JPS61162177A - セルラ−ゼの生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、トルナフテートに対し耐性をもつアクレモニ
ウム・セルロリティカスＴＮ　（Ａｃｒｅ■ｏｎｉｕ鵬
ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　ＴＮ）株によるセルラ
ーゼの製造方法に関するものである。

〔従来技術〕

セルラーゼはセルロースをグルコース、セロビオースや
セロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系を触媒する酵素
群の総称であり、その作用株式によりＣ１酵素（アビセ
ラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ＦＰアーゼ、エキソ−
β−グルカナーゼなどともいう）、Ｃｘ酵素（ＣＭＣア
ーゼ、エンド−β−グルカナーゼともいう）とβ−グル
コシダーゼ（セロビオースともいう）など種々の名称で
呼ばれる酵素が存在する。セルラーゼはこれら複数の酵
素が調和のとれた相互作用をすることによりセルロース
を、最終的にその構成糖であるグルコースにまで分解す
る。

近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用の観点か
ら注目され、盛んに研究されているが。

従来、よく研究されてきた、トリコデルマ・レーゼイ（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ＋ｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデ
ルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ
）やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属などの微生物
によるセルラーゼの生産は、その生産能力が充分でなく
、また、セルラーゼ自体の分解力も充分でないため、セ
ルロースを完全にグルコースまで分解することができず
、セロビオースやセロオリゴ糖を多量に生成残存するな
どの問題があった。

本発明者らは、先に結晶性セルロースに対する分解力が
優れ、且つグルコースの糖化能力の優れたセルラーゼ生
産菌を求めて、広く自然界から微生物の検索を行ってき
た結果、土壌中より分離し。

アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉ
ｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）と同定した糸状菌
の生産するセルラーゼが、結晶性セルロースに対する分
解力が強いこと、またこの酵素はβ−グルコシダーゼ活
性が、従来よく知られているセルラーゼ生産菌に怖べ著
しく強いため、セルロースを、殆んど完全番こグルコー
スにまで分解できる、極めて糖化性の−れた酵素である
ことを認め、特許出願した（特酢出願番号昭５８−３８
４３２）。

〔目　　的〕 更に、この微生物によるセルラーゼの生産能を高めるた
め、本微生物の改良について種々検討を加えてきた結果
、トルナフテート（Ｔｏｌｎａｆｔａｔｅ（ｍ、Ｎ−Ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌ　　ｔｈｉｏｃａｒｂａｎｉｌｉｃ　　
ａｃｉｄ　　０−２−ｎａｐｈｔｈｙｌｅｓｔ、ｅｒ）
　）に対して耐性を示す突然変異株（ＡｃｒｅＩＩｌｏ
ｎｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔ、１ｃｕｓ　ＴＮと命名
）がセルラーゼ生産能を顕著に増大していることを認め
た。第１表は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏ
ｌｙｔｉｃｕｓの親株とＴＮ株によるセルラーゼ生産能
の一例を示している。

第１表 ・表から明らかなように、トルナフテート耐性突潰・変
異ＴＮ株のセルラーゼ生産能は、！５！株に比ペアビセ
ラーゼとＣＭＣアーゼで約３倍、そしてβ−グルコシダ
ーゼは約２倍になり、これらいずれのセルラーゼ成分も
著しく増強されたものであった。

本発明以前に、トルナフテート耐性をマーカーとして耐
性変異株を造成し、セルラーゼはもとより、微生物生産
物の生産を増強した例は知られておらず、本発明はその
最初のものである。

〔構　　成〕

本発明は、セルラーゼ生産能の増強されたトルナフテー
ト耐性をもつアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃ
ｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓＴＮ
）株によるセルラーゼの製造方法に関するものである。

以下に、本発明の内容を更に具体的に示す。

本発明のトルナフテート耐性株は以下のようにして造成
される。

アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＢＭＰ　−６
８６７）をツアペック（Ｃｚａｐｅｋ）培地（ＮａＮｏ
　３０．３％、に２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０５Ｘ１０−　”％、　ＫＣΩ５Ｘ１０−’％。

ＦａＳＯ４・７Ｈ２０１Ｘ　１０−　’　％、グルコー
ス１％）に懸濁し、これにＮＴＧにトロソグアニジン）
をθ〜３Ｘ１０−”勇一度となるように加え、室温で０
．５〜３時間イン−ｖｈベート後、遠心分離して菌体を
回収し、　Ｃｚａｐｅｋ培地で１充分洗滌後、同培地に
懸濁した。該菌懸濁物の・部を４×１０″″２〜２Ｘ１
０−’　％トルナフテートを含むＣｚａｐｅｋ平板培地
（ＮａＮＯ３０，３％、Ｋ　２　ＨＰＯ４０，１％、Ｍ
ｇ５０４・７Ｈ２ｏ　５Ｘ１０−　”％、ＫＣＱ　５Ｘ
１０−”％。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１ＸＩＯ−”％、グルコース１％
、寒天１．５％、ストレプトマイシン２．５Ｘ１０−”
　％、ペニシリンＧ２．５Ｘ１０−”％、ＰＨ５，６）
に散布し、３０℃でインキュベートした。生育してくる
トルナフテート耐性株を上記同組成の斜面培地に釣菌し
保存した。このようにして得られたトルナフテート耐性
株中に、高頻度でセルラーゼ生産増強株が認められた。

なお、　４Ｘ１０−　”〜ｌＸｌ０−”％のトルナフテ
ートを含むＣｚａｐｅｃｋ平板培地上に親株および耐性
株の菌体懸濁液を散布して、３０℃で培養したところ、
耐性菌は比較的良好に生育するが、親株は全く生育、席
作められなかった。

１菌の菌学的性質は親株に対して認識できるはｍ−４差
異は認めら札ないが、以下にＴＮ株の菌学的仕置の概要
を記載する。

生育：麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、３０℃７
日で直径７０＋＊ｍに達する。集落は最初白色で後にや
や黄色味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り上がり羊毛状
を呈し、時に編状の菌糸束を形成する。培養後期には集
落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈する。ツアペック寒天
培地上でもほぼ同様の生育を示すが気生菌糸の盛り上が
りはより少い。

生育ｐＨ範ＩＩ　！ｔ、３．５〜６．０テｊｉ適ｐＨＩ
ｔ４付近、生育温度範囲は１５℃〜４３℃で、最適生育
温度は３０℃付近である。

形態：菌糸の直径は０．５〜２．５μ■、無色で菌糸に
は隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面である。

分生子二分生子形成能は非常に不安定でツアペック寒天
および麦芽エキス寒天培地による継代培養により容易に
消失した。分離時における観察では、分生子柄は気生菌
糸側面より突出し、無色である。

分生子は亜球形（２，５〜５×２〜４．５μｍ）で滑面
、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。

ネ菌株はアクレモニウム・セルロリティカス（！ｍ、）
ｅ＋ｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｔ
Ｎ株（微工研条寄第：＜ｃ崗＄とじて寄託されている。

４菌により生産されるセルラーゼの酵素的性質を以下に
記載する。

（Ａ）アビセラーゼの酵素的性質 （１）作用 セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶性の高い不溶
性セルロースに対し作用してグルコース。

セロビオース等の還元糖を生成する。

（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ 本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８．最適作用ｐＨは約４．
５に認められた。

（３）安定ｐＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約６であった。

（４）作用温度範囲及び最適作用ｐＨ 本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％−４”
Ｆｔ　Ｉセル、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ旧、５）の下
で１ｏ分間迩苔１させたときの最適作用温度は約６５℃
に認めら一杯１シ。

（５）熱安定性 本酵素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で、
各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃
までの温度ではほとんど失活せず、６５℃、１０分間の
加熱で約５０％、そして７０℃、１０分間の加熱で約８
０％失活した。

（６）阻害剤 各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される。また、ＳＨ阻害剤で
あるパラクロルマーキュリ−ベンゾエイトによっても１
ｍＭで８０％の阻害を受ける。

（７）精製法 本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコンＨＩ　
−Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＲ−セファロ
ース（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィー
（ＮａＣｆｆｉ　Ｏ→ＩＭグラジェント）と同カラムに
よる再クロマトグラフィー（ＮａＣＱ　Ｏ→０．６Ｎ）
により、より精製することができる。

（８）分子量 Ａｊｏ−ｇｅｌ（Ａ　０．５ｍ）カラムによるゲル濾過
法によＪψ緬定した分子量は約１４０，０００であった
。

・“Ｉ！−Ｉ＃ｂ活性測定法 、ｃｔ、ｔＭ酢酸緩衝液に０．５％濃度のアビセル懸濁
物（ｐＨ４，５）０．５ｍ　Ｑに適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量１．０爾１２とし、　５０℃で反応を行っ
た。そして生成する還元糖はソモギー・ネルフン法によ
り測定した。

この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。

（Ｂ）ＣＭＣアーゼの酵素的性質 （１）ＣＭＣアーゼの多成分性 ＣＭＣアーゼはディスク電気泳動的に少くとも４成分に
分離され、それぞれは分子量と等電点により区別される
。ＣＭＣアーゼ■は分子量約１６０，０００で等１−勺
５．０８．以下同様に■は約１６０，０００．４．９５
．　ｍ″！祠１２０，０００．４．６０．　ＩＶは約１
２０，０００．４．４８であり、魂Ｎらアイソザイムの
複合物よりＣＭＣアーゼは成っ−１−一る。

（２）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の可溶
性セルロース誘導体に作用し、これをグルコース及びセ
ロビオース等に分解する成分（ＣＭＣアーゼ■および■
）とグルコースを極くわずかしか生成せずセロビオース
以上のセロオリゴ糖に分解する作用を持つ成分（ＣＭＣ
アーゼ■、■）が存在する。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ ＣＭＣアーゼ複合体の作用ｐＨ範囲は、はぼ２〜８にわ
たり最適作用ｐＨは約４．５に認められた。

（４）安定ｐＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定ｐＨ範囲は約３．
５〜約６であった。

（５）作用温度範囲及び最適作用温度 このＣＭＣアーゼ複合体は約９０℃までの高温に作用す
るが、１％ＣＭＣ，０，０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
）の下で１０分間反応させたときの最適作用温度は約６
５℃に認められた。

（６）熱安定性 軸素を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で、各
温層辿ル分間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃ま亡
゛一度ではほとんど失活せず、６５℃、１０分間の萼穐
涛約４０％、そして７０℃、１０分間の加熱で約７０・
　％失活した。

（７）阻害剤 各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよび
銅イオンにより強く阻害される。

（８）精製法 本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコンＨＩ　
−Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、　ＤＥＡＥ−セファ
ロース（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィ
ー（ＮａＣＱＯ→ＩＭグラジェント）と同カラムによる
再クロマトグラフィー及びクロマトフオーカシングによ
り各成分に精製できる。

（９）活性測定法 ０、１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％ＣＭＣ溶液（ｐＨ
４，５）−−ｔに、適量の酵素液を加え、蒸留水で全量
１ｘｕｋとし、５０℃で反応を行った。そして、生成す
テ上元糖はソモギー・ネルラン法により測定しＥ。

この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１雫位とした。

（Ｃ）　　β−グルコシダーゼの酵素的性質（１）作用 サリシン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラ
オース、セロペンタオース、セロヘキサオースのような
セロオリゴ糖に作用して、これをグルコースに分解する
。また１本酵素はアビセルのような高分子セルロースに
も作用するがＣＭＣやＨｌＩＣ（ヒドロキシエチルセル
ロース）にはほとんど作用しない。サリシン、セロビオ
ース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタ
オース及びセロヘキサオースに対するＫｍ値は、それぞ
れ３．４０．２．２６．１．１９．０．８２．０．５２
そして０．５１℃阿であった。

（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ 本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８、最適作用ｐＨは約４．
５に認められた。

（３）安定ｐＨ クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間ノ＃
イしたときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約５であった。

０Ｂ作用温度範囲及び最適作用ｐＨ 本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％サリシ
ン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で１０分
間反応させたときの最適作用温度は約６５℃に認められ
た。

（５）熱安定性 ０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の下で、各温度で
１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６５℃までの高
温ではほとんど失活せず、７０℃、１０分間の加熱で約
４０％失活し、そして８０℃、　１０分間の加熱で９０
％以上失活した。

（６）阻害剤 各種重金属イオンのうち１＋ｓＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される。また、グルコース−
δ−ラクトンは基質に対して拮抗阻害剤として作用する
。

（、；７）　　精製法 本酵素は培養濾液からホロファイバー（アミコ°シＨＩ
　−Ｐ５）により脱塩濃縮したのち、ＤＥＡＥ−セファ
ロース（ＣＬ　−６Ｂ）によるカラムクロマトグラフィ
ー（ＮａＣＱＯ→ＩＭグラジェント）とクロマトフオー
カシング（ｐＨ６→４）とＢｉｏ−ｇｅｌ（Ａ　０．５
ｍ）によるゲル濾過により、電気泳動的に均一なまでに
精製することができる。

（８）分子量 Ｂｉｏ−ｇｅｌ（Ａ　Ｏ，５ｍ）を用いるゲル濾過法に
より測定した分子量は約２４０，０００であった。

（９）活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％サリシン溶液（ｐ
Ｈ４，５）０．５ｍ　Ｑに適量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１．ＯｍΩとし、５０℃で反応を行った。そして
生成するグルコースをソモギー・ネルラン法により測定
した。

この条件で、１分間にｌμｓｏｌのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。

トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・セルロリテ
ィカスＴＮ株の培養は、炭素源として、セルロース、ア
ビセル、綿、バガス、小変動のような純セルロースまた
はセルロース含有物が使用さ卑、これに窒素源として、
硝酸塩、アンモニウム導、尿素のような無機窒素または
ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕のような有機
窒素源のいずれか、または併用して使用する。更に、こ
れに補足する培地原料として、マンガン、亜鉛などの金
属塩などが添加された培地で行われるが、この培地に対
し、ベタインを０．０１〜１％程度添加する。培養は固
体培養または液体培養のいずれでもよいが通常、２０〜
４０℃で２〜１５日間好気的に培養される。

セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるので、液体
培養の場合、培養後、濾過または遠心分離して得た除菌
液について、また、固体培養の場合は、培養後、水また
は適当な塩類溶液で抽出した酵素液について、硫安また
は硫酸ナトリウムなどで沈澱させるか、あるいはアセト
ン、アルコールのような有機溶媒を添加してセルラーゼ
を沈澱へせ、分離、乾燥して酵素粉末を得る。

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ セルロース４％、に２）ＩＰＯ４１，２％、バクトペプ
トン１％、　ＫＮＯ３０，６％、尿素０．２％、ＫＣＱ
　Ｏ，１６％、Ｍｇ５０４−７８２００．１２％、Ｚｎ
ＳＯ４・７Ｈ２０１ＸＩＯ−３％、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２
０ｔｘｔｏ−’％、ＣｕＳＯ４・５）＋　２０　ｔｘｉ
ｏ−３し、３０℃で１０日間好気的に培養した。培養後
、暮心分離して得た上澄液について生産されたセルラー
ゼのアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ及びβ−グルコシダー
ゼ活性を測定した。結果は第２表に示す通りであった。

第２表 表から明らかなように、トルナフテート耐性株（ＴＮ株
）のセルラーゼ生産能は親株に比べ、ＣＭＣアーゼが約
３倍に、そしてアビセラーゼとβ−グルコシダーゼは約
２倍に増大したものであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・セル
   ロリティカスＴＮ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕ
   ｌｏｌｙｔｉｃｕｓＴＮ）を炭素源と窒素源を含む培地
   に培養し、培養物からセルラーゼを採取することを特徴
   とするセルラーゼの製造法。