JPH0412951B2

JPH0412951B2 -

Info

Publication number: JPH0412951B2
Application number: JP56180133A
Authority: JP
Inventors: Katsumi Nakamura; Kunpei Kitamura
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1981-11-10
Filing date: 1981-11-10
Publication date: 1992-03-06
Also published as: JPS58101691A; US4496656A

Description

【発明の詳細な説明】

〔〕発明の背景本発明は、細菌によりセルラーゼを製造する方
法に関する。近年、バイオマスエネルギー開発の一つとし
て、セルロース資源を酵素により糖化する試みが
国家的規模で行なわれている。そのような目的に適した酵素としては、高い結
晶性セルロース分解活性を有しているセルラーゼ
が好ましく、そのようなセルラーゼとしては糸状
菌、たとえばトリコデルマ、イルペツクス、アス
ペルギルス、スポロトリクム等に属する微生物、
の産生するセルラーゼが良く知られている。しか
し、糸状菌はセルラーゼ産生の培養に長期間（１
〜２週間）が必要であり、また固体培養が好まし
い等の欠点があつた。一方、細菌においては、セルラーゼ産生菌とし
てセルロモナスに属する微生物が良く知られてい
るが、それらの産生するセルラーゼは結晶性セル
ロース分解活性が著しく低く、また、結晶性セル
ロース分解に係る酵素を菌体外に分泌しないとも
報告されている（Aust.J.Biol.Sci.，第31巻、第
553〜564頁（1978年））。それ故、セルラーゼの製
造に関して、糸状菌による場合に匹敵するほどに
実用性のあるものは、細菌においては未だ報告さ
れていない。〔〕発明の概要本発明は前記の糸状菌における問題を解決する
ために、細菌により糸状菌のセルラーゼに匹敵す
るセルラーゼを製造することを目的として鋭意研
究の結果、セルロモナス・ウダCB4（微工研条寄
第199号）を使用すればこの目的が達成されるこ
とを見出して完成されたものである。従つて、本発明によるセルラーゼの製造法は、
セルロモナス・ウダCB4（微工研条寄第199号）を
セルロース含有培地において培養し、産生された
セルラーゼを培養液中より採取すること、を特徴
とするものである。本発明によれば、セルロモナス・ウダCB4（微
工研条寄第199号）は、従来報告の見られない高
い活性のセルラーゼを培地中に産生するために、
糸条菌の産生するセルラーゼに匹敵する高い結晶
性セルロース分解活性を有するセルラーゼを、２
日間という短い培養期間において、製造すること
ができる。〔〕発明の具体的説明１セルラーゼ産生菌本発明において使用するセルラーゼ産生菌は、
セルロモナス・ウダ（Cellulomonas Uda）CB4
（微工研条寄第199号）である。セルロモナス・ウダCB4は、発明者らにより高
崎市のビール工場廃水処理場より分離されたもの
であり、その菌学的性質は以下の通りである。 (1) 形態的性質菌形：不規則桿菌大きさ：0.4×0.8〜4.8μ 運動性：なしグラム染色：陽性培養形態：肉汁寒天平板培養において発育良
好、表面は滑らか、辺縁は明確、色は黄色、粘
性を示す。 (2) 生理学的性質生育温度：16〜38℃ 生育 PH：6.0〜10.6 酸素要求性：通性嫌気性カタラーゼ反応：陽性硝酸還元性：陽性ゼラチン液化：序々に液化アセチルメチルカルビノール生産：陰性メチルレツド試験：陽性ジアスターゼ生産：陽性ビタミン要求性：カオチン、サイアミン無機窒素の利用性：陽性紙の分解性：陽性グリコースからの酸の生成：陽性ペプトンからのアンモニア生成：陽性リボース、ラフイノースの資化：陰性酢酸の資化：陽性Ｌ（＋）−乳酸、グルコン酸の資化：陰性細胞壁ペプチドグルカンのタイプ：Ｌ−Orn−
Ｄ−Glu 細胞壁多糖類の糖組成：主としてグルコース、
他に微量のリボース、マンノース以上の菌学的性質から、「バージーズ・マニユ
アル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリオロジ
イ」第８版（1979）（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology，8th Ed.（1974））
および「インターナシヨナル・ジヤーナル・オ
ブ・システマチツク・バクテリオロジー」第29
巻、第273〜282頁（1979）（Int.J.Byst.
Sacteriol.，Vol.29，p.273〜282（1979））に従い、
本菌はセルロモナス・ウダに属する。しかしなが
ら、本菌と既知のセルロモナス・ウダとは第１表
に示すようにそのセルラー産生能において大きく
異なり、それ故、本菌をセルロモナス・ウダBC4
と命名した。セルロモナス・ウダCB4は、工業技術院微生物
工業技術研究所に、微工研条寄第199号（昭和56
年９月７日）として寄託されている。第１表に本菌とセルロモナス・ウダを含む既知
のセルロモナス属細菌とのセルラーゼ産生能の相
違を示す。なお、セルラーゼ活性は、各菌株を、
アビセル２％、ポリペプトン２％、K₂HPO₄0.2
％、MgSO₄7H₂O0.05％、酵母エキス0.05％、
Tween80（商標）0.1％、からなる培地に植菌し、
30℃において48時間振とう培養したのち、培養液
を遠心分離し、得られた上澄液について調べたも
のである。

【表】

【表】セルロモナス・ウダCB4は既知のセルロモナ
ス・ウダ・ATCC491と比較して、アビセル分解
活性において16倍以上、紙分解活性において５
倍以上、CMC分解活性において20倍以上の活性
を産生し、明らかに既知のセルロモナス・ウダと
は区別される。また、セルロモナス・ウダCB4は
他のセルロモナス属細菌に比べても、著しく高い
セルラーゼ活性を産生し、セルロモナス属細菌の
中において本菌が従来にない特異的な細菌である
ことを示している。更に、本菌は、アビセル分解
活性において、現在、最も高いセルラーゼ活性を
生産するとされているトリコデルマ・リーセイ・
QM9414の文献値よりも高い活性を産生すること
ができる。２セルラーゼの生産セルラーゼの生産は、セルロモナス・ウダCB4
（微工研条寄第199号）を、セルロースを含む培地
において培養することによつて行なわれる。生産に使用される培地の炭素源としては、種々
のセルロース物質が単独もしくは組合せて用いら
れる。具体的には、綿、綿糸、脱脂綿、オガク
ズ、大豆粕等の天然セルロース、一般紙類、
紙、バルブ等の化学処理セルロース、セロフア
ン、アビセル等の再生セルロース、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等
のセルロース誘導体である。窒素源としては、硫
安、硝安等の無機アンモニア塩、尿素、アミノ
酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白
分解物等の有機窒素源が使用出来る。その他、
K₂HPO₄、MgSO₄等の無機塩類、必要ならばビ
タミン等の有機微量栄養素やTween80（商標）等
の界面活性剤を含有する通常の培地が使用され
る。培養は液体培養で行なわれ、通常の通気攪拌
培養装置が用いられる。培養温度は20〜38℃、好
ましくは、23〜31℃、培養PHは、PH6.5〜9.0、好
ましくはPH8.0付近、が用いられる。培養時間は、
一般的には２〜３日である。生成されたセルラーゼの採取は、常法に従つて
行なうことができる。具体的には、遠心分離、
過等による除菌処理によつて得られる培養液は、
そのまま粗酵素液として用いることができ、更
に、硫安塩析、有機溶媒による沈澱処理等の公知
の方法を用いることによつて、粗酵素剤を得るこ
ともできる。３生成セルラーゼセルロモナス・ウダCB4株を前記と同様にして
培養し、得られた培養上澄液について、諸性質を
検討して、下記の結果を得た。 (1) 作用基質および分解産物天然セルロースたとえば綿、綿糸、脱脂綿、オ
ガクズ、大豆粕、ビール粕など、化学処理セルロ
ースたとえば一般紙類、紙、パルプなど、再生
セルロースたとえばセロフアン、アビセルなど、
セルロース誘導体たとえばカルボキシメチルセル
ロース（CMC）、HE−セルロースなど、を加水
分解して、主としてセルビオースと微量のグルコ
ースとを生成する。本発明のセルラーゼは既知の
セルラーゼと同様に複合酵素であるが、β−グル
コシダーゼ活性が弱く、分解産物は主としてセル
ビオースである。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性第１図に示すように、アビセル分解活性（実線
で表示）に対する作用至適PHはPH5.5、CMC分解
活性（鎖線で表示）に対するそれはPH6.5である。
また、25℃で24時間放置した場合のPH安定域は、
アビセル分解活性およびCMC分解活性共にPH５
〜８である。 (3) 作用至適温度および熱安定性第２図に示すように、アビセル分解活性（実線
で表示）に対する作用至適温度は45〜50℃、
CMC分解活性（鎖線で表示）に対するそれは55
℃である。また、第３図に示すように、PH5.5酢
酸緩衝液中において、種々の温度条件下で24時間
放置した場合の熱安定性はCMC分解活性（鎖線
で表示）がアビセル分解活性（実線で表示）より
も高く、40℃で24時間放置した場合はCMC分解
活性はほぼ100％存在しているにもかかわらずア
ビセル分解活性は約70％失われる。 (4) 賦活性および阻害剤アビセル分解活性は、1mMのMnCl₂、CoCl₂お
よび10mMのCaCl₂により1.5〜2.5倍に賦活され、
1mMのSDS（ドデシル−硫酸ナトリウム）および
10mMのCTAB、CuCl₂によつて約70％の阻害を
受ける。 CMC分解活性は、10mMのCaCl₂および1mM
のFeSo₄により1.3倍に賦活され、10mMのCuCl₂
によつてほぼ完全に阻害される。アスペルギルス属およびトリコデルマ属糸状菌
の生産するセルラーゼ活性は、Mn，Cu，Zn等の
２価の金属イオンにより阻害を受け、またスポロ
トリクム属糸状菌の生産するセルラーゼは、これ
ら２価の金属イオンにより賦活化される。これに
対し、本発明のセルラーゼは２価の金属イオンの
うちでもMn，Co，Caにより賦活化され、Zn，
Cuにより阻害されることから、従来の酵素とは
明瞭に区別される。４実験例実施例１セルロモナス・ウダCB4の１白金耳を10mlの肉
エキス培地に植菌し、30℃で２日間振とう培養す
ることによつて前培養液を得た。この前培養液
0.5mlを50mlのアビセル含有培地（アビセル２％、
ポリペプトン２％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、酵母エキス0.05％、Tween80 0.1
％、PH8.0）に接種し、30℃で２日間振とう培養
した。この培養液を遠心分離して得られた上澄液
は、アビセル分解活性1.04単位／ml、CMC分解
活性23.3単位／ml、の酵素活性を示した。実施例２実施例１で得られた培養上澄液400mlに640mlの
冷アセトンを添加し、生じた沈澱を遠心分離によ
り集め、減圧下にて乾燥して、粗酵素1.5ｇを得
た。この標品の活性は、アビセル分解活性58.2単
位／ｇ、CMC分解活性2.170単位／ｇであつた。実施例３実施例１と同様にして培養したセルロモナス・
ウダCB4の前培養液0.5mlを50mlのビール粕含有
培地（ビール粕２％、ポリペプトン２％、K₂
HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.05％、酵母エキス
0.05％、Tween80 0.1％、PH8.0）に接種し、30℃
で２日間振とう培養した。この培養液を遠心分離
して得られた上澄液は、アビセル分解活性0.22単
位／ml、CMC分解活性5.7単位／ml、の酵素活性
を示した。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、本発明により得られるセルラー
ゼの相対活性を作用PH（第１図）、作用温度（第
２図）および保存温度（第３図）との関係におい
て示すグラフである。図中、実線は作用基質セル
ロースがアビセルの場合を、鎖線はCMCの場合
をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１セルロモナス・ウダCB4（微工研条寄第199
号）をセルロース含有培地において培養し、産生
されたセルラーゼを採取することを特徴とする、
セルラーゼの製造法。