JP7400468B2 - トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下している、トリコデルマ属糸状菌の変異株。
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、少なくともN末端側から413番目以降のアミノ酸残基が欠損している(1)に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株。
(3)(1)または(2)に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
(4)(1)または(2)に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
(5)(1)または(2)に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を、ラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも1種類または2種類以上の誘導剤を含む培地で培養する工程を含む、(4)に記載のセルラーゼの製造方法。
(6)セルロース含有バイオマスから糖を製造する方法であって、以下の工程:
工程a:配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているトリコデルマ・リーセイの変異株を培養し、セルラーゼを製造する工程
工程b:工程aで得られたセルラーゼを用いて、前記バイオマスを糖化する工程
を含む、糖の製造方法。
タンパク質濃度測定試薬(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio-Rad社製)を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬250μLに希釈した糸状菌の培養液を5μL添加し、室温で5分間静置後の595nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてBSAを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
(β-グルコシダーゼ比活性測定方法)
1mMp-ニトロフェニル-β-グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加して30℃で10分間反応させた。その後2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
1mMp-ニトロフェニル-β-キシロピラノシド(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
1mMp-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で60分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースArbocel(登録商標)B800(レッテンマイヤー社製)または平均粒径100μmに粉末化したバガスを使用した。酵素液としては、トリコデルマ・リーセイまたはトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液を1mL採取して遠心分離し、菌体を除去した上清を回収し、さらに0.22μmのフィルターでろ過したろ液を用いた。なお、木材原料粉末セルロースArbocel(登録商標) B800(レッテンマイヤー社製)は、以降Arbocel B800と記載する場合がある。
糖化反応は以下のようにして行った。2mLチューブの中にArbocel(登録商標)B800もしくは平均粒径100μmに粉末化したバガスと、酢酸ナトリウムバッファー(pH5.2)を終濃度0.1Mになるように添加し、固形分濃度が反応開始時にArbocel(登録商標)B800を用いた際には8重量%、バガスを用いた際には10重量%となるように純水を加えた。さらに、酵素液を添加し、ヒートブロックローテーターを用いて、50℃の反応条件で反応を開始した。24時間糖化反応後のサンプルを10,000×gの条件下で10分間遠心分離を行い、上清を分取し、上清のボリュームの10分の1量の1N 水酸化ナトリウム水溶液を添加し、糖化反応を停止させた。反応停止後の糖化液中の糖濃度を下記に示すUPLCによる糖分析に供した。糖化反応に用いる酵素液は、培養液のタンパク質濃度と、比活性から各実施例または比較例の条件に合うように添加量を算出して用いた。
グルコース、キシロース、セロビオースは、ACQUITY(登録商標)UPLC システム(Waters)を用いて、以下の条件で定量分析した。
グルコース、キシロース、セロビオースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。セロビオースが1g/Lより低い値の場合は、検出限界以下とした。
カラム:AQUITY(登録商標)UPLC BEH Amide 1.7μm2.1×100mm Column
分離法:HILIC
移動相:移動相A:80%アセトニトリル、0.2%TEA水溶液、移動相B:30%アセトニトリル、0.2%TEA水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件:(A99.90%、B0.10%)、開始2分後:(A96.70%、B3.30%)、開始3.5分後:(A95.00%、B5.00%)、開始3.55分後:(A99.90%、B0.10%)、開始6分後:(A99.90%、B0.10%)。
検出方法:ELSD(蒸発光散乱検出器)
流速:0.3mL/min
温度:55℃。
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株は以下のとおり作製した。配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下した配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を含むDNA断片として、配列番号3で表される遺伝子配列からなるDNA断片を作製し、当該DNA断片をトリコデルマ・リーセイ QM9414株に形質転換することで作製した。この方法により、配列番号1において、1415番目に11塩基が挿入し、配列番号2において、419番目で翻訳が終了するポリペプチドを有するトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。DNA断片導入のための選択マーカーとしてアセトアミドおよびアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ(AmdS)遺伝子(amdS)を使用した。amdSを含むDNA配列の上流および下流に、上記の配列番号3で表される塩基配列からなるDNA断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ QM9414株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
(フラスコ培養)
実施例1で作製したQM9414変異株Iの胞子を1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液0.1mLを表1または表2に示した50mLバッフル付フラスコへ入れた10mLのフラスコ培地へ接種させ、振盪培養機にて28℃、120rpmの条件にて120時間培養を行った。培養液中に含まれるタンパク質濃度を参考例1に記載の方法で、セルラーゼの各種比活性を参考例2に記載の方法で測定した。表1の培地で培養した際の結果を表3に、表2の培地で培養した際の結果を表4に示す。
培養開始120時間後に1mL培養液を採取した。培養液を15,000×g、4℃の条件下で10分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。
参考例1で記載した手法を用い、培養開始120時間目の培養液におけるタンパク質濃度を測定し、続いて参考例2に記載の方法でセルラーゼの比活性を測定した。結果を表3と表4に示す。
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号10で表される遺伝子配列からなるDNA断片を作製し、当該DNA断片をトリコデルマ・リーセイ QM9414株に形質転換することで作製した。この方法により、配列番号1において、435番目と436番目の間にamdSが挿入され、配列番号2の機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。amdSを含むDNA配列の上流および下流に、上記の配列番号10で表される塩基配列からなるDNA断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイQM9414株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
実施例1で作製したQM9414変異株Iの代わりにQM9414変異株IIを用いた以外は、実施例2と同様の操作・条件で培養を行い、培養液中に含まれるタンパク質濃度と、セルラーゼの各種比活性を測定した。結果を表3と表4に示す。
実施例1で作製したQM9414変異株Iの代わりにトリコデルマ・リーセイ QM9414株を用いた以外は、実施例2と同様の操作・条件で培養を行い、実施例2と同様の方法で培養液中に含まれるタンパク質濃度とセルラーゼの各種比活性を測定した。表1の培地で培養した際の結果を表3に、表2の培地で培養した際の結果を表4に示す。
実施例2で得られたQM9414変異株Iの表1に示す培地を用いた培養開始から120時間目の培養液を用いて、表5および参考例3に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。セルロース含有バイオマスとして、Arbocel(登録商標)B800または粉末バガスを用いた。結果を表6に示す。
実施例4で得られたQM9414変異株IIの培養液のうち、表1に記載の培地で培養した際の培養開始から120時間目の培養液を用いて、参考例3に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。Arbocel(登録商標)B800の糖化反応は、表7に、粉末バガスの糖化反応は表8にそれぞれ反応条件を示す。結果を表9に示す。
比較例1で得られたトリコデルマ・リーセイ QM9414株の培養液のうち、表1に記載の培地で培養した際の培養開始から120時間目の培養液を用いた以外は、実施例5または6と同様の操作・条件でセルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。結果を表6と9に示す。
実施例4で得られたQM9414変異株IIの培養液のうち、表2に記載の培地で培養した際の培養開始から120時間目の培養液を用いて、表6および参考例3に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。Arbocel(登録商標)B800の糖化反応は、表10に、粉末バガスの糖化反応は表11にそれぞれ反応条件を示す。結果を表12に示す。
比較例1で得られたトリコデルマ・リーセイ QM9414株の培養液のうち、表2に記載の培地で培養した際の培養開始から120時間目の培養液を用いた以外は、実施例7と同様の操作・条件でセルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。結果を表12に示す。
実施例5と比較例2の結果から、表1に記載の培地の培養にて得られた培養液を用いたArbocel(登録商標) B800の糖化反応において、トリコデルマ・リーセイ QM9414株のセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度は3.3g/Lであるのに対し、QM9414変異株Iを用いた場合では4.8g/Lであった。また、糖化液に含まれるキシロース濃度は、QM9414株を用いた場合では3.9g/Lであるのに対し、QM9414変異株Iを用いた場合では4.9g/Lであった。
Claims (5)
- トリコデルマ・リーセイ QM6a株と比較して配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させた、トリコデルマ・リーセイの変異株。
- 請求項1に記載のトリコデルマ・リーセイの変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
- 請求項1に記載のトリコデルマ・リーセイの変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
- 請求項1に記載のトリコデルマ・リーセイの変異株を、ラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも1種類または2種類以上の誘導剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項3に記載のセルラーゼの製造方法。
- セルロース含有バイオマスから糖を製造する方法であって、以下の工程:
工程a:トリコデルマ・リーセイ QM6a株と比較して配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させたトリコデルマ・リーセイの変異株を培養し、セルラーゼを製造する工程
工程b:工程aで得られたセルラーゼを用いて、前記バイオマスを糖化する工程
を含む、糖の製造方法。
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