WO2020027010A1 - トリコデルマ属糸状菌の変異株およびタンパク質の製造方法 - Google Patents

トリコデルマ属糸状菌の変異株およびタンパク質の製造方法 Download PDF

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amino acid
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culture
mutant
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雄介 加川
紳吾 平松
山田　勝成
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東レ株式会社
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a mutant strain of Trichoderma filamentous fungus capable of keeping the viscosity of a culture solution low, and a method for producing a protein using the mutant strain.
  • Trichoderma filamentous fungi are known to have a high protein-producing ability, and the production of proteins using Trichoderma filamentous fungi has been studied. Specifically, Trichoderma filamentous fungi produce cellulase, which is classified as a saccharifying enzyme among proteins, using cellulose, lactose, cellobiose and the like as inducers. In order to enhance the production of cellulase, many studies have been conducted from a long time ago, such as overexpression of factors controlling cellulase production, gene modification such as deletion, optimization of culture conditions, and the like.
  • Trichoderma filamentous fungi belong to aerobic filamentous fungi that require oxygen for growth and protein production.
  • Trichoderma filamentous fungi are characterized in that, when cultured in a liquid medium, the viscosity of the culture solution increases with growth. When the viscosity of the culture solution increases, the distribution of oxygen and nutrients becomes uneven, so when culturing Trichoderma filamentous fungi, the culture solution is agitated or the oxygen supply is increased by increasing the oxygen supply. It is necessary to prevent the decrease of the dissolved oxygen saturation and maintain it at a certain level or more. Further, as the size of the culture tank increases, the oxygen transfer capacity coefficient decreases.
  • Patent Literatures 1 to 6 disclose the dissolution during aerobic fermentation in a submerged culture compared to a parent strain by reducing the destruction or production of Sfb3, Mpg1, Gas1, Seb1, Crz1 and Tps1 proteins of Trichoderma filamentous fungi, respectively. It is disclosed that the amount of oxygen can be maintained at a low stirring rate. Patent Document 7 describes that disruption of the BXL1 gene of Trichoderma filamentous fungi can suppress a decrease in the dissolved oxygen saturation of a culture solution.
  • the present inventors have conducted intensive studies to identify the genes of Trichoderma filamentous fungi that enable the viscosity of the culture solution to be kept low. As a result, it was found that the mutation of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit kept the viscosity of the culture solution low. And found that the decrease in the dissolved oxygen saturation in the culture solution could be suppressed, and completed the present invention.
  • the present invention includes the following (1) to (8).
  • a method for producing a protein comprising a step of culturing the mutant strain of the genus Trichoderma according to any one of (1) to (6).
  • a method for producing cellulase comprising a step of culturing the mutant strain of the genus Trichoderma according to any one of (1) to (6).
  • the mutant strain of the genus Trichoderma of the present invention can maintain the viscosity of the culture solution lower than that of the parent strain before the introduction of the mutation, and can also suppress a decrease in dissolved oxygen saturation in the culture solution.
  • an unexpected effect of increasing the production of proteins, particularly cellulase, is also obtained.
  • the present invention is characterized in that the viscosity of a culture solution can be kept low by introducing a mutation into a parent strain of Trichoderma filamentous fungus, which is a microorganism originally excellent in protein production ability.
  • the parent strain of Trichoderma filamentous fungus used in the present invention is not limited to a wild strain, and a mutant strain of Trichoderma filamentous fungus improved so as to enhance protein production ability can also be preferably used as a parent strain.
  • a mutant strain of Trichoderma filamentous fungus is subjected to a mutation treatment with a mutagen or ultraviolet irradiation, and a mutant strain having improved protein productivity can be used as the parent strain.
  • the parent strain include Trichoderma parareesei (ATCC MYA-4777), which is an ancestor of Trichoderma reesei, QM6a strains (NBRC31326), QM4123N, and QM9123N (QM4123N) strains which are known mutant strains belonging to Trichoderma reesei.
  • PC-3-7 strain ATCC 66589
  • QM9123 strain NBRC31327)
  • RutC-30 strain ATCC 56765
  • CL-847 strain Enzyme. Microbiol. Technol. 10, 341-346 (1988)
  • MCG77 strain Biotechnol. Bioeng. Symp. 8, # 89 (1978)
  • MCG80 strain Biotechnol.
  • Trichoderma citrinoviride (ATCC24961), Trichoderma longibrachiatum (ATCC18648), Trichoderma virens (ATCC9645), Trichoderma atroviride (ATCC20476), Trichoderma gamsii (NFCCI2177), Trichoderma asperellum (ATCC52438), Trichoderma harzianum (ATCC20846), Trichoderma @ guizhouense and the like.
  • Beta-adaptin large subunit is one of the proteins constituting an adapter protein complex composed of a tetramer. Adapter protein complexes are widely conserved in eukaryotes. It is known that the adapter protein binds to clathrin and forms vesicles involved in intracellular and extracellular transport (Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 101, 14108-14113 (2004)). )).
  • beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunits possessed by the filamentous fungi belonging to Trichoderma are preferably polypeptides having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is derived from Trichoderma reesei
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is derived from Trichoderma citrinoviride
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is derived from Trichoderma longibrachiatum.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is derived from Trichoderma m virens
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is derived from Trichoderma atroviride
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is derived from Trichoderma gamsii.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is derived from Trichoderma asperellum and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. It is derived from Trichoderma harzianum
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is derived from a Trichoderma guizhouense.
  • the alignment results of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 10 are shown in FIGS. 1-1 and 1-2.
  • SEQ ID NOs: 2 to 10 As shown in FIGS. 1-1 and 1-2, the sequence identities of SEQ ID NOs: 2 to 10 are 90% or more, and beta-adaptin @ large ⁇ subunit has high amino acid sequence conservation in Trichoderma filamentous fungi. Understand.
  • a glutamine residue is commonly conserved at the 300th amino acid residue from the N-terminal side of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 2 to 10.
  • SEQ ID NO: 2 as an example.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a polypeptide belonging to Trichoderma reesei as described above, and according to National Center Center for Biotechnology Information, the adapter adapter-aprox-protein of the strain Trichoderma reesei QM6a (QM6a) is provided. It is registered as adaptin ⁇ large ⁇ subunit (EGR48910). Also, according to the National Center for Biotechnology Information, Censused Domain, Architecture, Retriever, and Tool, the 14th to 531st amino acid residues from the N-terminal side are disclosed as an Adaptin N Terminal domain.
  • having a mutation in the amino acid sequence constituting beta-adaptin large subunit may be any of amino acid deletion, substitution, or addition.
  • the glutamine residue at the 300th position from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 is mutated to an amino acid residue other than glutamine, and particularly preferably lysine. Preferably, it is mutated.
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a specific example of a base sequence encoding an amino acid sequence in which the glutamine residue at the 300th position from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is mutated to an amino acid residue other than glutamine is represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 A specific example of a base sequence encoding an amino acid sequence in which the glutamine residue at the 300th position from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is mutated to an amino acid residue other than glutamine is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention may be a mutant strain in which the function of beta-adaptin large subunit is deficient or reduced.
  • the loss of the function of beta-adaptin large subunit refers to the loss of all, part of the polypeptide, all of the polypeptide being changed to a different amino acid, part of the polypeptide being changed to a different amino acid, or a combination thereof. More specifically, it indicates that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a sequence identity of 80% or less, and preferably 50% or less, with the amino acid sequence of beta-adaptin @ large ⁇ subunit shown above. , More preferably 20% or less, further preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less, further preferably 1% or less, and most preferably 0% or less. %.
  • Decreased function of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit refers to all or a partial deletion of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit, and also introduces a mutation that reduces or reduces the expression level of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit. This can also reduce the function of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit.
  • the expression level of beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit is reduced or eliminated by mutation of the promoter or terminator region of the gene encoding beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit.
  • a promoter and a terminator region correspond to a region of several hundred bases before and after a gene involved in transcription.
  • Mutations in which the function of beta-adaptin @ large ⁇ subunit is deficient or reduced, or methods for introducing mutations into the amino acid sequence constituting beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit, can be carried out by mutation treatment using a mutagen or ultraviolet irradiation known to those skilled in the art, a selection marker.
  • Known gene mutation methods such as gene recombination such as homologous recombination using, and mutation by a transposon can be used.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention has a reduced viscosity of the culture solution and can also suppress a decrease in the dissolved oxygen saturation in the culture solution, as compared with the parent strain before the introduction of the mutation. Thereby, the energy required for aeration stirring and the number of rotations can be reduced. In addition, since the rotation speed of the stirring can be set low, the shear damage to the mycelium can be reduced. In particular, in the case of culturing on a large scale, it is more effective because it reduces the capacity of the blower and the stirring motor required for aeration and the stirring energy.
  • the viscosity of the culture solution is a value measured under the following conditions, and the viscosity is compared by comparing the maximum values among the values measured under the following conditions.
  • the spores of the mutant strain of the genus Trichoderma and the parent strain to be evaluated were cultured in a preculture medium such that the spores of the parent strain became 1.0 ⁇ 10 5 spores per mL of the preculture medium (an example of a specific medium composition is described in Examples. As shown in Table 1) and cultured in a shaking incubator under the conditions of 28 ° C. and 120 rpm until the amount of cells becomes about 11 g / L.
  • the preculture medium was adjusted to 10% (v / v) with respect to the main culture medium shown in Table 2 to which Arbocel B800 (manufactured by Rettenmeier) was added so as to be 100 g / L (w / v). Inoculate and submerge using a 5 L jar fermenter.
  • the culture conditions after inoculating the preculture medium into the main culture medium, deep culture is performed under the culture conditions of 28 ° C., 700 rpm, and aeration rate of 100 mL / min while controlling the pH to 5.0.
  • the viscosity of the culture solution is measured using a digital rotational viscometer.
  • the digital rotational viscometer performs zero point calibration in advance.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention has a lower viscosity of the culture solution than the parent strain when the parent strain before the mutagenesis is cultured under the same conditions, and the viscosity of the mutant during the culture is lower than that of the parent strain.
  • the dissolved oxygen saturation in the culture solution can be calculated by measuring the oxygen utilization rate in the culture solution.
  • the oxygen utilization rate (mM / L / hr) in the present invention refers to the oxygen consumption rate per 1 L of the culture solution per unit time 24 hours after the start of the culture.
  • the culture is performed while maintaining the culture conditions constant, the supply of oxygen is stopped at 24 hours after the start of the culture, and the dissolved oxygen (mg / L) value (DO value) is plotted every 10 seconds. Then, the slope (A) (unit: DO / sec) is obtained for plots of three or more points that logarithmically decrease in the curve.
  • the following equation 1 is used to calculate the oxygen utilization rate.
  • Oxygen utilization rate (mM / L / hr) ( ⁇ A) ⁇ (1/32) ⁇ 60 ⁇ 60 (Equation 1).
  • DO meter can be used for measuring the DO value.
  • DO meter there is no particular limitation on the DO meter used, as long as the DO value can be measured accurately. Examples include a sealed DO electrode (manufactured by Able Corporation) and a dissolved oxygen sensor (manufactured by METTLER TOLEDO).
  • the DO meter performs zero point calibration and span calibration in advance. Zero-point calibration is performed using a 2% sodium sulfite solution. In the span calibration, aeration and agitation are performed in the absence of bacterial cells under the conditions for actual culturing, wait until the dissolved oxygen becomes saturated, and then confirm that the indicated value of the instrument is stable. Calibrate according to the saturated dissolved oxygen.
  • DO measurement is performed by pressurizing the culture tank, it is necessary to perform pressure correction. Further, when the culture tank is large, it is necessary to perform hydrostatic pressure correction. When performing the correction, it is calculated using the following equation 2.
  • Dissolved oxygen saturation was measured during the culture period for saturated dissolved oxygen when the pH and temperature were set to culture conditions using a culture medium containing no bacteria and the dissolved oxygen saturation when air was aerated was 100%. Is calculated as the dissolved oxygen saturation.
  • Dissolved oxygen (mg / L) indicates the concentration of oxygen dissolved in water.
  • saturated dissolved oxygen refers to dissolved oxygen in a state in which aeration and agitation are performed in the absence of bacterial cells under culture conditions for actually culturing, and the dissolved oxygen is constant.
  • the culture conditions such as aeration conditions are not changed during the culture period. As the oxygen demand decreases, the dissolved oxygen saturation increases. The dissolved oxygen saturation is calculated according to Equation 3 below.
  • Dissolved oxygen saturation (%) (dissolved oxygen during culture) / (saturated dissolved oxygen before culture start) ⁇ 100 (formula 3).
  • the measurement results obtained by adjusting the culture conditions such as the culture medium, the oxygen supply amount, the stirring speed, the temperature, the culture volume, and the inoculated amount.
  • the amount of inoculation at the time of measurement is preferably about 10% (v / v) with respect to the main culture solution.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention and the dissolved oxygen of the parent strain before the introduction of the mutation are cultured under similar conditions
  • the mutant strain has a higher minimum dissolved oxygen saturation than the parent strain, and is preferably 5% or more, more preferably 6% or more, more preferably 7% or more, further preferably 8% or more, further preferably 9% or more, further preferably 10% or more, further preferably 11% or more, and still more preferably 12% or more. %, More preferably 13% or more, further preferably 14% or more, particularly preferably 15% or more.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention does not decrease in growth ability as compared with the parent strain before the introduction of the mutation.
  • the difference in proliferation ability can be compared by measuring the amount of cells. The cell mass is measured as the dry cell weight. 10 mL of the culture solution is subjected to suction filtration using qualitative filter paper (grade 4, GE Healthcare), and the residue is dried together with the filter paper at 100 ° C. Then, the weight is measured, and the difference between the weights of the filter paper before and after filtration is defined as the dry cell weight.
  • the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention may be a gene that improves or reduces protein production in addition to a mutation in which the function of beta-adaptin @ large ⁇ subunit is deficient or reduced, or a mutation in the amino acid sequence that constitutes beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit. It may have a mutation. Specific examples include a gene mutation that reduces the function of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 13.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is a polypeptide belonging to Trichoderma reesei, and is registered in National Center for Biotechnology Information as a predicated 5050 protein of Trichoderma reesei QM6a strain, which is a registered EG50 strain of QM6a.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is a polypeptide of unknown function, the 95th to 277th amino acids from the N-terminal side from the N-terminus according to the National Center for Biotechnology Information, Cen- sified Domain, Architecture, Retriever, Tool.
  • MIF4G domain ⁇ eukaryotic ⁇ initiation ⁇ factor ⁇ 4G domain
  • MA-3 domains are known to have the function of binding to DNA or RNA (B Ochem.44, 12265-12272 (2005), Mol.Cell.Biol.1,147-156 (2007))
  • the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 contains at least DNA and / or Alternatively, it is presumed to have a function of binding to RNA.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the gene mutation that reduces the function of EGR50654 is defined as a total deletion of the MIF4G domain and / or the MA-3 domain of EGR50654, a partial deletion of the MIF4G domain and / or the MA-3 domain, and a difference between the MIF4G domain and the MA-3 domain.
  • Gene mutations whose steric relationship changes.
  • the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 can also be reduced by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a polypeptide belonging to Trichoderma reesei, and in National Center for Biotechnology Information, Predicated EG44 which is a registered strain of Trimoderma reesei which is a registered strain of Trimoderma reesei strain QM6a is registered in EG44.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the National Center for Biotechnology Information, Censured Domain, Architecture, Retrieval Tool, the 26th to 499th amino acids from the N-terminal to the 499th amino acid residue.
  • the group is disclosed to have a "Sugar (and other) @Transporter domain.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is capable of transporting sugar at least between the inside and outside of the bacterial body. It is presumed to be involved.
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the gene mutation that reduces the function of EGR44419 is defined as a total deletion of the Sugar (and other) @Transporter domain, a partial deletion of the Sugar (and @ other) @Transporter domain, and a change in the configuration of the Sugar (and @ other) @Transporter domain of EGR44419.
  • Gene mutation Furthermore, the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 can also be reduced by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is deficient is a mutation in which 11 bases are inserted at the 1415th position in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the present invention also relates to a method for producing a protein, which comprises a step of culturing a mutant strain of Trichoderma sp. Having a mutation in the amino acid sequence constituting beta-adaptin ⁇ large ⁇ subunit.
  • proteins secreted outside the cells can be efficiently produced.
  • the protein to be produced is not limited, but is preferably an enzyme, more preferably a saccharifying enzyme such as cellulase, amylase, invertase, chitinase, pectinase, and particularly preferably cellulase.
  • the cellulase produced by the present invention contains various hydrolases, including enzymes having a decomposing activity on xylan, cellulose, and hemicellulose.
  • hydrolases including enzymes having a decomposing activity on xylan, cellulose, and hemicellulose.
  • cellobiohydrolase EC 3.2.1.91
  • endoglucanase EC43.2.1.4
  • ⁇ -glucosidase which hydrolyzes cellooligosaccharides and cellobiose
  • xylanase characterized by acting on hemicellulose and particularly xylan
  • xylooligosaccharide ⁇ -xylosidase which hydrolyzes
  • the cellulase protein concentration is measured as follows. A culture solution obtained by culturing Trichoderma filamentous fungi by the method of the present invention is centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is used as a cellulase solution. 5 ⁇ L of a cellulase solution diluted with 250 ⁇ L of Quick Start Bradford Protein Assay (manufactured by Bio-Rad) is added, and the absorbance used at 595 nm after standing at room temperature for 15 minutes is measured. Using the bovine serum albumin solution as a standard solution, the concentration of the protein contained in the saccharifying enzyme solution is calculated based on the calibration curve.
  • the culture method for culturing Trichoderma filamentous fungi in the present invention is not particularly limited, for example, a liquid culture using a centrifuge tube, a flask, a jar fermenter, a tank, or the like, or a solid culture using a plate or the like. it can.
  • the filamentous fungus of the genus Trichoderma is preferably cultured under aerobic conditions, and among these culture methods, a jar fermenter or a deep submerged culture in which aeration and stirring are performed in a tank are particularly preferable.
  • the medium composition in the culturing step is not particularly limited as long as the medium composition allows the filamentous fungus of the genus Trichoderma to produce a protein, and a well-known medium composition of the genus Trichoderma can be employed.
  • a well-known medium composition of the genus Trichoderma can be employed.
  • the nitrogen source for example, polypeptone, broth, CSL, soybean meal and the like can be used.
  • an inducer for producing a protein may be added to the medium.
  • the cellulase When producing cellulase according to the present invention, the cellulase can be cultured in a medium containing at least one or two or more inducers selected from the group consisting of lactose, cellulose and xylan.
  • cellulose or xylan may be added with biomass containing cellulose or xylan as an inducer.
  • biomass containing cellulose and xylan include seed plants, fern plants, moss plants, algae, aquatic plants, and other waste materials as well as plants. Seed plants are classified into gymnosperms and angiosperms, both of which can be preferably used.
  • Angiosperms are further classified into monocotyledons and dicotyledons, and specific examples of monocotyledons include bagasse, switchgrass, napier grass, Elianthus, corn stover, corn cob, rice straw, straw, and the like. Specific examples of plants include beet pulp, eucalyptus, oak, birch, and the like.
  • pretreated biomass containing cellulose or xylan may be used.
  • the pretreatment method is not particularly limited, and for example, a known method such as an acid treatment, a sulfuric acid treatment, a dilute sulfuric acid treatment, an alkali treatment, a hydrothermal treatment, a subcritical treatment, a fine pulverizing treatment, and a steaming treatment can be used. Pulp may be used as biomass containing pretreated cellulose and xylan.
  • the method for culturing the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus of the present invention is not particularly limited.
  • a liquid culture using a centrifuge tube, a flask, a jar fermenter, a tank, or the like, or a solid culture using a plate or the like may be used.
  • the ventilation rate is preferably about 0.1 to 2.0 vvm, more preferably 0.3 to 1.5 vvm, and particularly preferably 0.5 to 1.0 vvm.
  • the cultivation temperature is preferably about 25 to 35 ° C, more preferably 25 to 31 ° C.
  • the pH condition in the culture is preferably pH 3.0 to 7.0, and more preferably pH 4.0 to 6.0.
  • the culturing time is not particularly limited as long as it can be carried out until a recoverable amount of the protein is accumulated under the conditions for producing the protein, but is usually 24 to 288 hours, preferably 24 to 240 hours, more preferably Is 36 to 240 hours, more preferably 36 to 192 hours.
  • the method of recovering the protein contained in the culture solution in which the mutant strain of Trichoderma filamentous fungus is cultured is not particularly limited, but the protein of Trichoderma filamentous fungus can be removed from the culture solution to recover the protein.
  • Examples of the method for removing cells include a centrifugal separation method, a membrane separation method, a filter press method and the like.
  • the cells of Trichoderma are not allowed to grow in the culture. Processing is preferred. Examples of the method for treating cells so that they cannot grow include heat treatment, chemical treatment, acid / alkali treatment, and UV treatment.
  • the culture solution treated as described above so that the cells are not removed or grown can be used as it is as the enzyme solution.
  • Protein concentration measuring method A protein concentration measuring reagent (Quick Start Bradford protein assay, manufactured by Bio-Rad) was used. 5 ⁇ L of the culture solution of the filamentous fungus diluted to 250 ⁇ L of the protein concentration measurement reagent returned to room temperature was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the absorbance at 595 nm was measured with a microplate reader. BSA was used as a standard, and the protein concentration was calculated according to a calibration curve.
  • Dissolved oxygen saturation was determined by setting the pH and temperature to culture conditions using a culture medium containing no bacteria, and setting the saturated state of dissolved oxygen when air was aerated to 100%. In this case, the ratio of the dissolved oxygen to the saturated dissolved oxygen during the culture period was calculated as the dissolved oxygen saturation.
  • a closed type dissolved oxygen electrode SDOC-12F-L120 manufactured by Able Corporation was used.
  • the culture solution 39, 48, 62, 72, 86, 96, and 111 hours after the start of culture was measured using a digital rotary viscometer DV2T and a spindle.
  • the viscosity (cP) when the rotation speed was set to 0.3 rpm was determined using UL ADAPTOR (manufactured by BROOKFIELD).
  • the culture solution was subjected to suction filtration with filter paper, and the difference between the dry cell weight of the filter paper before and after suction filtration was referred to as the bacterial cell amount. did.
  • Trichoderma reesei QM9414 mutant strain I having reduced function of beta-adaptin large subunit A poly-amino acid sequence comprising amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 having a mutation in the amino acid sequence constituting beta-adaptin large subunit
  • a DNA fragment comprising the gene sequence represented by SEQ ID NO: 15 was prepared as a DNA fragment containing the gene encoding the peptide, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain, whereby the function of beta-adaptin large subunit was improved. Reduced Trichoderma reesei mutants were generated.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei having a polypeptide in which the cytosine at position 1080 in SEQ ID NO: 1 has been changed to adenine and the sequence 300 in SEQ ID NO: 2 has been mutated from glutamine to lysine.
  • Acetamide and an acetamidase (AmdS) gene (amdS) capable of degrading acetamide were used as selection markers for DNA fragment introduction.
  • mutagenesis was performed so as to add a portion homologous to the gene sequence of Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • a plasmid for use was prepared.
  • a DNA fragment obtained by treating the synthesized DNA fragment represented by SEQ ID NO: 16 with restriction enzymes KpnI and NotI was used as an upstream DNA fragment.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a conventional method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18, and the resulting amplified fragment was subjected to a downstream DNA fragment treated with restriction enzymes MluI and SpeI. DNA fragments were used, and the upstream and downstream DNA fragments were introduced into the plasmid into which amdS was inserted using KpnI and NotI and MluI and SpeI restriction enzymes, respectively, to construct a plasmid for mutation introduction.
  • the plasmid for mutagenesis was treated with restriction enzymes ApaI and AscI, and the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 15 was used to transform Trichoderma rereei strain QM9414 (NBRC31329).
  • the obtained mutant was used as QM9414 mutant I in the following experiments.
  • Example 2 Production test of protein using QM9414 mutant I (preculture)
  • the spores of the QM9414 mutant strain I prepared in Example 1 were diluted with physiological saline to a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 / mL, and 2.5 mL of the diluted spore solution was placed in a 1-L baffled flask shown in Table 1.
  • the cells were inoculated into the 250 mL of the preculture medium, and cultured in a shaking incubator at 28 ° C. and 120 rpm for 72 hours.
  • Arbocel B800 (Main culture) Arbocel B800 (Rettenmeier) was added to the main culture medium shown in Table 2, and deep culture was examined using a 5 L jar fermenter (manufactured by Biot). 250 mL of a preculture of Trichoderma reesei QM9414 strain and the QM9414 mutant I prepared in Example 1 were inoculated into 2.5 L of a main culture medium supplemented with Arbocel B800. The culture conditions were as follows: after inoculation of the preculture medium into the main culture medium, deep culture was performed under the culture conditions of 28 ° C., 700 rpm, aeration rate of 100 mL / min, while controlling the pH to 5.0.
  • Example 3 Preparation of Trichoderma reesei QM9414 Mutant II with Reduced Function of beta-adaptin large Subunit Mutant of Trichoderma reesei, whose sequence number is 19 from the sequence number of the Trichoderma reesei with the reduced sequence of trichoderma reesei, has a reduced function of beta-adaptin large subunit.
  • a DNA fragment was prepared by transforming the DNA fragment into Trichoderma reesei strain QM9414. According to this method, a mutant strain of Trichoderma reesei in which amdS is inserted between positions 791 and 792 in SEQ ID NO: 1 and the function of beta-adaptin large subunit is reduced is obtained.
  • a plasmid for mutagenesis was prepared so that a portion homologous to the gene sequence of Trichoderma reesei QM9414 strain was added upstream and downstream of the DNA fragment sequence containing amdS. did.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma rereei strain QM9414 according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOS: 20 and 21, and the resulting amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and NotI. Was used as the upstream fragment.
  • PCR was performed using genomic DNA and the oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 22 and 23. The obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes MluI and SpeI as a downstream fragment, and the upstream and downstream DNA fragments were designated as AflII.
  • Example 4 Production test of protein using QM9414 mutant strain II Culture was performed under the same operation and conditions as in Example 2 except that QM9414 mutant strain II was used instead of QM9414 mutant strain I prepared in Example 1. The concentration of the protein contained in the culture solution, the dissolved oxygen saturation in the culture solution, and the viscosity of the culture solution were measured.

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Abstract

本発明は、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異、あるいはｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有するトリコデルマ属糸状菌の変異株および当該変異株を用いて培養中の培養液の粘度を低く保ちながらタンパク質を生産する方法である。

Description

トリコデルマ属糸状菌の変異株およびタンパク質の製造方法
　本発明は培養液の粘度を低く保つことができるトリコデルマ属糸状菌の変異株および当該変異株を用いたタンパク質の製造方法に関する。
　トリコデルマ属糸状菌は、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、トリコデルマ属糸状菌を用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。具体的には、トリコデルマ属糸状菌は、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質として、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する。セルラーゼ製造量を強化するため、古くよりセルラーゼ製造を制御する因子の過剰発現、欠損をはじめとする遺伝子の改変、培養条件の最適化などの検討が多々行われている。
　一方で、トリコデルマ属糸状菌は生育やタンパク質の製造に酸素を必須とする好気性糸状菌に属している。また、トリコデルマ属糸状菌は液体培地で培養すると、増殖に伴い培養液の粘度が高まるという特徴を有している。培養液の粘度が高まると、酸素や栄養素の分布が不均一になるため、トリコデルマ属糸状菌を培養する際には、培養液を撹拌したり、酸素供給量を増加させたりして培養中の溶存酸素飽和度の低下を防ぎ、一定以上に維持する必要がある。また、培養槽が大型化すると、酸素移動容量係数が低くなるため、培養中の溶存酸素飽和度を一定以上に保つためには、さらに撹拌数や酸素供給量を増やす必要がある。しかしながら、撹拌数を増やすと、菌体に大きなせん断ダメージを与えてしまうという課題があり、酸素供給量を増やすためにはより大きなエネルギーが必要になるという課題もある。
　特許文献１から６では、それぞれトリコデルマ属糸状菌のＳｆｂ３、Ｍｐｇ１、Ｇａｓ１、Ｓｅｂ１、Ｃｒｚ１およびＴｐｓ１のタンパク質の破壊または生成を減少させることにより、親株と比較して深部培養における好気性発酵時の溶存酸素量を低い撹拌数で維持することが可能になると開示されている。また、特許文献７には、トリコデルマ属糸状菌のＢＸＬ１遺伝子を破壊すると、培養液の溶存酸素飽和度の低下を抑制することができると記載されている。
特表２０１３－５３３７５１号公報 特表２０１４－５１３５２９号公報 特表２０１４－５１３５３０号公報 特表２０１４－５１３５３１号公報 特表２０１４－５１３５３２号公報 特表２０１４－５１３５３３号公報 国際公開第２０１７／１７０９１７号
　上記のとおり、トリコデルマ属糸状菌を用いてタンパク質を製造するにあたり、培養液中の溶存酸素濃度の低下を抑制し、一定以上に保つことは非常に重要である。本発明では、トリコデルマ属糸状菌を用いた液体培養によるタンパク質の製造の際に、培養液の粘度を低く保つことができれば、培養スケールを大型化した場合でも、攪拌に必要なエネルギーを低減することができると共に、培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制することもできると考え、培養液の粘度を低下させるトリコデルマ属糸状菌の変異株の取得および当該トリコデルマ属糸状菌の変異株を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、培養液の粘度を低く保つことを可能にするトリコデルマ属糸状菌の遺伝子を特定するために鋭意検討した結果、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの変異が培養液の粘度を低く保つことができるようになり、さらに培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（８）で構成される。
（１）ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異を有し、当該変異株の培養液の粘度が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異を有さない親株と比較して低下することを特徴とする、トリコデルマ属糸状菌変異株。
（２）ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有し、当該変異株の培養液の粘度が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有さない親株と比較して低下することを特徴とする、トリコデルマ属糸状菌変異株。
（３）前記アミノ酸配列の変異が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列のＮ末端側から３００番目のグルタミン残基のグルタミン以外のアミノ酸残基への変異である、（２）に記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
（４）前記グルタミン以外のアミノ酸残基がリジンである、（３）に記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
（５）前記ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列が配列番号２から１０で表されるアミノ酸配列のいずれかである、（１）から（４）のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
（６）前記トリコデルマ属糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉである、（１）から（５）のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（８）（１）から（６）のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌変異株は、変異導入前の親株と比較して培養液の粘度を低く保つことが可能であり、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。さらに、タンパク質、特にセルラーゼの製造量も向上するという予想外の効果も得られる。
トリコデルマ属糸状菌が有するｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成する全長アミノ酸配列の比較。 トリコデルマ属糸状菌が有するｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成する全長アミノ酸配列の比較。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４変異株ＩをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００を用いて培養した際の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４変異株ＩをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００を用いて培養した際の培養液中の粘度の経時的な推移。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４変異株ＩＩをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００を用いて培養した際の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４変異株ＩＩをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００を用いて培養した際の培養液中の粘度の経時的な推移。
　本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるトリコデルマ属糸状菌の親株に変異を導入することによって、培養液の粘度を低く保つことができることを特徴としている。本発明で用いるトリコデルマ属糸状菌の親株は野生株に制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良されたトリコデルマ属糸状菌の変異株も親株として好ましく用いることができる。例えば、トリコデルマ属糸状菌の変異株には、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の製造性が向上した変異株を上記親株として利用することができる。
　前記親株の具体例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの先祖にあたるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ（ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－４７７７）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに属する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８，　８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１－４５９（１９８２））、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ（ＡＴＣＣ２４９６１）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ（ＡＴＣＣ１８６４８）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ（ＡＴＣＣ９６４５）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ（ＡＴＣＣ２０４７６）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇａｍｓｉｉ（ＮＦＣＣＩ２１７７）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ（ＡＴＣＣ５２４３８）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ（ＡＴＣＣ２０８４６）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅなどが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ－３－７株、ＲｕｔＣ－３０株、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇａｍｓｉｉはＮＦＣＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｕｎｇａｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｉａ）より入手することができる。これら具体例のうち、親株として特に好ましく用いられるのはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに属する菌株である。
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔは、４量体から構成されるアダプタープロテイン複合体を構成するタンパク質のひとつである。アダプタープロテイン複合体は、真核生物に広く保存されている。当該アダプタープロテインはクラスリンと結合し、細胞内外や菌体内外の輸送に関与する小胞を構成することが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１,１４１０８－１４１１３（２００４））。
　トリコデルマ属糸状菌の有するｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの具体例としては、好ましくは配列番号２から１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ由来であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ由来であり、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ由来であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ由来であり、配列番号７で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇａｍｓｉｉ由来であり、配列番号８で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ由来であり、配列番号９で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来であり、配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅ由来である。ここで、配列番号２から１０で表されるアミノ酸配列のアライメント結果を図１－１および図１－２に示す。図１－１および図１－２に示す通り、配列番号２から１０の配列同一性は９０％以上であり、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔは、トリコデルマ属糸状菌においてアミノ酸の配列保存性が高いことがわかる。また、図１－１で示した通り、配列番号２から１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側より３００番目のアミノ酸残基には、グルタミン残基が共通して保存されている。以下、配列番号２を例にその特徴をさらに説明する。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記のとおりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株が持つａｄａｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰ－１）ｃｏｍｐｌｅｘ　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ（ＥＧＲ４８９１０）として登録されている。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１４番目～５３１番目のアミノ酸残基はＡｄａｐｔｉｎ　Ｎ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎドメインを有すると開示されている。
　本発明における、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有するとは、アミノ酸の欠失、置換、または付加のいずれであってもよい。好ましくは、配列番号２から１０のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３００番目のグルタミン残基が、グルタミン以外のアミノ酸残基に変異していることが好ましく、特に好ましくはリジンへ変異していることが好ましい。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３００番目のグルタミン残基が、グルタミン以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号１で表される塩基配列のうち、１０８０番目の塩基であるシトシンがアデニンへの変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３００番目のアミノ酸残基がグルタミンからリジンへ変異する。
　また、本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下した変異株であってもよい。
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損するとは、そのポリペプチドが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、上記に示したｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの全欠損、一部欠損、全て異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる方法として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによるフレームシフトやストップコドン変異が挙げられる。
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下するとは、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの全欠損や一部欠損が挙げられ、また、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの発現量の低下または発現量の消失させる変異を導入することによっても、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能を低下させることができる。ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの発現量の低下または発現の消失は、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔをコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異により行われる。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列自体にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こらない場合でも、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ外に位置するアミノ酸配列にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こることにより、タンパク質の機能が低下することが知られている。また、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔをコードする遺伝子自体に塩基の欠失、置換、または付加などの変異が起こらない場合でも、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔをコードする遺伝子外に位置する塩基配列に塩基の欠失、置換、または付加などの変異が起こることにより、タンパク質の機能が低下することが知られている。
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異、あるいはｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を導入する方法は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、トランスポゾンによる変異など、公知の遺伝子変異方法を用いることができる。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、培養液の粘度が低下し、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。これにより、通気撹拌に必要なエネルギーや、回転数を低減させることができる。また、撹拌の回転数を低く設定できるため、菌糸への剪断ダメージを低減させることもできる。特に、大きなスケールでの培養の際には、通気に必要なブロワや撹拌モーターの容量、撹拌エネルギーの削減につながるためさらに効果的である。
　本発明において、培養液の粘度は以下の条件で測定した値を用い、粘度の比較は以下の条件で測定した値のうち最大値同士を比較する。まず、評価対象とするトリコデルマ属糸状菌の変異株と親株の胞子を前培養培地１ｍＬあたり１．０×１０５胞子となるよう前培養培地（具体的な培地組成の一例は、実施例中の表１のとおり。）へ接種し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて菌体量が１１ｇ／Ｌ前後になるまで培養を行う。次に、１００ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）になるようＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００（レッテンマイヤー社製）を添加した表２で示した本培養培地に対し、１０％（ｖ／ｖ）になるよう前培養培地を接種させ、５Ｌジャーファーメンターを用い、深部培養を行う。培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養を行う。培養液の粘度の測定は、デジタル回転粘度計を用いる。デジタル回転粘度計は、予め０点校正を行う。培養開始から、３９、４８、６２、７２、８６、９６、１１１時間後の採取直後の培養液をそれぞれ指定の容器に１６ｍＬ採取し、培養液にスピンドルを浸して０．３ｒｐｍの回転数にて回転させ、この時のスピンドルに働く粘性抵抗であるトルクを室温条件下にて測定することにより、培養液の粘度を測定する。粘度の単位は、センチポアズ（ｃＰ）とする。１ポアズは、流体内に１ｃｍにつき１ｃｍ／秒の速度勾配があるとき、その速度勾配の方向に垂直な面において速度の方向１ｃｍ２につき１ダインの力の大きさの応力が生ずる粘度と定義される。デジタル回転粘度計には、ＤＶ２Ｔ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）、スピンドルには、ＵＬ　ＡＤＡＰＴＯＲ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）などを用いることができる。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、当該変異導入前の親株を同様の条件で培養した場合と比較すると、変異株は親株に比べて、培養液の粘度が低くなり、培養中の粘度の最大値が、好ましくは１００ｃＰ以上、より好ましくは２００ｃＰ以上、より好ましくは４００ｃＰ以上、より好ましくは５００ｃＰ以上、さらに好ましくは６００ｃＰ以上、さらに好ましくは７００ｃＰ以上、さらに好ましくは８００ｃＰ以上、さらに好ましくは９００ｃＰ以上、特に好ましくは１０００ｃＰ以上低くなる。
　培養液中の溶存酸素飽和度は、培養液中の酸素利用速度を測定することによって算出することができる。本発明における酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）は、培養開始後２４時間後の単位時間当たりの培養液１Ｌ当たりの酸素消費速度のことを指す。具体的な算出方法は、培養条件を一定に保って培養を行い、培養開始後２４時間時点で酸素の供給を止め、溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）の値（ＤＯ値）を１０秒間ごとにプロットし、その曲線の中で対数的に減少している３点以上のプロットについて、その傾き（Ａ）（単位；ＤＯ／ｓｅｃ）を求める。酸素利用速度の算出には式は以下に示す式１を用いる。
　酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）＝（－Ａ）×（１／３２）×６０×６０・・・（式１）。
　ＤＯ値の測定には市販のＤＯ計を使用することができる。使用するＤＯ計には特に制限はなく、ＤＯ値を正確に測定できるものであれば良い。例として、密閉型ＤＯ電極（エイブル株式会社製）や溶存酸素センサー（メトラー・トレド株式会社製）などが挙げられる。ＤＯ計は予め０点校正とスパン校正を行っておく。０点校正は亜硫酸ソーダ２％溶液を使用して行う。スパン校正は実際に培養する条件において菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が飽和になるまで待ち、その後計器の指示値が安定していることを確認し、その温度での飽和溶存酸素に合わせて校正を行う。また、培養槽を加圧してＤＯ測定を行う際は、圧補正を行う必要がある。さらに、培養槽が大きい場合は静水圧補正を行う必要がある。補正を行う際には、以下に示す式２を用いて算出する。
　Ｄ＝ＤＯ（１＋α＋β）・・・（式２）
Ｄ：補正した飽和溶存酸素
ＤＯ：１気圧、純水中での飽和溶存酸素
α：ゲージ圧（ｋｇ／ｃｍ２）
β：静水圧（ＤＯ計取り付け位置の液深（ｍ）／１０）。
　溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出する。溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）は、水中に溶解している酸素の濃度を表す。飽和溶存酸素とは、実際に培養を行なう培養条件において、菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が一定になった状態での溶存酸素のことを指す。また、溶存酸素飽和度を算出する際は、培養期間中に通気条件など培養条件を変化させることはしないこととする。酸素要求性 が低下すると、溶存酸素飽和度は増加する。溶存酸素飽和度は以下の式３に従って算出する。
　溶存酸素飽和度（％）＝（培養中の溶存酸素）／（培養開始前の飽和溶存酸素）×１００・・・（式３）。
　溶存酸素飽和度を比較する場合には、最小値同士を比較する。
　酸素利用速度や、溶存酸素飽和度を比較する場合には、培地、酸素供給量、撹拌速度、温度、培養容量、植菌量などの培養条件を揃えて測定した結果を用いる。測定の際の植菌量は本培養液に対し、１０％（ｖ／ｖ）程度が好ましい。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株と、当該変異導入前の親株の溶存酸素を同様の条件で培養すると、変異株は、親株に比べて溶存酸素飽和度の最小値が高くなり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、さらに好ましくは８％以上、さらに好ましくは９％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１１％以上、さらに好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１３％以上、さらに好ましくは１４％以上、特に好ましくは１５％以上高くなる。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、増殖能が低下しないことが好ましい。増殖能の差は菌体量を測定することで比較することができる。菌体量は、乾燥菌体重量として測定する。培養液１０ｍＬを定性ろ紙（グレード４、ＧＥヘルスケア社）を用いて吸引ろ過し、残渣をろ紙ごと一緒に１００℃にて乾燥させる。そして、重量を測定し、ろ過前後のろ紙の重量差を乾燥菌体重量とする。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異、あるいはｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列の変異以外にも、タンパク質製造量が向上する遺伝子変異を有していてもよい。具体的には、配列番号１１および／または配列番号１３で表されるポリペプチドの機能が低下する遺伝子変異が挙げられる。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ５０６５４として登録されている。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から９５番目～２７７番目のアミノ酸残基は「Ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４Ｇドメイン（以降ＭＩＦ４Ｇドメインと記載する。）、Ｎ末端側から３８０番目～４８５番目のアミノ酸残基はＭＡ－３ドメインを有すると開示されている。ＭＩＦ４ＧおよびＭＡ－３の両ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する機能を有することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，１２２６５－１２２７２（２００５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，１４７－１５６（２００７））。これらの記載により配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくともＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合する機能を有すると推定される。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１２で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ５０６５４の機能が低下する遺伝子変異とは、ＥＧＲ５０６５４が有するＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの全欠損、ＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの一部欠損、ＭＩＦ４ＧドメインとＭＡ－３ドメインとの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１２で表される塩基配列において、１０３９番目から１０４４番目のいずれかの塩基が欠失する変異が挙げられる。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４４４１９として登録されている。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２６番目～４９９番目のアミノ酸残基は「Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを有すると開示されている。この記載により配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも菌体の内側と外側の間における糖の輸送に関与していると推定される。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１４で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４４４１９の機能が低下する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４４４１９が有するＳｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１４で表される塩基配列において、１４１５番目に１１塩基が挿入する変異が挙げられる。
　また、本発明はｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有するトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含むタンパク質の製造方法に関する。
　本発明の方法では、菌体外に分泌されるタンパク質を効率的に製造することができる。製造されるタンパク質に制限はないが、好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ等の糖化酵素であり、特に好ましくはセルラーゼである。
　本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。
　セルラーゼのタンパク質濃度は以下の通り測定を行う。本発明の方法でトリコデルマ属糸状菌を培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をセルラーゼ溶液とする。Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　プロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。
　本発明でトリコデルマ属糸状菌を培養する培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ属糸状菌は、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。
　培養工程の培地組成は、トリコデルマ属糸状菌がタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ属細菌の周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地にはタンパク質を製造させるための誘導物質を添加してもよい。
　本発明によりセルラーゼを製造する場合には、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養することができる。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類され、単子葉植物の具体例としてはバガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としてはビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが挙げられる。
　また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの変異株である場合は、好気的条件で培養することが好ましく、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく、０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃程度が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が生産される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行える時間であれば特に制限はないが、通常、２４～２８８時間、好ましくは２４～２４０時間、より好ましくは３６～２４０時間、さらに好ましくは３６～１９２時間である。
　トリコデルマ属糸状菌の変異株を培養した培養液に含まれるタンパク質を回収する方法は特に限定されないが、トリコデルマ属糸状菌の菌体を培養液から除去し、タンパク質を回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。
　また、トリコデルマ属糸状菌の変異株を培養した培養液から菌体を除去せずに、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でトリコデルマ属糸状菌の菌体が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
　タンパク質がセルラーゼのような酵素の場合には、上記のように菌体を除去又は生育していないように処理した培養液を、そのまま酵素液として利用することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　＜参考例１＞タンパク質濃度測定方法
　タンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌の培養液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
　＜参考例２＞溶存酸素飽和度の算出
　溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出した。ＤＯ計は密閉型溶存酸素電極ＳＤＯＣ－１２Ｆ－Ｌ１２０（エイブル株式会社製）を使用した。
　＜参考例３＞培養液の粘度の測定
　採取した培養液の粘度を測定するため、培養開始３９、４８、６２、７２、８６、９６、１１１時間後の培養液をデジタル回転粘度計　ＤＶ２Ｔとスピンドル　ＵＬ　ＡＤＡＰＴＯＲ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社製）を使用し、回転数を０．３ｒｐｍに設定した際の粘度（ｃＰ）を求めた。
　＜参考例４＞菌体量の測定
　培養液中に含まれる菌体量を測定するため、培養液をろ紙で吸引ろ過し、吸引ろ過前後のろ紙の乾燥菌体重量の差を菌体量とした。
　＜実施例１＞ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４変異株Ｉの作製
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異の入った配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片として、配列番号１５で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４株に形質転換することで、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの変異株を作製した。この方法により、配列番号１において、１０８０番目のシトシンがアデニンへ変わり、配列番号２において、３００番目がグルタミンからリジンへ変異したポリペプチドを有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの変異株が得られる。ＤＮＡ断片導入のための選択マーカーとしてアセトアミドおよびアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子（ａｍｄＳ）を使用した。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
　具体的には、配列番号１６で示す合成したＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とした。また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号１７および１８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とし、上流及び下流ＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築した。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｐａＩとＡｓｃＩで処理し、配列番号１５で示す得られたＤＮＡ断片でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）を形質転換した。得られた変異株をＱＭ９４１４変異株Ｉとして以下の実験に用いた。
　なお、分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行った。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行った。
　＜実施例２＞ＱＭ９４１４変異株Ｉを用いたタンパク質の製造試験
　（前培養）
　実施例１で作製したＱＭ９４１４変異株Ｉの胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを表１に示した１Ｌバッフル付フラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（本培養）
　Ａｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００（レッテンマイヤー社）を表２で示した本培養培地に添加し、５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）を用い、深部培養検討を行った。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株および実施例１で作成したＱＭ９４１４変異株Ｉの前培養液２５０ｍＬをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００が添加された本培養培地２．５Ｌに接種した。培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（培養液の採取）
　培養開始３９、４８、６２、７２、８６、９６、１１１時間後にそれぞれ２０ｍＬの培養液を採取した。採取した培養液の一部を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離して上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として以下の実験に用いた。
　（タンパク質濃度の測定）
　参考例１で記載した手法を用い、培養開始９６時間目に採取した培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定した。その結果、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株と比較して、ＱＭ９４１４変異株Ｉは、相対値でタンパク質濃度は１．３倍高かった。
　（培養液中の溶存酸素飽和度の測定）
　参考例２で記載した手法を用い、培養液中の経時的な溶存酸素飽和度を測定した。その結果、図２に示されるとおりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株は培養開始後６０時間前後に培養液中の溶存酸素飽和度が最小値として１．７％まで低下したのに対して、ＱＭ９４１４変異株Ｉは培養液中の溶存酸素飽和度は最小値として３７．６％であった。
　（培養液の粘度の測定）
　参考例３で記載した手法を用い、培養液中の経時的な粘度を測定した。その結果、図３で示されるとおりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株の最大粘度は１，８００ｃＰ以上であったのに対し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ変異株の最大粘度は８００ｃＰ以下であった。これらの結果から、ＱＭ９４１４変異株Ｉでは培養液中の粘度を低く保つことが可能であり、溶存酸素飽和度の低下も抑制されることがわかった。
　（菌体量の測定）
　参考例４で記載した手法を用い、実施例２（前培養）の培養にて、培養開始７２時間目の培養液中に含まれる菌体量を測定した。その結果、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株の菌体量は１１．３ｇ／Ｌ、ＱＭ９４１４変異株Ｉの菌体量は１１．０ｇ／Ｌであり、両株間で菌体量の差は確認できなかった。
　＜実施例３＞ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４変異株ＩＩの作製
　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの変異株は、配列番号１９で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株に形質転換することで作製した。この方法により、配列番号１において、７９１番目と７９２番目の間にａｍｄＳが挿入され、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの変異株が得られる。上記の配列番号１９からなるＤＮＡ断片を導入するために、ａｍｄＳを含むＤＮＡ断片配列の上流および下流に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
　具体的には、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号２０および２１で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流断片とした。また、ゲノムＤＮＡと配列番号２２および２３で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流断片とし、上流および下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築した。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号１９で示す得られたＤＮＡ断片でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株を実施例１の記載通りに形質転換を行った。得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ変異株をＱＭ９４１４変異株ＩＩとして以下の実験に用いた。
　＜実施例４＞ＱＭ９４１４変異株ＩＩを用いたタンパク質の製造試験
　実施例１で作製したＱＭ９４１４変異株Ｉの代わりにＱＭ９４１４変異株ＩＩを用いた以外は、実施例２と同様の操作・条件で培養を行い、培養液中に含まれるタンパク質の濃度、培養液中の溶存酸素飽和度および培養液の粘度を測定した。
　（タンパク質濃度の測定）
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を１とした場合、ＱＭ９４１４変異株ＩＩの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．４であった。この結果から、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が低下したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを培養することによって、当該タンパク質の機能を低下させない場合と比べてタンパク質の製造量を向上できることがわかった。
　（培養液中の溶存酸素飽和度の測定）
　参考例２で記載した手法を用い、培養液中の経時的な溶存酸素飽和度を測定した。その結果、図４に示されるとおりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株は培養開始後６０時間前後に培養液中の溶存酸素飽和度が最小値として１．９％まで低下したのに対して、ＱＭ９４１４変異株ＩＩは培養液中の溶存酸素飽和度は最小値として２７．７％であった。
　（培養液の粘度の測定）
　参考例３で記載した手法を用い、培養液中の経時的な粘度を測定した。その結果、図５に示されるとおりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４株の最大粘度は１，９００ｃＰ以上であったのに対し、ＱＭ９４１４変異株ＩＩの最大粘度は１，０００ｃＰ以下であった。これらの結果から、ＱＭ９４１４変異株ＩＩでは培養液中の粘度を低く保つことが可能であり、溶存酸素飽和度の低下も抑制されることがわかった。

Claims (8)

  1. 　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異を有し、当該変異株の培養液の粘度が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔの機能が欠損または低下する変異を有さない親株と比較して低下することを特徴とする、トリコデルマ属糸状菌変異株。
  2. 　ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有し、当該変異株の培養液の粘度が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列に変異を有さない親株と比較して低下することを特徴とする、トリコデルマ属糸状菌変異株。
  3. 　前記アミノ酸配列の変異が、ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列のＮ末端側から３００番目のグルタミン残基のグルタミン以外のアミノ酸残基への変異である、請求項２に記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
  4. 　前記グルタミン以外のアミノ酸残基がリジンである、請求項３に記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
  5. 　前記ｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔを構成するアミノ酸配列が配列番号２から１０で表されるアミノ酸配列のいずれかである、請求項１から４のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
  6. 　前記トリコデルマ属糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉである、請求項１から５のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  8. 　請求項１から６のいずれかに記載のトリコデルマ属糸状菌変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
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