JP2021083414A - セルラーゼの製造方法およびそれを用いたグルコースの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】セルラーゼ生産能を有するトリコデルマ属糸状菌の培養方法を改良することにより、バイオマスをグルコースに加水分解するバイオマス分解活性の高いセルラーゼを提供すること。【解決手段】セルラーゼの製造方法は、トリコデルマ属糸状菌を培養し、該トリコデルマ属糸状菌にセルラーゼを生産させることを含み、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水を、トリコデルマ属糸状菌の培養中に培養物に添加することを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、トリコデルマ属糸状菌を用いたセルラーゼの製造方法およびそれを用いたバイオマスからのグルコースの製造方法に関する。

トリコデルマ属糸状菌は、高いセルラーゼ生産能を有していることが知られており、トリコデルマ属糸状菌を培養することによるセルラーゼの生産検討が行われている。トリコデルマ属糸状菌は、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質としてセルラーゼを生産するが、トリコデルマ属糸状菌が生産するセルラーゼは様々な加水分解酵素の混合物であることが知られている。

セルロースを含むバイオマスを、セルラーゼを用いて分解することで、発酵原料であるグルコースが製造され、このグルコースを用いてセルラーゼの生産性を高める方法や、セルラーゼの酵素活性を向上させる検討が行われている。この時、バイオマス分解活性の高いセルラーゼが求められており、トリコデルマ属糸状菌に遺伝子組換えにより特定の酵素を発現させることでバイオマス分解活性を強化するなどの検討が多々行われている。

特許文献１では、トリコデルマ・リーセイを遺伝子組換えし、グロメレラ・グラミニコラ由来β−グルコシダーゼを発現させることでバイオマス分解活性を向上させた例が開示されている。

非特許文献１では、アスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼをトリコデルマ・リーセイ培養液に加えてバイオマス分解活性を向上させた例およびトリコデルマ・リーセイを遺伝子組換えし、アスペルギルス・アクリータス由来β−グルコシダーゼを発現させることでバイオマス分解活性を向上させた例が開示されている。

また、非特許文献２では、上記の組換体のトリコデルマ属糸状菌を培養する際に、培養液を中和するためのアンモニア水にセルラーゼの誘導物質であるラクトースを溶解させて用いる方法が開示されている。

特表２０１７―５３２９６７号公報

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ１２０、Ｎｏ．６、６５７−６６５、２０１５ Ｊｏｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｏｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０１２， １１：７０

本発明者らは、セルラーゼ生産能を有するトリコデルマ属糸状菌の培養方法を改良することにより、バイオマスをグルコースに加水分解するバイオマス分解活性の高いセルラーゼを提供することを課題とした。

本発明者らは、バイオマスをグルコースに加水分解する活性の高いセルラーゼが生産可能となるトリコデルマ属糸状菌の培養方法を鋭意検討した。まず、後述のとおり、非特許文献２に記載の方法を参考に培養試験を行い、０．３％のアンモニア水にラクトースを５０ｇ／Ｌの濃度になるように溶解させた溶液を用いて、培養試験を行ったが、セルラーゼの生産量や、バイオマスをグルコースにまで分解するバイオマス分解活性の向上は確認されなかった。本発明者らは、さらに検討を重ね、ラクトースをアンモニア水に溶解させると、水への飽和溶解度以上に溶解することを見出した。さらに、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたアンモニア水を培養中に添加することにより、製造されたセルラーゼのバイオマス分解活性の高いセルラーゼが生産可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
（１）トリコデルマ属糸状菌を培養し、該トリコデルマ属糸状菌にセルラーゼを生産させることを含むセルラーゼの製造方法であって、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水を、前記トリコデルマ属糸状菌の培養中に培養物に添加することを含む、セルラーゼの製造方法。
（２）前記ラクトース含有アンモニア水を添加することにより、前記培養物のｐＨを３．５以上７．０以下に維持することを含む、（１）記載の方法。
（３）前記培養物のｐＨを４．０以上６．０以下に維持することを含む、（２）記載の方法。
（４）前記ラクトース含有アンモニア水が、アンモニア濃度１０％(w/v)以上のアンモニア水を用いて調製されたものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記トリコデルマ属糸状菌が、トリコデルマ・リーセイである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のセルラーゼを用いてバイオマスを糖化することを含む、グルコースの製造方法。

本発明のセルラーゼはバイオマス分解活性が向上しており、セルラーゼを用いたバイオマス糖化時により多くのグルコースを得ることが可能である。

本発明におけるトリコデルマ属糸状菌は、トリコデルマ属に属し、セルラーゼを生産する能力を有していれば特に制限はない。好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）である。また、トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼの生産性が向上した変異株を利用してもよい。例えば、トリコデルマ属糸状菌のセルラーゼの生産性が向上した変異株の具体例は、トリコデルマ・リーセイの先祖にあたるトリコデルマ・パラリーセイ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ−４７７７）、トリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ−８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１−３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８， ８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１−４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ−３−７株、ＲｕｔＣ−３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。

本発明は、トリコデルマ属菌属糸状菌を培養してセルラーゼを製造する際に、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水を培養中に培養物に添加することで、バイオマス分解活性の高いセルラーゼを得ることが可能となり、遺伝子組換え体の封じ込めが必要な遺伝子組換え技術を使うことなくバイオマス分解活性を向上させることができる。もっとも、特許文献１や、非特許文献１に記載のような、微生物の遺伝子を組換えてセルラーゼの生産性を向上させる方法と組み合わせて用いてもよい。

本発明におけるセルラーゼには様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）などが挙げられる。

本発明におけるバイオマス分解活性とは、バイオマスが加水分解されてグルコースを生じる活性を意味し、バイオマスが加水分解されて生じるグルコースの量を測定することでその活性を測定する。具体的なバイオマス分解活性の測定方法の一例は、以下のとおりである。

バイオマスとして、粉砕したバガスを使用し、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を用いてバガスを５重量％になるよう調整し、さらに、防腐剤としてエリスロマイシンを反応液１ｇあたり１００μｇになるよう添加する。セルラーゼをバガス１ｇあたり８ｍｇになるよう加え、４５℃にて２４時間転倒攪拌しバイオマスの分解反応を行う。反応後の反応液を８，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清のグルコース濃度を測定する。測定の結果、グルコース濃度が高まれば、バイオマス分解活性が向上したと判断する。

本発明におけるバイオマス分解活性の向上とは、全タンパク質あたりのバイオマス分解活性の向上であっても良いし、培養液あたりのバイオマス分解活性の向上であっても良い。好ましくは全タンパク質あたりのバイオマス分解活性の向上である。

バイオマス分解活性の向上率は、向上していれば特に限定されないが、５％以上であることが好ましく、グルコースの収量が５％以上向上することが好ましい。

本発明のトリコデルマ属糸状菌の培養方法は、遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができるが、液体培養が好ましい。

トリコデルマ属糸状菌は好気微生物であるため、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１〜２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３〜１．５ｖｖｍがより好ましく、０．５〜１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３１℃がより好ましい。

培養におけるｐＨの条件は、特に制限はないが、好ましくはラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたアンモニア水をｐＨ調整に用いて、培養物のｐＨを３．５以上に維持することが好ましい。より好ましくはｐＨ３．５〜７．０に維持し、さらに好ましくはｐＨ４．０〜６．０に維持する。

培養時間は、セルラーゼが生産される条件で、回収可能な量のセルラーゼが蓄積されるまで行える時間であれば特に制限はないが、通常、２４〜２８８時間、好ましくは２４〜２４０時間、より好ましくは３６〜２４０時間、さらに好ましくは３６〜１９２時間である。

培養工程の培地組成は、トリコデルマ属糸状菌がセルラーゼを製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ属糸状菌の周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができ、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水を窒素源として用いることもできる。また、培地には、セルラーゼを製造させるための誘導物質（後述）を添加してもよい。炭素源としては、例えば、ラクトース含有アンモニア水中のラクトースや、後述の誘導物質であるセルロースやキシラン、これらを含むバイオマス等を用いることができる。

本発明によりセルラーゼを製造する場合には、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水以外に、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類の誘導物質を含む培地で培養してもよい。また、この場合、セルロースやキシランとしては、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロースやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。裸子植物の具体例としては、スギ、マツなどが挙げられる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類され、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としてはビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが挙げられる。培地中の誘導物質の濃度は、セルラーゼの生産量が高まる濃度であれば特に限定されず、適宜設定できるが、通常、１０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ程度である。

また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、硫酸、酢酸などによる酸処理、苛性ソーダ、アンモニアなどによるアルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロースやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。

本発明において培養中に添加するラクトース含有アンモニア水中のラクトースの濃度は２５０ｇ／Ｌ以上であればよく、好ましくは４００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは５００ｇ／Ｌ以上である。ラクトース含有アンモニア水中のラクトースの濃度の上限値は、特に限定されないが、通常、８００ｇ／Ｌ程度、好ましくは７００ｇ／Ｌ程度である。

ラクトースをアンモニア水ではなく水に溶解させた場合、その飽和溶解度は通常の使用温度である室温付近では、１５℃では１４５ｇ／Ｌ、２５℃で１７８ｇ／Ｌである。加温して３９℃であっても２４０ｇ／Ｌであり、２５０ｇ／Ｌ以上の濃度で溶解させて培養に使用することは困難である。

本発明におけるラクトースを溶解させるためのアンモニア水の濃度は、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上の濃度で溶解させるためにアンモニア濃度が３％(w/v)以上である必要がある。好ましくは容易にラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上の濃度で溶解させるため、アンモニア濃度５％(w/v)以上のアンモニア水が用いられる。より好ましくはアンモニア濃度１０％(w/v)以上、さらに好ましくはアンモニア濃度２０％(w/v)以上のアンモニア水が用いられる。用いるアンモニア水中のアンモニア濃度の上限値は特に限定されないが、通常、３０％(w/v)程度である。

トリコデルマ属糸状菌を培養した培養液に含まれるセルラーゼを回収する方法は特に限定されないが、トリコデルマ属糸状菌の菌体を培養液から除去し、セルラーゼを回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。

また、トリコデルマ属糸状菌を培養した培養液から菌体を除去せずに、セルラーゼ溶液として利用してもよい。この場合、培養液中でトリコデルマ属糸状菌が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。

本発明におけるタンパク質濃度は例えば以下の通り測定を行うことができる。トリコデルマ属糸状菌を培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をセルラーゼ溶液とする。Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（商標） Ｂｒａｄｆｏｒｄ プロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいてタンパク質濃度を算出する。

本発明において、セルラーゼにより分解されるバイオマスはセルロースを含むバイオマスであればよく、具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。裸子植物の具体例としては、スギ、マツなどが挙げられる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類され、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としてはビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが挙げられる。

セルラーゼにより分解されるバイオマスはあらかじめ前処理を行っていても良い。前処理方法としては、特に限定されないが、具体的には、硫酸、酢酸などによる酸処理、苛性ソーダ、アンモニアなどによるアルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。

本発明の方法により製造されたセルラーゼによるバイオマスの分解自体は、常法により行うことができる。例えば、バイオマスを水溶媒中で温度とｐＨを制御してセルラーゼと反応することによりおこなうことができる。セルラーゼによる分解反応時のｐＨは、セルラーゼによる加水分解反応が可能なｐＨであればよいが、ｐＨ３からｐＨ７付近が好ましく、より好ましくはｐＨ４からｐＨ６であり、特に好ましくはｐＨ５付近である。反応温度は、４０℃から７０℃が好ましい。

本発明におけるグルコースの測定は、例えば、グルコースＣＩＩ−テストワコー（富士フイルム和光純薬工業社製）を使用して行うことができる。この場合、１００μＬの測定試薬に５μＬの試料を添加し、室温で１５分間静置後に主波長５０５ｎｍ、副波長６００ｎｍで吸光度を測定し、ブドウ糖標準液Ｉを用いて作成した検量線に基づいてグルコース濃度を算出することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
使用するタンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。

＜参考例２＞グルコースの測定
使用するグルコース濃度測定試薬：グルコースＣＩＩ−テストワコー、富士フイルム和光純薬工業社製
測定条件
測定温度：室温
測定試薬：１００μＬ
試料：５μＬ
反応時間：１５分
吸光度：５０５ｎｍ（主）、６００ｎｍ（副）
標準品：ブドウ糖標準液I。

＜参考例３＞ラクトースのアンモニア水への溶解
ラクトースを１０％アンモニア水溶液に溶解した後、１０％アンモニア水溶液でメスアップすることにより各濃度（５０、２００、２５０、５００、６００ｇ／Ｌ）でラクトースを溶解させたアンモニア水を調整した。５００ｇ／Ｌと６００ｇ／Ｌでラクトースを溶解させる際は、５０℃にて加温したが、いずれもトリコデルマ属糸状菌の培養中に添加する際には室温２０℃付近にまで冷却して使用した。

＜参考例４＞コーンハルの粉砕
トウモロコシの種子の外皮であるコーンハル（サンエイ糖化株式会社）を乾燥させた後、粉砕し、以下の実験中で、本培養培地に用いた。

実施例１〜３、比較例１〜３ トリコデルマ属糸状菌の培養によるセルラーゼの生産試験
（前培養）
トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７株の胞子を１．０×１０^７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを、１Ｌバッフル付フラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地（下記表１）へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。

^＊５×マンデルス溶液は以下の組成
７ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
１０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４
２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ
１．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
^＊＊１０×酒石酸アンモニウム溶液は、９２ｇ／Ｌ 酒石酸アンモニウムを含む
^＊＊＊微量元素溶液は以下の組成
０．３ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３
１．３ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ
５ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ
２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ
０．４ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ
１０ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ_２

（本培養）
Ａｒｂｏｃｅｌ Ｂ８００（レッテンマイヤー社）を後述する本培養培地に添加し、５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）を用い、深部攪拌培養を行った。

トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７株の前培養液２５０ｍＬを表２に示す本培養培地２．５Ｌに接種した。

培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部攪拌培養を行った。

ｐＨの制御は、参考例３で調整したラクトースを溶解させたアンモニア水を用い、コントロールとしてラクトースを溶解させていないアンモニア水を用いた。ｐＨ調整に伴い、参考例３で調製した、ラクトースを溶解させたラクトース含有アンモニア水を培養中に培養液（液体の培養物）に添加した。

＊表１と同じ
***表１と同じ

（培養液の採取）
培養開始から、培養終了時の８９時間経過後まで経時的に培養液をそれぞれ２０ｍＬ採取した。採取した培養液の一部は、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得、その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。

（タンパク質濃度の測定）
参考例１で記載した手法を用い、培養開始８９時間後に採取した培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定した。結果を表３に示す。表３に示されるように、タンパク質濃度に大きな変化は見られなかった。

（バイオマス分解活性の測定）
ジェットミルにより平均粒径１００μｍに粉砕したバガスをバイオマスとして使用し、バイオマス分解活性の測定を行った。１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を用いてバガスを５重量％になるよう調整し、防腐剤としてエリスロマイシンを反応液１ｇあたり１００μｇになるよう添加した。セルラーゼをバガス１ｇあたり８ｍｇになるよう加え、４５℃にて２４時間転倒攪拌しバイオマスの分解反応を行った。反応液を８，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清のグルコース濃度を測定した。

結果を表４に示す。表４に示されるように、ラクトースを２００ｇ／Ｌ以下で溶解させたアンモニア水を用いて生産したセルラーゼと比較して、２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたアンモニア水を用いた時に得られるグルコースの濃度が向上した。

＊N=2平均値

Claims (6)

1. トリコデルマ属糸状菌を培養し、該トリコデルマ属糸状菌にセルラーゼを生産させることを含むセルラーゼの製造方法であって、ラクトースを２５０ｇ／Ｌ以上で溶解させたラクトース含有アンモニア水を、前記トリコデルマ属糸状菌の培養中に培養物に添加することを含む、セルラーゼの製造方法。
2. 前記ラクトース含有アンモニア水を添加することにより、前記培養物のｐＨを３．５以上７．０以下に維持することを含む、請求項１記載の方法。
3. 前記培養物のｐＨを４．０以上６．０以下に維持することを含む、請求項２記載の方法。
4. 前記ラクトース含有アンモニア水が、アンモニア濃度１０％(w/v)以上のアンモニア水を用いて調製されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記トリコデルマ属糸状菌が、トリコデルマ・リーセイである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のセルラーゼを用いてバイオマスを糖化することを含む、グルコースの製造方法。