JPS592272B2 - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４１菌を培養
し、その培養物からセルラーゼを採取することによって
セルラーゼを製造する方法に関するものである。

一般にセルラーゼは、Ｃ１酵素（結晶性セルロース分解
酵素）、ＣＸ酵素（ＣＭＣ分解酵素）およびβ−グルコ
シダーゼ（セロビオース分解酵素）などと呼ばれる多様
な酵素成分からなる複合酵素系を指しており、その作用
としては、セルロースを分解し、これをグル□コースあ
るいは、セロオリゴ糖にまで糖化することである。

近年、セルロース性資源の有効利用を計る上から、この
ようなセルラーゼの作用が改めて注目され、セルロース
の酵素糖化について多くの研究開発がなされてきている
。

一方、稲ワラ、トウモロコシの茎、葉およびバガスなと
酵素糖化の原料となる天然のセルロースは、一般に結晶
性が高〈従来のセルラーゼによる加水分解に強い抵抗性
を示す。

したがってこうした高結晶セルロースを充分分解しうる
セルラーゼの開発が期待されているのである。

本発明者らは、結晶性セルロースの分解力が優れ、かつ
、グルコースへの糖化能力の強いセルラーゼ生産菌を求
めて、微結晶セルロースを分解する菌を広く自然界から
検索した結果、トリコデルマ・ハルヂアナム（Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎ−ｕｍ）の−菌株Ｍ
−４１株が強力な結晶性セルロース分解活性とグルコー
ス生成能をもつセルラーゼを培地中に産生蓄積する事実
を見い出し本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、トリコデルマ・ハルヂアナム Ｍ−
４１株を用いた、結晶性セルロール糖化力の強力なセル
ラーゼの製造法に関するものである。

本発明において使用するトリコデルマ・ハルヂアナム（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）Ｍ−
４１株の菌学的性質は以下の通りである。

１、麦芽エキス、デキストロース寒天培地上での生育 麦芽エキス、デキストロース、寒天培地上での生育は早
く、２８℃、３日間の培養で７２〜７５ｍｍの直径に達
する。

これらコロニーの性状は羊毛状で胞子を輪紋状に形成す
る。

コロニーは初め白色で胞子形成にしたがって青緑色から
暗青緑色になる。

培養後期にはココナツツ臭をともなう。

コロニーの裏面は無色。菌糸は、無色、平滑、分岐性で
隔壁を有し、横巾は２，５〜５，０μｍである。

分生子柄は気中菌糸より生じ、輪生状あるいは樹木状に
分岐、先端はフィアライドとなる。

フイアライドは１個側生、２個対生あるいは数個輪生し
、まっすぐあるいはわずかに曲がるびん形で、先端は長
頚状で無色である。

フイアロ型分生子は分岐先端のフイアライド頂端に６〜
３０個かたまり、球状の分生子頭を形成する。

これらフィアロ型分生子は球型（直径２−３μｍ）で表
面滑面、緑色である。

２、ポテト デキストロース、寒天培地上でのコロニー
の状態。

ポテト デキストロース、寒天上でのコロニーの生育は
非常に早く、２８℃、３日間で７８〜８０ｍｒｎの直径
に達する。

これらコロニーは羊毛状で胞子を分散して豊富に形成す
る。

コロニーの色は青緑色から暗青緑色となる。

コロニーの裏面は無色。

３、生理的性質 ■ 生育の範囲（前記麦芽エキス、デキストロース培地
使用） ｐＨ２，５〜７．５、温度１７．５〜４０．０°Ｃ■
最適生育条件（前記麦芽エキス、デキストロース培地使
用） ｐＨ４，５〜７．０、温度２５°Ｃ〜３０°Ｃ以上の菌
学的諸性質をトリコデルマ属に関するリファイの記載（
マイコロジカル ペーパー１１６巻 １１９６９年）と
対比し、トリコデルマ・ハルヂ゛アナム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｈｏｒｚｉａｎｕｍ）と同定されるべき
微生物であることを認めた。

そして本菌は微工研菌寄第５８５５号として、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。

当該酵素の生産に使用される培地の炭素源としては、濾
紙粉末、微結晶性セルロース、一般紙類稲ワラ、パルプ
粕等の植物繊維質が使用でき、窒素源としては、無機ア
ンモニウム塩、硝酸塩、および肉エキス、ペプトン、蛋
白質分解物等の有機窒素源も使用できる。

その他、ＫＨ２ＰＯ４２Ｍｇ５０４ＣａＣｌ ２ ｔ
ＣｏＣＩ ２ 、ＦｅＳＯ４ｔ Ｍｎ ８０４ 、Ｚｎ
、ＳＯ４等の無機塩類を含む培地が使用される。

本菌株の培養は液体培養の他に固体培養もできるが、工
業的には液体培養が有利である。

液体培養は上記培地を使用して、培養温度２０〜４０℃
で培養ｐＨ４，５〜６．５で通気しながら培養すれば、
６〜８日間で結晶性セルロース分解活性は最高となり、
８日間培養した時の活性は１３０〜１６０Ｕ／ｍｌに達
する。

当該酵素の活性測定法は次に示すような酵素反応による
還元糖の増加を測定する方法（例えば、ネルソンーソモ
ギー法など）で測定した。

Ｃ１酵素（結晶性セルロース分解酵素）は、１％微結晶
性セルロース０．２５ｍ１を基質とし、これに適当量の
酵素液を加え、更にｐＨ４，８ｔ ０．０５ Ｍ％酢酸
緩衝液０．５． ｍｌを加え蒸留水で全量１．０麻とし
、５０℃で３０分間反応させた。

この条件で１分間に１μｇのグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位とした。

ＣＸ酵素（ＣＭＣ分解酵素）β−グルコシダーゼは、そ
れぞれ１％カルボキシメチルセルロース−ナトリウム塩
（ＣＭＣ）および１％サリシンを基質とし、反応時間１
０分で同様に測定した。

得られた培養液を遠心分離、又は濾過等により菌体を分
離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液として使用
することもできるが、濾液を濃縮しアセトン、エタノー
ル、イソプロパツールなどの有機溶剤を加えて沈降させ
るか、硫安などの塩析剤で沈澱させるなどして、強力な
活性を有する粗酵素剤を得ることができる。

このようにして得られる粗酵素剤は次のような性質を有
する。

（１）作用 濾紙、アビセル、一般紙類、脱脂綿、０Ｍセルロース、
パルプおよび脱リグニン稲ワラ、バガス等に作用し、こ
れを溶解させグルコース等の還元糖を生成せしめる。

（２）至適ｐＨおよび安定性 ５０℃における至適ｐＨは４．８である。

また、ｐＨ３，５−８，０の範囲で安定であり、この範
囲では５℃、２４時間で９０％以上の活性が残存する。

（３）最適作用温度および安定性 ｐＨ４，８，２４時間反応で至適作用温度は４５〜５０
℃であった。

また、４５℃以下では９６時間以上安定であり、この温
度以下では、はぼ１００％活性は残存していた。

（４）阻害剤 本粗酵素剤はＣｕ２＋、Ｈｇ２＋、およびＡｇ＋にによ
って強く阻害される。

（５）精製 粗酵素剤中の夾雑物質はセルロースカラムによる吸着ク
ロマトグラフィー、および通常のイオン交換クロマトグ
ラフィー、セファデックスゲルによるゲル濾過等により
除くことができ、高度に精製された酵素剤を得ることが
できる。

本発明により生産されるセルラーゼは、結晶性セルロー
スに対して従来の酵素より一層よく作用する特徴がある
。

例えばすべてのセルラーゼ成分を含み、完全なセルラー
ゼを生産するとされるトリコデルマ・レーゼイＱＭ９４
１４ （ＡＴＣＯ２６９２１）による結晶性セルロース
（アビセル）の氷解率は、３３〜４０％にすぎない（バ
イオテクノロジー アンド バイオエンジニアリングＸ
ＶＩ巻、１４７１〜１４９３ページ、１９７４年の■表
）が、本発明により生産される酵素を使用すると高濃度
のアビセルに対しても最終的に、９０％以上水解するこ
とができる。

このように、本発明により生産される酵素は結晶性セル
ロースに対し、これを効率よく水解するという特徴の他
に、得られる糖化物の糖組成が殆んどグルコースからな
るということも本発明の大きな特徴の一つとして挙げら
れる。

すなわち、セルラーゼにはＣ１活性（結晶性セルロース
分解活性）Ｃｘ活性（ＣＭＣ分解活性）とβ−グルコシ
ダーゼ活性（セロビオース分解活性）などの酵素活性が
含まれているが、この構成割合がセルロースの氷解およ
び糖化率に重要に関係している。

そして、本発明により生産されるセルラーゼは、このう
ちのβ−グルコシダーゼも充分に含んでいるということ
である。

例えば、トリコデルマ・レーゼイのセルラーゼによるセ
ルロース糖化物はグルコースに対してセロビオースが多
く含まれ、セロビオース対グルコースの割合は１対１か
ら１対３であり（ジャーナル オブ ファーメンテ−ジ
ョン テクノロジー ５４巻、２６７ページ １９７６
年）このクルコースの割合を高めるためには、アスペル
ギルス・ニガーなとのβ−グルコシダーゼヲ更に添加す
る必要がある（アップライド マイクロバイオロジー
１６巻 ４１９ページ １９６８年）。

しかし、本発明のセルラーゼを使用すれば他からβ−グ
ルコシダーゼの添加をすることなくセルロースから約９
０％の収量で直接グルコースを得ることができる。

第−表は本発明により得られるセルラーゼとトリコデル
マ・レーゼイＱＭ９４１４のセルラーゼに含まれる各酵
素活性の構成を示している。

表から明らかなように、本発明により生産されるセルラ
ーゼのβ−グルコシダーゼ活性は、トリコデルマ・レー
ゼイＱＭ９４１４のものに比べ３倍以上の活性がある。

そして結晶性セルロースの分解活性も本発明のセルラー
ゼの方が約２倍高い。

これらのことが、本発明により生産されるセルラーゼを
使用すれば、結晶性のセルロースや各種天然セルロース
からも極めて高い収量で直接グルコースが得られるとい
う特徴の理由となっているのである。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 １ トリコデルマ・ハルヂアナム Ｍ−４１株（微工研菌寄
第５８５５号）をポテト・デキストロース寒天スラント
（ｐＨ６，０）上で３０℃、６日間培養してよく胞子を
形成させた後、その−白金耳を５０ｍ１／２００１ｎｌ
容のフラスコの次の組成の培地に接種し、温度３０℃、
８日間回転振盪培養した。

培地組成 セルロースパウダー ０．７５ ｇ／ｄｉ
ＫＮＯ３０，２０ ペプトン ０．１５ＫＨ２ＰＯ
４０，１０ Ｍｇ５０４・７Ｈ２００，０５ ポリエチレング刃コール 七ノーパラーイソーオクチル フェニルエーテノ収ＴｒｉｔｏｎＸ−１００） ０．
１０Ｚ ｎ ＳＯ４・７Ｈ２００，１４１１１９／ｄ、
ｌ培地組成 Ｆｅ ＳＯ４・７Ｈ２００，５０ｍｙ／ｄｉＩＣｏＣ１
２０，２０ Ｍｎ ８０４ ・４Ｈ２００，１に の培養液を遠心分離し残渣を除去して得られる粗酵素液
は微結晶性セルロースに対して１６２Ｕ／ｍｌの酵素活
性を示し、１％微結晶性セルロースを第４図に示すよう
に、４５℃、２４時間反応で約７０％可溶化し、４日間
反応で９６％とほぼ透明化した。

また、この時の可溶性糖液の組成はグルコース８９％、
セロビオース３．９％、その他高級オリゴ糖７．１％で
あった。

実施例 ２ 実施例１と同様な培地３００ＶＩ！を２１容のフラスコ
にとり１２０℃、１５分間殺菌した後、トリコデルマ・
ハルヂアナム Ｍ−４１（微工研菌寄第５８５５号）の
胞子を５白金耳接種し、実施例１と同様に培養して培養
濾液２８０ｒｒＬｌを得た。

濾液の微結晶性セルロース分解活性は１３３ Ｕ／Ｔｎ
ｌであり、β−グルコシダーゼ活性は８８Ｕ／ＴＬｌで
あった。

培養濾液を限外濾過器（バイオエンジニアリング社製、
ダイアフィルターＧＣ−０５Ｔ使用）により濃縮後、硫
安６０％飽和で塩析し、透析、凍結乾燥して微結晶性セ
ルロース分解活性１８０ Ｕ／弘β−グルコシダーゼ活
性９０Ｕ／〜を示す粗酵素粉末１８０Ｉｎ９を得た。

実施例 ３ 実症例２で得られた粗酵素粉末を、２０％微結晶性セル
ロース懸濁液に、２％濃度で添加し、ｐＨ４，８、温度
４５℃で２４時間作用させた結果、可溶化率４６％で８
．０％のグルコース溶液が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は当該酵素の至適ｐＨ１第２図は安定ｐＨ範囲、
第３図は作用至適温度を示すものである。 また、第４図は当該酵素による１％微結晶性セルロース
のｐＨ４，８、温度４５℃における可溶化率の経時的変
化を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４１株を培養し、
   培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセル
   ラーゼの製造方法。