JP2784062B2

JP2784062B2 - 微生物セルラーゼの製造方法

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Publication number: JP2784062B2
Application number: JP26484689A
Authority: JP
Inventors: 雅彦澤田
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 1989-10-16
Filing date: 1989-10-16
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2013-08-06
Also published as: JPH03130072A

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は、CMC分解活性に比し、結晶性セルロース分
解活性並びに紙分解活性の高いセルラーゼ生産能を有
する細菌新菌株、並びに該菌株を使用するセルラーゼの
製造方法に関する。

（２）従来の技術近年バイオマスエネルギーの総合的開発の一環とし
て、セルロース資源の酵素糖化利用の試みが盛んに行な
われるほか、セルラーゼ剤によるパルプの叩解（特開昭
60−126395）や、小麦粉の改質（特開平１−171647）等
の新たなセルラーゼの用途開も進んでいる。

このような幅広い目的に適用し得るセルラーゼとして
は、高い結晶性セルロース分解活性ないし高い紙分解
能を示すセルラーゼが必要であり、トリコデルマ属、イ
ルペックス属、アスペルギルス属、フザリウム属、スポ
ロトリクム属等の糸状菌由来のセルラーゼが用いられて
いる。

しかし、これらの糸状菌によるセルラーゼの生産に
は、１〜２週間にも及ぶ長期の培養時間が必要であり、
更に培養液中に、多種類の夾雑酵素を生産するため、精
製工程が複雑化するなどの欠点があった。

また、放線菌の生産するセルラーゼについては、サー
モモノズポーラ属、マイクロビスポーラ属、ストレプト
マイセス属等の報告があるが、いずれも実用の段階には
達していない。

（３）発明が解決しようとする問題点ある種の細菌は、培養液中に酵素蛋白を分泌するが、
その菌体外に生産される酵素の種類は、通常２・３種類
と少なく、目的とする酵素を特異的に得ようとする場合
に、比較的に有利である。

また細菌は、酸素に対する挙動から、好気性細菌と嫌
気性細菌に分類されるが、培養の容易さや安全性の面か
ら、一般的に好気性細菌が利用されることが多い。

セルラーゼを生産する好気性細菌としては、セルロモ
ナス属、セロビブリオ属、シュードモナス属、或いはバ
チルス属菌株が知られているが、これら細菌の生産する
セルラーゼは、一般的に結晶性セルロースに対する作用
が低いとされている。

例外的にセルロモナス・ウダCB4株（特開昭58−10169
1）について、比較的強いアビセル分解活性が報告され
ている。しかし、このCB4株の場合も、実用的なセルラ
ーゼ活性である、紙分解活性が低く（J.Ferment.Tech
nol.vol.61,p.379−382（1983）；発酵と工業vol.44,p.
753−764（1986））、この点が実用化の上で難点であ
る。

バチルス属細菌の生産するセルラーゼについては、ア
ルカリ耐性セルラーゼ、アルカリセルラーゼ（特開昭50
−28515,特開昭58−224686,特開昭63−146786,J.Gen.Mi
crobiol.vol.131,p.3339（1985））等、特に特殊環境下
で作用するセルラーゼに関する報告が多い。しかも、そ
の活性はCMC分解活性や、β−グルコシダーゼ活性につ
いてのものがほとんどであって、結晶性セルロースや
紙に対する作用に注目したものは少ない。

M.A.O.Trevinoらは、CMC生産工場の汚染菌から分離し
たバチルス・サーキュランスが、エンドグルカナーゼ
（CMC分解酵素）と共に、微弱な紙分解活性（3.93 Fi
lter paper units/mg蛋白）を示した旨の報告をしてい
るが（Appl.Microbiol.Biotechnol.vol.31,p.146（198
9））、後述する本発明の酵素単位系に換算すると、0.0
56FPU/mlと極めて低く、実用上の紙分解活性とは言い
難い。

その他、特開昭61−35784,特開昭63−146786等セルラ
ーゼに関連して、紙やアビセルに対する作用に言及し
た文献はあるが、その活性の程度は微弱であるか不明確
で、実用上有用なものではない。

また、現在用いられている糸状菌のセルラーゼは、作
用pH,安定pHともpH4〜５付近に至適範囲を有し、pH7以
上ではほとんど活性を示さず、中性ないし微アルカリ性
で作用し得る紙分解活性生産菌は、得られていない。

（４）問題点を解決するための手段本発明者らは、好気性細菌でかつ中性域において、高
い紙分解活性ないし結晶性セルロース分解活性を示す
セルラーゼの生産菌株を、新たに分離すべく鋭意探索の
結果、静岡県清水市の畑地より優秀な一菌株LP−547株
を得た。

さらにこの菌株について、培養条件、培地条件を検討
することにより、２〜４日間の培養で、糸状菌のセルラ
ーゼと同等の酵素を工業的に生産する可能性を見出し、
また、糸状菌由来の酵素では作用しなかった。中性域で
の使用も可能なことを認め、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ここに得られた、高い紙分解活
性ないし結晶性セルロース分解活性を示すセルラーゼの
生産菌LP−547株と、該菌株を使用したセルラーゼの生
産方法を提供するものである。

本発明において使用するセルラーゼ生産菌LP−547株
は、以下の菌学的性質を有する。

形態的性質菌形：桿菌大きさ:0.6〜0.8×1.7〜5.0μｍ運動性：周鞭毛による運動。

グラム染色：陽性培養形態：肉汁寒天平板培養に発育。

表面は平滑。色は半透明で白色。

胞子：主に片端に形成。楕円状。

胞子嚢の状態：膨潤。

生理学的性質生育温度:20〜40℃（最適35〜40℃）生育ｐ H:6.0〜9.0（最適7.0〜8.0）酸素要求性：絶対好気性澱粉分解：陽性紙分解：陽性チロシン分解：陰性フェニルアラニンの脱アミノ化：陰性硝酸還元能：陰性硝酸呼吸能：陰性食塩要求性：陰性インドール生成：陰性硫化水素の生成：陽性Ｖ−Ｐ反応：陰性Ｖ−Ｐ培養液のpH:6以下（pH5.28）カタラーゼ反応：陽性シトクロームオキシダーゼ反応：陰性キシロース，マンニトールからの酸生成：陽性クエン酸の資化：陰性以上の菌学的性質から、本菌株は『バージーズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』
第２巻（Bergy's Manual of Systematic Bacteriology
vol.2（1986））の記載に準拠し、バチルス・サーキュ
ランスと同定し、Bacillus circulans LP−547と命名し
た。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、その寄託番号は、微工研菌寄第10970号である。

なお、前記マニュアルのバチルス・サーキュランスの
項に「弱くセルロースを分解する株もある」旨の記載が
あるが、これはCMC含有プレートにおける結果を示した
もので、本発明の新規性に係わるものではない。

本発明のセルラーゼ剤（以下「本酵素」と略す）を得
るには、Bacillus circulans LP−547株を栄養源含有培
地に接種し、常法に従って培養し、培地中に蓄積した本
酵素を採取することにより行なわれる。

本酵素の生産には、Bacillus circulans LP−547株の
他、その天然ないし人工変異株も本酵素の生産能を有す
る限り使用できる。LP−547株の人工変異株を得るに
は、人工変異の一般的方法が利用されるが、例えば紫外
線照射、コバルト60等のγ線照射、化学的変異誘発剤等
が可能なほか、遺伝子工学的手法により、本酵素の遺伝
子をクローニングして、他の微生物に本酵素の生産能力
を導入することによっても可能である。

これらの菌株の培養には、通常の細菌類の培養方法が
利用可能であるが、一般的には、液体培養が好適であ
る。培地の炭素源としては、綿、綿糸、鋸屑、ふすま、
大豆粕、稲藁、米糠等の天然セルロース、紙、パル
プ、セルロース・パウダー、紙又は再生紙等の化学処理
セルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセル
ロース、エチルセルロース、等のセルロース誘導体、セ
ロオリゴ糖などのセルロース系物質が好ましいが、澱
粉、デキストリン、白糠、コーン・ミール等の多糖類、
ラクトース、シュクロース等の二糖類、グルコース、フ
ラクトース、マンノース等の単糖類などの使用が可能で
あり、またこれらの組合せによる使用も可能である。

窒素源としては、コーンスティープリカー（CSL）、
麦芽エキス、カゼイン、肉エキス、ペプトン、無機アン
モニウム塩等を使用することができる。

また、KH₂PO₄,MgSO₄,FeSO₄,MnSO₄,CaCl₂,CoCl₂,KCl,N
aClなどの無機塩類やビタミン等の有機微量要素、さら
にツィーン40,ツィーン80,スパン80等の界面活性剤を必
要に応じて加えることができる。また、培養の初発pH7.
0〜9.0までの広い範囲で可能である。

本酵素の生産は、上記の栄養源等を含有する培地で20
〜45℃、好ましくは30〜37℃付近で行なわれ、24〜96時
間の培養で、充分なセルラーゼ活性が得られる。

培養液、または抽出液を直接酵素液として用いること
も可能であるが、培養液、菌体、培養液濃縮物、あ
るいはこれらから硫安、食塩等による塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、等電点沈澱、溶媒分画、吸着クロ
マトグラフィー等の精製法を単独もしくは組み合わせる
ことにより得られた部分精製品ないし精製標品も、本酵
素の利用目的に使用される。

セルラーゼ活性の測定は、Mandelsらの方法（Biotech
nol.Bioeng.Symp.,vol.6,p.21−33（1976））に準じて
行った。但し、緩衝液には酢酸緩衝液を用い、pH6.0と
した。以下、紙分解活性の具体的分析方法を示す。

1mlの0.05M酢酸緩衝液（pH6.0）に、0.5mlの希釈酵素
液を加え、50mgに調整した紙（ワットマンNo.1紙約
１×6cm）の１片を投入混合し、50℃で１時間反応させ
た後、液中に生じた還元糖量を、ジニトロサリチル酸法
によって、グルコースとして定量した。１酸素単位（FP
U/ml）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還
元糖を生ずる酸素量とした。

また、セロビオヒドラーゼ活性の測定は、以下のとお
り行った。

1mlの0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）に、一定量の酵素液を
加え、50℃で２〜３分間加熱し、5mMのパラニトロフェ
ニル−β−Ｄ−セロビオシドを、0.5mlを添加して、20
分間反応させる。反応後、1M炭酸ナトリウムを1mlを加
えて反応を停止させ、410nmの吸光度により、遊離した
パラニトロフェノール量を定量する。

１酵素単位（U/ml）は、１分間に１μmolのパラニト
ロフェノールを遊離する酵素量とした。

上記方法で得られた酵素液は、以下の諸性質を有して
いた。

作用pHおよび安定性 50℃における活性とpHの関係は、第１図に示したとお
り、pH5.5〜7.0が至適であった。また、50℃に１時間保
持したときのpH安定域は、第２図に示したごとく、pH5.
5〜9.0であった。

作用温度および安定性 pH6.0,1時間の反応の場合の活性と温度の関係は、第
３図に示したように、50℃が至適であった。また、pH6.
0に30分間保持した場合の温度安定域は、第４図のとお
り、50℃までであった。

賦活剤および阻害剤本酵素は、1mMのSnCl₂,ZnSO₄,および10mMのNiCl₂によ
り、約60〜70％,1mMのCuCl₂,10mMのZnSO₄により、100％
に近い阻害を受ける。

一方、トリコデルマ属起源のセルラーゼ剤は、Cl²⁺,Z
n²⁺により阻害を受けないので、本酵素はトリコデルマ
属のものとは、あきらかに異なる酵素と考えられる（第
１表）。

（４）実施例以下、本発明を、実施例により詳細に説明する。

＜実施例−１＞バチルス・サーキュランスLP−547の１白金耳を、20m
lのグルコース含有肉エキス培地に接種し、28℃で２日
間振盪培養を行ない、前培養液とした。

この前培養液を、100mlの生産培地（KCフロックＷ−1
00 2％，コーンスティーブリカー１％，硝酸アンモニウ
ム0.5％，硫酸マグネシウム0.03％，尿素0.1％，リン酸
１カリウム0.1％，ツイン−80 0.1％,pH7.0）に、濃度
が２％となるように接種し、30℃で４日間振盪培養し
た。

遠心分離により菌体および残渣を除去し、得られた
液中の、紙分解活性を測定したところ、0.80FPU/mlで
あった。

＜実施例−２＞実施例１で得た培養液を集め、分画分子量10,000の
平膜型限外過濃縮機により、約５倍に濃縮し種々の酵
素活性を測定したところ、紙分解活性3.15FPU/ml,CMC
分解活性30.4U/mlであった。

なお、β−グルコシダーゼ活性およびカゼイン分解活
性は、検出されなかった。

＜実施例−３＞実施例１と同様にして得られた前培養液を、2.5Lの生
産倍地（CKフロックＷ−100 2％，コーンスティーブリ
カー１％，硝酸アンモニウム0.5％，硫酸マグネシウム
0.03％，尿素0.1％，リン酸１カリウム0.1％，ツイン−
80 0.1％,pH9.0）を含む5L容ミニジャーファーメンター
に、濃度が４％となるように接種し、37℃,250rpm,1vvm
で４日間培養した。

遠心分離により菌体および残渣を除去し、得られた
液中の紙分解活性は0.88FPU/ml,セロビオヒドラーゼ
活性は0.31U/ml,CMC分解活性は8.91U/mlであった。

＜実施例−４＞ 1gの紙片を、30mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に
加え、実施例３で得られた培養液、およびトリコデルマ
・リーセイQM−9414の培養液の脱塩濃縮物を、それぞれ
1FPU（トリコデルマ属の酵素は、Mandelsらの原法に従
い、50mMのクエン酸緩衝液pH4.8で測定）加え、50℃に
て緩やかに攪拌しつつ反応させた。結果は第５図に示し
たとおりで、本発明の酵素による紙分解力は、トリコ
デルマ・リーセイのものに比べ著しく高い活性を示し
た。

（５）発明の効果本発明により、CMC分解活性に比し、結晶性セルロー
ス分解活性並びに紙分解活性の高いセルラーゼ生産能
を有する細菌新菌株が提供され、該菌株を使用するセル
ラーゼの新規な製造方法が、確立された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の活性とpHの関係を示す。第２図は、本酵素のpH安定性を示す。第３図は、本酵素の活性と温度の関係を示す。第４図は、本酵素の温度安定性を示す。第５図は、本酵素（曲線１）とトリコデルマ属セルラー
ゼ（曲線２）の、pH7.0における紙分解の経時変化を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:09）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】CMC分解活性に比し、結晶性セルロース分
解活性並びに紙分解活性の高いセルラーゼ生産能を有
する細菌株バチルス・サーキュランスLP−547株（Bacil
lus circulans LP−547）微工研菌寄第10970号。
【請求項２】バチルス・サーキュランスLP−547株（Bac
illus circulans LP−547）微工研菌寄第10970号を培地
に培養し、培地中にCMC分解活性に比し、結晶性セルロ
ース分解活性並びに紙分解活性の高いセルラーゼを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするセルラ
ーゼの製造方法。