WO2023171644A1 - ろ過助剤、ろ過処理方法およびセルラーゼの製造方法 - Google Patents
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Classifications
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- B01D37/02—Precoating the filter medium; Addition of filter aids to the liquid being filtered
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- B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
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Definitions
- the present invention relates to a filter aid whose active ingredients are a mixture of an inorganic filter aid and a filamentous fungus culture, a filtration treatment method using the filter aid, and a cellulase production method using the filter aid.
- Trichoderma filamentous fungi produce cellulases, which are classified as saccharifying enzymes among proteins, using cellulose, lactose, cellobiose, and the like as inducers.
- Cellulase is used as a saccharifying enzyme to hydrolyze cellulose-containing biomass to produce sugar, but as the first step to obtain cellulase from the culture solution of cellulase-containing Trichoderma filamentous fungi, cellulase-containing Trichoderma Trichoderma filamentous cells and turbidity in the culture solution are removed from the genus filamentous fungus culture solution. By removing these, it becomes possible to avoid membrane clogging in the downstream membrane filtration process (MF, UF). As a means of removing suspended matter, there are methods of filtering using a suction filtration device such as a precoat filter or a pressure filtration device such as a filter press using a filter aid.
- a suction filtration device such as a precoat filter or a pressure filtration device such as a filter press using a filter aid.
- Non-Patent Document 1 a filter aid mainly composed of biodegradable fibers such as cellulose and chitin is sometimes used (Patent Documents 1 and 2).
- filter aids There are two types of filter aids: body feed, in which the filter aid is added directly to the liquid to be filtered, and precoat, in which a layer of filter aid is formed on the surface of the filter media. In solid-liquid separation, filtration using both methods is performed (Patent Document 3).
- the present inventor discovered that the enzymatic activity of cellulase recovered after filtration treatment was We have discovered a phenomenon in which the temperature decreases significantly compared to before the filtration treatment.
- a decrease in the enzymatic activity of cellulase leads to a decrease in the decomposition ability of cellulose-containing biomass, which causes a decrease in sugar yield when sugar is produced by hydrolyzing cellulose-containing biomass with cellulase.
- an object of the present invention is to establish a method for maintaining high enzyme activity even after filtration of a microbial culture solution containing cellulase.
- the present inventor found that a mixture of an inorganic filter aid such as diatomaceous earth and a culture solution of filamentous fungi such as Trichoderma filamentous fungi and Talaromyces filamentous fungi is useful as a filter aid.
- the present invention was completed based on the new discovery that cellulase with high enzyme activity can be recovered by performing a filtration process using the filter aid as the solid-liquid separation step described above.
- the present invention is comprised of the following [1] to [16].
- a filtration treatment method comprising a step of filtration treatment together with the filter aid according to any one of [1] to [5].
- the filtration process is a filtration process in which the liquid to be filtered is passed from the pre-coated side of a filter medium pre-coated with the filter aid according to any one of [1] to [5], [6] or [ 7].
- a method for producing cellulase comprising a step (2) of collecting cellulase from which microbial cells have been filtered out by performing a filtration treatment together with the prepared filter aid according to any one of [1] to [5].
- the microorganism in step (1) is a microorganism having the ability to produce cellulase having ⁇ -xylosidase activity
- step (2) is a step of recovering cellulase having ⁇ -xylosidase activity.
- the method for producing cellulase according to [9] or [10] which is a filtration treatment in which the filter aid according to any one of 5 is added.
- the filtration treatment in step (2) is performed by preparing the culture solution containing the cultured microbial cells obtained in step (1) independently from step (1)
- a method for producing sugar comprising a step of producing cellulase by the method according to any one of [9] to [15], and a step of hydrolyzing cellulose-containing biomass with the cellulase obtained in the step.
- cellulase whose enzyme activity is maintained at a high level can be recovered even by filtration of a culture solution containing cellulase.
- a filter aid is a substance that has one or more of the functions of reducing filtration resistance, reducing clogging of a filter medium, and improving the clarity of a filtrate.
- filter aids are broadly classified into organic filter aids and inorganic filter aids, but organic filter aids (e.g., biodegradable fiber polymers such as cellulose and chitin) are used for filtering target substances (e.g., cellulases). ), the present invention is characterized by the use of an inorganic filter aid.
- the most typical type of inorganic filter aid is diatomaceous earth, which is produced as the fossil of diatoms, which are phytoplankton.
- the inorganic filter aid used in the present invention preferably has diatomaceous earth and/or perlite as its active ingredient, more preferably diatomaceous earth as its main component, and diatomaceous earth itself. It is more suitable to use it as an inorganic filter aid.
- main component means more than 50% by weight of the constituent components.
- Diatomaceous earth differs from other algae in that it is covered with a hard, porous cell wall made of amorphous hydrated silicic acid (SiO 2 .nH 2 O). This is called a quartz shell, and it has countless pores with a diameter of about 0.1 to 1 ⁇ m. These pores are macroscopic compared to the pore size (0.2 to 20 nm) of activated carbon and zeolite, and do not have adsorption performance like activated carbon or zeolite (J.Soc.Powder Technol., Japan, 39, p114-121, 2002). The mined raw materials are refined through operations such as drying, classification, and firing. Filter aids made of diatomaceous earth are broadly classified into fired products and flux fired products, but either type of diatomaceous earth may be used as the main component of the inorganic filter aid.
- diatomaceous earth can be used.
- Radiolite #100 "Radiolite #200”, which is the Radiolite (registered trademark) series manufactured by Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd.
- Radiolite #300 “Radiolite #500”, Standard Super Cell which is Celite (trademark) series manufactured by Imerys, “Celite 350”, “Celite 505”, “Celite 512”, “Celite 577” Among these, “Celite 512" is preferred.
- Radiolite #700 For flux-fired products, there are Radiolite (registered trademark) series "Radiolite #700", “Radiolite #800”, “Radiolite #900”, “Radiolite #3000”, Imerys' Celite ( Examples include “Celite 281”, “Celite 499”, and “Celite 503" from Hyflo Supercell, which is a Celite (trademark) series, and among these, "Radiolite #700" is preferred.
- the filter aid of the present invention is characterized by being a mixture of the above-mentioned inorganic filter aid and a filamentous fungus culture solution.
- the mixture that is the filter aid of the present invention is characterized in that it is a mixture that is prepared independently of the filtration process. For example, when filtering a filamentous fungus culture solution, When a filtering agent is added, a mixture of an inorganic filter aid and a filamentous fungus culture solution is prepared as the liquid to be filtered, but such a mixture does not correspond to the filter aid of the present invention.
- the filamentous fungi of the filamentous fungi culture solution used in the filter aid of the present invention are not particularly limited, and include Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, and Bjerkandera. , Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium (Fusarium), Fumicola Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces es), Penicillium spp.
- filamentous fungi there are Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, and Neurosporium.
- Genus La Neurospora, Penicillium, Piromyces, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, and Trichoderma ) are given as specific examples. , preferably a filamentous fungus of the genus Trichoderma or a filamentous fungus of the genus Talaromyces.
- the filamentous fungus of the genus Trichoderma used to prepare the filamentous fungus culture solution may be a wild strain or a mutant strain of the filamentous fungus of the genus Trichoderma that has been improved to have increased protein production ability.
- Specific examples of filamentous fungi of the genus Trichoderma include Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma atroviride, and Trichoderma longibrachiatum, but preferably Trichoderma longibrachiatum. This is Hoderma Reesei.
- Trichoderma reesei include Trichoderma parareesei (ATCC MYA-4777), which is the ancestor of Trichoderma reesei, and Trichoderma reesei (ATCC MYA-4777).
- QM6a strain NBRC31326)
- QM9123 strain NBRC31326
- PC-3-7 strain ATCC66589
- QM9123 strain NBRC31327)
- RutC-30 strain ATCC56765
- CL-847 strain Enzyme. Microbiol.
- the Talaromyces filamentous fungus used to prepare the filamentous fungus culture solution may be a wild strain or a mutant strain of Talaromyces filamentous fungi that has been improved to have increased protein production ability.
- Specific examples of filamentous fungi of the genus Talaromyces include Talaromyces marneffei, Talaromyces stipitatus, Talaromyces amestolkiae, and Ta.
- Talaromyces atroroseus, Talaromyces verruculosus, Talaromyces cellulololyticus, Talaromyces Pinophilus or Talaromyces emersonii is preferred, and Talaromyces cellulololyticus is more preferred.
- Talaromyces cellulolyticus examples include Y-94 strain (FERM BP-5826), TN strain (FERM BP-11452), and C1 strain (FERM BP-5826), which are known mutant strains derived from Talaromyces cellulolyticus. RM P-18508), CF- 2612 strain (FERM BP-10848) and derivative strains thereof.
- the method for culturing filamentous fungi is not particularly limited, and can be cultured, for example, by liquid culture using centrifuge tubes, flasks, jar fermenters, tanks, etc., solid culture using plates, etc.
- Trichoderma filamentous fungi are preferably cultured under aerobic conditions, and among these culture methods, deep culture in which the fungi are cultured in a flask, particularly a jar fermenter, or a tank with aeration and stirring is preferred.
- the ventilation amount is preferably about 0.1 to 2.0 vvm, more preferably 0.3 to 1.5 vvm, and particularly preferably 0.5 to 1.0 vvm.
- the culture temperature is preferably 25-35°C, more preferably 25-31°C.
- the pH conditions during culture are preferably pH 3.0 to 7.0, more preferably pH 4.0 to 6.0.
- the culture is carried out under conditions that allow the bacterial cells to grow or to produce proteins until a recoverable amount of bacterial cells is accumulated.
- the time is about 24 to 288 hours, and more preferably 36 to 240 hours.
- the filamentous fungus culture solution is cultured until the filamentous fungus has a dry weight of preferably 1 g/L or more, more preferably 3 g/L or more, even more preferably 5 g/L or more, particularly preferably 10 g/L or more.
- Use culture medium preferably 50 g/L, more preferably 40 g/L.
- the dry bacterial weight is determined by taking 2 mL of the filamentous fungus culture into a 2 mL Eppendorf tube, centrifuging it at 20,000 x g for 10 minutes at 4°C using a centrifuge, then discarding the supernatant and adding distilled water. After washing, the collected bacterial pellet was centrifuged again using a centrifuge at 20,000 x g for 10 minutes at 4°C, and then dried in a dry heat sterilizer at 105°C for 2 hours, and then transferred to an electronic balance. It can be determined by measuring the weight (g-cell/2 mL) using a microorganism and converting it to dry bacterial weight (g-cell/L).
- the filamentous fungus culture solution may be a culture solution from which filamentous fungi have been removed or a culture solution containing filamentous fungi, but a culture solution containing filamentous fungi is preferably used.
- the mixing ratio of the inorganic filter aid and the filamentous fungus culture is such that the concentration of the inorganic filter aid contained in the filamentous fungus culture is preferably 1 to 15% (w/v), and 3 to 12% (w/v). It is more preferably 5% to 10% (w/v), and even more preferably 5 to 10% (w/v). In addition, if it exceeds 15% (w/v), the fluidity of the liquid to be filtered may decrease, resulting in poor filterability.
- the pH set when mixing the inorganic filter aid and the filamentous fungus culture is preferably 2.0 to 7.0, more preferably 3.0 to 6.0. It is not preferable to use a filter aid mixed at a pH of 8.0 or higher because the desired effect cannot be obtained.
- the time for mixing and incubating the inorganic filter aid and the filamentous fungus culture is not particularly limited, but is preferably at least 1 hour, more preferably at least 6 hours, and even more preferably at least 12 hours.
- Examples of filtration treatment methods based on the use of the filter aid of the present invention include heavy pressure filtration, vacuum filtration, and pressure filtration.
- heavy pressure filtration for example, a sand layer filter or a bag filter can be used.
- vacuum filtration devices such as Nutsche, precoat filters (drum filters), etc. can be used.
- pressure filtration devices such as candle filters, leaf filters, filter presses, and bag filters can be used.
- the filtration treatment method to which the filter aid of the present invention can be applied is preferably vacuum filtration or pressure filtration, more preferably pressure filtration.
- the device for performing pressure filtration is preferably a leaf filter or a filter press, and more preferably a filter press.
- the filter press may be vertical or horizontal.
- examples of the filtration treatment method using the filter aid of the present invention include a method in which the filter aid of the present invention is added to the liquid to be filtered (body feed) and then filtered according to the above-mentioned filtration treatment method.
- the cake formed by filtering the liquid to be filtered containing the filter aid contains a mixture of turbidity and filter aid, has a high porosity, and has low filtration resistance.
- the filter aid of the present invention may be used in an amount of 1 to 15% (w/v) based on the amount of the liquid to be filtered, as an equivalent amount of the inorganic filter aid contained in the filter aid. It is preferably 3 to 12% (w/v), more preferably 5 to 10% (w/v). Note that if the equivalent amount of the inorganic filter aid exceeds 15% (w/v), the fluidity of the liquid to be filtered may decrease, resulting in poor filterability.
- the filter aid of the present invention is applied (precoated) on the surface of a filter cloth in advance, and then the liquid to be filtered is passed through from the coated surface side and filtered. It may be a method.
- the filter aid of the present invention to be precoated contains filamentous fungal cells, and for example, by forming a layer (precoat layer) of the filter aid with a thickness of 2 to 6 mm on the filter cloth, clogging of the filtration can be prevented. This traps the suspended solids and facilitates the operation of peeling off the cake from the filter medium after the filtration operation.
- the type of filter cloth to be precoated is not particularly specified as long as it can be used in the above-mentioned filtration treatment method. There may be.
- Filter cloth can be purchased from Nakao Filter Industries Co., Ltd., Ataka Daiki Co., Ltd., etc.
- the filtration process to which the filter aid of the present invention can be applied is not particularly limited, but it can be suitably used in a filtration process to filter out microbial cells from a microbial culture solution, and a specific example is the ability to produce cellulase.
- Examples include a filtration process in which microbial cells are filtered out from a microbial culture solution to recover cellulase.
- the filter aid of the present invention is used in a filtration process for recovering cellulase having ⁇ -xylosidase activity by filtering out microbial cells from a culture solution of a microorganism that has the ability to produce cellulase having ⁇ -xylosidase activity. Through this filtration treatment, cellulase can be recovered without impairing ⁇ -xylosidase activity.
- Cellulases include various hydrolytic enzymes, including enzymes that have degrading activity for xylan, cellulose, and hemicellulose. Specific examples include cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), which produces cellobiose by hydrolysis of cellulose chains, and endoglucanases (EC 3.2.1.4), which hydrolyze the central part of cellulose chains.
- ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21) that hydrolyzes cellooligosaccharides and cellobiose, xylanase (EC 3.2.1.8) characterized by acting on hemicellulose, hydrolyzes xylooligosaccharides Examples include ⁇ -xylosidase (EC 3.2.1.37).
- the cellulases secreted by Talaromyces filamentous fungi which will be described later, include pectinase and galactanase as enzymes that decompose polysaccharides such as pectin and galactan.
- “Cellulase” (Meiji Seika Pharma) has high pectinase activity and galactanase activity in addition to cellulase activity.
- the filter aid of the present invention produces cellulase by culturing microorganisms capable of producing cellulase, accumulating cellulase in the culture solution, and performing solid-liquid separation through filtration using the filter aid of the present invention. It is characterized by
- filamentous fungi examples include Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium sosporium) , Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe , Mucor , Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaet e), Pyromyces, Puru Pleurotus, Rhizopus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium cladium), Trametes ( Trametes), and Trichoderma filamentous fungi.
- filamentous fungi there are Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, and Neurosporium.
- Genus La Neurospora, Penicillium, Piromyces, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, and Trichoderma
- Trichoderma filamentous fungi and Talaromyces filamentous fungi are more preferred.
- filamentous fungi of the genus Trichoderma and filamentous fungi of the genus Talaromyces include the aforementioned filamentous fungi of the genus Trichoderma and filamentous fungi of the genus Talaromyces that are used in the preparation of the filter aid of the present invention.
- the filter aid of the present invention can be obtained from a culture solution of a microorganism that has the ability to produce a cellulase having ⁇ -xylosidase activity, preferably a microorganism that has the ability to further produce a cellulase that has pectinase activity and/or galactanase activity. It is suitably used in solid-liquid separation to recover cellulases having these enzyme activities.
- microorganisms having the ability to produce cellulase having ⁇ -xylosidase activity include bacteria, yeast, filamentous fungi, and among these, filamentous fungi are preferred.
- filamentous fungi include Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium sosporium) , Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe , Mucor , Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaet e), Pyromyces, Puru Pleurotus, Rhizopus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium cladium), Trametes ( Trametes), and Trichoderma filamentous fungi.
- filamentous fungi there are Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, and Neurosporium.
- Genus La Neurospora, Penicillium, Piromyces, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, and Trichoderma ) selected from the group consisting of Fungi are preferred, and filamentous fungi of the genus Trichoderma are preferred.
- filamentous fungi of the genus Trichoderma and filamentous fungi of the genus Talaromyces include the aforementioned filamentous fungi of the genus Trichoderma and filamentous fungi of the genus Talaromyces that are used in the preparation of the filter aid of the present invention.
- a common medium in the field of cellulase production is used. Furthermore, the production amount of cellulase can be improved by culturing in a medium containing a cellulase inducer.
- Cellulase inducers include cellulose degradation intermediates including lactose, sophorose, gentibiose, and cellobiose, crystalline cellulose, xylan, and biomass including cellulose and xylan.
- biomass containing cellulose and xylan include pulp, bagasse, cassava pulp, switchgrass, napier grass, Erianthus, corn stover, corncob, cornhull, rice straw, wheat straw, beet pulp, eucalyptus, oak, and birch.
- pulp or corn hull is preferred, and corn hull is more preferably used.
- cellulase inducers made from corn hulls include ground corn hulls described in WO2021/235419.
- pretreated biomass containing cellulose and xylan is also preferably used as a cellulase inducer.
- known methods such as acid treatment, sulfuric acid treatment, dilute sulfuric acid treatment, alkali treatment, hydrothermal treatment, subcritical treatment, pulverization treatment, steaming treatment, and pulverization treatment can be used.
- liquid sugar or biomass may be added during the cultivation to further improve the accumulated cellulase concentration.
- liquid sugar to be added include cellulose degradation intermediates including glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, sophorose, gentibiose, and cellobiose; specific examples of biomass include crystalline cellulose, xylan, and cellulose and Examples include biomass containing xylan. Specific examples of biomass containing cellulose and xylan include the aforementioned biomass.
- liquid sugar is preferred from the viewpoint of operability, and glucose and lactose are particularly preferred.
- the timing to start adding the liquid sugar used is preferably within 144 hours from the start of culture, more preferably within 72 hours from the start of culture, and particularly preferably within 24 hours from the start of culture. Sugar may be added once, multiple times, or continuously.
- the culture method for culturing microorganisms capable of producing cellulase and accumulating cellulase in the culture solution is not particularly limited, and examples include liquid culture using centrifuge tubes, flasks, jar fermenters, tanks, etc., and plate culture. It can be cultured using solid culture, etc.
- the aeration conditions for microorganisms that have the ability to produce cellulase may be according to conditions suitable for the microorganism to be cultured, but when using Trichoderma filamentous fungi as the microorganism, it is preferable to culture them under aerobic conditions.
- the ventilation amount is preferably about 0.1 to 2.0 vvm, more preferably 0.3 to 1.5 vvm, and particularly preferably 0.5 to 1.0 vvm.
- the culture temperature is preferably about 25 to 35°C, more preferably 25 to 31°C.
- the pH conditions during culture are preferably pH 3.0 to 7.0, more preferably pH 4.0 to 6.0.
- the culture is carried out under conditions that allow the bacterial cells to grow or to produce proteins until a recoverable amount of bacterial cells is accumulated. Usually, the time is about 24 to 288 hours, and more preferably 36 to 240 hours.
- the carbon source used for preculture may be sugars that do not induce cellulase, such as glucose, fructose, sucrose, and maltose, or cellobiose, crystalline cellulose, xylan, and biomass containing cellulose and xylan.
- a cellulase inducer may be used, it is preferable to use glucose from the viewpoint of culture operations such as ease of assimilation and ability to feed the main culture solution.
- the culture conditions are preferably as described above.
- Trichoderma filamentous fungi or Talaromyces filamentous fungi as a microorganism having the ability to produce cellulase, a part of the preculture solution of Trichoderma filamentous fungi or Talaromyces filamentous fungi is added to the main filter aid of the present invention. It can be used as a culture solution of filamentous fungi of the genus Trichoderma or filamentous fungi of the genus Talaromyces.
- the cellulase-containing culture solution obtained by the above method is preferably subjected to a filtration treatment to reduce the bacterial fraction.
- a filtration treatment to reduce the bacterial fraction.
- Centrifugation is preferred as a method for reducing the bacterial cell fraction.
- devices used for centrifugation include bottom discharge type, continuous type, and separation plate type (DeLaval type). There are no particular restrictions on the centrifugation conditions, as long as the cells can be sedimented and removed.
- a culture solution containing cellulase is filtered together with the filter aid of the present invention to filter out microbial cells, and cellulase is recovered.
- the present invention is characterized in that the filter aid is prepared independently of the filtration process, such as a filtration process in which cellulase is filtered out from a Trichoderma filamentous fungus culture solution containing cellulase.
- the liquid to be filtered is a mixture of diatomaceous earth and a Trichoderma filamentous fungus culture solution containing cellulase.
- the cellulase from which the microbial cells have been filtered may be used as a crude enzyme solution as is, or it may be used after being formulated into a formulation by a known method.
- the cellulase obtained in the present invention can be widely used for hydrolyzing cellulose-containing biomass.
- Cellulose-containing biomass is one that contains at least cellulose or hemicellulose, and specifically includes pulp, bagasse, cassava pulp, switchgrass, napier grass, Erianthus, corn stover, corncob, cornhull, rice straw, wheat straw, and beetroot. Examples include pulp, eucalyptus, oak, and birch.
- These cellulose-containing biomass contains impurities such as the polymeric aromatic compounds lignin and hemicellulose, but as a pretreatment, lignin and hemicellulose are partially decomposed using acids, alkalis, and pressurized hot water.
- the resulting cellulose-containing biomass may be used as cellulose.
- the conditions for hydrolysis may be set to the optimal reaction conditions for cellulase derived from filamentous fungi, including a treatment temperature of 40 to 60°C, a treatment pH of 3 to 7, and a cellulose-containing biomass solid concentration of 0.1 to 30%. is preferred. By setting the above-mentioned optimal reaction condition range, biomass hydrolysis efficiency can be maximized.
- This hydrolysis treatment may be carried out batchwise or continuously. Since the hydrolyzate obtained by such enzyme treatment contains monosaccharide components such as glucose and xylose, it can be used as a fermentation raw sugar for fermentation production of various chemical products.
- enzyme components having other functions such as oxidase, reductase, hydrolase, transferase, and isomerase may be added to form an enzyme agent.
- enzyme components having such other functions are not limited to filamentous fungi, and enzyme components derived from any living organisms or enzyme components produced by genetic recombination may be added and used.
- Trichoderma filamentous fungi Preparation of filamentous fungus culture solution Spores of Trichoderma reesei PC-3-7 (ATCC66589) (hereinafter also simply referred to as "Trichoderma filamentous fungi") were added to a concentration of 1.0 x 10 7 /mL. Diluted with saline. Two 1 L baffled flasks containing 250 mL of the medium shown in Table 1 were prepared, 2.5 mL of the diluted spore solution was inoculated, and cultured in a shaking culture machine at 28° C. and 120 rpm for 72 hours. One of the flasks was inoculated into the main culture solution of Reference Example 2, and the other flask was used for preparing the filter aid of Reference Example 2, so cultivation was continued until after the main culture was completed.
- Talaromyces cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) (hereinafter also simply referred to as "Talaromyces filamentous fungus") was used as the filamentous fungus, cultivation was carried out in the same manner.
- the dry cell weight (g-cell/L) of the Talaromyces filamentous fungus culture was determined to be 34.7 g/L in the same manner as the Trichoderma filamentous fungus culture.
- ⁇ Reference Example 2 Preparation of crude enzyme solution derived from filamentous fungi
- Trichoderma reesei PC-3-7 strain As the filamentous fungus, 2.5 L of the cellulase production medium shown in Table 2 was placed in a 5 L jar fermenter (manufactured by Biot). and sterilized in an autoclave at 121°C for 40 minutes. 250 mL of the culture solution of Trichoderma reesei PC-3-7 of Reference Example 1 was used as a preculture solution and inoculated into a cellulase production medium (inoculation amount 10% v/v).
- Protein concentration measurement reagent Quick Start (trademark) Bradford 1 ⁇ Dye Reagent (manufactured by Bio-Rad) Protein concentration measurement reagent: 250 ⁇ L Crude enzyme dilution: 5 ⁇ L Measurement temperature: room temperature Reaction time: 5 minutes Absorbance: 595 nm Standard product: BSA.
- ⁇ Reference Example 5 Conditions for measuring ⁇ -xylosidase specific activity
- Substrate p-nitrophenyl- ⁇ -xylopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan)
- Reaction solution 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -xylopyranoside
- Crude enzyme dilution 10 ⁇ L Reaction temperature: 30°C
- Reaction time 10 minutes
- Reaction terminator 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate
- Absorption 405nm
- Enzyme reaction Enzyme dilution was mixed with substrate cooled to 4°C on a 96-well PCR plate, and incubated at 30°C for 10 minutes using a thermal cycler.
- reaction solution was quickly cooled to 4° C., and 10 ⁇ L of 2M sodium carbonate was added to stop the enzyme reaction.
- Quantification of activity The absorbance of the reaction solution at 405 nm was measured using a microplate reader, and the amount of p-nitrophenol released in the reaction solution was calculated from the value of the calibration curve based on the standard product. 1 U of activity is defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute, and ⁇ -xylosidase activity was calculated from the amount of p-nitrophenol contained in the enzyme dilution solution. The activity per mg of protein was determined by dividing the ⁇ -xylosidase activity contained in the diluted enzyme solution by the protein concentration of the diluted enzyme solution.
- reaction solution was quickly cooled to 4° C., and 10 ⁇ L of 1M sodium hydroxide was added to stop the enzyme reaction.
- Color reaction 40 ⁇ L of enzyme reaction solution and 80 ⁇ L of DNS reagent were mixed on a new 96-well PCR plate, and heated at 95° C. for 5 minutes using a thermal cycler. The coloring solution was cooled to room temperature, mixed with 120 ⁇ L of water, and 180 ⁇ L of the solution was transferred to a new 96-well microplate.
- Quantification of activity The absorbance of the coloring solution at 540 nm was measured using a microplate reader, and the amount of reducing sugar released in the reaction solution was calculated from the value of the calibration curve based on the standard product.
- 1 U of activity is defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar per minute, and the pectinase activity was calculated from the amount of reducing sugar contained in the enzyme dilution solution.
- the activity per 1 mg of protein was determined by dividing the pectinase activity contained in the diluted enzyme solution by the protein concentration of the diluted enzyme solution.
- Galactose coloring reagent DNS reagent Enzyme reaction: Mix the enzyme dilution solution with the substrate cooled to 4°C on a 96-well PCR plate, and incubate for 10 minutes at 50°C using a thermal cycler. did.
- reaction solution was quickly cooled to 4° C., and 10 ⁇ L of 1M sodium hydroxide was added to stop the enzyme reaction.
- Color reaction 40 ⁇ L of enzyme reaction solution and 80 ⁇ L of DNS reagent were mixed on a new 96-well PCR plate, and heated at 95° C. for 5 minutes using a thermal cycler. The coloring solution was cooled to room temperature, mixed with 120 ⁇ L of water, and 180 ⁇ L of the solution was transferred to a new 96-well microplate.
- Quantification of activity The absorbance of the coloring solution at 540 nm was measured using a microplate reader, and the amount of reducing sugar released in the reaction solution was calculated from the value of the calibration curve based on the standard product.
- 1 U of activity is defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar per minute, and the galactanase activity was calculated from the amount of reducing sugar contained in the enzyme dilution solution.
- the activity per 1 mg of protein was determined by dividing the galactanase activity contained in the diluted enzyme solution by the protein concentration of the diluted enzyme solution.
- Example 1 Solid-liquid separation of crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi using a mixture of diatomaceous earth and a culture solution containing Trichoderma filamentous fungi as a filter aid (precoat agent) Prepared by the method described in Reference Example 1 The entire volume of the Trichoderma filamentous fungus culture solution was centrifuged at 3,000 ⁇ g, 4° C., for 10 minutes to separate the supernatant and the microbial cells. The bacterial cell fraction was collected, suspended in distilled water, and centrifuged at 3,000 ⁇ g and 4° C. for 10 minutes to wash the bacterial cell fraction.
- Example 2 Solid-liquid separation of cellulase crude enzyme solution using a mixture of diatomaceous earth and supernatant of Trichoderma filamentous fungus culture solution as a filter aid (pre-coating agent) Trichoderma filamentous fungi prepared by the method described in Reference Example 1 The entire bacterial culture solution was centrifuged at 3,000 xg, 4°C, for 10 minutes to separate the supernatant and the bacterial cells. Diatomaceous earth "Celite 512" was added to the obtained supernatant to give a concentration of 10% (w/v), and the mixture was cultured with shaking at 120 rpm for 1 hour at room temperature, which was used as a filter aid for precoating.
- the crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi prepared in Reference Example 2 was suction-filtered in the same manner as in Comparative Example 1 except that this filter aid was used, and the filtrate was collected, and the filtrate was recovered using the method described in Reference Examples 4 and 5.
- the protein concentration and ⁇ -xylosidase specific activity of the filtrate collected were measured.
- the protein concentration slightly decreased before and after suction filtration, but this is thought to be due to dilution by water remaining during precoat formation. Further, the ⁇ -xylosidase specific activity was 22.5% compared to the unfiltered crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi (Reference Example 2).
- Example 3 Solid-liquid separation of crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi using a mixture of diatomaceous earth and a culture solution containing Trichoderma filamentous fungi as a filter aid (precoat agent and body feed agent) Described in Reference Example 1 Diatomaceous earth "Celite 512" was added to the total volume of the Trichoderma filamentous fungus culture solution prepared by the method described in 1. to give a concentration of 10% (w/v), and cultured with shaking at 120 rpm for 1 hour at room temperature. It was used as a filter aid for feed. The crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi was suction-filtered in the same manner as in Comparative Example 2 except that this filter aid was used, and the filtrate was collected. Protein concentration and ⁇ -xylosidase specific activity were measured.
- the protein concentration slightly decreased before and after suction filtration, but this is thought to be due to dilution by water remaining during precoat formation.
- the ⁇ -xylosidase specific activity was 88.4% compared to the unfiltered crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi (Reference Example 2).
- Example 4 Solid-liquid separation of crude enzyme solution derived from Trichoderma fungi using a mixture of diatomaceous earth and supernatant of Trichoderma fungus culture solution as a filter aid (precoat agent and body feed agent) Described in Reference Example 1
- the entire volume of the Trichoderma filamentous fungus culture solution prepared by the method described above was centrifuged at 3,000 x g and 4°C for 10 minutes to separate the supernatant and the fungal cells. Thereafter, a mixture of diatomaceous earth "Celite 512" and the supernatant fraction was prepared.
- the crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi was suction-filtered in the same manner as in Comparative Example 2, except that this mixture was used as a filter aid for precoat and body feed, and the filtrate was collected, and the results are described in Reference Examples 5 and 6.
- the protein concentration and ⁇ -xylosidase specific activity of the filtrate collected by the method described above were measured.
- Example 5 Solid-liquid separation of crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi using a mixture of diatomaceous earth and a culture solution containing Talaromyces filamentous fungi as a filter aid (precoat agent and body feed agent) Described in Reference Example 1 Diatomaceous earth "Celite 512" was added to the total volume of the Talaromyces filamentous fungus culture solution prepared by the method described above to give a concentration of 10% (w/v), and the mixture was cultured at room temperature with shaking at 120 rpm for 1 hour. It was used as a filter aid for body feed. The crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi was suction-filtered in the same manner as in Comparative Example 2 except that this filter aid was used, and the filtrate was collected. Protein concentration and ⁇ -xylosidase specific activity were measured.
- the ⁇ -xylosidase specific activity was reduced to 18.8% when compared with the unfiltered crude enzyme solution derived from Talaromyces filamentous fungi (Reference Example 2). Further, the pectinase specific activity and galactanase specific activity were 85.6% and 73.8%, respectively, when compared with the unfiltered crude enzyme solution derived from Talaromyces filamentous fungi (Reference Example 2).
- Example 6 Solid-liquid separation of crude enzyme solution derived from Talaromyces filamentous fungi using a mixture of diatomaceous earth and a culture solution containing Talaromyces filamentous fungi as a filter aid (precoat agent and body feed agent) Described in Reference Example 1 Diatomaceous earth "Celite 512" was added to the total volume of the Talaromyces filamentous fungus culture solution prepared by the method described above to give a concentration of 10% (w/v), and the mixture was cultured at room temperature with shaking at 120 rpm for 1 hour. It was used as a filter aid for body feed.
- the ⁇ -xylosidase specific activity was 84.7% when compared with the unfiltered crude enzyme solution derived from Talaromyces filamentous fungi (Reference Example 2).
- the pectinase specific activity and galactanase specific activity were 102% and 97.9%, respectively, when compared with the unfiltered crude enzyme solution derived from Talaromyces filamentous fungi (Reference Example 2).
- Example 7 Cellulose-containing biomass saccharification test Using the unfiltered crude enzyme solution derived from Trichoderma filamentous fungi obtained in Reference Example 2, the filtrate obtained in Comparative Examples 2 and 3, and Examples 3 and 4, an alkali A saccharification test was conducted on the treated bagasse.
- Alkali-treated bagasse prepared according to the method described in Reference Example 4 was incubated with 5% (w/v) biomass at 50°C for 7 hours using a rotating rotor, and then incubated at 20,000 x g at 4°C for 10 minutes.
- the reaction liquid supernatant was collected by centrifugation. 20 ⁇ L of 1N NaOH as a reaction stop solution was added to 180 ⁇ L of the reaction solution supernatant, and the amount of xylose released was quantified under the analysis conditions shown in Reference Example 7.
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Abstract
セルラーゼの製造方法におけるセルラーゼを含有する培養液から菌体および培養液中の濁質を除去するためのろ過処理において、ろ過助剤として無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物を利用することで、酵素活性が高く維持されたセルラーゼを得ることができる。
Description
本発明は、無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物を有効成分とするろ過助剤、当該ろ過助剤を用いたろ過処理方法および当該ろ過助剤を用いたセルラーゼの製造方法に関する。
トリコデルマ属糸状菌は、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、トリコデルマ属糸状菌を用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。トリコデルマ属糸状菌は、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質として、タンパク質の中でも糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する。
セルラーゼは、セルロース含有バイオマスを加水分解して糖を製造するための糖化酵素として利用されるが、セルラーゼを含有するトリコデルマ属糸状菌の培養液からセルラーゼを得る最初のステップとして、セルラーゼを含有するトリコデルマ属糸状菌培養液からトリコデルマ属糸状菌体および培養液中の濁質を除去する。これらを除去することで下流の膜ろ過工程（ＭＦ、ＵＦ）での膜詰まりを回避することが可能となる。濁質を除去する手段として、ろ過助剤を用いてプレコートフィルタなどの吸引濾過装置や、フィルタープレスなどの加圧濾過装置でろ過する手法があり、珪藻土やパーライト、特に珪藻土をろ過助剤として使用する方法が知られており（非特許文献１）、その際、セルロースやキチンといった生分解性繊維を主成分とするろ過助剤が使用されることもある（特許文献１および２）。
ろ過助剤の使用形式としては、被ろ過処理液に直接ろ過助剤を添加するボディーフィードと、予めろ材表面にろ過助剤の層を形成させるプレコートの２種類があり、通常ろ過助剤を用いた固液分離では両方の方式を採用したろ過が実施される（特許文献３）。
Ｔｏｍａｎｔｓｃｈｇｅｒ Ｋｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＳＩＺＥ ＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＫＩＥＳＥＬＧＵＨＲ ＦＩＬＴＥＲ ＧＲＡＮＵＬＡＴＩＯＮ，ＭＥＴＡＬＵＲＧＩＡ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，１７，１０，１９２－１９７，２０１２
本発明者は、セルラーゼを含有する培養液から微生物菌体および培養液中の濁質を除去するための固液分離としてろ過処理を検討する過程で、ろ過処理後に回収されるセルラーゼの酵素活性がろ過処理前と比較して著しく低下するという現象を見出した。セルラーゼの酵素活性の低下は、セルロース含有バイオマスの分解能の低下につながり、セルロース含有バイオマスをセルラーゼにより加水分解して糖を製造する際の糖収量の低下の原因となる。
そこで本発明では、セルラーゼを含有する微生物培養液のろ過処理後も酵素活性が高く維持するための方法を確立することを課題とする。
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、珪藻土などの無機系ろ過助剤とトリコデルマ属糸状菌やタラロマイセス属糸状菌等の糸状菌培養液の混合物がろ過助剤として有用であり、前述の固液分離工程として当該ろ過助剤を使用したろ過処理をすることによって、酵素活性が高く維持されたセルラーゼを回収できることを新規に見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の［１］～［１６］で構成される。
［１］無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物である、ろ過助剤。
［２］前記無機系ろ過助剤が珪藻土である、［１］に記載のろ過助剤
［３］前記糸状菌がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、［１］または［２］に記載のろ過助剤。
［４］前記培養液が、糸状菌体の乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）が少なくとも１．０ｇ／Ｌ以上になるまで培養した培養液である、［１］～［３］のいずれかに記載のろ過助剤。
［５］前記培養液が培養後の糸状菌体を含む、［１］～［４］のいずれかに記載のろ過助剤。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理する工程を含む、ろ過処理方法。
［７］前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液に［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理工程である、［６］に記載のろ過処理方法。
［８］前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液を［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理工程である、［６］または［７］に記載のろ過処理方法。
［９］セルラーゼを生産する能力を有する微生物を培養する工程（１）、および、工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、工程（１）とは独立して調製した［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理し、微生物菌体がろ別されたセルラーゼを回収する工程（２）を含む、セルラーゼの製造方法。
［１０］前記工程（１）の微生物がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物であり、前記工程（２）がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを回収する工程である、［９］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１１］前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液に、前記工程（１）とは独立して調製した請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理である、［９］または［１０］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１２］前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、前記工程（１）とは独立して調製した［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理である、［９］～［１１］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１３］前記工程（２）のろ過処理がフィルタープレスである、［９］～［１２］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１４］前記工程（１）で培養するセルラーゼを生産する能力を有する微生物がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、［９］～［１３］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１５］前記工程（１）で培養する糸状菌の前培養液と無機系ろ過助剤を混合して［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤を調製する工程を含む、［１４］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１６］［９］～［１５］のいずれかに記載の方法によりセルラーゼを製造する工程、および、前記工程で得られたセルラーゼでセルロース含有バイオマスを加水分解する工程を含む、糖の製造方法。
［１］無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物である、ろ過助剤。
［２］前記無機系ろ過助剤が珪藻土である、［１］に記載のろ過助剤
［３］前記糸状菌がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、［１］または［２］に記載のろ過助剤。
［４］前記培養液が、糸状菌体の乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）が少なくとも１．０ｇ／Ｌ以上になるまで培養した培養液である、［１］～［３］のいずれかに記載のろ過助剤。
［５］前記培養液が培養後の糸状菌体を含む、［１］～［４］のいずれかに記載のろ過助剤。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理する工程を含む、ろ過処理方法。
［７］前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液に［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理工程である、［６］に記載のろ過処理方法。
［８］前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液を［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理工程である、［６］または［７］に記載のろ過処理方法。
［９］セルラーゼを生産する能力を有する微生物を培養する工程（１）、および、工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、工程（１）とは独立して調製した［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理し、微生物菌体がろ別されたセルラーゼを回収する工程（２）を含む、セルラーゼの製造方法。
［１０］前記工程（１）の微生物がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物であり、前記工程（２）がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを回収する工程である、［９］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１１］前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液に、前記工程（１）とは独立して調製した請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理である、［９］または［１０］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１２］前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、前記工程（１）とは独立して調製した［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理である、［９］～［１１］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１３］前記工程（２）のろ過処理がフィルタープレスである、［９］～［１２］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１４］前記工程（１）で培養するセルラーゼを生産する能力を有する微生物がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、［９］～［１３］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
［１５］前記工程（１）で培養する糸状菌の前培養液と無機系ろ過助剤を混合して［１］～［５］のいずれかに記載のろ過助剤を調製する工程を含む、［１４］に記載のセルラーゼの製造方法。
［１６］［９］～［１５］のいずれかに記載の方法によりセルラーゼを製造する工程、および、前記工程で得られたセルラーゼでセルロース含有バイオマスを加水分解する工程を含む、糖の製造方法。
本発明によれば、セルラーゼを含有する培養液のろ過処理によっても、酵素活性が高く維持されたセルラーゼを回収することが可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
＜ろ過助剤およびろ過処理方法＞
ろ過助剤とは、ろ過抵抗の低減、ろ材の目詰まり低減およびろ液の清澄度向上のうちの１つ以上の働きを有する物質をいう。一般に、ろ過助剤は有機系ろ過助剤と無機系ろ過助剤に大別されるが、有機系ろ過助剤（例えば、セルロースやキチンといった生分解性繊維ポリマー）はろ過対象物（例えば、セルラーゼ）によって分解してしまうことがあるため、本発明では無機系ろ過助剤を使用することを特徴とする。無機系ろ過助剤の種類としては、植物性プランクトンである珪藻の化石として産出される珪藻土が最も代表的である。珪藻土の他に火山活動で噴出した溶岩に由来するパーライトも無機系ろ過助剤の例として挙げられるが、パーライトの多くは珪藻土ろ過助剤の補助的な役割として使用される。したがって、本発明で用いられる無機系ろ過助剤は、その有効成分として珪藻土および／またはパーライトが主成分であることが好適であり、珪藻土が主成分であることがより好適であり、珪藻土そのものを無機系ろ過助剤として使用することがさらに好適である。なお、「主成分」とは構成成分の５０重量％超であることを意味する。
ろ過助剤とは、ろ過抵抗の低減、ろ材の目詰まり低減およびろ液の清澄度向上のうちの１つ以上の働きを有する物質をいう。一般に、ろ過助剤は有機系ろ過助剤と無機系ろ過助剤に大別されるが、有機系ろ過助剤（例えば、セルロースやキチンといった生分解性繊維ポリマー）はろ過対象物（例えば、セルラーゼ）によって分解してしまうことがあるため、本発明では無機系ろ過助剤を使用することを特徴とする。無機系ろ過助剤の種類としては、植物性プランクトンである珪藻の化石として産出される珪藻土が最も代表的である。珪藻土の他に火山活動で噴出した溶岩に由来するパーライトも無機系ろ過助剤の例として挙げられるが、パーライトの多くは珪藻土ろ過助剤の補助的な役割として使用される。したがって、本発明で用いられる無機系ろ過助剤は、その有効成分として珪藻土および／またはパーライトが主成分であることが好適であり、珪藻土が主成分であることがより好適であり、珪藻土そのものを無機系ろ過助剤として使用することがさらに好適である。なお、「主成分」とは構成成分の５０重量％超であることを意味する。
珪藻土は他の藻類と異なり、珪藻は非晶質の水和珪酸（ＳｉＯ２・ｎＨ２Ｏ）からなる多孔質の硬い細胞壁で覆われている。これは珪殻とよばれ、直径０．１～１μｍ程度の無数の孔が開いている。これは活性炭やゼオライトの孔径（０．２～２０ｎｍ）と比較するとマクロな孔であり、活性炭やゼオライトのような吸着性能はない（Ｊ．Ｓｏｃ．Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｊａｐａｎ，３９，ｐ１１４－１２１，２００２）。採掘された原料は、乾燥、分級、焼成などの操作を経て精製される。珪藻土からなるろ過助剤は、焼成品と融剤焼成品とに大別されるが、無機系ろ過助剤の主成分として使用する珪藻土としてはどちらを用いてもよい。
珪藻土は市販のものを使用することができ、例えば、焼成品であれば、昭和化学工業株式会社製のラヂオライト（登録商標）シリーズである“ラヂオライト＃１００”、“ラヂオライト＃２００”、“ラヂオライト＃３００”、“ラヂオライト＃５００”、イメリス製のＣｅｌｉｔｅ（セライト）（商標）シリーズであるスタンダード・スーパーセル、“Ｃｅｌｉｔｅ ３５０”、“Ｃｅｌｉｔｅ ５０５”、“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”、“Ｃｅｌｉｔｅ ５７７”が挙げられ、これらの中でも“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”が好ましい。融剤焼成品であれば、ラヂオライト（登録商標）シリーズである“ラヂオライト＃７００”、“ラヂオライト＃８００”、“ラヂオライト＃９００”、“ラヂオライト＃３０００”、イメリス製のＣｅｌｉｔｅ（セライト）（商標）シリーズであるハイフロ・スーパーセルの“Ｃｅｌｉｔｅ ２８１”、“Ｃｅｌｉｔｅ ４９９”、“Ｃｅｌｉｔｅ ５０３”などが挙げられ、これらの中でも“ラヂオライト＃７００”が好ましい。
本発明のろ過助剤は、前述の無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物であることを特徴としている。また、本発明のろ過助剤である前記混合物は、ろ過処理工程とは独立して調製される混合物であることを特徴としており、例えば、糸状菌培養液をろ過処理する際に無機系ろ過助剤を添加する場合、被ろ過処理液として無機系ろ過助剤と糸状菌培養液の混合物が調製されることになるが、このような混合物は本発明のろ過助剤には該当しない。
本発明のろ過助剤に使用される糸状菌培養液の糸状菌は特に制限はなく、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルサ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パーシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ぺニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロチャート属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プルロータス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）糸状菌が挙げられる。これらの糸状菌の中でも、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などが具体例として挙げられるが、好ましくはトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である。
糸状菌培養液の調製に用いられるトリコデルマ属糸状菌は、野生株であっても、タンパク質製造能が高まるように改良されたトリコデルマ属糸状菌の変異株であってもよい。トリコデルマ属糸状菌の具体例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍが挙げられるが、好ましくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉである。また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの具体例として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの具体例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの先祖にあたるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ－４７７７）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．，８，８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２，４５１－４５９（１９８２））およびこれらの派生株などが挙げられる。さらに、ＱＭ９４１４株を起源とする、ＷＯ２０１９／１８８９８０号、ＷＯ２０１９／２３０８６０号、ＷＯ２０２０／０２７０１０号、ＷＯ２０２０／０４５４７２号、ＷＯ２０２０／０４５４７３号、ＷＯ２０２０／０７５７８７号、ＷＯ２０２０／０７５７８８号に記載の変異を持った変異株を用いることもできる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ－３－７株、ＲｕｔＣ－３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
糸状菌培養液の調製に用いられるタラロマイセス属糸状菌は、野生株であっても、タンパク質製造能が高まるように改良されたタラロマイセス属糸状菌の変異株であってもよい。タラロマイセス属糸状菌の具体例としては、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌は、前述の特徴を有するものであれば特に制限はないが、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｍｅｓｔｏｌｋｉａｅ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｒｏｓｅｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉが好ましく、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓがより好ましい。Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓの具体例としては、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓに由来する公知の変異株であるＹ－９４株（ＦＥＲＭ ＢＰ－５８２６）、ＴＮ株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４５２）、Ｃ１株（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５０８）、ＣＦ－２６１２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０８４８）およびこれらの派生株が挙げられる。
糸状菌の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ属糸状菌は、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、フラスコ、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、菌体が生育する、あるいはタンパク質が生産される条件下で、回収可能な量の菌体量が蓄積されるまで行う。通常、２４～２８８時間程度であり、３６～２４０時間がより好ましい。
糸状菌培養液としては、糸状菌が乾燥菌体重量として好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは５ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１０ｇ／Ｌ以上になるまで培養した培養液を使用する。糸状菌培養後の糸状菌の乾燥菌体重量の上限は、本発明の効果を阻害しない限り特に制限はないが、５０ｇ／Ｌであることが好ましく、４０ｇ／Ｌであることがより好ましい。なお、乾燥菌体重量は、糸状菌の培養液２ｍＬを２ｍＬ容－エッペンドルフチューブに取り、遠心分離機により２０，０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離しその後、上清を廃棄し蒸留水で洗浄後、再び遠心分離機により２０，０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離して回収した菌体ペレットを、乾熱滅菌器にて１０５℃、２時間乾燥処理して、電子天秤を用いて重量（ｇ－ｃｅｌｌ／２ｍＬ）を測定し、乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）に換算することで求めることができる。
また、糸状菌培養液としては、糸状菌体を除去した培養液であっても、糸状菌体を含んだ培養液であってもよいが、糸状菌体を含んだ培養液が好ましく用いられる。
無機系ろ過助剤と糸状菌培養液の混合比率は、糸状菌培養液中に含まれる無機系ろ過助剤濃度が１～１５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、３～１２％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、さらに好ましくは５～１０％（ｗ／ｖ）である。なお、１５％（ｗ／ｖ）を超えると、被ろ過処理液の流動性が低下することによってろ過性が悪化してしまうことがある。
無機系ろ過助剤と糸状菌培養液を混合させる際に設定するｐＨは、ｐＨ２．０～７．０が好ましく、ｐＨ３．０～６．０がより好ましい。ｐＨ８．０以上に設定して混合したろ過助剤を使用した場合、所望の効果が得られないので好ましくない。
無機系ろ過助剤と糸状菌培養液を混合させてインキュベーションする時間は特に制限はないが、好ましくは１時間以上、より好ましくは６時間以上、さらに好ましくは１２時間以上が好ましい。
本発明のろ過助剤の使用を前提とするろ過処理方法として、重圧ろ過、真空ろ過、加圧ろ過法が挙げられる。重圧ろ過を実施する場合、例えば砂層ろ過機や袋ろ過機を使用することができる。また、真空ろ過を実施する場合、ヌッチェ、プリコートフィルター（ドラムフィルタ）などの装置を使用することができる。加圧ろ過を実施する場合、キャンドルフィルター、リーフフィルター、フィルタープレス、バグフィルターといった装置を使用することができる。本発明のろ過助剤が適用可能なろ過処理方法として、好ましくは真空ろ過または加圧ろ過であり、より好ましくは加圧ろ過である。さらに、加圧ろ過を実施する装置としては、好ましくはリーフフィルターまたはフィルタープレスであり、より好ましくはフィルタープレスである。フィルタープレスは縦型であっても横型であってもよい。
また、本発明のろ過助剤を適用したろ過処理方法としては、被ろ過処理液に本発明のろ過助剤を添加（ボディーフィード）してから前述のろ過処理方法に従ってろ過する方法が挙げられる。本方法では、ろ過助剤を含んだ被ろ過処理液をろ過することにより形成されるケークは、濁質とろ過助剤とが混在しており、空隙率が高く、ろ過抵抗の少ないものとなる。本方法では、本発明のろ過助剤を、当該ろ過助剤に含まれる無機系ろ過助剤の相当量として、被ろ過処理液量に対して１～１５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、３～１２％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、５～１０％（ｗ／ｖ）であることがさらに好ましい。なお、無機系ろ過助剤の相当量として１５％（ｗ／ｖ）を超えると、被ろ過処理液の流動性が低下することによってろ過性が悪化してしまうことがある。
また、本発明のろ過助剤を適用したろ過処理方法として、あらかじめ本発明のろ過助剤をろ布の表面に塗布（プレコート）してから、被ろ過処理液を塗布面側から通じてろ過する方法であってもよい。プレコートする本発明のろ過助剤は、糸状菌体を含むことが好ましく例えば、２～６ｍｍの厚みのろ過助剤からなる層（プレコート層）をろ布上に形成させることで、ろ過の詰まりとなる濁質が捕捉され、ろ過操作後のケークをろ材から剥離する操作も容易となる。プレコートされるろ布の形式は、前述のろ過処理方法で使用できるろ布であれば特に指定はなく、例えば、平畳織であっても、綾畳織であっても、逆綾畳織であってもよい。ろ布は中尾フィルター工業株式会社やアタカ大機株式会社などから購入することができる。
本発明のろ過助剤が適用できるろ過処理の対象は特に限定されないが、微生物培養液から微生物菌体をろ別するろ過処理において好適に使用することができ、具体例としてセルラーゼを生産する能力を有する微生物培養液から微生物菌体をろ別してセルラーゼを回収するろ過処理が挙げられる。特に、β－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物の培養液から微生物菌体をろ別してβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを回収するためのろ過処理では、本発明のろ過助剤を使用したろ過処理によって、β－キシロシダーゼ活性を損なうことなくセルラーゼを回収することができる。
＜セルラーゼの製造方法＞
セルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）、ヘミセルロースに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）が挙げられる。さらに、後述するタラロマイセス属糸状菌が分泌するセルラーゼの中には、ペクチンやガラクタンといった多糖を分解する酵素としてペクチナーゼ、ガラクタナーゼが含まれており、例えば市販のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌由来セルラーゼ製剤“アクレモニウムセルラーゼ”（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ）はセルラーゼ活性と併せて高いペクチナーゼ活性、ガラクタナーゼ活性を有する。
セルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）、ヘミセルロースに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）が挙げられる。さらに、後述するタラロマイセス属糸状菌が分泌するセルラーゼの中には、ペクチンやガラクタンといった多糖を分解する酵素としてペクチナーゼ、ガラクタナーゼが含まれており、例えば市販のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌由来セルラーゼ製剤“アクレモニウムセルラーゼ”（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ）はセルラーゼ活性と併せて高いペクチナーゼ活性、ガラクタナーゼ活性を有する。
本発明のろ過助剤は、セルラーゼを生産する能力を有する微生物を培養して培養液中にセルラーゼを蓄積させ、本発明のろ過助剤を用いたろ過処理で固液分離することによってセルラーゼを製造することを特徴としている。
セルラーゼを生産する能力を有する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌などが挙げられ、このうち糸状菌が好ましい。糸状菌の例としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルサ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パーシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ぺニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロチャート属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プルロータス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）糸状菌が挙げられる。これらの糸状菌の中でも、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される糸状菌が好ましい。また、セルラーゼの生産性、および、得られるセルラーゼのバイオマス糖化性能の観点からは、トリコデルマ属糸状菌およびタラロマイセス属糸状菌がより好ましい。トリコデルマ属糸状菌およびタラロマイセス属糸状菌の具体例としては、本発明のろ過助剤の調製に使用される前述のトリコデルマ属糸状菌およびタラロマイセス属糸状菌が挙げられる。
また、本発明のろ過助剤は、β－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物、好ましくはさらにペクチナーゼ活性および／またはガラクタナーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物の培養液からこれら酵素活性を有するセルラーゼを回収するための固液分離において好適に用いられる。
β－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌などが挙げられ、このうち糸状菌が好ましい。糸状菌の例としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルサ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パーシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ぺニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロチャート属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プルロータス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）糸状菌が挙げられる。これらの糸状菌の中でも、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、パイロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、および、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される糸状菌が好ましく、トリコデルマ属糸状菌より好ましい。トリコデルマ属糸状菌およびタラロマイセス属糸状菌の具体例としては、本発明のろ過助剤の調製に使用される前述のトリコデルマ属糸状菌およびタラロマイセス属糸状菌が挙げられる。
セルラーゼを生産する能力を有する微生物の培養は、セルラーゼ生産の分野において一般的な培地が用いられる。また、培養の際にはセルラーゼ誘導剤を含む培地で培養することでセルラーゼの生産量を向上させることができる。セルラーゼ誘導剤としては、ラクトース、ソホロース、ゲンチビオース、およびセロビオースを含むセルロースの分解中間体、結晶性セルロース、キシラン、そしてセルロースおよびキシランを含むバイオマスが挙げられる。セルロースおよびキシランを含むバイオマスの具体例としては、パルプ、バガス、キャッサバパルプ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、コーンハル、稲わら、麦わら、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバが挙げられるが、パルプまたはコーンハルが好ましく、コーンハルがより好ましく用いられる。コーンハルを原料とするセルラーゼ誘導剤としては、例えば、ＷＯ２０２１／２３５４１９号に記載のコーンハル粉砕物が挙げられる。
また、セルロースおよびキシランを含むバイオマスの前処理物もセルラーゼ誘導剤として好ましく用いられる。前処理方法としては、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、粉砕処理など公知の手法を用いることができる。
また、セルラーゼ蓄積濃度の更なる向上を目的として液糖やバイオマスを培養途中から添加しても良い。添加する液糖の具体例として、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソホロース、ゲンチビオース、およびセロビオースを含むセルロースの分解中間体が挙げられ、バイオマスの具体例として結晶性セルロース、キシラン、そしてセルロースおよびキシランを含むバイオマスが挙げられる。セルロースおよびキシランを含むバイオマスの具体例は前述のバイオマスが挙げられる。培養槽への添加の際、操作性の観点からは液糖が好ましく、特にグルコースおよびラクトースが好ましい。用いられる液糖の添加を開始するタイミングは、培養開始から１４４時間までが好ましく、培養開始から７２時間までがより好ましく、培養開始から２４時間までが特に好ましい。糖の添加は、一回でもよいし、複数回でもよいし、連続的に添加してもよい。
セルラーゼを生産する能力を有する微生物を培養して培養液中にセルラーゼを蓄積させるための培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。また、セルラーゼを生産する能力を有する微生物の通気条件は培養する微生物に適した条件に従えばよいが、微生物としてトリコデルマ属糸状菌を用いる場合は好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、フラスコ、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃程度が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、菌体が生育する、あるいはタンパク質が生産される条件下で、回収可能な量の菌体量が蓄積されるまで行う。通常、２４～２８８時間程度であり、３６～２４０時間がより好ましい。
また、前述の培養に先立ち、セルラーゼを生産する能力を有する微生物を前培養し、前培養液を前述の培養に供することが好ましい。前培養に用いる炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースのようなセルラーゼを誘導しない糖を炭素源として用いても良いし、セロビオース、結晶性セルロース、キシラン、そしてセルロースおよびキシランを含むバイオマスのようなセルラーゼ誘導剤を用いても良いが、易資化性や本培養液への送液性といった培養操作の観点からグルコースを用いることが好ましい。培養条件は前述した培養に供することが好ましい。なお、セルラーゼを生産する能力を有する微生物としてトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌を用いる場合、トリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌の前培養液の一部を、本発明のろ過助剤の主成分であるトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌培養液として利用することができる。
前述の方法で得られたセルラーゼを含む培養液は、ろ過処理の前に菌体画分を減少させることが好ましい。予め菌体画分を減少させることで、ろ過処理で使用する装置のろ室が固形分で満たされるのを防ぐことができる。菌体画分を減少させる方法としては、遠心分離が好ましい。遠心分離に用いられる装置としては、例えば底部排出型、連続型、分離板型（デラバル型）が挙げられる。遠心条件は特に制限はなく、菌体を沈降させ除去できれば良い。
本発明では、セルラーゼを含む培養液を本発明のろ過助剤と共にろ過処理して微生物菌体をろ別し、セルラーゼを回収する。また、本発明では、ろ過助剤をろ過処理工程とは独立して調製されたものであることを特徴としており、例えば、セルラーゼを含有するトリコデルマ属糸状菌培養液からセルラーゼをろ別するろ過処理工程において、ろ過助剤として珪藻土をボディーフィードしたり、ろ過助剤として珪藻土をろ布にプレコートする場合には、被ろ過処理液は珪藻土とセルラーゼを含有するトリコデルマ属糸状菌培養液の混合物となるが、このような混合物は本発明のろ過助剤には該当せず、また、このような態様は本発明のろ過助剤を「セルラーゼの製造工程とは独立して調製する」ことには該当しない。本発明のろ過助剤を適用したセルラーゼを含む培養液のろ過処理方法は前述のとおりであり、ろ過助剤をボディーフィードするろ過処理であっても、ろ過助剤をろ布にプレコートするろ過処理であってもよく、その両方であってもよい。
微生物菌体がろ別されたセルラーゼは、そのまま粗酵素液として使用してもよく、公知の方法により製剤化してから使用してもよい。
本発明で得られたセルラーゼは、広くセルロース含有バイオマスの加水分解に使用することができる。セルロース含有バイオマスとは、少なくともセルロースまたはヘミセルロースを含むものであり、具体的には、パルプ、バガス、キャッサバパルプ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、コーンハル、稲わら、麦わら、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバが挙げられる。これらのセルロース含有バイオマスは、高分子芳香族化合物リグニンやヘミセルロースなどの不純物が含まれているが、前処理として、酸、アルカリおよび加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを部分的に分解したセルロース含有バイオマスを、セルロースとして利用してもよい。加水分解の条件は、糸状菌由来セルラーゼの至適反応条件に設定すればよいが、処理温度４０～６０℃、処理ｐＨ３～７、およびセルロース含有バイオマス固形分濃度０．１～３０％であることが好ましい。上記の至適反応条件範囲に設定することにより、バイオマス加水分解効率を最大限発揮することができる。この加水分解処理は、バッチ式で行って、連続式で行ってもよい。このような酵素処理によって得られた加水分解物は、グルコースやキシロースなどの単糖成分を含むため、各種化学品を発酵生産するための発酵原料糖として使用することが可能である。
本発明で得られたセルラーゼを使用する際は、酸化酵素、還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素など別の機能を有する酵素成分を加えて酵素剤としてもよい。特にこうした別の機能を有する酵素成分としては、糸状菌に限定されるものでなく、あらゆる生物由来の酵素成分、遺伝子組換えにより生産された酵素成分を添加して使用してもよい。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
＜参考例１＞糸状菌培養液の調製
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７（ＡＴＣＣ６６５８９）（以下、単に「トリコデルマ属糸状菌」ともいう。）の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈した。表１に示した培地２５０ｍＬを仕込んだ１Ｌバッフル付フラスコを２本準備し、希釈胞子溶液２．５ｍＬ接種し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。このうちのフラスコ１本を参考例２の本培養液に接種し、もう一本を参考例２のろ過助剤調製に使用するために本培養終了後まで培養を継続した。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７（ＡＴＣＣ６６５８９）（以下、単に「トリコデルマ属糸状菌」ともいう。）の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈した。表１に示した培地２５０ｍＬを仕込んだ１Ｌバッフル付フラスコを２本準備し、希釈胞子溶液２．５ｍＬ接種し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。このうちのフラスコ１本を参考例２の本培養液に接種し、もう一本を参考例２のろ過助剤調製に使用するために本培養終了後まで培養を継続した。
培養終了後、トリコデルマ属糸状菌の培養液２ｍＬを２ｍＬ容－エッペンドルフチューブに取り、遠心分離機により２０，０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離して上清を廃棄し、蒸留水で洗浄後、再び遠心分離機により２０，０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離して菌体ペレットを回収した。回収した菌体ペレットを、乾熱滅菌器にて１０５℃、２時間乾燥処理して、電子天秤を用いて重量（ｇ－ｃｅｌｌ／２ｍＬ）を測定し、トリコデルマ属糸状菌培養液の乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた結果、１．５ｇ／Ｌであった。
また、糸状菌としてＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｃ１株（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５０８）（以下、単に「タラロマイセス属糸状菌」ともいう。）を用いる場合も同様の方法で培養を実施した。トリコデルマ属糸状菌培養液と同様にタラロマイセス属糸状菌培養液の乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた結果、３４．７ｇ／Ｌであった。
＜参考例２＞糸状菌由来粗酵素液の調製
糸状菌としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７株を用いる場合、表２で示したセルラーゼ生産用培地２．５Ｌを５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）に仕込み、１２１℃、４０分オートクレーブ滅菌処理した。参考例１のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７の培養液２５０ｍＬを前培養液として、セルラーゼ生産用培地に接種した（接種量１０％ｖ／ｖ）。培養条件は、本培養培地に参考例１で調製した培養液を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養開始した。培養１０時間後、表３に示すグルコースおよびラクトースを含む糖液を２２５ｍＬ／ｄａｙの速度で添加し、溶存酸素濃度が２０％となるように糖液の流加を調整しながら培養を行った。
糸状菌としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７株を用いる場合、表２で示したセルラーゼ生産用培地２．５Ｌを５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）に仕込み、１２１℃、４０分オートクレーブ滅菌処理した。参考例１のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７の培養液２５０ｍＬを前培養液として、セルラーゼ生産用培地に接種した（接種量１０％ｖ／ｖ）。培養条件は、本培養培地に参考例１で調製した培養液を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養開始した。培養１０時間後、表３に示すグルコースおよびラクトースを含む糖液を２２５ｍＬ／ｄａｙの速度で添加し、溶存酸素濃度が２０％となるように糖液の流加を調整しながら培養を行った。
糸状菌としてＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｃ１株を用いる場合、セルラーゼ誘導剤（ラクトース）、培養液温度（３０℃）、ｐＨ条件（ｐＨ４．０）、流加条件（流加無し）以外の条件は前述のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＰＣ－３－７株と同様の条件で培養を行った。
培養終了後、培養液を８０ｍＬ採取し５０ｍＬ容遠沈管（コーニング製）２本に等量分注した。菌体を除去するために遠沈管を３，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、デカンテーションにてトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液およびタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液を得た。これら粗酵素液について、後述する参考例４および５に記載の方法でタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定し、また、タラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液に関してはさらに後述する参考例６および７に記載の方法でペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性を測定し、これらの数値を１００％として、以降の実施例・比較例の数値と比較した。
＜参考例３＞アルカリ処理バガスの調製
バガス乾燥重量１００ｇに対し、９．３ｇの苛性ソーダを混合し、１２１℃、３０分間反応させ、アルカリ処理バガスを調製した。
バガス乾燥重量１００ｇに対し、９．３ｇの苛性ソーダを混合し、１２１℃、３０分間反応させ、アルカリ処理バガスを調製した。
＜参考例４＞タンパク質濃度測定条件
タンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
粗酵素希釈液：５μＬ
測定温度：室温
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。
タンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
粗酵素希釈液：５μＬ
測定温度：室温
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。
＜参考例５＞β－キシロシダーゼ比活性の測定条件
基質：ｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
粗酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ 炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて３０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、２Ｍ 炭酸ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離しているｐ－ニトロフェノール量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれるｐ－ニトロフェノール量からβ－キシロシダーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるβ－キシロシダーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
基質：ｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
粗酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ 炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて３０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、２Ｍ 炭酸ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離しているｐ－ニトロフェノール量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれるｐ－ニトロフェノール量からβ－キシロシダーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるβ－キシロシダーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
＜参考例６＞ペクチナーゼ比活性の測定条件
基質：５．５ｇ／Ｌ ポリガラクツロン酸を含有する１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ（タンパク質濃度が０．２５ｇ／Ｌとなるように希釈）
標準品：０．２５～４ｇ／Ｌ ガラクツロン酸
発色試薬：ＤＮＳ試薬（５ｇ／Ｌ ３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）および３００ｇ／Ｌ 酒石酸ナトリウムカリウムを０．４Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解したもの）
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、１Ｍ 水酸化ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
発色反応：新しい９６ウェルＰＣＲプレート上で酵素反応液４０μＬとＤＮＳ試薬８０μＬを混合し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間加熱した。発色液は室温まで冷却し、水１２０μＬと混合した後、そのうち１８０μＬを新しい９６ウェルマイクロプレートに移した。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、発色液の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離している還元糖量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれる還元糖量からペクチナーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるペクチナーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
基質：５．５ｇ／Ｌ ポリガラクツロン酸を含有する１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ（タンパク質濃度が０．２５ｇ／Ｌとなるように希釈）
標準品：０．２５～４ｇ／Ｌ ガラクツロン酸
発色試薬：ＤＮＳ試薬（５ｇ／Ｌ ３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）および３００ｇ／Ｌ 酒石酸ナトリウムカリウムを０．４Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解したもの）
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、１Ｍ 水酸化ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
発色反応：新しい９６ウェルＰＣＲプレート上で酵素反応液４０μＬとＤＮＳ試薬８０μＬを混合し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間加熱した。発色液は室温まで冷却し、水１２０μＬと混合した後、そのうち１８０μＬを新しい９６ウェルマイクロプレートに移した。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、発色液の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離している還元糖量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれる還元糖量からペクチナーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるペクチナーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
＜参考例７＞ガラクタナーゼの比活性の測定条件
基質：５．５ｇ／Ｌ ポテト由来ガラクタンを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ（タンパク質濃度が０．２５ｇ／Ｌとなるように希釈）
標準品：０．２５～４ｇ／Ｌ ガラクトース
発色試薬：ＤＮＳ試薬
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、１Ｍ 水酸化ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
発色反応：新しい９６ウェルＰＣＲプレート上で酵素反応液４０μＬとＤＮＳ試薬８０μＬを混合し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間加熱した。発色液は室温まで冷却し、水１２０μＬと混合した後、そのうち１８０μＬを新しい９６ウェルマイクロプレートに移した。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、発色液の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離している還元糖量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれる還元糖量からガラクタナーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるガラクタナーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
基質：５．５ｇ／Ｌ ポテト由来ガラクタンを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ（タンパク質濃度が０．２５ｇ／Ｌとなるように希釈）
標準品：０．２５～４ｇ／Ｌ ガラクトース
発色試薬：ＤＮＳ試薬
酵素反応：９６ウェルＰＣＲプレート上で４℃に冷却した基質に酵素希釈液を混合し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を速やかに４℃まで冷却し、１Ｍ 水酸化ナトリウム１０μＬを添加することにより酵素反応を停止させた。
発色反応：新しい９６ウェルＰＣＲプレート上で酵素反応液４０μＬとＤＮＳ試薬８０μＬを混合し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間加熱した。発色液は室温まで冷却し、水１２０μＬと混合した後、そのうち１８０μＬを新しい９６ウェルマイクロプレートに移した。
活性の定量：マイクロプレートリーダーにより、発色液の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品に基づく検量線の値から反応液中に遊離している還元糖量を算出した。活性１Ｕは、１分間あたり１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素希釈液中に含まれる還元糖量からガラクタナーゼ活性を算出した。タンパク質１ｍｇあたりの活性は、酵素希釈液中に含まれるガラクタナーゼ活性を、酵素希釈液のタンパク質濃度で除じた値とした。
＜参考例８＞糖濃度の測定
粗酵素液１８０μＬに対し反応停止液として１Ｎ ＮａＯＨ を２０μＬ添加した溶液を調製し、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、以下の条件でキシロース定量分析し、濃度を測定した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ，ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
移動相：８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．２％（ｖ／ｖ）トリメチルアミン（ＴＥＡ）混合溶液
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎでアセトニトリルを８０％から７５％にグラジエントをかけて溶出
温度：５０℃
検出方法：ＥＬＳＤ（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）。
粗酵素液１８０μＬに対し反応停止液として１Ｎ ＮａＯＨ を２０μＬ添加した溶液を調製し、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、以下の条件でキシロース定量分析し、濃度を測定した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ，ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
移動相：８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．２％（ｖ／ｖ）トリメチルアミン（ＴＥＡ）混合溶液
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎでアセトニトリルを８０％から７５％にグラジエントをかけて溶出
温度：５０℃
検出方法：ＥＬＳＤ（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）。
＜比較例１＞珪藻土をろ過助剤（プレコート剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。溶出した水は廃棄した。
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。溶出した水は廃棄した。
次に、参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液２０ｍＬを、プレコート層を形成させたポリサルフォンホルダーに静かに滴下し、真空ポンプで吸引ろ過した。得られたろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法でタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。また、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して５３．９％であった。
＜実施例１＞珪藻土およびトリコデルマ属糸状菌体を含む培養液の混合物をろ過助剤（プレコート剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。菌体画分を回収し、蒸留水を用いて懸濁後、３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して菌体画分を洗浄した。洗浄した菌体画分を分離した上清画分と等量の蒸留水で懸濁させた後、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例１と同様の手順で参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。菌体画分を回収し、蒸留水を用いて懸濁後、３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して菌体画分を洗浄した。洗浄した菌体画分を分離した上清画分と等量の蒸留水で懸濁させた後、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例１と同様の手順で参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して７４．７％であった。
＜実施例２＞珪藻土およびトリコデルマ属糸状菌培養液の上清の混合物をろ過助剤（プレコート剤）として用いたセルラーゼ粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。得られた上清に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例１と同様の手順で参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。得られた上清に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例１と同様の手順で参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して６８．１％であった。
＜比較例２＞珪藻土をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。溶出した水は廃棄した。
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。溶出した水は廃棄した。
次に、参考例２で調製したトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液１０ｍＬに対し、前述のろ過助剤１０ｍＬを添加し（ボディーフィード）、プレコート層を形成させたポリサルフォンホルダーに静かに滴下し、真空ポンプで吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４および図１に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。また、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して２２．５％であった。
＜比較例３＞珪藻土およびトリコデルマ属糸状菌培養液の菌体画分の混合物をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。菌体画分を回収し、蒸留水を用いて懸濁後、３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して菌体画分を洗浄した。洗浄した菌体画分を分離した上清画分と等量の蒸留水で懸濁させた後、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。菌体画分を回収し、蒸留水を用いて懸濁後、３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して菌体画分を洗浄した。洗浄した菌体画分を分離した上清画分と等量の蒸留水で懸濁させた後、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して２６．２％であり、比較例２と同等であることが明らかになった。
＜実施例３＞珪藻土およびトリコデルマ属糸状菌体を含む培養液の混合物をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量に１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量に１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４および図１に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して８８．４％であった。
＜実施例４＞珪藻土およびトリコデルマ属糸状菌培養液の上清の混合物をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。その後、珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”と上清画分の混合物を調製した。この混合物をプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例５および６に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したトリコデルマ属糸状菌培養液全量を３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清と菌体を分離した。その後、珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”と上清画分の混合物を調製した。この混合物をプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例５および６に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して６７．８％であった。
＜実施例５＞珪藻土およびタラロマイセス属糸状菌体を含む培養液の混合物をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したタラロマイセス属糸状菌培養液全量に、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したタラロマイセス属糸状菌培養液全量に、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は比較例２と同様の手順でトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４および５に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度およびβ－キシロシダーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、タンパク質濃度は吸引ろ過前後で若干減少したが、これはプレコート形成時に残留した水分によって希釈されたことが原因と考えられる。一方、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較して８１．２％であった。
＜比較例４＞珪藻土をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。分離した水は廃棄した。
蒸留水に１０％（ｗ／ｖ）となるよう珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤１０ｍＬをポリサルフォンホルダーのろ布に滴下させた後、真空ポンプで吸引ろ過してろ過助剤のプレコート層を形成させた。分離した水は廃棄した。
次に、参考例２で調製したタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液１０ｍＬに対し、前述のろ過助剤１０ｍＬを添加し（ボディーフィード）、プレコート層を形成させたポリサルフォンホルダーに静かに滴下し、真空ポンプで吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４～７に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度、β－キシロシダーゼ比活性、ペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較すると、１８．８％まで低下していた。また、ペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性は未ろ過処理のタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較すると、それぞれ８５．６％および７３．８％であった。
＜実施例６＞珪藻土およびタラロマイセス属糸状菌体を含む培養液の混合物をろ過助剤（プレコート剤およびボディーフィード剤）として用いたタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液の固液分離
参考例１に記載の方法で調製したタラロマイセス属糸状菌培養液全量に、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は、比較例４の手順でタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４～７に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度、β－キシロシダーゼ比活性、ペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性を測定した。
参考例１に記載の方法で調製したタラロマイセス属糸状菌培養液全量に、１０％（ｗ／ｖ）となるように珪藻土“Ｃｅｌｉｔｅ ５１２”を添加して、室温で１時間１２０ｒｐｍで振盪培養させたものをプレコート用およびボディーフィード用のろ過助剤とした。このろ過助剤を使用した以外は、比較例４の手順でタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液を吸引ろ過してろ液を回収し、参考例４～７に記載の方法で回収したろ液のタンパク質濃度、β－キシロシダーゼ比活性、ペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性を測定した。
表４に示した通り、β－キシロシダーゼ比活性は未ろ過処理のタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較すると８４．７％であった。また、ペクチナーゼ比活性およびガラクタナーゼ比活性は未ろ過処理のタラロマイセス属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）と比較すると、それぞれ１０２％および９７．９％であった。
＜実施例７＞セルロース含有バイオマス糖化試験
参考例２で得られた未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液、比較例２および３、実施例３および４で得られたろ液を用いてアルカリ処理バガスの糖化試験を実施した。
参考例２で得られた未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液、比較例２および３、実施例３および４で得られたろ液を用いてアルカリ処理バガスの糖化試験を実施した。
参考例４に記載の方法に従って調製したアルカリ処理バガスを５％（ｗ／ｖ）バイオマス仕込みで５０℃、７時間、回転ローターを用いてインキュベートした後、２０，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離により反応液上清を回収した。反応液上清１８０μＬに反応停止液である１Ｎ ＮａＯＨを２０μＬ添加し、参考例７に示す分析条件でキシロース遊離量を定量した。
表５に示した通り、未ろ過処理のトリコデルマ属糸状菌由来粗酵素液（参考例２）を用いた結果、キシロース遊離量は１０．１ｇ／Ｌを示した。比較例２および３のろ液を用いた結果、キシロース遊離量はそれぞれ７．８７ｇ／Ｌ、８．０４ｇ／Ｌを示し、参考例２と比較してそれぞれ２２．７％、２０．３％減少した。一方、実施例３のろ液を用いた結果、キシロース遊離量は１１．５ｇ／Ｌを示し、参考例２と比較して１３．９％増加した。また、実施例４のろ液を用いた結果、キシロース遊離量は９．５５ｇ／Ｌを示し、参考例２と比較して５．４４％減少したものの、１０％未満の減少にとどまった。
Claims (16)
- 無機系ろ過助剤および糸状菌培養液の混合物である、ろ過助剤。
- 前記無機系ろ過助剤が珪藻土である、請求項１に記載のろ過助剤
- 前記糸状菌がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、請求項１または２に記載のろ過助剤。
- 前記培養液が、糸状菌体の乾燥菌体重量（ｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）が少なくとも１．０ｇ／Ｌ以上になるまで培養した培養液である、請求項１～３のいずれかに記載のろ過助剤。
- 前記培養液が培養後の糸状菌体を含む、請求項１～４のいずれかに記載のろ過助剤。
- 請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理する工程を含む、ろ過処理方法。
- 前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液に請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理工程である、請求項６に記載のろ過処理方法。
- 前記ろ過処理工程が、被ろ過処理液を請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理工程である、請求項６または７に記載のろ過処理方法。
- セルラーゼを生産する能力を有する微生物を培養する工程（１）、および、工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、工程（１）とは独立して調製した請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤と共にろ過処理し、微生物菌体がろ別されたセルラーゼを回収する工程（２）を含む、セルラーゼの製造方法。
- 前記工程（１）の微生物がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを生産する能力を有する微生物であり、前記工程（２）がβ－キシロシダーゼ活性を有するセルラーゼを回収する工程である、請求項９に記載のセルラーゼの製造方法。
- 前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液に、前記工程（１）とは独立して調製した請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤を添加するろ過処理である、請求項９または１０に記載のセルラーゼの製造方法。
- 前記工程（２）のろ過処理が、前記工程（１）で得られた培養後の微生物菌体を含む培養液を、前記工程（１）とは独立して調製した請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤をプレコートしたろ材のプレコート側から通じるろ過処理である、請求項９～１１のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- 前記工程（２）のろ過処理がフィルタープレスである、請求項９～１２のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- 前記工程（１）で培養するセルラーゼを生産する能力を有する微生物がトリコデルマ属糸状菌またはタラロマイセス属糸状菌である、請求項９～１３のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- 前記工程（１）で培養する糸状菌の前培養液と無機系ろ過助剤を混合して請求項１～５のいずれかに記載のろ過助剤を調製する工程を含む、請求項１４に記載のセルラーゼの製造方法。
- 請求項９～１５のいずれかに記載の方法によりセルラーゼを製造する工程、および、前記工程で得られたセルラーゼでセルロース含有バイオマスを加水分解する工程を含む、糖の製造方法。
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- 2023-03-07 WO PCT/JP2023/008470 patent/WO2023171644A1/ja active Application Filing
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