CN108949590B

CN108949590B - 一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用

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Publication number: CN108949590B
Application number: CN201810816723.7A
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 赵帅; 王龙
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN108949590A

Abstract

本发明公开了一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用。本发明提供的工程菌是将特异DNA分子通过同源重组取代草酸青霉基因组DNA中PoxPepA蛋白酶的编码基因得到的；特异DNA分子中具有特异表达盒，其中启动子为序列26第1至19位所示启动子pPoxEgCel5B，启动编码特异蛋白质的基因的表达；特异蛋白质自包括信号肽spPoxGA15A、生淀粉糖化酶；生淀粉糖化酶为序列26第20至635位所示蛋白质。本发明提供的工程菌，用于生产生木薯淀粉酶具有非常高的产量，可用于相关工业，具有重大的应用推广价值。

Description

一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用。

背景技术

进入21世纪以来，随着全球经济的快速发展，资源枯竭、能源短缺、环境污染以及生态破坏等一系列问题日益凸显。寻找和开发利用绿色可再生能源迫在眉睫。生物质资源是地球上储量最丰富、分布最广的可再生绿色资源。生物质资源的高效开发和利用，对解决能源危机和生态环境问题具有重要作用。

淀粉是自然界中仅次于纤维素的一种可再生生物质资源，是由α-1,4/α-1,6糖苷键连接葡萄糖残基的大分子聚合物，分为直链淀粉和支链淀粉两种类型。淀粉包括非粮木薯淀粉，是一种重要的工业原材料，可用于生产葡萄糖、果葡糖浆和燃料乙醇等产品。广西木薯资源丰富，其种植面积和产量均占全国的70％以上。

生淀粉酶可直接作用、水解未经蒸煮的生淀粉颗粒，包括α-生淀粉酶(Rawstarch-digestingα-amylase)、β-生淀粉酶(Raw starch-digestingβ-amylase)和生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting glucoamylase，RSDG)，一些微生物如曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)等能够产生生淀粉酶。RSDG可直接将未经蒸煮的生淀粉水解成葡萄糖，应用在生淀粉加工产业中，节约成本，减少环境污染。相关报道表明，将RSDG应用于以淀粉原料的燃料酒精生产中，可减少所生产出酒精的燃烧值10％-20％的能量消耗。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用。

本发明提供的工程菌，涉及草酸青霉中一个蛋白酶基因插入位点、一个启动子序列、一个信号肽编码序列，具有高产生木薯淀粉酶的优势。

本发明提供了一种工程菌，是将特异DNA分子通过同源重组取代草酸青霉基因组DNA中PoxPepA蛋白酶的编码基因得到的；所述特异DNA分子中具有特异表达盒，其中启动子为启动子pPoxEgCel5B，启动编码特异蛋白质的基因的表达；

所述特异蛋白质自上游至下游包括如下两个区段：信号肽spPoxGA15A、生淀粉糖化酶；

信号肽spPoxGA15A如序列表的序列26第1至19位氨基酸残基所示；

生淀粉糖化酶为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列26第20至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)来源于青霉且与(a1)具有98％以上同一性(identity)的蛋白质；

(a3)在(a1)或(a2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。

所述特异蛋白质自上游至下游由如下两个区段组成：信号肽spPoxGA15A、生淀粉糖化酶。

所述特异蛋白质为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列26第1至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b2)序列表的序列26所示的蛋白质。

所述编码特异蛋白质的基因自上游至下游依次由如下两个区段组成：序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段。

所述PoxPepA蛋白酶为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列25所示的蛋白质；

(c2)来源于青霉且与(c1)具有98％以上同一性的蛋白质。

特异DNA分子中具有用于实现所述同源重组的上游同源臂和下游同源臂。所述上游同源臂如序列表的序列1所示。所述下游同源臂如序列表的序列3所示。

所述启动子pPoxEgCel5B如序列表的序列14所示。

所述特异表达盒自上游至下游依次由如下区段组成：序列表的序列14所示的DNA区段，序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段，序列表的序列16所示的DNA区段。

所述特异DNA分子自上游至下游依次由如下区段组成：序列表的序列1所示的DNA区段，序列表的序列2所示的DNA区段，序列表的序列14所示的DNA区段，序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段，序列表的序列16所示的DNA区段，序列表的序列3所示的DNA区段。

本发明还保护一种工程菌，是特异DNA分子与草酸青霉进行同源重组得到的工程菌；所述特异DNA分子中具有特异表达盒，其中启动子为启动子pPoxEgCel5B，启动编码特异蛋白质的基因的表达；

信号肽spPoxGA15A如序列表的序列26第1至19位氨基酸残基所示；

生淀粉糖化酶为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列26第20至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)来源于青霉且与(a1)具有98％以上同一性的蛋白质；

(a3)在(a1)或(a2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。

所述特异蛋白质为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列26第1至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b2)序列表的序列26所示的蛋白质。

所述PoxPepA蛋白酶为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列25所示的蛋白质；

(c2)来源于青霉且与(c1)具有98％以上同一性的蛋白质。

所述启动子pPoxEgCel5B如序列表的序列14所示。

本发明还保护一种工程菌，是线性化重组质粒与草酸青霉进行同源重组得到的工程菌；所述线性化重组质粒中具有特异DNA分子；所述特异DNA分子中具有特异表达盒，其中启动子为启动子pPoxEgCel5B，启动编码特异蛋白质的基因的表达；

信号肽spPoxGA15A如序列表的序列26第1至19位氨基酸残基所示；

生淀粉糖化酶为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表的序列26第20至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)来源于青霉且与(a1)具有98％以上同一性的蛋白质；

(a3)在(a1)或(a2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质。

所述特异蛋白质为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列26第1至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b2)序列表的序列26所示的蛋白质。

所述PoxPepA蛋白酶为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列25所示的蛋白质；

(c2)来源于青霉且与(c1)具有98％以上同一性的蛋白质。

所述启动子pPoxEgCel5B如序列表的序列14所示。

所述重组质粒为将所述特异DNA分子插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到的重组质粒pEASY-Blunt-PoxGA15A。

所述线性化重组质粒是用限制性内切酶Hind III酶切重组质粒pEASY-Blunt-PoxGA15A得到线性化质粒。

本发明还保护一种特异DNA分子，为如下(d1)或(d2)：(d1)特异DNA分子甲，自上游至下游依次由如下区段组成：序列表的序列14所示的DNA区段，序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段，序列表的序列16所示的DNA区段；

(d2)特异DNA分子乙，自上游至下游依次由如下区段组成：序列表的序列1所示的DNA区段，序列表的序列2所示的DNA区段，序列表的序列14所示的DNA区段，序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段，序列表的序列16所示的DNA区段，序列表的序列3所示的DNA区段。

本发明还保护具有所述特异DNA分子的特异重组质粒。所述重组质粒具体为将所述特异DNA分子插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到的重组质粒pEASY-Blunt-PoxGA15A。

本发明还保护工程菌OXPoxGA15A，工程菌OXPoxGA15A，又称为Penicilliumoxalicum OXPoxGA15A草酸青霉OXPoxGA15A，已于2017年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2017794。

本发明还保护以上任一所述工程菌或特异DNA分子或特异重组质粒在生产生木薯淀粉酶和/或生淀粉糖化酶中的应用。所述生淀粉糖化酶为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列26第1至635位氨基酸残基组成的蛋白质；(b2)序列表的序列26所示的蛋白质。

本发明提供的工程菌，可以通过发酵制备得到具有生木薯淀粉酶的粗酶液，可以直接作为生木薯淀粉酶使用，也可以与其它生木薯淀粉酶复配混合使用，也可用于纯酶制剂的制备。

以上任一所述草酸青霉具体可为突变体ΔPoxKu70。

本发明提供的工程菌，用于生产生木薯淀粉酶具有非常高的产量，可用于相关工业，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为草酸青霉蛋白酶基因缺失突变株蛋白酶产量的测定结果。

图2为突变体ΔPoxKu70和工程菌ΔPoxPepA的纤维素酶产量、木聚糖酶产量、生木薯淀粉酶产量的结果；FPase(滤纸酶)；CMCase(羧甲基纤维素酶)；pNPGase(β-葡萄糖苷酶)；pNPCase(外切纤维素酶)；Xylanase(木聚糖酶)；RCSDE(生木薯淀粉酶)。

图3为启动子活性比较的结果。

图4为信号肽活性比较的结果。

图5为检测生木薯淀粉酶产量的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。WA：麦麸加Avicel。

载体pCPXG418：参考文献Chen MM,Jiang MG,Shang JJ,et al.CYPI,ahypovirus-regulated cyclophilin,is required for virulence in the chestnutblight fungus.Mol Plant Pathol.2011；12(3):239-246；质粒pCPXG418在文献中的名称为“transformation vector pCPXG418”。

再生培养基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、琼脂粉17.0g，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20分钟。

WA培养基：KH₂PO₄ 4.0g、(NH₄)₂SO₄ 4.0g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂ 0.6g、FeSO₄·7H₂O 0.005g、MnSO₄ 0.0016g、ZnCl₂ 0.0017g、CoCl₂ 0.002g、麦麸4g、Avicel 1g、Tween 801mL,用蒸馏水定容至1L,pH5.5；121℃灭菌20分钟。

STC溶液：山梨醇91g、Tris 6.05g、CaCl₂ 2.25g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至500mL。

PTC溶液：聚乙二醇3350 40g、Tris 3.03g、CaCl₂ 2.25g，溶于200mL去离子水中，用稀HCl溶液调pH至8.0，蒸馏水定容至250mL。

草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1，又称Penicillium oxalicum HP7-1，简称草酸青霉HP7-1。草酸青霉HP7-1在CGMCC的保藏编号为：CGMCC 10781。

草酸青霉突变体ΔPoxKu70，又称Penicillium oxalicum mutantΔPoxKu70，简称突变体ΔPoxKu70。突变体ΔPoxKu70是在草酸青霉HP7-1的基础上敲除PoxKu70基因得到的。突变体ΔPoxKu70在CGMCC的保藏编号为：CGMCC 3.15650。

p-NP的全称为对硝基苯。p-NPC的全称为对硝基苯纤维二糖苷。CMC的全称为羧甲基纤维素。p-NPG的全称为对硝基苯-α-D-葡萄糖苷。

葡萄糖标准曲线的制作方法：用无菌去离子水作为溶剂，先制备浓度为1mg/mL的葡萄糖母液，然后稀释得到各个浓度的葡萄糖标准溶液(浓度依次为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL)；向500μL葡萄糖标准液中加入1000μLDNS溶液，沸水浴10min，冷却至室温后，吸取200μL至酶标板，测定540nm波长处吸光值；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；标准曲线的函数式为：y＝3.1835x-0.0216(R²＝0.9997)，其中y为光吸收值，x为葡萄糖浓度。

p-NP标准曲线的制作方法：用无菌去离子水作为溶剂，先制备浓度为10mM的p-NP标准液母液，然后稀释得到各个浓度的p-NP标准溶液(浓度依次为0mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM)；分别吸取140μL各个浓度的p-NP标准溶液到1.5mL离心管中，向每个离心管中加入70μL 0.4M Na₂CO₃溶液，混匀后瞬时离心使得溶液聚集到离心管底部；取200μL反应液于96孔酶标板中，在410nm波长下测定其OD值，绘制p-NP标准曲线，回归方程为y＝7.3081x+0.0544，R²＝0.9999，其中y为光吸收值，x为p-NP浓度。

滤纸酶(FPase)产量的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

②取发酵上清，采用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为溶剂进行稀释，得到待测酶液；将待测酶液沸水煮10分钟灭活，得到灭活酶液；

③向含有Whatman 1号滤纸条的离心管中加入1mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，50℃预热5min；

④加入500μL待测酶液或500μL灭活酶液，50℃静置反应60min，然后加入3mL DNS溶液终止反应，沸水煮10min，放入冰水混合物中冷却，然后吸取200μL至酶标板测定540nm波长处吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算糖浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的滤纸酶浓度。

木聚糖酶(xylanase)产量的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

②取发酵上清，采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为溶剂进行稀释，得到待测酶液；将待测酶液沸水煮10分钟灭活，得到灭活酶液；

③向2mL离心管中加入450μL 1g/100ml木聚糖水溶液，50℃预热5min；

④加入50μL待测酶液或50μL灭活酶液，50℃静置反应10min，然后加入1mL DNS溶液终止反应，沸水煮10min，放入冰水混合物中冷却，然后吸取200μL至酶标板，测定540nm波长处吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算糖浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的木聚糖酶浓度。

羧甲基纤维素酶(CMCase)产量的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

③向2mL离心管中加入450μL 1g/100ml CMC水溶液，50℃预热5min；

④加入50μL待测酶液或50μL灭活酶液，50℃静置反应30min，然后加入1mL DNS溶液终止反应，沸水煮10min，放入冰水混合物中冷却，然后吸取200μL至酶标板，测定540nm波长处吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算糖浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的羧甲基纤维素酶浓度。

β-葡萄糖苷酶(pNPGase)产量的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

②取发酵上清，采用pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为溶剂进行稀释，得到待测酶液；将待测酶液沸水煮10分钟灭活，得到灭活酶液；

③向1.5mL离心管中加入116μL pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入14μL25mM p-NPG水溶液，50℃预热5min。

④加入10μL待测酶液或10μL灭活酶液，50℃静置反应15min，加入70μL 0.4MNa₂CO₃水溶液终止反应，然后吸取200μL至酶标板，测定410nm波长处吸光值，根据p-NP标准曲线计算浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol p-NP所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的β-葡萄糖苷酶浓度。

外切纤维素酶(pNPCase)产量的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

③向1.5mL离心管中加入58μL pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入14μLp-NPC溶液，50℃预热5min。

④加入68μL待测酶液或68μL灭活酶液，50℃静置反应15min，加入70μL 0.4MNa₂CO₃水溶液终止反应，然后吸取200μL至酶标板测定410nm波长处吸光值，根据p-NP标准曲线计算浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol pNP所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的外切纤维素酶浓度。

生木薯淀粉酶活力的测定方法如下：

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

②取发酵上清，采用pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为溶剂进行稀释，得到待测酶液；将待测酶液沸水煮10分钟灭活，得到灭活酶液；

③向2mL离心管中加入450μL 1g/100ml木薯生淀粉溶液(溶剂为pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)，40℃预热5min；

④加入50μL待测酶液或50μL灭活酶液，40℃静置反应30min，加入1mL DNS溶液终止反应，沸水煮10min，冷却至室温，12000rpm离心5min收集上清液，然后吸取200μL至酶标板测定540nm波长处吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算糖浓度，一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，然后根据稀释倍数换算得到发酵上清中的生木薯淀粉酶浓度。

蛋白酶产量的测定方法如下：

①采用蒸馏水为溶剂，制备酪氨酸标准溶液(浓度依次为0、20、40、60、80、100μg/mL)；向100μL酪氨酸标准溶液中加入100μL 0.5M碳酸钠水溶液，然后加入100μL福林酚试剂，混匀后28℃反应30分钟，然后取200μL测量660nm波长处吸光值，以酪氨酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

②取450μL 1％酪蛋白溶液(溶剂为pH5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)，加至2mLEP管中，28℃预热5分钟；然后加入50μL粗酶液并混匀，28℃反应10分钟；然后加入800μL10％三氯乙酸溶液终止反应，12000rpm离心5分钟，收集上清液；取100μL上清液，加入100μL0.5M碳酸钠溶液和100μL福林酚试剂，混匀后28℃反应30分钟，然后取200μL测量660nm波长处吸光值，根据标准曲线计算蛋白酶酶活力。一个酶活力单位(U)定义为每分钟产生1mol酪氨酸所需的酶量。

G418表达盒如序列表的序列2所示。序列表的序列2中，第1至714位核苷酸组成启动子，第715-1470位核苷酸组成G418基因，第1471-1890位核苷酸组成终止子。

实施例1、草酸青霉蛋白酶基因缺失突变株的构建

一、草酸青霉中候选蛋白酶基因的确定

分析草酸青霉HP7-1的基因组及转录组，筛选得到转录水平排名前四的4个酸性蛋白酶基因：POX01336(PoxAlp2)、POX03146(PoxPep2)、POX05007(PoxPepA)和POX07371(PoxSed1)。

二、草酸青霉中蛋白酶基因敲除盒的构建

PoxPepA敲除盒自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。同源右臂如序列表的序列3所示。PoxPepA敲除盒用于通过同源重组敲除基因组中的PoxPepA基因(PoxPepA基因的开放阅读框如序列表的序列4所示)。

PoxAlp2敲除盒自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列5所示。同源右臂如序列表的序列6所示。PoxAlp2敲除盒用于通过同源重组敲除基因组中的PoxAlp2基因(PoxAlp2基因的开放阅读框如序列表的序列7所示)。

PoxPep2敲除盒自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列8所示。同源右臂如序列表的序列9所示。PoxPep2敲除盒用于通过同源重组敲除基因组中的PoxPep2基因(PoxPep2基因的开放阅读框如序列表的序列10所示)。

PoxSed1敲除盒自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列11所示。同源右臂如序列表的序列12所示。PoxSed1敲除盒用于通过同源重组敲除基因组中的PoxSed1基因(PoxSed1基因的开放阅读框如序列表的序列13所示)。

三、草酸青霉蛋白酶基因缺失突变株的构建

分别采用步骤二的四个敲除盒进行草酸青霉蛋白酶基因缺失突变株的构建。

1、向敲除盒(5μg DNA)加入2μL 100mM亚精胺水溶液，混匀后加入到100μL突变体ΔPoxKu70原生质体中，混合均匀，冰上静置30分钟。

2、完成步骤1后，向体系中加入1mL PTC溶液，混合均匀，室温静置25分钟。

3、完成步骤2后，向体系中加入2mL STC溶液，混合均匀，将混合液加入到15mL 55℃的再生培养基中，混合均匀，然后将混合液倒入无菌培养皿中(每个培养皿倒入3mL左右)；待完全凝固后，室温放置30分钟，然后加入40mL含800μg/mL G418和250μg/mL潮霉素的固体PDA培养基，覆盖在表面；待完全凝固后，放入28℃培养箱中倒置培养5天。

4、完成步骤3后，用0.1％(体积百分含量)吐温80水溶液清洗以收集孢子，然后将孢子悬液用无菌水进行梯度稀释，将各个稀释液涂布在含800μg/mL G418和250μg/mL潮霉素的PDA培养基平板上，28℃倒置培养3天。

5、完成步骤4后，挑选单菌落，提取基因组DNA，进行PCR鉴定。

采用PoxPepA敲除盒进行上述步骤，得到的PoxPepA基因被敲除的工程菌命名为工程菌ΔPoxPepA。

采用PoxAlp2敲除盒进行上述步骤，得到的PoxAlp2基因被敲除的工程菌命名为工程菌ΔPoxAlp2。

采用PoxPep2敲除盒进行上述步骤，得到的PoxPep2基因被敲除的工程菌命名为工程菌ΔPoxPep2。

采用PoxSed1敲除盒进行上述步骤，得到的PoxSed1基因被敲除的工程菌命名为工程菌ΔPoxSed1。

四、草酸青霉蛋白酶基因缺失突变株蛋白酶产量的测定

分别将步骤三的四个工程菌作为待测菌，检测蛋白酶产量。

将1mL待测菌的孢子悬浮液(孢子悬浮液中，孢子浓度为1×10⁸个孢子/mL)接种到100mL WA培养基中，28℃、180rpm振荡培养144小时，然后4℃、8000rpm离心10分钟，收集上清液。检测上清液中的蛋白酶浓度。

结果见图1。与突变体ΔPoxKu70相比，工程菌ΔPoxPepA的蛋白酶产量降低了76.9％，然而，工程菌ΔPoxPep2、工程菌ΔPoxAlp2和工程菌ΔPoxSed1的蛋白酶产量无显著性差异。结果表明，PoxPepA基因是草酸青霉菌株中非常关键的一个胞外蛋白酶基因。

五、工程菌ΔPoxPepA进一步的验证及表型分析

用Southern杂交试验进一步对工程菌ΔPoxPepA进行验证。突变体△PoxKu70得到4394bp的杂交带，工程菌ΔPoxPepA得到大小为7453bp的杂交带，杂交带大小和预计大小一致。结果表明，工程菌ΔPoxPepA中PoxPepA基因已被敲除，而且敲除盒也没有发生其他位点的整合。

检测突变体ΔPoxKu70和工程菌ΔPoxPepA的纤维素酶产量、木聚糖酶产量、生木薯淀粉酶产量。结果见图2。相比突变体ΔPoxKu70，工程菌ΔPoxPepA的纤维素酶(FPase、CMCase、pNPCase和pNPGase)产量、木聚糖酶(Xylanase)产量和生木薯淀粉酶(RCSDE)产量均无显著差异。

突变体△PoxKu70和工程菌ΔPoxPepA在PDA平板上培养6天后，生长无明显差异。

实施例2、草酸青霉中强诱导型启动子的鉴定

一、草酸青霉中候选启动子的确定

分析草酸青霉HP7-1在含有WA或葡萄糖的培养条件下的转录组，将转录水平由高到低排名前五的5个基因：POX02308(PoxLPMO9A)、POX06820(POX06820)、POX01166(PoxEgCel5B)、POX00089(PoxChiB1)和POX04786(PoxCbhCel6A)的启动子作为候选启动子。上述5个基因在含WA的培养条件下FPKM(Fragments per kilobase of exon per millionmapped reads)值分别为：10021.93、7952.22、7468.14、6795.32和5574.13。上述5个基因在含葡萄糖的培养条件下FPKM(Fragments per kilobase of exon per million mappedreads)值分别为：49.15、1906.28、50.77、1940.06和20.36。POX02308、POX06820、POX01166、POX00089和POX04786基因分别编码裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白、内切β-1,4葡聚糖酶、内切几丁质酶以及纤维二糖水解酶。

二、特异DNA分子的构建

DNA分子Ⅰ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列14所示的启动子pPoxEgCel5B。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子Ⅱ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列17所示的启动子pPoxLPMO9A。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子Ⅲ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列18所示的启动子pPoxCbhCel6A。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子Ⅳ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列19所示的启动子pPOX06820。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子Ⅴ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列20所示的启动子pPoxChiB1。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

三、重组质粒的构建

将DNA分子Ⅰ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-pPoxEgCel5B。

将DNA分子Ⅱ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-pPoxLPMO9A。

将DNA分子Ⅲ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-pPoxCbhCel6A。

将DNA分子Ⅳ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-pPOX06820。

将DNA分子Ⅴ插入pEASY-Blunt克隆载体的Spe I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-pPoxChiB1。

四、工程菌的构建

分别将步骤三的四个重组质粒作为待测质粒。

1、取待测质粒，用限制性内切酶进行酶切(其中重组质粒pEASY-Blunt-pPoxLPMO9A、pEASY-Blunt-pPOX06820和pEASY-Blunt-pPoxEgCel5B用Hind III酶切，pEASY-Blunt-pPoxChiB1和pEASY-Blunt-pPoxCbhCel6A用Not I酶切)，得到线性化质粒。

2、将线性化质粒导入突变体ΔPoxKu70原生质体，得到工程菌。

重组质粒pEASY-Blunt-pPoxEgCel5B进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌pPoxEgCel5B-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-pPoxLPMO9A进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌pPoxLPMO9A-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-pPoxCbhCel6A进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌pPoxCbhCel6A-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-pPOX06820进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌pPOX06820-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-pPoxChiB1进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌pPoxChiB1-gfp。

五、启动子活性比较

分别将步骤四的五个工程菌作为待测菌，检测荧光强度。

将1mL待测菌的孢子悬浮液(孢子悬浮液中，孢子浓度为1×10⁸个孢子/mL)接种到100mL WA培养基中，28℃、180rpm振荡培养，每24小时取样菌体，进行菌体破碎然后提取胞内蛋白，检测荧光强度。

结果见图3。五个启动子在含有WA的培养条件下的强弱关系为：pPoxEgCel5B>pPoxLPMO9A>pPoxCbhCel6A>pPOX06820>pPoxChiB1。最强启动子为pPoxEgCel5B启动子。

实施例3、草酸青霉中高效分泌信号肽的鉴定

一、候选信号肽的初步筛选

分析草酸青霉114-2在WA培养条件下的分泌组，筛选得到相对分泌量排名前三的分泌蛋白(PDE_09417、PDE_01201和PDE_07945)，所占比例分别为29％、11％和10％。NCBIBlastP比对分析显示PDE_09417，PDE_01201和PDE_07945在草酸青霉HP7-1中同源蛋白分别为POX01356、POX09352和POX05587，一致性分别为99％、98％和98％。POX01356、POX09352和POX05587分别注释为糖苷水解酶GA15A、α-淀粉酶Amy13A和纤维二糖水解酶Cel7A-2。

二、特异DNA分子的构建

DNA分子ⅰ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、信号肽编码序列、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列14所示的启动子pPoxEgCel5B。信号肽编码序列为序列表的序列21所示的信号肽spPoxGA15A编码序列。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子ⅱ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、信号肽编码序列、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列14所示的启动子pPoxEgCel5B。信号肽编码序列为序列表的序列22所示的信号肽spPoxAmy13A编码序列。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

DNA分子ⅲ自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、信号肽编码序列、gfp基因、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列14所示的启动子pPoxEgCel5B。信号肽编码序列为序列表的序列23所示的信号肽spPoxCbhCel7A-2编码序列。gfp基因如序列表的序列15所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

三、重组质粒的构建

将DNA分子ⅰ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-spPoxGA15A。

将DNA分子ⅱ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-spPoxAmy13A。

将DNA分子ⅲ插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-spPoxCbhCel7A-2。

四、工程菌的构建

分别将步骤三的三个重组质粒作为待测质粒。

1、取待测质粒，用限制性内切酶Hind III进行酶切，得到线性化质粒。

2、将线性化质粒导入突变体ΔPoxKu70原生质体，得到工程菌。

重组质粒pEASY-Blunt-spPoxGA15A进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌spPoxGA15A-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-spPoxAmy13A进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌spPoxAmy13A-gfp。

重组质粒pEASY-Blunt-spPoxCbhCel7A-2进行上述步骤，得到的工程菌命名为工程菌spPoxCbhCel7A-2-gfp。

五、信号肽活性比较

分别将步骤四的五个工程菌作为待测菌，检测荧光强度。

将1mL待测菌的孢子悬浮液(孢子悬浮液中，孢子浓度为1×10⁸个孢子/mL)接种到100mL WA培养基中，28℃、180rpm振荡培养，每24小时取样上清液，检测荧光强度。

结果见图4，这三个信号肽的分泌强度关系为spPoxGA15A>spPoxAmy13A>spPoxCbhCel7A-2。最强信号肽为spPoxGA15A。

实施例4、草酸青霉生淀粉糖化酶基因过量表达菌株的构建

一、特异DNA分子的构建

特异DNA分子自上游至下游依次由同源左臂、G418表达盒、启动子、信号肽编码序列、生淀粉糖化酶基因(PoxGA15A基因)、终止子和同源右臂组成。同源左臂如序列表的序列1所示。启动子为序列表的序列14所示的启动子pPoxEgCel5B。信号肽编码序列为序列表的序列21所示的信号肽spPoxGA15A编码序列。PoxGA15A基因如序列表的序列24所示。终止子如序列表的序列16所示。同源右臂如序列表的序列3所示。

二、重组质粒的构建

将步骤一构建的特异DNA分子插入pEASY-Blunt克隆载体的Sac I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pEASY-Blunt-PoxGA15A。

三、工程菌的构建

1、取重组质粒pEASY-Blunt-PoxGA15A，用限制性内切酶Hind III进行酶切，得到线性化质粒。

2、将线性化质粒导入突变体ΔPoxKu70原生质体，得到工程菌，将该工程菌命名为工程菌OXPoxGA15A。

四、检测生木薯淀粉酶产量

将1mL待测菌的孢子悬浮液(孢子悬浮液中，孢子浓度为1×10⁸个孢子/mL)接种到100mL WA培养基中，28℃、180rpm振荡培养168小时，每24小时取培养上清，以生木薯淀粉为底物测定生木薯淀粉酶产量。

待测菌为步骤三制备的工程菌OXPoxGA15A。

结果表明，在2-7天中，相比突变体ΔPoxKu70，工程菌OXPoxGA15A的生木薯淀粉酶产量显著提高，见图5。其中，在第七天，工程菌OXPoxGA15A的生木薯淀粉酶产量达到了241.6U/mL，是突变体ΔPoxKu70的4.4倍。

现有技术中其它菌株的生木薯淀粉酶产量为：草酸青霉HP7-1，55.1U/mL；Laceyella sacchari LP175，181.1U/mL(文献：Lomthong T,Chotineeranat S,Kitpreechavanich V,Production and characterization of raw starch degradingenzyme from a newly isolated thermophilic filamentous bacterium,Laceyellasacchari LP175.Starch/

2015；67:255–266.)；P.oxalicum GXU20，20.0U/mL(文献：Lin HJ,Xian L,Zhang QJ,et al.Production of raw cassava starch-degradingenzyme by Penicillium and its use in conversion of raw cassava flour toethanol.J Ind Microbiol Biotechnol.2011；38:733–742)；Aspergillus sp.MZA-3，3.3U/mL(Moshi AP,Hosea KMM,Elisante E,Mamo G,Onnby L,Nges IA(2016)Productionof raw starch degrading enzyme by Aspergillus sp and its use in conversion ofinedible wild cassava flour to bioethanol.J Biosci Bioeng.2016；121:457–463.)。

工程菌OXPoxGA15A，又称为Penicillium oxalicum OXPoxGA15A草酸青霉OXPoxGA15A，已于2017年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2017794。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 一种高产生木薯淀粉酶的草酸青霉工程菌及其应用

<130> GNCYX181337

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2476

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 1

aattatattg tctcctttgt gagggcaggt gaagtagttg ggtatctatc ttcactgcat 60

cacttggatc tcgaatcatg catgtggact aggtagtggc ttacttaaga ttacgggctg 120

ctaggtggtt gctggctgct ggagtggagg tccgatcctt tttggttgat gactcgaact 180

gaaatgaaag aattatgcca taacacttgg catataaaat acctatttca cccatgatgt 240

ggttgtccaa cggagtccat ttcaacacaa aacgtgatgc tatctctcaa ggaatatgta 300

gtagaccggg ggacccggga acaggtgacc cctatggaag aatatgcgat ctagtcaacc 360

ggtagactgc ccgaataagg gcggtctgtg atatatttga cagtaaaatc acattccccc 420

ccaaaaagga aaagaaatca agagacatca gtaagcgggc atcggttatt ttaatattta 480

aaagctgagc gaatcgataa tttctgcttt atttgataga gcggcgcctg gatttcgcaa 540

tacatgtagt tgtgtcttga ctcgtcacga ctacaatacc atatcactag taggccacta 600

ggtaccatat tcctctgggt agtgaatatt gaatgatgat tgatgtttat aatgagcgta 660

gtgtgagagc accaattaat cgttgtcaat tcccaacacg gccttggaat cttcaagtaa 720

catgactttg gcgacgcgag gctattgaac ataccgagat cgaagtcctt gagagtaaga 780

ataggattca aaggggatca attgaatgac gaatttcggt taggaacccg ctcgggttcc 840

aggatcatcc gctctgttgg gtgccacccg tgaccagggt ccttgaatgt ccgaggcctg 900

ccaaggatcg ttcacagatc acgactggta atcacgaatc acgcgccctg ctgctcttat 960

ctttgtcctt ttgtcagtcc gcacctggta ctcaagaacc atcacatcat gtatagagcc 1020

atgaagacaa ggatggtgcc gcgggggtga tgacagtcga gtgtcttgag acccaatcag 1080

cccgccccga tcctcatgac tcttcaccct cacagatggc acatacgccc cgtttcagct 1140

cttgagtttg acgcgatgtg accctcgcac ggccggagac accaccccca ccccccaccg 1200

agaaaggctt tccgagtgaa gagagtcatt ggctgcaccg aggagatgac cggctcctga 1260

tcgacagagc aagcctcctg gacccttctt ggtggcttca attgcttaca cattgctctc 1320

ctctacgggc catcatctcg caatttccac ctgtcaaggg tcttcgttct tctctactgt 1380

acagtagaga gtgaccggcc tatttgctcc ggcccattca cagtccacga tccatactct 1440

attgtccaag ctaaacgctt gtggaccact cacagaccgc agccacgccg tcacccaagg 1500

tcgctatcac tttttctaaa tcattcagga tcgctattag ttaccaggtt cgactgcacc 1560

cagacatgag ctggtgaggg tcttggtggc ggagacacag acctcgctgc tatctacggg 1620

cgctcagcga agcaccttca taccactgca ggtccgtagg ctgactggtt ggcaacgagc 1680

gcttgctggg agcacgttcg taatcctagg tttaggcttg gctcttttgg ggaagtgaca 1740

atgcgtgtgt cggtcaatca ggttcagtcc aatcggccct ttggttgagt caagttactg 1800

gtatttctcc gaccaacgct agcgtgctca ccaggcagcc aagattgctt gtcaggatca 1860

agccttccag tgtcagggac ccaccgcgag tgcggcgtct tccccgcttc ttgcaggttc 1920

ccgaggattg gcctctcaga gcgcacggat tctcgaggca aattggggct tatctgctgc 1980

aattcgacac gatggttatt acccacaggg caatatgcaa ccctatagat gttcccacat 2040

cgcactgctg aacggactcc ggcttggccg ttggacgtcc gtgacaagtc cgaggtcttg 2100

atgaccctga tagcttgggc ggatccatga aagtcctgca gagatttcga tcgacagaga 2160

gatcttccca gaagagcaat atctccttct cgaccgatca aagaagatgc gggatcactc 2220

gagagaagca ttcgccttgg atctcttgct gccgctgttg cttccagggc tatcgtggac 2280

atcgcgagct cagcggaacc tccagatgcc tgagaccttc tctgagatct ataaaagcac 2340

agctctcttc gcagaactca gtgaatcttt ctatctctca gactcgtcca catcttctga 2400

gcctcgatct tagccttctc tgagaccttc actcctccat attcgcttct tgtccaatcg 2460

taccgtctcg tccatc 2476

<210> 2

<211> 1890

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tctagaaaga aggattacct ctaaacaagt gtacctgtgc attctgggta aacgactcat 60

aggagagttg taaaaaagtt tcggccggcg tattgggtgt tacggagcat tcactaggca 120

accatggtta ctattgtata ccatcttagt aggaatgatt tcgaggttta tacctacgat 180

gaatgtgtgt cctgtaggct tgagagttca aggaagaaac atgcaattat ctttgcgaac 240

ccagggctgg tgacggaatt ttcatagtca agctatcaga gtaaagaaga ggagcatgtc 300

aaagtacaat tagagacaaa tatatagtcg cgtggagcca agagcggatt cctcagtctc 360

gtaggtctct tgacgaccgt tgatctgctt gatctcgtct cccgaaaatg aaaatagctc 420

tgctaagcta ttcttctctt cgccggagcc tgaaggcgtt actaggttgc agtcaatgca 480

ttaatgcatt gcagatgagc tgtatctgga agaggtaaac ccgaaaacgc gttttattct 540

tgttgacatg gagctattaa atcactagaa ggcactcttt gctgcttgga caaatgaacg 600

tatcttatcg agatcctgaa caccatttgt ctcaactccg gagctgacat cgacaccaac 660

gatcttatat ccagattcgt caagctgttt gatgatttca gtaacgttaa gtggatggat 720

ccatctactc tagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg 780

agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc 840

aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca 900

gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc 960

atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc 1020

ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc 1080

catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc 1140

cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg 1200

agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct 1260

tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca 1320

cgatagccgc gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac 1380

aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat 1440

tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc 1500

gtgcaatcca tcttgttcaa tcatatcgat gcttcggtag aataggtaag tcagattgaa 1560

tctgaaataa agggaggaag ggcgaactta agaaggtatg accgggtcgt tcacttacct 1620

tgcttgacaa acgcacaagt tatcgtgcac caagcagcag atgataataa tgtcctcgtt 1680

cctgtctgct aataagagtc acacttcgag cgccgccgct actgcttaca agtgggctga 1740

tctgaccagt tgcctaaatg aaccatcttg tcaaacgaca caaattttgt gatccgcctg 1800

gacgactaaa ccaaaatagc attgatgtgt tgacctccac tagctccagc caagcccaaa 1860

aatgctcctt caatatcatc ttctgtcgac 1890

<210> 3

<211> 2189

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 3

atgtagatca ccaagttgca cgccgacagc cgtgccaagg ttctccccag ttcttaggga 60

gagggggaaa ccccttgttc aatcaacttt ggctctgatg gctctttgaa cgggccaata 120

ggttatatgg catggaccag agtcgaactc acattatgcc ttgatccgat tttttcggtt 180

ccctgatctt ctcatgtcta ttgatgactc gtgaccggaa gctctgacac ggccggtctt 240

gtatataagt gtccttgatc gatacatgca ggagatgatt gaatatagga gcaattgttt 300

ctaccacctt attcttctcc tattgtagca tgagacctat tgggcagtag cttttgtagg 360

ccacggtcaa ctgctaaaat ctctcgttat ccactttgac ttgcaggagt ttttaataac 420

agcctttgtg acaaagtcct tttgcaacaa atggagtcct ttcaatctat gagagtcccc 480

cagcgtaaga aatttacttc caatccggag aaagaggcac ttccagatcg acttttggtc 540

acaagttgta ttgcgggtca acctgaggct tagagaccga tgaaccggac ctgagcgacc 600

acgtgcgggt gaacccacaa gaggacgagg ggcagtagtt cagcaaagtt cacttgaaca 660

caccagaaac cgagcccaga cgggctgtcg gacattgccg tctacagcac atattgtctg 720

tgcgcagagc atcctctgaa atattctcac ttcattgcaa catagacgat gattggtgca 780

tgccagccct gcagaaagag aattatcatg gtcgtatccg gggcgattcg acttgcgggg 840

gagagtcacg ttggtggaaa agtggagtcc tctgcgagtg gcggatcgcc tcgtctcaat 900

tgacgacccg ccttgcccga aactccgttc tcgaccctcg aatgatctca gttcaacgat 960

tcgatttgca cagttgcccg ccccgtcttg ttctcgattg ctttttccga tcaaattgga 1020

aattctcgcg cccgctgtct atccattgtg tcctccatct ccaactgcga taccccccct 1080

ggtacacaac ctttctgtgt ctctcctttt ctcgagcgtt caggtcgatt tccatctgcc 1140

actgactact gcacgccgac cgtgtctcaa atcgcccgcc ctccccctta ggctccagag 1200

ttccttactc tgcctttgtc acagtccctc tcacccggct ggtcgtggca gcgcgcggct 1260

tatacccgat gatggacgtc tgactcttga accgacatcg ttatctacgc agatcctctg 1320

caggggcatt tatcatccga aggaaccgaa tcctaacggc gcggacttgg gcgaaatcgg 1380

cctaccgctt gaagcggcat cctgaccatg ggagatgcgc ctcatttgac gccccgccag 1440

atttgggcgg taccaacaac gaccacagcg cagacgtatc cctctgggtg cacgcctttt 1500

gttctgccga gcgaaggttg gtttccctct tgttcgttct ggccatctgt tcggctgaat 1560

tcccgggccg agttattggg gaccctcagc ttcgccttcg cggcttggcg tgatcgtgac 1620

tgatgaccgt gtacctgacg ttgctctacc caggcatcgt tcgtatcaac aactcttatg 1680

ccctaacttt gaccggcaac gctatctacg aacccgtctg cactggcgat ccgaccgact 1740

acgtccacgt ttccgccgtt ctcgatactc gtgacccttt ttactcctcc gtgaccccgc 1800

aactctatgc gattggatgt gcgactgtcg tcagttacgt cctggtcatc attcttctta 1860

tcacgcctcg cactttcttc attggtggcc ctggtggagg cgccaatttc ctcggacgcc 1920

atggtatgat caccggctcc tacagcggca actcgtccgt cgttggggtg ggtggacggc 1980

cctggctgca aaaggtcgcc gcgacgttag tggcgatatc cttgacgatt gcgacggtgg 2040

attctttcaa ggtggcccag cgacaatatg attatgggtt ctctgatgcg gaggcgcttt 2100

cgcaggaagt gattgacggg acagaaattc gcatcttccg cgtgatatcg agtactttcc 2160

tctggctggc ccaggttcag acgctgatc 2189

<210> 4

<211> 1188

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 4

atggttgtct tcagcaaggt tacggccgtt ctggccagtc tggcggtcgt ctcatcggcc 60

atgcccaccg gcgacgcggc caaggcctcc cccaaggcca acttctctat caagcagacg 120

gttcggccgg gatcaaagaa ggtcgtcaac ttgccagcca tgtatgcggc ctcgattgcc 180

aagtatggcg gcaaggtccc ccagagtgtc aaggctgctg ctgcggccgg cactgccatc 240

accacgccta cggaaaatga cgaggagtac ttgactcccg tcaccgttgg tggctccact 300

ctcaacctgg actttgatac cggctctgct gatctgtggg tgttctcatc ccagctgcct 360

tcatctgaga cccagggtca cgacatctat cgccccagtc gcaatgcgcg aaagctctct 420

ggctacacct ggtccatctc ctacggcgat ggaagcactg ccagcggtaa cgtctacaag 480

gacaccgtca ccgttggtgg tgtgaccgcc tctagccagg cggttgaggc tgcccagacc 540

gtcagccagc agtttgttca aaacgcaggc aatgatggtc tccttggttt ggcattcagc 600

tcgatcaaca ccgttcagcc gcaggcccaa accaccttct tcgataccgt gcaatcccag 660

ctggattcgc ctttgttcgc ggttaccctg aagcacaacg ctcccggtac ctacgacttc 720

ggtttcatcg acaactccaa gtacactggc caattggcct acaccccggt cgacaactcc 780

cagggcttct ggtccttcac tgccgactcc tactcggctg gtagcgctca gggaggttcc 840

attcagggta tcgctgacac cggcactact cttctgctcc ttgacgacag cgttgtcgac 900

aactactaca gccaagtcga gggtgcgaac tcggactcct ctgccggtgg tatcaccgtc 960

ccttgtgatg cacagctgcc cgactttgtc gtcagcatcg ccggctacga cgcggtcgtt 1020

cccggctcac tgattaacta cgctcccctg tccggcaaca cctgcttcgg tggtatccag 1080

agcaactccg gcattggctt ctccatcttc ggcgacatct tcctgaagag ccagtacgtc 1140

gttttcgacg ccagcggccc tcagctcggt ttcgctgctc aggcatag 1188

<210> 5

<211> 2384

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 5

ttggaccgag gtacatatcc atcttcgcac ctacattttg tttgggaccc aggtttggta 60

ccatcctggg caagctaata gatgttttca tcctgattca ccttcatttt atagcatgaa 120

tctcctggtg gtcccgtcgg gttggttgca catcgaggaa tacccagcct catcagagag 180

aagtgtggcc taccaaatca tgagctcgac agattttgca accagataga atcattcgat 240

aaaattgatc atggatccat cgctcgatca gaggtcccga tccagatata accccagccc 300

gcaaaggctt tccaaatccg gtttcacttt tgtcgattga caagaggtaa tgctctagag 360

tcctgcgggt atcgactgga gaaagcacac ccggtcggga gttgcaacag tgaaaggaag 420

aattcgacca gaggtgtctt ttccacgatt gaaactggca acttgggtca ccttaatttc 480

tgaatttctg gccactagtc gagtttggcc tcttgaaaag catatcttct cttcaggatc 540

ttccctccat acatgttgcg agactgtgcc ttgacaattt ggtatcgaca ggttgcagac 600

gccttcatgg aatcctagtc cttgattgga tggttggata aattgaacca aagacaattc 660

ttcagcaagg gaccctccta ttgaacgaac tggattaccc gaccttaaga gggaactgcc 720

cggagttcac tcagagcacg agagcaccag gtcaggtgcc gggagggata acatccaacc 780

tcaggccacc atatggaact atggagctac ctacatacgt atgtaggaat tgccagtggt 840

tcatgcccat ggtgaggcaa cactcgtcaa cttccattgc atgtctatgg actctcacca 900

caccacattg ttgaacagaa ttacagctgg tgcttccata gattgaattt catcttgtac 960

agatgaggtg cctcaagttg ctttgcaggt tgatcaggtg gattgaggtg ttcccactta 1020

ccccgacccg cactcctgat ttccccgcag ctcgtctgta ggtatgcctc gtcgcttgcc 1080

tggtgtagct gcaggctttc cgtgcagacc acctgccaag cgtcgatata gcatcactcc 1140

caactaagct gtggtttttg tgaataccac ctctcaatct tactgaatct cgatggtggt 1200

ggttaattac ttcttgccaa ggagcaggaa tgatgttgct gaccagcagg cgaccgtgtt 1260

gaggtcatgt tactccacgc cacccagacc cgcttccggc ggtggcctag tgtgccgatc 1320

gttgaatcga tatagatagc acaagatgca tctgcgatgt cgcactattg ggacgcaagc 1380

acgcgactcg caaagttgcc ttcaagacca ccgagaatgc gtcgtcacgc ccatacggct 1440

gacgactgtt tctgtgcgat cgatggacct gccaggtacc cgaaaggggg aacaggccac 1500

agggtccttt cagagtatcc atccaatagc ttccgtccta tcacctcatt ctgtcatcca 1560

atgcaggtcc gggaaggggt cagatggcta tcagctagaa gagacaagcc cttgatgttc 1620

tactggacag agttctgagt catcgagtca tctggatttc agaaccagaa acaagtttgg 1680

aaaccgggga ccaagcgaca agtgaggtgc gtgcaagtac tgtagcgcac gcacgcacag 1740

ccctggctgt acactcatac cgtacactcg tattggtgtc tggtacagaa cgtacggtac 1800

cgtccgtaga ctccccagcc cccgaggaat tcttcttcag ccttgatcga cttccccgcc 1860

tcaggcgagg cgccagcgtc catctgcatc cgccgcggca taacaacggc ttagataatc 1920

ttctttcagt accgtgcctc gtgacctctg tatcatcagg gtggtatacg gtcacagagc 1980

gtatcgcctc aaccccggtc ttgagggatc caccgcgatc gacagctcac caccaatcga 2040

ccgcttatcc gtgcccgccc tgggctggta ttgcccgctc tgactggtat cttaaccgta 2100

tccagtcgtc tctgctcccc cgtcagctcc cgcttgcatc atgctttctc cgccttcttg 2160

tcgcccttag ataaggacct gggtccagtg acccagttac tcctcacatc tcctcatcac 2220

ctcctcatca cctccctccc cttcgcttcc tcttcttctt cccttcccat ctccaaccgc 2280

tcgtcgacag cttagtcgac acctatccta tctgtgctat cctttccttg tgatatcttt 2340

gaatccctgt cgttcattgt ccatatccta taccaatcgt catc 2384

<210> 6

<211> 2256

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 6

agagacttcg tgatcgagac ccgtctgtga cgggccggtc tttcctgggc atttttggac 60

ggaaggattc acattggcgc agatcagttg ctttgtttta tcctgattca tgattactct 120

tttccccttt ctcttattgt catggactct tctatttttt tttcgtcgga ttagtcgatc 180

cggtgtgctc aacctatagt atctcacaga ttgttacttg ctcttctgct tctcgctctt 240

gattcctcct gttatcacca ccaggtgcac catctcggtt atagctcgac atttgaatcc 300

tgacttaggg tcccctacat gcaaatgatt cgccattttg agttattctt tcctccgctg 360

gtaaccacac gagcccgggc gggagtcccc caacttatag tatgctcact cctgtgcacg 420

atccaaactt ttctcattcc gaaaggcaga aagtcgtcaa tcgtagcgtt gaacagaccg 480

cttgcaaaca cacaaccgct cacaactatg aaggacctcc gcccggcact tgcatcaatc 540

tcgcgccccc gtcttccctc gtctgacttg cactcctcgc gttccataga tatccgatgt 600

atagcctaaa agtgatgccc attggaaact tgaaaagtaa gggggagtgt atcatgtagg 660

gcccctcacc aaaacaccat gctaggtcta tatctgctct ggcagggatc cgatcgtttt 720

cctcctcgct cgatttgtca tatttcgtct actcctcagg gagacaggta ccgagtcctc 780

gctgcctcca tggagaccaa gatttaaagc actgtgggta tcttttgtga gacatctcat 840

ctaatcccaa cttctatttt cctaaggttg atcccatcct gggctggtat ccgcgtgaaa 900

gagtgtcttc ggctctggga ctcttacctg aactctgtca gcaaaccgcc ctacagctag 960

agatctcaaa gttgaatgac tgggtgcttt gtacttttcc cagtcctcgc ctttgctttc 1020

ataagcgggg cgagcagagc atgtcttgct ctctatgagg tccttatcct cttcttgaca 1080

acaagtgaat ttaacccgat ccgcaaatac gcgcaaatct caggaggaaa tgatctcgtg 1140

ggatgttact tttcagtcaa agcgatgacg agggatatat ttctctttta aatggtggtg 1200

gactggatta agctggaggt tccagtcagt cagctttgag tctgattgaa atatagcccg 1260

gtaagggcta tgagcttcct ataatctgtt tgtgtgaacg ccgggctggg ttgattacct 1320

atcgagccgt aaccttagtg gacggttgat agaatagtag tatttaccac gttgagtcac 1380

ttcttttgac taggtagcct tttatttagc atggggctgt cgggatgccc atagccagga 1440

atgaattaga ccaataaact ttcttccccc agagttgcat tattagttgt ttggtttact 1500

cagtcaggta taggcgggat ctgggtcaat tcaaagtgac aacgctggca tctctatgtc 1560

attttactgt tactcgctgt gttgggactg gtatcaccgg atcgacaata tgtctaccac 1620

gagaccatgt tttgagaaag tcagttttgc tgaatgcggt gatggaatga atgcccgtgc 1680

tttgtgctgt cagttgcgga ccgaatctgt cacgtagtgc ggctctcggt caggccgaaa 1740

ttgaccgttg agagtttgca tacaaccttc cgatatcctg cttggactgt caaagcaggg 1800

aacctatgat tataaggtga aggtgaagca ggacagtgtt agaaagcaag aaggagccaa 1860

gttttgtctt tttgaaaaat gggttcaaga gtcttcaact tcattataat cttatatagt 1920

gatccataat catcgtttgg aggaagcggg gagcttgctt tttcttcttt tggtccttta 1980

ccaagcatcc cacagcacgt aatacacata tctcgtttga acatcagaat taaagaaaag 2040

gaaaaggaat cccgcacaga gtggtcgcgt ctacgcctcc atgccaacga cagtaccagt 2100

ctggtcgatc tcgaccttgg ttcgcttcaa gctggcattg cgagggttgg gggcgtcgaa 2160

gatctccttg agctcttcaa gggtctttcc ggcggtctcg acaaagaaga agtagatgat 2220

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<210> 7

<211> 1512

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 7

atgaagggcc tactcagcct gacactcctt ccgctgctgg cagctgcatc tcccacttgg 60

tctgaaacca tccataacgg tgcagctccc ctcatctctt ccacaagtgc caaggagatc 120

ccggattcct atatcgtcgt gtttaagaag catgtcggag cttccgcagc gtctgctcac 180

cacagctggg tgcaggacat ccactcggac aacgtgcgga tggagctgaa gaagcgctcc 240

ctcttcggct ttgaaagcga gccttacctc ggcgtgaagc acaccttcca cgttgcgggc 300

tcgctgatgg gctacgctgg tcacttccat gaggacgtga tcgagcaggt tcgccggcat 360

ccggatgtcg agtacatcga gaaggactcg gaggtccacc actttgagga ccctgccatc 420

gagaagaatg ccccctgggg tctggctcgt atctctcacc gtgacagtct ttcctttggt 480

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cgttccaacg gctcgggtac catgtccgat gtcgtcaagg gcgtcgagtg ggctgcagag 780

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gttgccaaca tgtctctggg tggtggtagc tcccgcactc tcgacctcgc cgtgaacgct 900

gctgttgacg ctggcatgca cttcgccgtt gctgccggta acgacaacgc cgacgcttgc 960

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gagcgtgctt acttctccaa ctacggcaag tgcactgaca tcttcgcacc tggtctgaac 1080

attctgtcca cctggattgg tagcaagtac gctgtcaaca ccatctccgg aacttccatg 1140

gcctcccctc atatcgccgg tctcctggcc tactatgtct ctctccagcc tgcctccgac 1200

tccgcctacg ctgtcgagga gattaccccc aagaagctca aggatgcgct gatcaccatc 1260

gctacttccg gtgctctgtc tgatattccc tccgacaccc ctaacctcct cgcctggaac 1320

ggtggtggtt cctccaacta caccgagatc gtttccaagg gtggctacaa ggctggtgct 1380

tccgagtcca tgaagaagca cctcgatgag cttgttggca aggtcgagga agtgattgcc 1440

aaggagcaga aggtcctgag ccacgagctc ggtgctatct acagcgagat caaggacgct 1500

gttagcgctt ag 1512

<210> 8

<211> 2780

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 8

agtgctagct atataacgcc taaccgcctt ctctttcaca gacaccgttt catattaaga 60

cgatgctcac ctccagtctc aagaaatggc tagcctcgaa acacacgaag tcctcgctct 120

gattagagcc acgatctcga ccctcgaaaa ctcttatgat gtctacagcg acatttttga 180

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ggcactcaaa gccgcaaata aacaggtgcg ggcgatgaag gacgaagaaa tgtgcaaaga 300

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cttgttgact gtaaaggaag agatgacatc agcgactgaa cctcagcttg agcttctgct 540

cgagtctatc aaggaggtat cgacgatccc tccatcgcta tcagttgagg gccagacctc 600

cggttttaac aacttcgggt cgggcactca gaatatcaac actggcagtg gctcccagaa 660

caacaacaat agcaccgggc agcagtttat cggcggaacg tttgggtgct tcaacccctt 720

gcgctcgaaa tagcaagaat attgtcttcc gactcgagat cagcgttctt cttgaatact 780

agcttgacag ctgccgaatg cccgtctaca gcagaagaca gcgccgtcaa gccattcttg 840

tttttttggc tcgcgacttg gggtatacca acgagccagt tgctcttgtc atcatatgta 900

gcccatgatg gcgctgtcat tctgcctggt gatagggtgt tgccaacgta gttctaatga 960

ctcaggtgca ggaaaaggaa atttcacaag gagaaactct cgcgcagttt gatgaaggaa 1020

ataaatattg tcatgatgaa ttgaaacaaa taatctacac caagctctga gacgtgactt 1080

gaagtcctca tctttctcta ggtcgaggtc gtgaatagat tttgatgtgc tgtcaacctt 1140

caacgcaacg ttcattttgt ttgctgtata gtcacgtgat acaccaggat ggatatgtag 1200

atcgcatgtc tcgctcccca atcattctac catcttcatt ctcccttcat cctctctttc 1260

gtactccgta ggcccctctc catcaatcaa caaggaattg cggactggtc cactggtaag 1320

cgccatcgct cccgcacgat gatgttactt gtttcgagct ctgggccgct cttttctcgg 1380

gagcttggac aggagctttg gtcgcctggt tggtctggac tctgcagcgt atcaggtacg 1440

gtccctgacg aactgtccag gagtctttcc cgcttgatcc gggcgcagat cacatgggcg 1500

ggggaaatcg aggtgctcgt gatggtttgg actgtccgca aggtaaattt cgccaccacc 1560

aggagcccct tgaaccacgt cttgcctttt ccattcccat tgcctaggag caaaatcagg 1620

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atctaatggc accctgatta acattattga tgagaggcct cctgaccatt gcgagaggta 2040

aggttcaggt cgatacccgt ccgaatgggg aggatgtctc ccagatctgg ttactgcagt 2100

ccgtcgggtg cgaccaaccc tgggaatccg gagctatctg cagctctgca ctgctgtagt 2160

acagcagaat atttctgccg ttgggtgtca ctggatcatc gccgtattcc agtccaatag 2220

aactgtaggc gcatgctgac cgtacgcatg tgttatttgg ttttttgggg gtaatacact 2280

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agcgtccagt gtctactgtc tagtaccctg tgctggcagc ggagggtaac atgtagtgag 2520

gagtgggtca agcgcaagac gattgggttg cgcagaaacg ggaccagctg attccgggtt 2580

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<210> 9

<211> 2283

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 9

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ttcttccagg ggatcccgag gctagctatt taaggcactc gtccacacac attttcttgt 120

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ttctctttcc atttgtattt gtcgcttctt gttcaagtcc tctggactgt ttgagtctct 300

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gcctctcttg aaactcaaga tctcatagaa gatcccagcc ctttctgtag agcccatgaa 480

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cgaaagcccc tctacctagg acttggatgc atctgataac caaccttgtc acacggccgc 600

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cacttactat ttagtacttt gtagaacttc agctacctac caagttactt actgcaatcc 720

tcggtactta ttggggtgaa aaatgaagag aagatattaa gtagtaagag actaaggtat 780

taagcataat catattatgc acagactcga accatgacga tgcaccaaac ttcatgtcaa 840

gttatcggtg tatatgaaga ctggtgtgca tatgcagtca agcgggggta gagttacagc 900

tctcgtctct gagagatcct acaaaatcat cataatatac acatttacct tacttttcat 960

gtgaatggta cctactactg gtagcactgt gagtactgca gtgtgaagta tgcagtgtgc 1020

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cacgcccgtt tgtttcaagc cgagagacct cgaccacgtc cggccctttc atcctttctc 1260

cgtgcaaaaa acccgcccac caactggcac tccccaaccc acaacgaccg tagtcaccgt 1320

acggtttacc tgaaacagct ggtcgctctt ctttccacgc accttatccg cccccaaaaa 1380

taaaacacac gtcccgttca ccctagctcc acgtacgtct cccgatctcc acttcccatg 1440

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caa 2283

<210> 10

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<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 10

atgaagtcct tcactctgct cacagcctcg gcgctgttgg gcgctgcctc tgcggaggtg 60

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ctgtgggtac cctcgtcgca gtgcacctcg attgcctgct tcctccacag caagtacgac 480

tcgtcctcgt cgagcacgta caagaagaac ggaaccgagt tcgctatccg ctatggatcc 540

ggtagcctaa gtggtttcgt gtcccaagac accctgaaga tcggcgacct ggatatcaag 600

caccaggatt tcgccgaggc cacccaggaa cctggtctcg cctttgcctt tggccgcttt 660

gacggcattc tgggtcttgg cttcgacacc atctctgtta acaagatggt gccgcctttc 720

tacaacgccc tggaccaggg tctgctggat gagcctgtgt ttgccttcta ccttggtgac 780

accaacaagg agggagatga ctcggtggcc acctttggtg gtgtcgacaa gagccactac 840

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<210> 11

<211> 2532

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 11

cactccatcg tcagcagatc atcgatgtgt tgtggaaatg gtgtggctcg gacagccatg 60

gcagttgatg cggctttgat cctctccacc accaaagcct ttccgtgcct ctcaatcgca 120

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acctggtgcc gcgttggccg aatgggcccg aacgaacact ccatgctctg gcttttggtg 300

gaggacgttg cttcttccac acctagtact ggtacctgcg cttagtccac cctttgatga 360

gtattggccg cgcagactca gaatgtgatt cgcggtcacg cactcaccct gtacccggta 420

ctgtacatag cttatttcag gcggcggtta tgatcatgca ggtgcggatt acgggtcagc 480

ccttcaaagc accgtgaacg cactcgcgtg taaggttgtt tgcagcagcg agtgatatta 540

ggcaggcacc cccaaacgct cgccgcatgt ggtggcttgt cgattgagct cctgcaggga 600

cttttaaccc ccgatggcgc ctttcgatac cttaatcagg aataaatact gaaggtttcc 660

aacacctcga atctatcttg aaccgtgcac ggtgtcacct ccccaggatg taaaaaaaaa 720

agaaaaaacc cgatcccttc ttcctgggtc gccgggtcta ttgtctcgag tattttcatg 780

gtccttacta caggcaatgg tcttcatccc ccgatttgaa cggtgtgcga atgcattgcc 840

catgcgttac gtcgcatggg acagacttct caaatggcgg tatatctctc tgtgcgctca 900

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cgggtcatca aggtttccgt gaatgcctac tcttgttgaa atcatgatcc ttgttcttgc 1140

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attgttcttt tgcttgcccg ctcggagcaa actcgccgtc tacgagggtt gtctatgagc 1620

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ggaggtcatc actcgcatag tcgccatcgg tcctcttgtg cacaccaaaa gtcattctct 2040

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ccgggagaca gggcccacgg cctgtatagc ctcggagaga ctcgtcgttg agtcttactg 2400

gactgaggtt tataatcttc gttgtcggct tgcttgctgt ccccgggggg cttttcttct 2460

tcagtaccag cttgttttgc atgccgtatc tccccttgta ttcgtcgcag aggagaccgt 2520

tgaattgcac gc 2532

<210> 12

<211> 2565

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 12

gtctggagat ttggagggct ggaggtggag tacgcttttc gccctctttg ctgttgagac 60

cgtggccggg cagctcccga gtttcccgag caacaagcgt cgaaggaaaa gaaaaaaaaa 120

atctttgcat gggtagtatg gaggacagga cgcgatccca tcggggcgag atttgctctt 180

caccattttt ttcacgtgta gatctctcaa aagaaatcat gagaaggcgg aattcagcga 240

gtagcagcag ccacatcagc ctcacctgcc tgcacctgat tggtatgtac ctaattcaga 300

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agtagtcacc aaggtagcgt aaggactaca tacggaggag atagatcagg aagtccatcg 420

catgtcagca ggtggcgggg aaaacaattc cccccgatcg cgatgcatga catcaatgcc 480

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agccaccccg tttcaacaag tttatttggc tctccatctt tgtaggggtc aaaacggcaa 720

atggatgtcc cacatggcgt cagtaatata gtcattggag tcaataaact gcccttcttt 780

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tgactccgct gtccgctcgt gcaacagcca tgactcagct tcccaagagc aaggcccgtg 2220

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aatactgcca aaagaagggc attcacatca ctgcttattc agtatgtcga tgtttgccac 2400

ctaccctctg gtctccgcgc gaggaagaaa acttgacaga cactgacgac tggtatccga 2460

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<210> 13

<211> 1947

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 13

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<210> 14

<211> 1900

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 14

cgttctaaat cagaaaatcg tctagaataa tcaaagggac atacttagtc agatatgcag 60

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cttttcgtgt cttgatcatc gtcctgtgac agcgagcgtt ttgaatacga cgttgtacat 300

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caacactcac gggctagaca aactggacag cctcgaatat actctgttgc ctattcctcg 420

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<210> 15

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggcaatatca tcaaggtgca tggggcgtct accccgcata ctcacatcca ccctggaaaa 1440

aacccgagac cctttgacat ctgcaactcg gtgaagaatg caagtttctc atctatcgcg 1500

gcgacgctta ccggtttggg actccccgtg gtgcttaagg cccgaagcga tggcgacagc 1560

ccctgacgaa gcggagcaga agttgcagga tccaattgcc ggtgtatgcg ggcgtcctgg 1620

ggtacatggc cctttttggc caggggttct tttcatgtgg atgatatact cccattctgg 1680

gatagggtgt acttcaaagg cctactattc gcctgcagat caagatttgt tgcagtcacc 1740

ttgcagatat ccctggagaa agtgggattc ttcactctcc aaccctccgc gccatttcga 1800

gatagtatgc cgtgcccgtt agggctgtcg gaatgaagcc taaggggaaa cagactcgga 1860

tggactgtca aaatttgggt atatatacca ttagttgaga ccgccagatt cgagatcttt 1920

tttttgtctt tcttccaagc agatcaggct cgacttcttc attgacaatc aacgatagac 1980

acgacaaatt cctgatcacc 2000

<210> 19

<211> 2000

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 19

gtgaccagca tctaaccaag ggtgctttga ctgctttctt ttgggacccc cgacgatcgc 60

ggtaccctgt actgtacgat acagaaccac cgcgagggat gacggatgaa cggcgcgatg 120

cactcccaca gttctaggct cttgcccctt gcaacgtgat ggtcatttac accagttgtt 180

tacagcaacg ggttggtgtt gatggtggat cgtggtgggt gaagtgcatg gacggttcag 240

gggcaaaggt ggagacactg gcgggcccat cgagccggac atgaatggct cgggcgcggg 300

gggttgtcgc caggaacggg tagtgggtca cctcgaggga gcggtggatt ggtggaggag 360

tcgaaatgtg acgcgggctg aaactcgcta attgatcatg gtccctcttc gtctcgacgt 420

gcactcggcg taatctgctg gtggatttaa gagtctcacc tcttcattca tgaggtcagc 480

ttttgcgatg ataccgtacc tacacaaatg agcgtcaaga actcaagatg aagcaaactt 540

ccctagtcaa cagatccgag agttaataat gactttaaag gtcaccgtcc ttgttgtgga 600

catatgttgc gggtcatgga cacctggaca gtgcccgact ggagtatgta ctcattgagg 660

caacattaca gtagtgtgtc cactacgata tgtatgcatc cgttggtagc agacatagca 720

tccttttcaa ctgtttgcta cataagtacc taaggatatg ctgtagcaat ttggccttgg 780

tctggcctgc gctcatcgac cagacggcat ccactgactg gcgagccctc catgattgag 840

cacatgaggg aagaagacct cagttaccca agaaagctac aattctttgc tctcaacata 900

tccctgctga agtcgcagag catcatccag gcattctgtt gaccctgctg tgtagactag 960

tgtgcgttga tagatgcagt catgcaaaac aagcagctga ttgaggaggt gtgcagccct 1020

gcgccacgta ccacagaggc atcgatcgta tcatgcgttc attacagtaa gatgtaatga 1080

tacatggctt tactgtacaa gcggtgtctc atacggcctc ctcacctcat gtgactccgc 1140

tgacgtccac aacctccaca gactttcatt gcaactttct cgacacggca ccagtcatct 1200

tgcacgttca gcatgatcgg tgacctcgac gagtaagctg tcgaggcgca ggatgctagt 1260

gactccccaa tccaccacgg gctcagtcgg tacagcgaga tggcgccccc cccacgcgcc 1320

ctgtgacacc aatcaagaac ccgtagttcc tgtggctctg tgggtcagga tcaatcaggg 1380

ctgtgcgatt gattcaacgg gaaatcaggt acagacaaca agagtttagg ggcggcaaac 1440

caatgcaggt accacagtcc catattctcg tatgcttcga gtacgaaaga ccaaagtaaa 1500

agtggttttt gaccgcaaga tggtaggtac ttgatactct ccccacctcg aacgggcctt 1560

tgggtgcgac cagagcgcta gctcgcgaag atggggtccg ctgggccagc gtgcagtagc 1620

ccctgtgcaa gtgggaggtt ccagaactcc ccatctcgag tcagactcgc atcacatcaa 1680

cacccccccc cccctttttt tttaaggggg cccagagaga gtaagagaga gagagtgagt 1740

gattggaccc gccgatcaag cagcctaatc tccctgttca tacaaagggc ccccgactcc 1800

cccccgtgct ctcttcctct ctttctttct tctccaagtc catacttcgt tgccatcgca 1860

tcagtcactc tctcgacttc ggtcatccac tctttaccaa ctactacact ctttgcctca 1920

aaaagccttc gcttttttaa atcgcctttt tcaaatcacc tgaacggttt tatcttccat 1980

ttcacccacc aacattcaaa 2000

<210> 20

<211> 2000

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 20

tctgtcaaaa ttattttgag acgttttaaa aaaaaattcc cccaattttg tattttattt 60

ttgacacctg gtggttgatt tggccccttt acaattagcg tgacttgttc ttgatggatg 120

acgggagttc ttgcagatgc tctgcacttc tgcagagcga ttcttctcca aatacttgcc 180

cgagtcatct gatgttaaaa aaagctactg acggactcta agctcactgg tcactttcac 240

agcgttttcg gacattggga gatacgtgat tgatattgaa tccgatcaaa tgtcgagatc 300

attttgcagg aagaaagaag acaagaaatc cagtagatca agctcttgtc tctgagcgag 360

ataatatgaa tacatctcaa acttccctct tcaaagagta gacgagcttt aaacagagtt 420

aatgcacgga aatattaagc cttctgagta aaacaatcgc atatagtcgt ccacgtaggc 480

agagagagac gctcggcgcg tagaggaaag cacgtgagag ccccgtgagc tccggagcac 540

ccaagagggg aagagcctcg aggatgaaac ttagcacttg gacttaactt gtggcggaga 600

accaggcgcc tggtggtgca acgatctcat ggcctcttcc tcccccccgc catgccgccc 660

cgttcaggca catggtttca tatctttcga tgattcttag cagaacatta cccgagacac 720

ctcagatccg atctaagaca ccgttcgggc acactaagtc cagtctcggc ggatcagact 780

ccaccgaata ggccccaaac ccccaactcg acactccctt cctctctccc aagctcgcga 840

tcaaggtcgc aacaatggct ccatcaagca tatcatgctg acactcgcat ctccagttgc 900

ggccccctcg aaagtcgagc cgtgaggatt cgggaggtca aaagaggacc cgacactccg 960

tcttgggtcg catagcacat gccccggtcg catggttaat gagtgttaca tttgtagacc 1020

gcgcgggtga tgcgttcctg cagctcgcac cgacgagggt ggcctctaaa caatctcatt 1080

cgtcaagctt gcagccgagt gaataatcct gaacaatctc ggctgtagcg ttatcgaccc 1140

tttttttggt ggtcaacgcc tccactcccc ccacccccac tgtgatcaag ttacatcgag 1200

acaagagact ggcattccgt gaagatgggc ttgtcctcgg tgggcgacga aggaaagatc 1260

ggagaatgca acatccgcga ctgagatgcc aggtgaacgg cagacacatt agagttcact 1320

caactttttc agagttaccc ctgacaaaga tcgagcgtga tctgccacag gctgtcggcc 1380

atcggccatg cagaacacca agagtatcta gcatcagcaa tgagtgggac cgtgcgcatc 1440

cttaacgtcc acggtctagg tcggcgtcac atttcgcaag tttggagcgg tccctggtct 1500

tttcttcctt ccagcgcttc gagtgcattc accggtgacc ttcatctgtt gcatgggtca 1560

tgacccgatg gcccctttgc agccaccaga aatgtgaccg ttcctcgtcg acagcctcag 1620

ccactgaaac ggtggtgatc gcattggcca tgagcagaca acgagtgccc ccgatcttcg 1680

tttcggttac cgaaattaga aagcttacat gggagcgtga gcaagtggaa cccaacttgg 1740

tatcgtcaac tcgttgagct catttcgcaa aatgacctgg tagagagagg gtgtcttttc 1800

tttggaggtg aagcagacca cgttgctggc ttgggtccgg tgagcacaag ggctgctata 1860

gaggtggtgg ataaagcgcg agtgcgaaac atacaaatat actggtattt cccaacctgg 1920

cttcctttca atttctccaa caccagagtc gccggatcga ccagacattc cctcgagata 1980

cttccaacca ctcctttacc 2000

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 21

atgtctcgac ttctctacgc actgggtgcg ctggccgtgg gtcaatctgc cctggca 57

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 22

atgaaattcc ttggactagc tgctttgttt cttgcccaga ccgtggcggg tctgacggct 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 23

atgaagggtt ccatctccta ccagatctac aagggggctc tcctcctctc ctccctgctg 60

<210> 24

<211> 1869

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 24

gctcctcagc tgtctcctcg tgccactagc ttggattcct ggttgtcttc cgagaccact 60

ttctctctca atggtatcct ggccaacatt ggctccagcg gtgcctactc caagagtgcc 120

gccagtggtg cggtcattgc cagccctagc acatccaacc ctgactatta ctacacctgg 180

acccgcgacg ctgcgcttac tctcaaagcc cttgtggata ttttccgtaa tggaaacctg 240

ggactccaga ccgtcattga gcagtatgtg aacgcccagg ctaagctcca gacggtttcc 300

aacccttctg gaggcctctc tgatggcgcc ggcctcggtg agcccaagtt caatgtcgat 360

ttgagcgcct tcaccggtgc ttggggccgc ccccaacgcg acggtcctgc tctgcgcgcc 420

attgccttga ttgactttgg taactggttg atcgacaatg gatacaagag ctatgcggtc 480

aacaatgtgt ggcccattgt tcgcaacgac ttggcctacg ttgctcagta ctggagccag 540

tccggctttg atctctggga ggaggtcaac agcatgtcct tcttcaccgt ggcgaaccag 600

caccgctccc tggtcgaggg tagcgctttc gctagccgtg tcggcgcctc ctgctctgga 660

tgcgactcgc aggctcctca gattctctgc tacatgcagt ccttctggac cggctcctat 720

atcaacgcca acactggcgg tggccgctcc ggcaaggact ccaacaccat cctcgccagt 780

attcacacct ttgaccctgc ggcctcgtgc gacgacgtca ctttccagcc ttgctcttcc 840

cgtgcccttg ccaaccacaa ggtgtacacc gactctttcc gctccgtcta cgctctgaac 900

tccggaattg cccagggcaa ggccgtatct gtcggccgct accccgagga ttcctactac 960

ggcggcaacc cttggttcct gtccaacctc gccgcggccg agcagctcta cgatgccatc 1020

taccagtgga acaagatcgg ctccatcacc attaccagca cctccctcgc tttcttcaag 1080

gatgtgtacc cctccgctgc gacgggtacc tacgcctctg gcagcactac cttcaatgcc 1140

atcatcagcg ctgtgaagac ttatgccgac ggctacgtca gcattgtgca atcccactcc 1200

tacgccaacg gctctctttc cgagcagttt gaccgcacca cgggtctctc catctccgct 1260

cgtgacctca cctggtccta cgctgcgctc ctgactgcca acgaccgccg caacggtgtc 1320

gtccctccct cgtggggcgc tagctctgcc aacagcattc ccggctcgtg ctccatgggc 1380

tctgccactg gttcgtacgc cactccttct gttggctcct ggcccgctac tttgaccagc 1440

ggcaccgctg ctccttcgtc tacgtcgacc accacgaagg cccccaccac caccaccgcc 1500

accaccacca cttctgccgg ctcttgcacc acccccaccg ccgtcgctgt gaccttcgat 1560

gagattgcca ccaccacctt tggtgagaat gtctacctgg tcggttctat ttctcagctc 1620

ggtaactgga acaccgccaa cggtattccc ctgagcgcta gcaagtacac ttcgagcaac 1680

cctctgtggt acgccacggt caacttgccg gcgggtacca ccttccagta caagtacttc 1740

cgcaaggaga gcgacggttc catcaagtgg gagagcgacc ctaaccgctc ctacaccgtc 1800

cctgccaagt gcggtaccac tactgctacc gagaacgaca cctggcgcca ccaccaccat 1860

caccactaa 1869

<210> 25

<211> 395

<212> PRT

<213> Penicillium oxalicum

<400> 25

Met Val Val Phe Ser Lys Val Thr Ala Val Leu Ala Ser Leu Ala Val

1 5 10 15

Val Ser Ser Ala Met Pro Thr Gly Asp Ala Ala Lys Ala Ser Pro Lys

20 25 30

Ala Asn Phe Ser Ile Lys Gln Thr Val Arg Pro Gly Ser Lys Lys Val

35 40 45

Val Asn Leu Pro Ala Met Tyr Ala Ala Ser Ile Ala Lys Tyr Gly Gly

50 55 60

Lys Val Pro Gln Ser Val Lys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ile

65 70 75 80

Thr Thr Pro Thr Glu Asn Asp Glu Glu Tyr Leu Thr Pro Val Thr Val

85 90 95

Gly Gly Ser Thr Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu

100 105 110

Trp Val Phe Ser Ser Gln Leu Pro Ser Ser Glu Thr Gln Gly His Asp

115 120 125

Ile Tyr Arg Pro Ser Arg Asn Ala Arg Lys Leu Ser Gly Tyr Thr Trp

130 135 140

Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Asn Val Tyr Lys

145 150 155 160

Asp Thr Val Thr Val Gly Gly Val Thr Ala Ser Ser Gln Ala Val Glu

165 170 175

Ala Ala Gln Thr Val Ser Gln Gln Phe Val Gln Asn Ala Gly Asn Asp

180 185 190

Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Gln

195 200 205

Ala Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr Val Gln Ser Gln Leu Asp Ser Pro

210 215 220

Leu Phe Ala Val Thr Leu Lys His Asn Ala Pro Gly Thr Tyr Asp Phe

225 230 235 240

Gly Phe Ile Asp Asn Ser Lys Tyr Thr Gly Gln Leu Ala Tyr Thr Pro

245 250 255

Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe Trp Ser Phe Thr Ala Asp Ser Tyr Ser

260 265 270

Ala Gly Ser Ala Gln Gly Gly Ser Ile Gln Gly Ile Ala Asp Thr Gly

275 280 285

Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp Asp Ser Val Val Asp Asn Tyr Tyr Ser

290 295 300

Gln Val Glu Gly Ala Asn Ser Asp Ser Ser Ala Gly Gly Ile Thr Val

305 310 315 320

Pro Cys Asp Ala Gln Leu Pro Asp Phe Val Val Ser Ile Ala Gly Tyr

325 330 335

Asp Ala Val Val Pro Gly Ser Leu Ile Asn Tyr Ala Pro Leu Ser Gly

340 345 350

Asn Thr Cys Phe Gly Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Ile Gly Phe Ser

355 360 365

Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asp Ala

370 375 380

Ser Gly Pro Gln Leu Gly Phe Ala Ala Gln Ala

385 390 395

<210> 26

<211> 641

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 26

Met Ser Arg Leu Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Leu Ala Val Gly Gln Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Gln Leu Ser Pro Arg Ala Thr Ser Leu Asp Ser

20 25 30

Trp Leu Ser Ser Glu Thr Thr Phe Ser Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Ser Gly Ala Tyr Ser Lys Ser Ala Ala Ser Gly Ala Val

50 55 60

Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr

65 70 75 80

Arg Asp Ala Ala Leu Thr Leu Lys Ala Leu Val Asp Ile Phe Arg Asn

85 90 95

Gly Asn Leu Gly Leu Gln Thr Val Ile Glu Gln Tyr Val Asn Ala Gln

100 105 110

Ala Lys Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser Gly Gly Leu Ser Asp Gly

115 120 125

Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Leu Ser Ala Phe Thr

130 135 140

Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Ile

145 150 155 160

Ala Leu Ile Asp Phe Gly Asn Trp Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Lys Ser

165 170 175

Tyr Ala Val Asn Asn Val Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu Ala Tyr

180 185 190

Val Ala Gln Tyr Trp Ser Gln Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val

195 200 205

Asn Ser Met Ser Phe Phe Thr Val Ala Asn Gln His Arg Ser Leu Val

210 215 220

Glu Gly Ser Ala Phe Ala Ser Arg Val Gly Ala Ser Cys Ser Gly Cys

225 230 235 240

Asp Ser Gln Ala Pro Gln Ile Leu Cys Tyr Met Gln Ser Phe Trp Thr

245 250 255

Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp

260 265 270

Ser Asn Thr Ile Leu Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Ser

275 280 285

Cys Asp Asp Val Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ser Arg Ala Leu Ala Asn

290 295 300

His Lys Val Tyr Thr Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ala Leu Asn Ser

305 310 315 320

Gly Ile Ala Gln Gly Lys Ala Val Ser Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp

325 330 335

Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Pro Trp Phe Leu Ser Asn Leu Ala Ala Ala

340 345 350

Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Asn Lys Ile Gly Ser Ile

355 360 365

Thr Ile Thr Ser Thr Ser Leu Ala Phe Phe Lys Asp Val Tyr Pro Ser

370 375 380

Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn Ala Ile

385 390 395 400

Ile Ser Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly Tyr Val Ser Ile Val Gln

405 410 415

Ser His Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Leu Ser Glu Gln Phe Asp Arg Thr

420 425 430

Thr Gly Leu Ser Ile Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala

435 440 445

Leu Leu Thr Ala Asn Asp Arg Arg Asn Gly Val Val Pro Pro Ser Trp

450 455 460

Gly Ala Ser Ser Ala Asn Ser Ile Pro Gly Ser Cys Ser Met Gly Ser

465 470 475 480

Ala Thr Gly Ser Tyr Ala Thr Pro Ser Val Gly Ser Trp Pro Ala Thr

485 490 495

Leu Thr Ser Gly Thr Ala Ala Pro Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys

500 505 510

Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ser Ala Gly Ser Cys

515 520 525

Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Ala Thr Thr

530 535 540

Thr Phe Gly Glu Asn Val Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly

545 550 555 560

Asn Trp Asn Thr Ala Asn Gly Ile Pro Leu Ser Ala Ser Lys Tyr Thr

565 570 575

Ser Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Ala Thr Val Asn Leu Pro Ala Gly Thr

580 585 590

Thr Phe Gln Tyr Lys Tyr Phe Arg Lys Glu Ser Asp Gly Ser Ile Lys

595 600 605

Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Lys Cys Gly

610 615 620

Thr Thr Thr Ala Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg His His His His His

625 630 635 640

His

Claims

1.一种工程菌，是将特异DNA分子通过同源重组取代草酸青霉基因组DNA中PoxPepA蛋白酶的编码基因得到的；所述特异DNA分子中具有特异表达盒，其中启动子为启动子pPoxEgCel5B，启动编码特异蛋白质的基因的表达；

所述PoxPepA蛋白酶为序列表的序列25所示的蛋白质；

所述启动子pPoxEgCel5B如序列表的序列14所示；

所述特异蛋白质为（b1）或（b2）：

（b1）序列表的序列26第1至635位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b2）序列表的序列26所示的蛋白质；

所述草酸青霉为突变体∆PoxKu70。

2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述编码特异蛋白质的基因自上游至下游依次由如下两个区段组成：序列表的序列21所示的DNA区段，序列表的序列24所示的DNA区段。

3.草酸青霉（Penicillium oxalicum）OXPoxGA15A，其保藏编号为CCTCC No.M2017794。

4.权利要求1至3中任一所述工程菌在生产生淀粉糖化酶中的应用。