기질을 0.5%로 하여 250 ㎖ flask에서 ATCC cellulose medium 907 액상배지에 페니실리움 옥살리쿰 KL1의 균체(지름 7 mm)를 접종한 후 33℃에서 7일간 150 rpm으로 배양하고 배양액을 12,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이 효소액의 여러 목질섬유소분해활성을 측정하여 아래 표2에 나타내었다. 여기에서보면 목질섬유소분해효소 생산에 여러 섬유질 원료들 중 쌀짚이 가장 골고루 우수하여 목질섬유소분해효소 생산을 위한 배지의 탄소원으로 쌀짚을 선정하였다.
천연섬유질 원료에 따른 여러 목질섬유소 분해효소 활성
기질 섬유소 분해효소 상대 활성 (%)
씨엠씨
에이즈
에프피
에이즈
베타
글루코시데이즈
아비쎌레이즈 자일라
네이즈
펙티
네이즈
보리짚 97.5 53.3 56.1 71.8 84.1 89.1
쌀짚 95.3 83.8 100.0 100.0 97.0 100.0
EFB 100.0 100.0 32.3 88.3 97.0 77.1
갈대 89.5 61.4 18.8 58.3 100.0 73.9
억새 98.1 40.8 21.0 47.8 95.7 67.7
없음

Claims (3)

  1. 씨엠씨에이즈, 에프피에이즈, 베타글코시데이즈, 아비쎌레이즈, 자일라네이즈, 펙티네이즈 목질섬유소분해효소를 모두 생산하는 페니실리움 옥살리쿰 KL1 (Penicillium oxalicum KL1;기탁번호 KACC93151P)곰팡이 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주의 배양액의 탄소원은 억새, 갈대, 팜열매껍질, 보리짚, 그리고 쌀짚으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 곰팡이 균주.
  3. 제1항의 균주로 생산한 목질섬유소분해효소를 사용하여 목질계 섬유질 원료로부터 포도당과 자일로스 단당류를 제조하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101650892B1 (ko) * 2013-05-31 2016-08-24 한국생명공학연구원 신규 당화효소 고활성 곰팡이 tg2 균주 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산 방법
KR102060862B1 (ko) * 2017-10-23 2019-12-30 계명대학교 산학협력단 바이오연료 또는 바이오플라스틱 생산을 위한 바이오매스의 전처리 및 당화 방법
CN108949590B (zh) * 2018-07-24 2021-08-17 广西大学 一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用
CN112430548B (zh) * 2019-10-31 2021-09-14 内蒙古科技大学 一种草酸青霉菌在溶解褐煤制取苯甲酸中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114729A1 (en) 2006-04-04 2007-10-11 Sinitsyn Arkady Panteleimonovi Method of lignocellulose materials saccharification using enzymes produced by penicillium fimiculosum
US20080076159A1 (en) 2006-07-10 2008-03-27 Dyadic International, Inc. Methods and Compositions for Degradation of Lignocellulosic Material
JP2011050359A (ja) 2009-09-04 2011-03-17 Musashino Chemical Laboratory Ltd 新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114729A1 (en) 2006-04-04 2007-10-11 Sinitsyn Arkady Panteleimonovi Method of lignocellulose materials saccharification using enzymes produced by penicillium fimiculosum
US20080076159A1 (en) 2006-07-10 2008-03-27 Dyadic International, Inc. Methods and Compositions for Degradation of Lignocellulosic Material
JP2011050359A (ja) 2009-09-04 2011-03-17 Musashino Chemical Laboratory Ltd 新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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African Journal of Microbiology Research. 2007. 7, pp.20-28. *
African Journal of Microbiology Research. 2007. 7, pp.20-28.*

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