CN112805366A - 里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法 - Google Patents

里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112805366A
CN112805366A CN201980066036.0A CN201980066036A CN112805366A CN 112805366 A CN112805366 A CN 112805366A CN 201980066036 A CN201980066036 A CN 201980066036A CN 112805366 A CN112805366 A CN 112805366A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
mutation
seq
acid sequence
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201980066036.0A
Other languages
English (en)
Inventor
加川雄介
平松绅吾
山田胜成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
Publication of CN112805366A publication Critical patent/CN112805366A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及具有包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变的里氏木霉的突变株，优选为进一步在选自包含序列号6、7、9、10的任一项所示的氨基酸序列的多肽中的1种以上多肽中具有下述所示的突变的突变株，使用该突变株，能够在将培养液中的培养液的粘度保持得较低的同时，生产蛋白质、特别是纤维素酶。

Description

里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法
技术领域
本发明涉及能够将培养液的粘度保持得较低、蛋白质的制造能力提高的里氏木霉的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法。
背景技术
已知里氏木霉具有高的蛋白质制造能力，一直以来进行了使用里氏木霉的蛋白质的制造的研究。里氏木霉以纤维素、乳糖、纤维二糖等作为诱导物质，在蛋白质之中特别是制造被分类为糖化酶的纤维素酶。为了强化纤维素酶制造量，自古以来对于以控制纤维素酶制造的因子的过表达、缺损为代表的基因的改变、培养条件的最适化等进行了大量研究。
另一方面，木霉属菌属于生长繁殖、蛋白质的制造需要氧的好氧性丝状菌。另外，木霉属菌具有如果在液体培养基中培养，则随着增殖而培养液的粘度提高这样的特征。如果培养液的粘度提高，则氧、营养素的分布变得不均匀，因此在培养木霉属菌时，需要搅拌培养液、增加氧供应量来防止培养中的溶解氧饱和度的降低，将其维持在一定以上。另外，如果培养槽大型化，则氧体积传递系数降低，因此为了将培养中的溶解氧饱和度保持在一定以上，需要进一步增加搅拌数、氧供应量。然而，如果增加搅拌数，则存在付与菌体以大的剪切损伤这样的课题，还存在为了增加氧供应量而需要大的能量这样的课题。
专利文献1～6中分别公开了通过使木霉属菌的Sfb3、Mpg1、Gas1、Seb1、Crz1和Tps1的蛋白质的破坏或生成减少，与突变前的亲本株相比能够以更低的搅拌数维持深层培养中的好氧性发酵时的溶解氧量。另外，专利文献7中记载，如果破坏木霉属菌的BXL1基因，则能够抑制培养液的溶解氧饱和度的降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2013-533751号公报
专利文献2:日本特表2014-513529号公报
专利文献3:日本特表2014-513530号公报
专利文献4:日本特表2014-513531号公报
专利文献5:日本特表2014-513532号公报
专利文献6:日本特表2014-513533号公报
专利文献7:国际公开第2017/170917号
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，使用里氏木霉进行蛋白质的制造时，抑制培养液中的溶解氧浓度的降低、将其保持在一定以上是非常重要的。本发明者们考虑，如果在使用里氏木霉利用液体培养制造蛋白质时，能够将培养液的粘度保持得较低，则即使在将培养规模大型化的情况下，也能够降低搅拌所需的能量，并能够抑制培养液中的溶解氧饱和度的降低。
因此本发明的课题是获得培养液的粘度降低的里氏木霉的突变株和提供使用该里氏木霉的突变株的蛋白质的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明者为了特定能够将培养液的粘度保持得较低的里氏木霉的基因而进行了深入研究，结果发现，通过培养在包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽中具有突变的里氏木霉的突变株，优选为进一步在选自包含序列号6、7、9、10的任一项所示的氨基酸序列的多肽中的1种以上多肽中具有突变的突变株，能够将培养液的粘度保持得较低，进而能够抑制培养液中的溶解氧饱和度的降低，从而完成了本发明。
即，本发明由以下(1)～(14)构成。
(1)里氏木霉的突变株，具有包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
(2)根据(1)所述的突变株，所述突变是包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的从N末端侧起第1791位的天冬氨酸残基向除天冬氨酸以外的氨基酸残基的突变。
(3)根据(1)或(2)所述的突变株，进一步具有包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
(4)根据(3)所述的突变株，所述突变是在序列号6所示的氨基酸序列的从N末端侧起第137位翻译终止的终止密码子突变。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的突变株，进一步具有包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
(6)根据(5)所述的突变株，所述突变是包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域缺损的突变。
(7)根据(5)或(6)所述的突变株，所述突变是在序列号7所示的氨基酸序列的从N末端侧起第297位的天冬氨酸残基中发生的移码突变。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的突变株，进一步在包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的位于GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域之间的氨基酸序列中具有突变。
(9)根据(8)所述的突变株，所述突变是包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽中的从N末端侧起第184位的丝氨酸残基向除丝氨酸以外的氨基酸残基的突变。
(10)根据(1)～(9)的任一项所述的突变株，进一步具有包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
(11)根据(10)所述的突变株，所述突变是包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的脂肪酸羟化酶超家族结构域缺损的突变。
(12)根据(10)或(11)所述的突变株，所述突变是在序列号10所示的氨基酸序列的从N末端侧起第257位的异亮氨酸残基中发生的移码突变。
(13)蛋白质的制造方法，包括：培养(1)～(12)的任一项所述的突变株的工序。
(14)纤维素酶的制造方法，包括：培养(1)～(12)的任一项所述的突变株的工序。
发明的效果
本发明的里氏木霉的突变株与突变导入前的里氏木霉亲本株相比能够将培养液的粘度保持得较低，还能够抑制培养液中的溶解氧饱和度的降低。进而，还得到了蛋白质、特别是纤维素酶的制造量也提高这样的预料外的效果。
附图说明
图1：里氏木霉QM9414-H株的培养液中的粘度(相对值)的经时变化
图2：里氏木霉QM9414-H株的培养液中的溶解氧饱和度的经时变化
图3：里氏木霉QM9414-I株的培养液中的粘度(相对值)的经时变化
图4：里氏木霉QM9414-I株的培养液中的溶解氧饱和度的经时变化
图5：里氏木霉QM9414-J株的培养液中的粘度(相对值)的经时变化
图6：里氏木霉QM9414-J株的培养液中的溶解氧饱和度的经时变化
具体实施方式
本发明以通过在作为本来蛋白质的制造能力优异的微生物的里氏木霉的亲本株中导入突变而能够将培养液的粘度保持得较低为特征。因此，本发明中使用的里氏木霉的亲本株不限于野生株，以蛋白质制造能力提高的方式进行了改良的里氏木霉的突变株也可以优选作为亲本株使用。例如、里氏木霉的突变株中，可以利用通过诱变剂、紫外线照射等施加突变处理从而蛋白质的制造性提高了的突变株作为上述亲本株。作为上述亲本株使用的突变株的具体例，可列举相当于里氏木霉的祖先的Trichoderma parareesei(ATCC MYA-4777)、里作为里氏木霉来源的公知的突变株的QM6a株(NBRC31326)、QM9123株(ATCC24449)、QM9414株(NBRC31329)、PC-3-7株(ATCC66589)、QM9123株(NBRC31327)、RutC-30株(ATCC56765)、CL-847株(Enzyme.Microbiol.Technol.10，341-346(1988))、MCG77株(Biotechnol.Bioeng.Symp.8，89(1978))、MCG80株(Biotechnol.Bioeng.12，451-459(1982))和它们的派生菌株等。其中，QM6a株、QM9414株、QM9123株可以从NBRC(NITEBiological Resource Center)获得，PC-3-7株、RutC-30株可以从ATCC(American TypeCulture Collection)获得。
本发明是具有包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变的里氏木霉的突变株，优选为进一步在选自包含序列号6、7、9、10的任一项所示的氨基酸序列的多肽中的1种以上多肽中具有下述所示的突变的突变株。对于这些突变株，在本说明书中有时记载为本发明的突变株。另外，对于所述突变导入前的株，在本说明书中有时记载为亲本株。而且本发明的突变株与亲本株相比，培养液的粘度降低，培养液中的溶解氧饱和度的降低也被抑制。由此，能够降低通气搅拌所需的能量、旋转数。另外，因为能够将搅拌的旋转数设定得较低，所以也能够降低对菌丝的剪切损伤。特别是在大规模下培养时，能够实现通气所需的鼓风机、搅拌电动机的容量、搅拌能量的削减，因而更加有效。
以下对于本发明的突变株所具有的各多肽的突变进行具体说明。
包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的全长4373氨基酸的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的动力蛋白(Dynein)重链(EGR51787)登记。动力蛋白是在真核生物中发现的马达蛋白质的1种，是通过由ATP水解而得的能量，从而沿着以微管为代表的构成细胞骨架的微小管上移动的蛋白质。动力蛋白重链是构成动力蛋白的重链，形成动力蛋白的主要骨架，是承担将由ATP水解而得的能量转换成运动的功能的蛋白质(DEshel，Cytoplasmic dynein is required for normal nuclear segregation in yeast，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,Volume 90，1993，Issue 23，P11172-11176)。作为编码包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举里氏木霉QM6a株所具有的序列号3所示的碱基序列。
作为使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的方法，可列举导入使动力蛋白重链全部缺损、动力蛋白重链的一部分缺损那样的突变的方法，具体可列举对编码包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过碱基的缺失、插入、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
动力蛋白重链的缺损是指其多肽全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号8所示的氨基酸序列中，与上述所示的动力蛋白重链的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
所谓构成动力蛋白重链的氨基酸序列中具有突变，可以是氨基酸的缺失、替换、或添加的任一种。优选为序列号8所示的氨基酸序列的从N末端侧起第1791位的天冬氨酸残基向除天冬氨酸残基以外的氨基酸残基的突变，突变后的氨基酸残基不特别限定，更优选突变成天冬酰胺。作为编码序列号8所示的氨基酸序列的从N末端侧起第1791位的天冬氨酸残基突变成了除天冬氨酸以外的氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列的具体例，可列举在序列号3所示的碱基序列中作为第5541位的碱基的鸟嘌呤突变成了腺嘌呤的序列。通过该突变，序列号8所示的氨基酸序列的从N末端侧起第1791位的氨基酸残基由天冬氨酸突变成天冬酰胺。
另外，也可以通过导入使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的表达降低、或使表达消失的突变，从而使该多肽的功能降低，具体可以通过由编码序列号8所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变造成的多肽的表达量的降低或消失来实现。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。
包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽突变了的突变株中该多肽的功能是否降低或缺损，可以通过该突变株培养液相对于亲本株培养液的培养液粘度降低来确认。
包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的全长861氨基酸的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质(N-terminal binuclear Zn cluster-containing/DNA binding domain-containingprotein，EGR44896)登记。包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质具有由2个螺旋构成的基序，所述螺旋由在作为转录因子的GAL4的内部存在的与DNA结合的Zn2Cys6基序形成，因此被推定为与DNA结合的蛋白质，具有转录因子的功能。作为编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举里氏木霉序列号1所示的碱基序列。
作为使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损的方法，可列举导入使包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质全部缺损、使包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质一部分缺损那样的突变的方法，具体可列举对编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过碱基的缺失、插入、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质的缺损是指其多肽全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号2所示的氨基酸序列中，与上述所示的包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
根据National Center for Biotechnology Information的CDD Search Results(CDD搜索结果)，公开了从N末端侧起第272～307位的氨基酸残基是GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域，从N末端侧起第388～805位的氨基酸残基是真菌转录因子调控中部同源区，可以通过使位于这些的任一结构域内的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低。作为具体例，可列举通过在序列号1所示的碱基序列中将411位的鸟嘌呤替换成腺嘌呤从而插入终止密码子的突变，通过该突变，在序列号6所示的氨基酸序列的从N末端侧起第137位翻译终止，承担包含N-末端双核Zn簇/包含DNA结合结构域的蛋白质的功能的构成GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域和真菌转录因子调控中部同源区的氨基酸序列消失，因此作为本来的蛋白质的功能消失。
另外，也可以通过导入使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的表达降低、或使表达消失的突变，从而使该多肽的功能降低，具体可以通过由编码序列号6所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变造成的多肽的表达量的降低或消失来实现。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。
包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽突变了的突变株中该多肽的功能是否降低或缺损，可以通过该突变株培养液相对于亲本株培养液的培养液粘度降低来确认。
包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的全长1138氨基酸的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(EGR45926)登记。包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center forBiotechnology Information的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第468～721位的氨基酸残基是富含亮氨酸重复序列(LRRS)、核糖核酸酶抑制剂(RI)样亚家族结构域。由该记载推定，包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽与核糖核酸酶形成复合体，参与RNA的稳定化等。作为编码包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举里氏木霉QM6a株所具有的序列号2所示的碱基序列。
作为使包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的方法，可列举导入使富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域全部缺损、使富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域一部分缺损那样的突变的方法，具体可列举对编码包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过碱基的缺失、插入、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域的缺损是指其结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号7所示的氨基酸序列中，与上述所示的富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
作为序列号7所示的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的具体例，可列举由在序列号2所示的碱基序列中第988位插入1碱基的腺嘌呤造成的移码突变。通过该突变，序列号7所示的氨基酸序列的从N末端侧起第297位的氨基酸由天冬氨酸替换成精氨酸，以后移码的结果是，构成富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域的氨基酸序列消失，由此，作为本来的蛋白质的功能缺损或降低。
另外，也可以通过导入使包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的表达降低、或使表达消失的突变，从而使该多肽的功能降低或缺损，具体可以通过由编码序列号7所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变造成的多肽的表达量的降低或消失来实现。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。
包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽突变了的突变株中该多肽的功能是否降低或缺损，可以通过该突变株培养液相对于亲本株培养液的培养液粘度降低来确认。
包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的全长937氨基酸的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的假定蛋白(EGR48369)登记。包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽根据National Center for Biotechnology Information的Conserved DomainArchitecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第76～108位的氨基酸残基具有由作为转录因子的GAL4所具有的与DNA结合的Zn2Cys6基序构成的2个螺旋形成的结构域，从N末端侧起第303～681位的氨基酸残基具有真菌转录因子调控中部同源区结构域。由该记载推定，包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽至少参与丝状菌的转录调节。作为编码包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举里氏木霉QM6a株所具有的序列号4所示的碱基序列。
作为使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的方法，可列举导入使GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域和/或真菌转录因子调控中部同源区结构域全部缺损、使GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域和/或真菌转录因子调控中部同源区结构域一部分缺损、使GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域的构型关系变化、使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变方法。
GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域和/或真菌转录因子调控中部同源区结构域的缺损是指其结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号9所示的氨基酸序列中，与上述所示的GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域或真菌转录因子调控中部同源区结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域的构型关系的变化，是通过在位于GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域之间的氨基酸序列中引起氨基酸的缺失、替换、或添加的突变而进行的。GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域、真菌转录因子调控中部同源区结构域被称为蛋白质结构域，蛋白质结构域是构成蛋白质的序列结构的一部分、具有功能的存在。在存在多个结构域的情况下，因为由多个结构域构成的立体结构构成蛋白质的立体结构的一部分，所以如果结构域彼此的构型变化，则蛋白质的立体结构变化，蛋白质的功能降低。
如上，已知即使在结构域的氨基酸序列自身不发生氨基酸的缺失、替换、或添加等突变的情况下，也会通过在位于2个结构域之间的氨基酸序列发生氨基酸的缺失、替换、或添加等突变，从而蛋白质的功能降低。位于GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域之间的氨基酸在序列号9所示的氨基酸序列中是指第109～302位的氨基酸序列的区域。
所谓在位于GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域的之间的氨基酸序列中具有突变，可以是氨基酸的缺失、替换、或添加的任一种。优选为序列号9所示的氨基酸序列的从N末端侧起第184位的丝氨酸残基突变成除丝氨酸以外的氨基酸残基，突变后的氨基酸残基不特别限定，优选突变成天冬酰胺。作为编码序列号9所示的氨基酸序列的从N末端侧起第184位的丝氨酸残基突变成了除丝氨酸以外的氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列的具体例，可列举在序列号4所示的碱基序列中作为第550位的碱基的腺嘌呤突变成了胞嘧啶的序列。通过该突变，序列号9所示的氨基酸序列的从N末端侧起第184位的氨基酸残基由丝氨酸突变成精氨酸。
另外，也可以通过导入使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的表达降低、或使表达消失的突变，从而使该多肽的功能降低，具体可以通过由编码序列号9所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变造成的多肽的表达量的降低或消失来实现。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。
包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽突变了的突变株中该多肽的功能是否降低或缺损，可以通过该突变株培养液相对于亲本株培养液的培养液粘度降低来确认。
包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的全长342氨基酸的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(EGR53142)登记。包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽根据National Center for BiotechnologyInformation的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第147～264位的氨基酸残基具有脂肪酸羟化酶超家族结构域。由该记载推定，包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽具有参与玉米黄质合成等的β-胡萝卜素羟化酶、C-5固醇脱饱和酶、C-4甲基固醇氧化酶等的功能。作为编码包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举里氏木霉QM6a株所具有的序列号5所示的碱基序列。
作为使包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损的方法，可列举导入使脂肪酸羟化酶超家族结构域全部缺损、使脂肪酸羟化酶超家族结构域一部分缺损、使包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变的方法，具体地，可列举对编码包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过碱基的缺失、插入、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
脂肪酸羟化酶超家族结构域的缺损是指其结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号10所示的氨基酸序列中，与上述所示的F-box结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
作为使位于脂肪酸羟化酶超家族结构域内的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举由在序列号5所示的碱基序列中第769位插入1碱基的鸟嘌呤造成的移码突变。通过该突变，序列号10所示的氨基酸序列的从N末端侧起第257位的氨基酸由异亮氨酸替换成天冬氨酸，以后移码的结果是，构成脂肪酸羟化酶超家族结构域的氨基酸序列变短，推测本来的功能消失。
此外，也可以通过导入使包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、或使表达消失的突变，从而使该多肽的功能降低，具体可以通过由编码序列号10所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变造成的多肽的表达量的降低或消失来实现。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。或可以使其缺损。
包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽突变了的突变株中该多肽的功能是否降低或缺损，可以通过该突变株培养液相对于亲本株培养液的培养液粘度降低来确认。
向上述基因的突变导入可以使用对于本领域技术人员来说公知的利用诱变剂或紫外线照射等的突变处理、使用选择标志物的同源重组等基因重组、或者利用转座子的突变等现有的基因突变方法。
本发明的突变株如前所述是具有包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变的里氏木霉的突变株，优选为进一步在选自包含序列号6、7、9、10的任一项所示的氨基酸序列的多肽中的1种以上多肽中具有前述的突变的突变株，作为这些突变的组合可列举以下的组合。
包含序列号8和6所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8和7所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8和9所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6和7和所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6和9所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、7和9所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、7和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、9和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6、7和9所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6、7和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、6、9和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
包含序列号8、7、9和10所示的氨基酸序列的多肽具有所述突变的里氏木霉的突变株。
序列号6～10所示的氨基酸序列的多肽全部具有所述突变的里氏木霉的突变株。
前述的组合的突变株可以通过对于本领域技术人员来说公知的利用诱变剂或紫外线照射等的突变处理、使用选择标志物的同源重组等基因重组、或者利用转座子的突变等现有的基因突变方法来获得，但优选可以通过对成为亲本株的里氏木霉的孢子，使用亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、紫外线等进行基因突变处理，对所得的突变株的基因进行分析，筛选具有上述突变的突变株，从而获得。
本发明的突变株与该突变导入前的亲本株相比，培养液的粘度降低，培养液中的溶解氧饱和度的降低也能够被抑制。由此，能够降低通气搅拌所需的能量、旋转数。另外，因为能够将搅拌的旋转数设定得较低，所以也能够降低对菌丝的剪切损伤。特别是在大规模下培养时，能够实现通气所需的鼓风机、搅拌电动机的容量、搅拌能量的削减，因此更加有效。进而，本发明的突变株与该突变导入前的亲本株相比，蛋白质的制造能力提高，因此本发明的突变株的培养液与同一培养条件下得到的该突变导入前的亲本株的培养液相比，蛋白质浓度增加。另外，在蛋白质是酶的情况下，酶的比活性增加。这里，蛋白质浓度的增加率、酶的比活性的增加率只要增加就不特别限定，优选为20％以上。
本发明中，培养液的粘度使用在以下条件下测定的值，粘度的比较将在以下条件下测定的值中的最大值彼此比较。首先，将作为评价对象的里氏木霉的突变株和亲本株的孢子以每1mL预培养培养基中1.0×105孢子的方式接种到预培养培养基(具体的培养基组成的一例如实施例中的表1)中，用振荡培养机在28℃、120rpm的条件下进行培养直到菌体量为11g/L左右。接下来，相对于以100g/L(w/v)添加了Arbocel B800(レッテンマイヤー社制)的表2所示的主培养培养基，以10％(v/v)接种预培养培养基，使用5L缸式发酵槽进行深层培养。培养液的粘度的测定使用数字型旋转粘度计。数字型旋转粘度计预先进行0点校准。将从培养开始起17、24、41、48、65、72、89、111小时后、或从培养开始起24、48、71、89、113、137小时后的刚刚采集之后的培养液分别在指定容器中采集16mL，在培养液中浸入转轴(spindle)以0.3rpm的旋转数使其旋转，在室温条件下测定作为此时作用于转轴的粘性阻抗的扭矩，从而测定培养液的粘度。粘度的单位为厘泊(cP)。1泊定义为当流体内对于1cm有1cm/秒的速度梯度时，在与该速度梯度的方向垂直的面上对于速度的方向1cm2产生1达因的力的大小的应力的粘度。数字型旋转粘度计使用DV2T(BROOKFIELD社)，转轴使用ULADAPTOR(BROOKFIELD社)等。
如果将本发明的里氏木霉的突变株与将该突变导入前的亲本株在同样的条件下培养时相比较，则培养液的粘度变低，培养中的粘度的最大值优选降低80％以上、更优选降低70％以上、进一步优选降低60％以上、最优选降低50％以上。另外，作为绝对值，本发明的突变株的培养中的粘度的最大值与亲本株优选降低100cP以上、更优选降低200cP以上、更优选降低400cP以上、更优选降低500cP以上、进一步优选降低600cP以上、进一步优选降低700cP以上、进一步优选降低800cP以上、进一步优选降低900cP以上、特别优选降低1000cP以上。
培养液中的溶解氧饱和度可以通过测定培养液中的氧利用速率来计算出。本发明中的氧利用速率(mM/L/hr)是指培养开始24小时后的每单位时间、每1L培养液的氧消耗速率。具体的计算方法是，将培养条件保持一定进行培养，在培养开始后24小时的时刻停止氧的供应，每隔10秒将溶解氧(mg/L)的值(DO值)绘图，对于在该曲线中对数地减少的3点以上的绘图点，求出其斜率(A)(单位；DO/sec)。氧利用速率的计算中，公式使用以下所示的式1。
氧利用速率(mM/L/hr)＝(-A)×(1/32)×60×60```(式1)。
DO值的测定使用市售的DO计。对所使用的DO计不特别限制，只要能够正确地测定DO值即可。作为例子，可列举密闭型DO电极(エイブル株式会社制)、溶解氧传感器(メトラー`トレド株式会社制)等。DO计预先进行0点校准和量程校准。0点校准使用亚硫酸钠2％溶液进行。量程校准在实际培养的条件下在不存在菌体的状态下进行通气、搅拌，等待至溶解氧饱和，然后确认计器的指示值稳定，根据该温度下的饱和溶解氧进行校准。另外，在将培养槽加压进行DO测定时，需要进行压力修正。进而，在培养槽较大的情况下需要进行静水压力修正。进行修正时，使用以下所示的式2进行计算。
D＝DO(1+α+β)```(式2)
D：修正后的饱和溶解氧
DO：1大气压、纯水中的饱和溶解氧
α：表压(kg/cm2)
β：静水压(DO计安装位置的液深(m)/10)。
溶解氧饱和度使用不含菌的培养基，将pH、温度设定为培养条件，将以通气空气时的溶解氧的饱和状态作为100％的情况下的、培养期间的溶解氧相对于饱和溶解氧的比例作为溶解氧饱和度计算出。溶解氧(mg/L)表示溶解在水中的氧的浓度。饱和溶解氧是指在实际进行培养的培养条件下，在不存在菌体的状态下进行通气、搅拌，溶解氧变为一定的状态下的溶解氧。另外，在计算溶解氧饱和度时，培养期间不要使通气条件等培养条件变化。如果氧需求性降低，则溶解氧饱和度增加。溶解氧饱和度按照以下式3计算。
溶解氧饱和度(％)＝(培养中的溶解氧)/(培养开始前的饱和溶解氧)×100```(式3)。
在比较溶解氧饱和度时，将最小值彼此比较。
在比较氧利用速率、溶解氧饱和度时，使用使培养基、氧供应量、搅拌速度、温度、培养容量、接菌量等培养条件一致而测定的结果。测定时的接菌量相对于主培养液优选为10％(v/v)左右。
如果将本发明的突变株与亲本株的溶解氧在同样的条件培养，则突变株与亲本株相比溶解氧饱和度的最小值变高，优选变高5％以上、进一步优选变高6％以上、进一步优选变高7％以上、进一步优选变高8％以上、进一步优选变高9％以上、进一步优选变高10％以上、进一步优选变高11％以上、进一步优选变高12％以上、进一步优选变高13％以上、进一步优选变高14％以上、特别优选变高15％以上。
本发明的突变株优选与该突变导入前的亲本株相比增殖能力不降低。增殖能力的差异可以通过测定菌体量来比较。菌体量作为干燥菌体重量测定。将培养液10mL使用定性滤纸(等级4、GEヘルスケア社)进行抽吸过滤，使残渣与滤纸一起在100℃干燥。然后测定重量，将过滤前后的滤纸的重量差作为干燥菌体重量。
本发明的突变株除了前述的突变以外，还可以具有蛋白质制造量的提高和/或培养液的粘度降低、培养液中的溶解氧饱和度的降低被抑制的突变。具体地，可列举包含序列号11、13、15、17、19、22、24的任一项所示的氨基酸序列的多肽的突变。
包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)的EGR50654登记。包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for BiotechnologyInformation的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第95～277位的氨基酸残基具有Middle domain ofeukaryotic initiation factor 4G结构域(真核起始因子4G的中间结构域，以后记载为MIF4G结构域)，从N末端侧起第380～485位的氨基酸残基具有MA-3结构域。已知MIF4G和MA-3这两个结构域具有与DNA或RNA结合的功能(Biochem.44,12265-12272(2005)，Mol.Cell.Biol.1,147-156(2007))。根据这些记载推定包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽至少具有与DNA和/或RNA结合的功能。
作为编码包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号12所示的碱基序列。作为EGR50654的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR50654所具有的MIF4G结构域和/或MA-3结构域的全部缺损、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的一部分缺损、MIF4G结构域与MA-3结构域的构型关系变化的基因突变。进而，也可以通过导入使包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变从而使该多肽的功能降低或缺损。作为包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号12所示的碱基序列中第1039位至第1044位的任一碱基缺失的突变。
通过包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性提高。
包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)的EGR44419登记。包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for BiotechnologyInformation的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第26～499位的氨基酸残基具有糖(及其他)转运蛋白结构域。由该记载推定包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽至少参与菌体的内侧与外侧之间的糖的运输。
作为编码包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号14所示的碱基序列。作为EGR44419的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR44419所具有的糖(及其他)转运蛋白结构域全部缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域一部分缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的构型关系变化的基因突变。进而，通过导入使包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变也能够使该多肽的功能降低或缺损。作为包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号14所示的碱基序列中第1415位插入11个碱基的突变。
通过包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号13所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性和β-葡糖苷酶的比活性提高。
包含序列号15所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，作为里氏木霉QM6a株所具有的β-衔接蛋白大亚基EGR48910登记。包含序列号15所示的氨基酸序列的多肽是构成衔接体蛋白质的蛋白质之一，该衔接体蛋白质在真核生物中广泛保守，与网格蛋白结合，构成参与细胞内外、菌体内外的运输的囊泡(Proc.Nati.Acad.Sci.USA.101,14108-14113(2004))。
作为编码包含序列号15所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号16所示的碱基序列。作为EGR48910的基因突变，可列举在序列号16所示的碱基序列中作为第1080位的碱基的胞嘧啶向腺嘌呤的突变。
通过包含序列号15所示的氨基酸序列的多肽内具有突变，从而与包含序列号15所示的氨基酸序列的多肽内不具有突变的里氏木霉相比，液体培养时的培养液的粘性降低。
包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)的EGR45828登记。包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for BiotechnologyInformation的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第86～186位的氨基酸残基为heat shock factor(热激因子，HSF)型DNA结合结构域。已知HSF型DNA结合结构域具有与编码HSF的基因的上游区域结合的功能，所述HSF是控制热激蛋白的表达的转录因子(Cell，65(3)，363-366(1991))。
作为编码包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号18所示的碱基序列。作为EGR45828的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR45828所具有的HSF型DNA结合结构域全部缺损、HSF型DNA结合结构域一部分缺损、HSF型DNA结合结构域的构型关系变化的基因突变。进而，也可以通过导入使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变从而使该多肽的功能降低。作为包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号18所示的碱基序列中在第85位插入1碱基的鸟嘌呤的引起移码的突变。
通过包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号17所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性提高。
包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(EGR47155)登记。包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for BiotechnologyInformation的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第362～553位的氨基酸残基为TLD结构域。TLD结构域是功能未知的。作为编码包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号20所示的碱基序列。作为EGR47155的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR47155所具有的TLD结构域全部缺损、TLD结构域一部分缺损、TLD结构域的构型关系变化的基因突变。进而，也可以通过导入使包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变从而使该多肽的功能降低或缺损。作为包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号20所示的碱基序列中第6位插入序列号21所示的46个碱基的移码突变。
通过包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号19所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性提高。
包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(EGR48056)登记。包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for BiotechnologyInformation的Censerved Domain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第130～172位的氨基酸残基为F-box结构域。已知F-box结构域是在控制细胞周期的蛋白质内发现的结构域(Proc.Natl.Acad.Sci.，95，2417-2422(1998))。作为编码包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号23所示的碱基序列。作为EGR48056的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR48056所具有的F-box结构域全部缺损、F-box结构域一部分缺损、F-box结构域的构型关系变化的基因突变。进而，也可以通过导入使包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变从而使该多肽的功能降低或缺损。作为包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号23所示的碱基序列第499位的胞嘧啶单碱基缺损的移码突变。通过包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号22所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性提高。
包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉QM6a株所具有的糖基转移酶家族41,partial(不完全)(EGR46476)登记。糖基转移酶家族41是由2聚体的复合体构成的蛋白质(The EMBO Journal，27，2080-2788(2008))，具有在刚刚翻译之后的新生蛋白质通过高尔基复合体的过程中，使N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)转移到作为氨基酸残基的丝氨酸或苏氨酸残基的功能(Biochemistry，Fourth edition，11，280-281(1995))。作为编码包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号25所示的碱基序列。
作为EGR46476的功能降低或缺损的基因突变，可列举EGR46476所具有的糖基转移酶家族41,partial(不完全)全部缺损、糖基转移酶家族41,partial(不完全)一部分缺损、糖基转移酶家族41,partial(不完全)的构型关系变化的基因突变。进而，也可以通过导入使包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变从而使该多肽的功能降低或缺损。作为包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举通过在序列号25所示的碱基序列中第6261位的胞嘧啶突变成腺嘌呤从而插入终止密码子的突变。通过包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽的功能降低或缺损，从而与包含序列号24所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低或缺损的里氏木霉相比，蛋白质的生产性提高。
另外，本发明涉及蛋白质的制造方法，包括培养所述突变株的工序。
本发明中培养里氏木霉的培养方法不特别限定，可以通过例如使用离心管、烧瓶、罐式发酵罐、罐等的液体培养、使用平板等的固体培养等进行培养。里氏木霉优选在需氧条件下培养，在这些培养方法中，特别优选在罐式发酵罐、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深部培养。
本发明的方法中，能够作为分泌到菌体外的蛋白质有效地制造。所制造的蛋白质不特别限制，优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，进一步优选为纤维素酶。
本发明中制造的纤维素酶包含各种水解酶，包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为具体例，可列举通过水解纤维素链来制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分开始水解的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、水解纤维寡糖和纤维二糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、以作用于半纤维素、特别是木聚糖为特征的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、水解木寡糖的β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等。
如前所述，用于确认本发明的突变株的蛋白质制造能力提高的纤维素酶的蛋白质浓度和比活性的提高的确认，通过这些水解酶的比活性的任一者提高来确认。
纤维素酶的蛋白质浓度如下进行测定。将通过用本发明的方法培养木霉属丝状菌而得的培养液以15000×g离心分离10分钟，将上清作为纤维素酶溶液。在Quick StartBradford蛋白测定(Bio-Rad社制)250μL中添加稀释后的纤维素酶溶液5μL，测定室温静置15分钟后在595nm使用的吸光度。以牛血清白蛋白溶液作为标准液，基于标准曲线计算糖化酶溶液所包含的蛋白质浓度。
β-葡糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应10分钟。接着加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，计算出比活性。
β-木糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应30分钟。接着，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，计算出比活性。
纤维二糖水解酶比活性通过以下的方法测定。首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应60分钟。接着然后，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后，以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，计算出比活性。
本发明的里氏木霉的突变株的培养方法不特别限定，例如，可以通过使用离心沉降管、烧瓶、缸式发酵槽、罐等的液体培养、或使用板等的固体培养等来进行培养。在里氏木霉的突变株的情况下，优选在好氧条件下进行培养，这些培养方法中，特别优选在缸式发酵槽、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。通气量优选为0.1vvm～2.0vvm左右，更优选为0.3vvm～1.5vvm，特别优选为0.5vvm～1.0vvm。培养温度优选为25℃～35℃左右，更优选为25℃～31℃。培养中的pH条件优选为pH3.0～7.0，更优选为pH4.0～6.0。培养时间只要是进行到在能生产蛋白质的条件下回收的量的蛋白质积累的时间就不特别限制，通常为24～288小时、优选为24～240小时、更优选为36～240小时、进一步优选为36～192小时。
培养工序的培养基组成只要形成里氏木霉能够制造蛋白质那样的培养基组成就不特别限制，可以采用里氏木霉的周知的培养基组成。作为氮源，可使用例如，多聚胨、肉汁、CSL、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加用于制造蛋白质的诱导物质。
在通过本发明制造纤维素酶的情况下，可以用在培养基中包含选自乳糖、纤维素和木聚糖中的至少1种或2种以上的诱导剂的培养基进行培养。另外，纤维素、木聚糖可以添加包含纤维素、木聚糖的生物质作为诱导物质。作为含有纤维素、木聚糖的生物质的具体例，可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物分类为裸子植物和被子植物，任一种都优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，可列举甜菜浆、桉树、栎树、白桦等。
另外，包含纤维素、木聚糖的生物质可以使用进行了前处理的。前处理方法不特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的手法。作为进行了这样的前处理的包含纤维素、木聚糖的生物质，可以使用浆。
对培养里氏木霉的突变株而得的培养液所包含的蛋白质进行回收的方法不特别限定，可以从培养液中除去里氏木霉的菌体，回收蛋白质。作为菌体的除去方法，可列举离心分离法、膜分离法、压滤法等为例。
另外，在不从培养里氏木霉的突变株而得的培养液除去菌体而制成蛋白质的溶解液利用的情况下，优选进行处理使得里氏木霉的菌体在培养液中不能生长。作为进行处理使得菌体不能生长的方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、UV处理等。
在蛋白质是纤维素酶的这样的酶的情况下，可以将如上所述除去菌体或进行处理使得菌体不生长而得的培养液直接作为酶液利用。
实施例
以下列举实施例具体地说明本发明。
＜参考例1＞蛋白质浓度测定条件
使用的蛋白质浓度测定试剂：Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad制)
测定条件
测定温度：室温
蛋白质浓度测定试剂：250μL
丝状菌的培养液：5μL
反应时间：5分钟
吸光度：595nm
标准品：BSA。
＜参考例2＞溶解氧饱和度的计算
溶解氧饱和度使用不含菌的培养基，将pH、温度设定为培养条件，将以通气空气时的溶解氧的饱和状态作为100％的情况下的、培养期间的溶解氧相对于饱和溶解氧的比例作为溶解氧饱和度计算出。DO计使用密闭型溶解氧电极SDOC-12F-L120(エイブル株式会社制)。
＜参考例3＞培养液的粘度的测定
为了测定采集的培养液的粘度，将培养开始39、48、62、72、86、96、111小时后的培养液，使用数字型旋转粘度计DV2T和转轴LV-1(BROOKFIELD社制)，求出将旋转数设定为0.3rpm时的粘度(cP)。
＜参考例4＞菌体量的测定
为了测定培养液中所含的菌体量，将培养液用滤纸抽吸过滤，将抽吸过滤前后的滤纸的干燥菌体重量的差作为菌体量。
＜参考例5＞纤维素酶的比活性的测定条件
(β-葡糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
(β-木糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
(纤维二糖水解酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
＜实施例1＞使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的序列号1所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号26所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，制作包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到序列号1所示的碱基序列缺损了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号1所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉QM9414株按照常规方法提取的基因组DNA、和序列号27和28所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与KpnI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号29和30所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与KpnI、MluI与SpeI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号26所示的所得的DNA片段转化里氏木霉QM9414株。分子生物学的手法如Molecular cloning,laboratorymanual,1st,2nd,3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene,61,165-176(1987)所记载的那样进行。
＜实施例2＞使包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的序列号2所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号31所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，制作包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到序列号2所示的碱基序列缺损了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号2所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉QM9414株按照常规方法提取的基因组DNA、和序列号32和33所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号34和35所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶SwaI与AscI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、SwaI与AscI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与AscI处理，用序列号31所示的所得的DNA片段转化里氏木霉QM9414株。分子生物学的手法如Molecular cloning,laboratorymanual,1st,2nd,3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene,61,165-176(1987)所记载的那样进行。
＜实施例3＞使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的序列号3所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号36所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，制作包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到序列号3所示的碱基序列缺损了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号3所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉QM9414株按照常规方法提取的基因组DNA、和序列号37和38所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号39和40所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、MluI与SpeI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号36所示的所得的DNA片段转化里氏木霉QM9414株。分子生物学的手法如Molecular cloning,laboratorymanual,1st,2nd,3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene,61,165-176(1987)所记载的那样进行。
(突变株的制作·评价)
按照前述的方法，获得包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株QM9414-J株。
＜实施例4＞使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的序列号4所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号41所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，制作包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到序列号4所示的碱基序列缺损了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号4所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉QM9414株按照常规方法提取的基因组DNA、和序列号42和43所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号44和45所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、MluI与SpeI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号41所示的所得的DNA片段转化里氏木霉QM9414株。分子生物学的手法如Molecular cloning,laboratorymanual,1st,2nd,3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene,61,165-176(1987)所记载的那样进行。
＜实施例5＞使包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽缺损了的里氏木霉的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的序列号5所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号46所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉QM9414株中，制作包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株。通过该方法，得到序列号5所示的碱基序列缺损了的里氏木霉的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号5所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉QM9414株按照常规方法提取的基因组DNA、和序列号47和48所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号49和50所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶SalI与SphI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、SalI与SphI的限制性酶导入到插入有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SphI处理，用序列号46所示的所得的DNA片段转化里氏木霉QM9414株。分子生物学的手法如Molecular cloning,laboratorymanual,1st,2nd,3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene,61,165-176(1987)所记载的那样进行。
＜实施例6＞里氏木霉的突变株的培养试验
(预培养)
将实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的孢子分别用生理盐水稀释为1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液2.5mL接种到表1所示的加入到1L带挡板的烧瓶中的250mL的预培养基中，利用振荡培养机以28℃、120rpm的条件进行72小时培养。作为对照，使用里氏木霉QM9414株，进行以下同样的实验操作。
表1
Figure BDA0003009417350000321
*5×マルデルス溶液为以下组成
7g/L(NH4)2SO4
10g/L KH2PO4
2g/L CaCl2·2H2O
1.5g/L MgSO4·7H2O
**10×酒石酸铵溶液包含92g/L酒石酸铵
***微量元素溶液为以下组成
0.3g/L H3BO3
1.3g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O
5g/L FeCl3·6H2O
2g/L CuSO4·5H2O
0.4g/L MnCl2·4H2O
10g/L ZnCl2
(主培养)
将Arbocel B800(レッテンマイヤー社)添加到表2所示的主培养培养基中，使用5L缸式发酵槽(バイオット社制)进行深层培养研究。
将里氏木霉QM9414株和实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的预培养液250mL接种到添加了Arbocel B800的主培养培养基2.5L中。
培养条件是，在主培养培养基中接种预培养培养基后，以28℃、700rpm、通气量100mL/min的培养条件一边控制pH5.0一边进行深层培养。
表2
Figure BDA0003009417350000331
*与表1相同。
***与表1相同。
(培养液的采集)
从培养开始到培养终止时的120小时经过后，经时地分别采集培养液20mL。将采集的培养液的一部分在15000×g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液而在以下实验中使用。
(蛋白质浓度的测定)
使用参考例1中记载的手法，测定在培养开始经过120小时后采集的培养液中的纤维素酶的蛋白质浓度。其结果是，实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的培养液中的蛋白质浓度与里氏木霉QM9414株的培养液中的蛋白质浓度相比变高。特别是实施例3中获得的使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽缺损了的QM9414-J株，与里氏木霉QM9414株相比，作为相对值蛋白质浓度高1.3倍。
(培养液中的溶解氧饱和度的测定)
使用参考例2中记载的手法，测定在实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的培养液中的经时的溶解氧饱和度。其结果是实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的培养液中的溶解氧饱和度比里氏木霉QM9414株变高。
另外，将QM9414和实施例3中获得的QM9414-J株的培养液中的溶解氧的经时的变化示于图6。QM9414株和QM9414-J株的培养液中的溶解氧浓度分别在从培养开始第80小时左右、60小时左右变成最小值，M9414-J株的最小溶解氧浓度比亲本株的QM9414的最小溶解氧浓度高20％左右。
(培养液的粘度的测定)
使用参考例3中记载的手法，测定实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的培养液中的经时粘度。其结果是实施例1～5中制作的里氏木霉的突变株的最大粘度比里氏木霉QM9414株变低。
另外，将以里氏木霉QM9414株的值作为1时的实施例3中获得的QM9414-J株的粘度的相对值示于图5。其结果是QM9414-J株的培养期间中的培养液的粘度比QM9414株变低。QM9414株和QM9414-J株的培养液中的粘度在从培养开始经过71小时左右变为最大。QM9414-J株的最大粘度降低到亲本株的QM9414株的最大粘度的40％左右。
(菌体量的测定)
使用参考例4中记载的手法，测定实施例6(预培养)在刚刚培养之后的的菌体量。其结果是不能在包含序列号6～10的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株与里氏木霉QM9414株之间确认菌体量的差。特别是实施例3中获得的使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽缺损了的QM9414-J株与里氏木霉QM9414株相比，不能确认菌体量的差。
(酶活性的测定)
用参考例5的条件，作为培养中途采集的培养液中的纤维素酶的比活性，分别测定β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶的比活性。测定405nm的吸光度的增加，将每1分钟游离1μmol的底物的活性作为1U，从而计算出比活性。其结果是，包含序列号6～10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉的突变株的培养液中的上述3种比活性与里氏木霉QM9414株的培养液中的比活性相比变高。特别是与里氏木霉QM9414株相比，实施例3中获得的QM9414-J株作为相对值，β-葡糖苷酶比活性高1.2倍、β-木糖苷酶比活性高1.2倍、纤维二糖水解酶比活性高1.1倍。
＜实施例7＞在包含序列号6～8所示的氨基酸序列的多肽中具有突变的里氏木霉的突变株的制作
对作为里氏木霉QM9414株的传代株的QM9414-G株进行基因突变处理，获得作为突变株的QM9141-H株。关于基因突变处理，将QM9414-G株的孢子以在表1所示的预培养培养基每1mL中成为1.0×105孢子的方式进行接种，将预培养培养基15mL培养半天后进行离心分离，回收孢子。然后，将回收的孢子用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)悬浮制成10mL的孢子溶液，向其中添加用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)溶解成1.0g/L的NTG溶液0.5mL，进行28℃、100分钟的基因突变处理。基因突变处理后的孢子通过离心分离回收之后，用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)洗涤3次，最终用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)10mL悬浮，将所得的产物作为基因突变处理孢子。
将该基因突变处理孢子添加到添加结晶纤维素而制备的琼脂培养基中，以在集落周围产生的作为由纤维素酶造成的结晶纤维素分解区域的晕的大小作为指标，挑选晕大的QM9414-H株。
QM9414-G株和QM9414-H株的基因分析的结果是，在QM9414-G株中保持着编码包含序列号6～10所示的氨基酸序列的多肽的基因，但在QM9414-H株中能够确认以下(1)～(3)所示的3处突变。
(1)序列号1所示的碱基序列的第411位的鸟嘌呤突变成了腺嘌呤。该突变是在序列号6所示的氨基酸序列的第137位插入终止密码子的突变。
(2)在序列号2所示的碱基序列的第988位插入了1碱基的腺嘌呤。该突变是从序列号7所示的氨基酸序列的第297位开始插入移码的突变。
(3)序列号3所示的碱基序列的第5541位的鸟嘌呤突变成了腺嘌呤。该突变是将序列号8所示的氨基酸序列的第1791位的天冬氨酸替换成天冬酰胺的突变。
＜实施例8＞里氏木霉的突变株的培养试验
对于实施例7中获得的QM9414-H株，通过与实施例6同样的方法进行培养，用参考例2和参考例3的条件测定培养液中的最大粘度(cP)和培养液中的最小溶解氧饱和度(％)。对照使用QM9414-G株。将以QM9414-G株的值作为1时的QM9414-H株的粘度的相对值示于图1。另外，将培养期间中的QM9414-G株和QM9414-H株的溶解氧的经时的变化示于图2。
它们的结果是，QM9414-H株的培养期间中的培养液的粘度比QM9414-G株变低。QM9414-H株和QM9414-G株的培养液中的粘度在从培养开始分别经过24小时左右时、经过41小时左右时变为最大。QM9414-H株的最大粘度降低到亲本株的QM9414-G株的最大粘度的40％左右。
培养液中的溶解氧浓度也在QM9414-H株中比QM9414-G株变高。QM9414-H株和QM9414-G株的培养液中的溶解氧浓度都在培养开始后经过36小时左右时变为最小值，QM9414-H株的经过36时的溶解氧浓度与亲本株的QM9414-G株相比变高25％左右。
＜实施例9＞在包含序列号9、10所示的氨基酸序列的多肽内具有突变的里氏木霉的突变株的制作
对作为里氏木霉QM9414株的传代株的实施例7中获得的QM9414-H株进行基因突变处理，获得作为突变株的QM9141-I株。关于基因突变处理，将QM9414-H株的孢子以在表1所示的预培养培养基每1mL中成为1.0×105孢子的方式进行接种，将预培养培养基15mL培养半天后进行离心分离，回收孢子。然后，将回收的孢子用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)悬浮制成10mL的孢子溶液，向其中添加用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)溶解成1.0g/L的NTG溶液0.5mL，进行28℃、100分钟的基因突变处理。基因突变处理后的孢子用离心分离回收之后，用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)洗涤3次，最终用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)10mL悬浮，将所得的产物作为基因突变处理孢子。将该基因突变处理孢子添加到添加结晶纤维素而制备的琼脂培养基中，以在集落周围产生的作为由纤维素酶造成的结晶纤维素分解区域的晕的大小作为指标，挑选晕大的QM9414-I株。
QM9414-H株和QM9414-I株的基因分析的结果是，在QM9414-H株中保持着编码包含序列号9和10所示的氨基酸序列的多肽的基因，但在QM9414-I株中能够确认以下2处突变。
(1)序列号4所示的碱基序列的第550位的腺嘌呤突变成了胞嘧啶。该突变是将序列号9所示的氨基酸序列的第184位的丝氨酸替换成精氨酸的突变。
(2)序列号5所示的碱基序列的第769位插入了1碱基的鸟嘌呤。该突变是从序列号10所示的氨基酸序列的第257位开始插入移码的突变。
＜实施例10＞里氏木霉的突变株的培养试验
对于实施例9中获得的QM9414-I株，用与实施例6同样的方法进行培养，用参考例1、参考例2、参考例3、参考例5的条件，分别测定培养液中的培养液中的最大粘度、培养液中的最小溶解氧饱和度、蛋白质浓度、纤维素酶的比活性。对照使用QM9414-H株。将以QM9414-H株的值为1时的QM9414-I株的粘度的相对值示于图3。另外，将培养期间中的QM9414-H株和QM9414-I株的溶解氧的经时的变化示于图4。
它们的结果是QM9414-I株的培养液中的粘度比QM9414-H株变低。QM9414-I株和QM9414-H株的培养液中的粘度在从培养开始经过24小时左右时变为最大。QM9414-I株经过24小时时的粘度降低到作为亲本株的QM9414-H株的75％左右。
培养液中的溶解氧浓度也是QM9414-I株与QM9414-H株相比变高。QM9414-H株和QM9414-I株的培养液中的溶解氧浓度均在经过36小时左右时变为最小值，QM9414-I株经过36小时时的溶解氧浓度与亲本株的QM9414-H株相比变高37％左右。
另外，与QM9414-H株相比，QM9414-I株蛋白质浓度变高1.11倍、β-葡糖苷酶比活性变高1.07倍、β-木糖苷酶比活性变高1.40倍、纤维二糖水解酶比活性变高1.03倍。
Figure IDA0003009417430000011
Figure IDA0003009417430000021
Figure IDA0003009417430000031
Figure IDA0003009417430000041
Figure IDA0003009417430000051
Figure IDA0003009417430000061
Figure IDA0003009417430000071
Figure IDA0003009417430000081
Figure IDA0003009417430000091
Figure IDA0003009417430000101
Figure IDA0003009417430000111
Figure IDA0003009417430000121
Figure IDA0003009417430000131
Figure IDA0003009417430000141
Figure IDA0003009417430000151
Figure IDA0003009417430000161
Figure IDA0003009417430000171
Figure IDA0003009417430000181
Figure IDA0003009417430000191
Figure IDA0003009417430000201
Figure IDA0003009417430000211
Figure IDA0003009417430000221
Figure IDA0003009417430000231
Figure IDA0003009417430000241
Figure IDA0003009417430000251
Figure IDA0003009417430000261
Figure IDA0003009417430000271
Figure IDA0003009417430000281
Figure IDA0003009417430000291
Figure IDA0003009417430000301
Figure IDA0003009417430000311
Figure IDA0003009417430000321
Figure IDA0003009417430000331
Figure IDA0003009417430000341
Figure IDA0003009417430000351
Figure IDA0003009417430000361
Figure IDA0003009417430000371
Figure IDA0003009417430000381
Figure IDA0003009417430000391
Figure IDA0003009417430000401
Figure IDA0003009417430000411
Figure IDA0003009417430000421
Figure IDA0003009417430000431
Figure IDA0003009417430000441
Figure IDA0003009417430000451
Figure IDA0003009417430000461
Figure IDA0003009417430000471
Figure IDA0003009417430000481
Figure IDA0003009417430000491
Figure IDA0003009417430000501
Figure IDA0003009417430000511
Figure IDA0003009417430000521
Figure IDA0003009417430000531
Figure IDA0003009417430000541
Figure IDA0003009417430000551
Figure IDA0003009417430000561
Figure IDA0003009417430000571
Figure IDA0003009417430000581
Figure IDA0003009417430000591
Figure IDA0003009417430000601
Figure IDA0003009417430000611
Figure IDA0003009417430000621
Figure IDA0003009417430000631
Figure IDA0003009417430000641
Figure IDA0003009417430000651
Figure IDA0003009417430000661
Figure IDA0003009417430000671
Figure IDA0003009417430000681
Figure IDA0003009417430000691
Figure IDA0003009417430000701
Figure IDA0003009417430000711
Figure IDA0003009417430000721
Figure IDA0003009417430000731
Figure IDA0003009417430000741
Figure IDA0003009417430000751
Figure IDA0003009417430000761
Figure IDA0003009417430000771
Figure IDA0003009417430000781
Figure IDA0003009417430000791
Figure IDA0003009417430000801
Figure IDA0003009417430000811
Figure IDA0003009417430000821
Figure IDA0003009417430000831
Figure IDA0003009417430000841
Figure IDA0003009417430000851
Figure IDA0003009417430000861
Figure IDA0003009417430000871
Figure IDA0003009417430000881
Figure IDA0003009417430000891
Figure IDA0003009417430000901
Figure IDA0003009417430000911
Figure IDA0003009417430000921
Figure IDA0003009417430000931
Figure IDA0003009417430000941
Figure IDA0003009417430000951
Figure IDA0003009417430000961
Figure IDA0003009417430000971
Figure IDA0003009417430000981
Figure IDA0003009417430000991
Figure IDA0003009417430001001
Figure IDA0003009417430001011
Figure IDA0003009417430001021
Figure IDA0003009417430001031
Figure IDA0003009417430001041
Figure IDA0003009417430001051
Figure IDA0003009417430001061
Figure IDA0003009417430001071
Figure IDA0003009417430001081
Figure IDA0003009417430001091
Figure IDA0003009417430001101
Figure IDA0003009417430001111
Figure IDA0003009417430001121
Figure IDA0003009417430001131
Figure IDA0003009417430001141
Figure IDA0003009417430001151
Figure IDA0003009417430001161
Figure IDA0003009417430001171
Figure IDA0003009417430001181
Figure IDA0003009417430001191
Figure IDA0003009417430001201
Figure IDA0003009417430001211
Figure IDA0003009417430001221
Figure IDA0003009417430001231
Figure IDA0003009417430001241
Figure IDA0003009417430001251
Figure IDA0003009417430001261
Figure IDA0003009417430001271
Figure IDA0003009417430001281
Figure IDA0003009417430001291
Figure IDA0003009417430001301
Figure IDA0003009417430001311
Figure IDA0003009417430001321
Figure IDA0003009417430001331
Figure IDA0003009417430001341
Figure IDA0003009417430001351
Figure IDA0003009417430001361
Figure IDA0003009417430001371
Figure IDA0003009417430001381
Figure IDA0003009417430001391
Figure IDA0003009417430001401
Figure IDA0003009417430001411
Figure IDA0003009417430001421
Figure IDA0003009417430001431
Figure IDA0003009417430001441
Figure IDA0003009417430001451
Figure IDA0003009417430001461
Figure IDA0003009417430001471
Figure IDA0003009417430001481
Figure IDA0003009417430001491

Claims (14)

1.里氏木霉的突变株，具有包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
2.根据权利要求1所述的突变株，所述突变是包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的从N末端侧起第1791位的天冬氨酸残基向除天冬氨酸以外的氨基酸残基的突变。
3.根据权利要求1或2所述的突变株，进一步具有包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
4.根据权利要求3所述的突变株，所述突变是在序列号6所示的氨基酸序列的从N末端侧起第137位翻译终止的终止密码子突变。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的突变株，进一步具有包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
6.根据权利要求5所述的突变株，所述突变是包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的富含亮氨酸重复序列、核糖核酸酶抑制剂样亚家族结构域缺损的突变。
7.根据权利要求5或6所述的突变株，所述突变是在序列号7所示的氨基酸序列的从N末端侧起第297位的天冬氨酸残基中发生的移码突变。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的突变株，进一步在包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的位于GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域与真菌转录因子调控中部同源区结构域之间的氨基酸序列中具有突变。
9.根据权利要求8所述的突变株，所述突变是包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽中的从N末端侧起第184位的丝氨酸残基向除丝氨酸以外的氨基酸残基的突变。
10.根据权利要求1～9的任一项所述的突变株，进一步具有包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
11.根据权利要求10所述的突变株，所述突变是包含序列号10所示的氨基酸序列的多肽的脂肪酸羟化酶超家族结构域缺损的突变。
12.根据权利要求10或11所述的突变株，所述突变是在序列号10所示的氨基酸序列的从N末端侧起第257位的异亮氨酸残基中发生的移码突变。
13.蛋白质的制造方法，包括：培养权利要求1～12的任一项所述的突变株的工序。
14.纤维素酶的制造方法，包括：培养权利要求1～12的任一项所述的突变株的工序。
CN201980066036.0A 2018-10-11 2019-10-10 里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法 Withdrawn CN112805366A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018192641 2018-10-11
JP2018-192641 2018-10-11
PCT/JP2019/039935 WO2020075788A1 (ja) 2018-10-11 2019-10-10 トリコデルマ・リーセイの変異株およびタンパク質の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112805366A true CN112805366A (zh) 2021-05-14

Family

ID=70164559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980066036.0A Withdrawn CN112805366A (zh) 2018-10-11 2019-10-10 里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210388410A1 (zh)
JP (1) JPWO2020075788A1 (zh)
CN (1) CN112805366A (zh)
BR (1) BR112021006248A2 (zh)
WO (1) WO2020075788A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3778864A4 (en) * 2018-03-26 2021-12-15 Toray Industries, Inc. TRICHODERMA REESEI MUTANT AND PROTEIN PRODUCTION PROCESS
WO2023171644A1 (ja) 2022-03-08 2023-09-14 東レ株式会社 ろ過助剤、ろ過処理方法およびセルラーゼの製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101348124B1 (ko) * 2005-07-19 2014-01-07 혹꼬우 가가꾸 고오교오 가부시끼가이샤 미생물에 의한 ｎ-아세틸-ｄ-글루코사민의 발효 생산방법
WO2012145598A1 (en) * 2011-04-22 2012-10-26 Danisco Us Inc. Filamentous fungi having an altered viscosity phenotype
CN108795988B (zh) * 2017-05-04 2022-07-29 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用
CN112639074A (zh) * 2018-08-29 2021-04-09 东丽株式会社 里氏木霉突变株和蛋白质的制造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20210388410A1 (en) 2021-12-16
BR112021006248A2 (pt) 2021-07-06
WO2020075788A1 (ja) 2020-04-16
JPWO2020075788A1 (ja) 2021-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112513249B (zh) 木霉属丝状菌的突变株和蛋白质的制造方法
JP7388195B2 (ja) トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法
CN112805366A (zh) 里氏木霉的突变株和蛋白质的制造方法
JP7388194B2 (ja) トリコデルマ・リーセイの変異株およびそれを用いたタンパク質の製造方法
WO2020075787A1 (ja) トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法
JP7400468B2 (ja) トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法
US9765347B2 (en) Transformant of Schizosaccharomyces pombe mutant and cloning vector
CN114981405B (zh) 木霉属丝状菌突变株
JP7334620B2 (ja) トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法
WO2012060389A1 (ja) シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210514