CN117925549A - 一种耐高温漆酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用 - Google Patents

一种耐高温漆酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用 Download PDF

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CN117925549A CN202311701006.7A CN202311701006A CN117925549A CN 117925549 A CN117925549 A CN 117925549A CN 202311701006 A CN202311701006 A CN 202311701006A CN 117925549 A CN117925549 A CN 117925549A
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刘逸寒
杨文华
马向阳
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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过重叠PCR技术进行定点突变获得耐高温的漆酶突变体及其制备与应用。所述漆酶突变体是在SEQ ID NO.1所示野生型漆酶基础上，发生包含D221Y、E231D、Y441H或Y441F突变中的至少一种获得的，相对于野生型，突变体酶活以及在80℃下热稳定性均有不同程度的提高，有利于拓展在降解木质纤维素、纸浆漂白等工业领域中的应用。

Description

一种耐高温漆酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过重叠PCR技术进行定点突变获得耐高温的漆酶突变体及其制备与应用。
背景技术：
漆酶是一种多酚氧化酶，可以催化酚类、胺类、芳香族等化合物，其结构和功能与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白有相似之处，是多铜氧化酶(MCOs)家族中的一员；19世纪末，Benfield第一次将其以生漆固化的活性物质分离出来并命名为漆酶；漆酶包含四个铜原子，在铜的作用下，能够进行电子传递反应并且不生成其他副产物。因此，漆酶被广泛应用于降解木质纤维素、纸浆漂白、食品工业等工业领域。
漆酶的氧化还原电位较低，能够直接氧化一些酚类的底物，但无法直接氧化氧化还原电位较高的非酚类底物。因此，为了扩大漆酶氧化的范围，需要添加某些特定小分子量的化合物(介体)来辅助。介体在循环中被漆酶氧化成自由基形式，自由基作为电子载体与酚类和其他化合物反应，将其氧化，这种反应体系被称为漆酶-介体系统(LMS)。
漆酶的来源比较广泛，自然界中的漆酶主要来源于植物、昆虫、微生物。其中植物漆酶主要从漆树、茶树、棉花、水稻、梨等分离获得，在抵御各种不良环境、提高农作物产量、植物木质素合成等发挥重要作用。昆虫漆酶是动物漆酶的主要研究对象，目前已经发现烟草天蛾、蚊子、棉铃虫、蝗虫等昆虫有漆酶活性。真菌来源的漆酶广泛分布在Basidiomyeetes、Asomyeetes、Neurospora、Aspergillus、Phanerochaetc chrysosporium等中，其中研究比较多是白腐真菌。细菌漆酶在Bacillus、Strepotomyces、Marinomonas、Enterobacter、Proteobacterium和Alteromonas等菌属中被陆续发现。
目前，商品化的漆酶大多为真菌来源，大多数真菌漆酶在温和的条件下更能发挥作用，最适温度在30-60℃之间，最适pH在3.0-6.0之间。真菌漆酶在高温、pH等环境中的应用受到了限制，细菌漆酶具有较好热稳定性、pH稳定性。在细菌漆酶中，芽孢杆菌来源漆酶拥有更好的热稳定性和pH稳定性，因此可以应用于降解木质纤维素、纸浆漂白、废水处理等重要领域。因此，在此基础上进一步提高细菌漆酶的稳定性，有利于其在工业上的应用。
蛋白质非理性分子设计是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变体。理性分子设计是在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。相较于非理性设计，理性设计拥有工作量小，更易获得有效突变体的优点。
芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。
因此，本发明中，通过对来源于沙福芽孢杆菌(Bacillus Safensis)的漆酶基因进行理性设计，突变筛选得到热稳定性提高的漆酶突变体基因。随后利用芽孢杆菌表达系统，表达制备了耐高温突变体漆酶。
发明内容：
基于漆酶高温应用场景的问题，为了获得热稳定性提升的漆酶，需对其现有性质作进一步改造，本发明的目的在于提供一种耐高温的漆酶突变体。将沙福芽孢杆菌(Bacillus Safensis)来源的漆酶基因(lac)在大肠杆菌BL21中进行表达；利用重叠PCR技术对基因lac突变，并利用ABTS对突变体进行筛选，选出热稳定性提高的突变体，实现了在枯草芽孢杆菌WB600和解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218中表达制备。
实现本发明目的的技术路线概述如下：
对来自沙福芽孢杆菌(Bacillus Safensis)的漆酶基因lac进行突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得突变体D221Y、E231D、Y441H、Y441F、E231D/Y441H、D221Y/Y441H、D221Y/Y441F、E231D/Y441F、D221Y/E231D，在80℃下的半衰期分别提高到野生型漆酶(LAC)的192％、143％、168％、140％、237％、158％、166％、167％、168％。获得编码基因lacm1、lacm2、lacm3、lacm4、lacm5、lacm6、lacm7、lacm8、lacm9。利用枯草芽孢杆菌WB600和解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218实现了最优突变体漆酶E231D/Y441H的高效制备。
本发明提供的技术方案之一，是一种漆酶突变体，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示野生型漆酶基础上，发生包含D221Y、E231D、Y441H或Y441F突变中的至少一种获得的；
进一步地，所述漆酶突变体为D221Y突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
更进一步地，所述D221Y突变体的编码基因lacm1，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
进一步地，所述漆酶突变体为E231D突变体，氨基酸序列如具有SEQ ID NO.5所示；
更进一步地，所述E231D突变体的编码基因lacm2，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
进一步地，所述漆酶突变体为Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
更进一步地，所述Y441H突变体的编码基因lacm3，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
进一步地，所述漆酶突变体为Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
更进一步地，所述Y441F突变体的编码基因lacm4，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
进一步地，所述漆酶突变体为E231D/Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
更进一步地，所述E231D/Y441H突变体的编码基因lacm5，核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
进一步地，所述漆酶突变体为D221Y/Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
更进一步地，所述D221Y/Y441H突变体的编码基因lacm6，核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；
进一步地，所述漆酶突变体为D221Y/Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示；
更进一步地，所述D221Y/Y441F突变体的编码基因lacm7，核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；
进一步地，所述漆酶突变体为E231D/Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
更进一步地，所述E231D/Y441F突变体的编码基因lacm8，核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示；
进一步地，所述漆酶突变体为D221Y/E231D突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
更进一步地，所述D221Y/E231D突变体的编码基因lacm9，核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示。
本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；
进一步地，采用的表达载体为pET-28a(+)，宿主为大肠杆菌；
更进一步地，宿主细胞为大肠杆菌BL21；
更进一步地，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600，或者宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218；
优选地，所述重组菌株是将突变体编码基因与表达载体pET-28a(+)连接后在宿主大肠杆菌中表达所得。
本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株在生产技术方案一所述漆酶突变体中的应用。
本发明提供的技术方案之四，是技术方案一所述漆酶突变体的应用，特别是在降解木质纤维素、纸浆漂白等工业领域的应用；更特别地是利用野生型LAC或突变体漆酶与介体1-羟基苯并三唑(HBT)协同商品纤维素酶降解玉米秸秆或甘蔗渣中的应用。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母或三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.漆酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示LAC突变体中突变的氨基酸。如E231D，表示位置231的氨基酸由野生型LAC的Glu替换成Asp，位置的编号对应于SEQ IDNO.1中野生型LAC成熟肽的氨基酸序列编号。
在本发明中，LAC代表野生型漆酶，LACM代表漆酶突变体，小写斜体lac表示野生型漆酶LAC的编码基因，小写斜体lacm1表示突变体D221Y的编码基因，小写斜体lacm2、lacm3……lacm9分别表示突变体E231D、Y441H……D221Y/E231D的编码基因，具体信息如下表。
有益效果：
本发明利用重叠PCR技术对LAC野生型进行突变，得到80℃下热稳定性相对于野生型提高的突变体D221Y、E231D、Y441H、Y441F、E231D/Y441H、D221Y/Y441H、D221Y/Y441F、E231D/Y441F、D221Y/E231D，在80℃下的半衰期分别提高到野生型漆酶(LAC)的192％、143％、168％、140％、237％、158％、166％、167％、168％。
附图说明：
图1为野生型漆酶的PCR扩增电泳图其中：M为DNA Marker，泳道1为pET-28a(+)PCR产物；泳道2为漆酶基因lac。
图2为pET-lac质粒酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pET-lac经NcoI和XhoI双酶切图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明实施例所用部分溶液及培养基如下：
Lysis buffer(mM)：Tris 20，NaCl 500，二硫苏糖醇1，咪唑20。
Wash buffer(mM)：Tris 20，NaCl 500，二硫苏糖醇1，咪唑100。
Elution Buffer(mM)：Tris 20，NaCl 500，二硫苏糖醇1，咪唑500。
LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，其余为水。固态培养基添加2％琼脂。
发酵培养基(g/L)：玉米粉64，豆饼粉40，加入2.7淀粉酶，4Na2HPO4，0.3KH2PO4，其余为水；90℃保温30min再121℃灭菌20min。
在本发明中，野生型漆酶LAC的成熟肽序列如SEQ ID NO.1所示：MNLEKFVDELPIPEVAEPVKKNPRQTYYEIAMEEVFLKVHRDLPPTKLWTYNGSLPGPTIKANRNEKVKVKWMNKLPLKHFLPVDHTIHSSHHDEPEVKTVVHLHGGVTPASSDGYPEAWFSRDFEATGPFFERETYVYPNHQQACTLWYHDHAMALTRLNVYAGLAGFYLISDAFEKSLELPKDDYDIPLMIMDRTFQEDGSLFYPSRPNDTPEDSDIPDPSIVPFFCGETILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRILNASNTRTYELHLDNDATILQIGSDGGFLPRPVRHQSFSIAPAERFDVIIDFSAYENKTITLKNTAGCGQDVNPETDANIMQFKVTRPLKGRVPKTLRPIFKPLPPLRPSRADRERKLTLTGTQDKYGRPILLLDNHFWNDPVTENPRLGSLEVWSIVNPTRGTHPIHLHLVQFRVLDRRPFDTEVYQSTGEIVYTGPNEAPPLHEQGYKDTIQAHAGEVIRIVARFVPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDIIQ。
在本发明中，E231D/Y441H突变体的成熟肽序列如SEQ ID NO.11所示：MNLEKFVDELPIPEVAEPVKKNPRQTYYEIAMEEVFLKVHRDLPPTKLWTYNGSLPGPTIKANRNEKVKVKWMNKLPLKHFLPVDHTIHSSHHDEPEVKTVVHLHGGVTPASSDGYPEAWFSRDFEATGPFFERETYVYPNHQQACTLWYHDHAMALTRLNVYAGLAGFYLISDAFEKSLELPKDDYDIPLMIMDRTFQEDGSLFYPSRPNDTPEDSDIPDPSIVPFFCGDTILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRILNASNTRTYELHLDNDATILQIGSDGGFLPRPVRHQSFSIAPAERFDVIIDFSAYENKTITLKNTAGCGQDVNPETDANIMQFKVTRPLKGRVPKTLRPIFKPLPPLRPSRADRERKLTLTGTQDKYGRPILLLDNHFWNDPVTENPRLGSLEVWSIVNPTRGTHPIHLHLVQFRVLDRRPFDTEVHQSTGEIVYTGPNEAPPLHEQGYKDTIQAHAGEVIRIVARFVPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDIIQ。
以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。
实施例1野生型漆酶基因的获得
1、使用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNA Kit)提取沙福芽孢杆菌(BacillusSafensis)TCCC 111022的基因组DNA，提取步骤如下：
(1)用接种环将菌株接种至LB固体平板上，37℃恒温培养过夜。
(2)从培养菌体的平板上挑取单菌落接种到液体试管培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜。
(3)取3mL-5mL菌液置于已灭菌的EP管中，12000r/min离心2min，弃上清。
(4)向EP管中加入200μL无菌水重悬菌体，再加入50μL溶菌酶，吹吸混匀，37℃保温20min。
(5)向EP管中加入100μL BTL buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡混匀，55℃保温40min，每隔20min振荡混匀。
(6)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置10min.
(7)12000r/min离心2min，除去未消化的部分，将上清转移至新的EP管中，加入220μL BDL buffer，65℃水浴15min。
(8)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀。
(9)将EP管中的液体转入回收柱静置1min，12000r/min离心1min，将滤液重新倒入回收柱中，重复两次，倒掉废液。
(10)加入500μL HBC buffer，12000r/min离心1min，弃滤液。
(11)加入700μL DNA wash buffer，静置1min，12000r/min离心1min，弃滤液。
(12)加入500μL DNAwash buffer，静置1min，12000r/min离心1min，弃滤液。
(13)12000r/min空离2min，弃废液管，将回收柱放到一个新的EP管中。
(14)置于55℃金属浴烘干10min。
(15)加入50μL 55℃的无菌水，室温静置5min，12000r/min离心2min，弃回收柱，EP管中液体为基因组。
2、以提取的沙福芽孢杆菌的基因组为模板，在ORF框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点NcoI、XhoI，本发明的漆酶基因lac的扩增引物如下：
上游引物P1：5’-CATGCCATGGATGAACCTAGAAAAATTTGTTGAC-3’
下游引物P2：5’-CCGTCGAGCTGAATGATATCCATCGGTCT-3’
以P1和P2作为上、下游引物，以沙福芽孢杆菌漆酶基因组为模板进行扩增。
其扩增的反应体系为：
上游引物P1 2.0μL
下游引物P2 2.0μL
基因组DNA为模板 2.0μL
Primer Star Max酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸8s，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1530bp的条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型漆酶基因lac(SEQ ID NO.2)，lac与pET-28a(+)质粒分别用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，将切胶回收的lac与载体pET载体连接，得到重组质粒pET-lac，酶切验证如图2所示，并将其转化至大肠杆菌JM109及大肠杆菌BL21中。
实施例2构建漆酶突变体
根据蛋白质动力学模拟结果，选择对蛋白稳定性影响较大的氨基酸残基进行突变，包括D221Y、E231D、Y441H、Y441F，并根据不同突变位点设计突变引物如下表1。
表1部分突变引物如下：
1、基于重叠PCR技术进行定点突变，构建漆酶突变体LACM。以D221Y突变为例，设计突变引物如下：
突变上游引物D221Y-F：
5’-ACATACCACCGCCATCCAT-3’
突变下游引物D221Y-R：
5’-ATGGATGGCGGTGGTATGT-3’
在重叠PCR第一步反应体系中，分别以P1和221-R作为上、下游引物，以P2和221-F作为上、下游引物。以质粒pET-lac为模板，进行PCR1反应，分别得到上游片段和下游片段。
上游片段扩增的反应体系为：
P1 2μL
221-R 2μL
野生型漆酶基因 2μL
Primer Star Max酶 25μL
ddH2O 19μL
下游片段扩增的反应体系为：
P2 2μL
221-F 2μL
野生型漆酶基因 2μL
Primer Star Max酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序为：98℃预变性30min；98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸5s，反应30个循环；72℃延伸10min。
2、切胶回收上、下游片段后进行PCR 2，反应体系为：
上游片段 2.0μL
下游片段 2.0μL
Primer Star Max酶 25μL
ddH2O 21μL
扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸8s，反应5个循环；72℃延伸10min。
3、PCR 2结束后向体系中加入引物P1和P2各2μL，进行PCR 3扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸10s，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，获得漆酶定点突变体基因lacm1。
4、将漆酶定点突变体基因lacm1与表达载体pET连接后转化至JM109中并提取其质粒即得重组质粒pET-lacm1，再将重组质粒pET-lacm1转化至大肠杆菌BL21中，获得重组菌株BL21/pET-lacm1。将BL21化转的转化子活化到一个新的分区划线的Kan板上，37℃倒置培养12小时，然后在无菌条件下，挑取突变体单菌落接种到含有Kan抗性的液体LB培养基培养，提质粒送测序确定获得D221Y突变体基因lacm1序列。获得的阳性转化子命名为E.coliBL21/pET-lacm1。
5、其余突变体编码基因的获得均同步骤1-4，按照表1替换对应引物即可。由此制备包含E231D突变体基因lacm2的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm2；包含Y441H突变体基因lacm3的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm3；包含Y441F突变体基因lacm4的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm4。
实施例3LACM的表达纯化与酶活测定
1、重组菌株的诱导表达
(1)在LB平板上，挑取实施例2步骤5获得的各E.coli BL21/pET-lacm的一个单菌落，接种于5mL LB试管中(含50μg/mL Kan)，放置在37℃摇床里震荡培养10h；
(2)将重组菌菌液转移到250mL LB培养基(终浓度为50μg/mL Kan)中，放置在37℃摇床里震荡培养2-2.5h；
(3)加入125μL的IPTG(终浓度0.5mmol/L)，在16℃摇床中，诱导培养16-20h；
(4)同时，培养E.coli BL21/pET-lac作为对照。取发酵液纯化制备野生型漆酶以及各漆酶突变体。
2、重组蛋白的Ni柱纯化
(1)破碎菌体
使用离心杯收集发酵液，10000rpm，离心15min，倒去上清液，加入20mL Lysisbuffer吹吸菌体，使用超声波进行破碎菌体，破坏细胞壁并释放菌内蛋白质。
破碎完成后，将菌液倒入50mL离心管中，并在4℃下以12000rpm离心30min，收集破碎上清，然后分别取样进行SDS-PAGE分析，依据结果判断LAC/LACM是否表达。
(2)LAC/LACM与镍柱结合
a.在进行镍柱纯化过程前，向纯化柱中加入适当量的ddH2O，并加入两倍柱体积的Lysis buffer以平衡树脂；
b.将平衡后的树脂和菌体的上清混合，置于磁力搅拌器中，以80-100r/min的速度结合1h，并保持全程低温(4℃)。
(3)蛋白纯化
a.在层析柜中将结合液分2-3次加入到纯化柱中；
b.待结合液完全滤出后，加入10mL Wash buffer，洗脱与树脂结合的杂蛋白；
c.最后向纯化柱中加入10mL已预冷的Elution Buffer，将与树脂结合的目的蛋白全部洗脱，收集滤液；
d.洗脱液全部转移至超滤离心管中，离心超滤至溶液剩余1mL时，加入提前预冷的50mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，重复置换两次。即得纯化的LAC/LACM蛋白。
3、ABTS测定LAC/LACM酶活
测定方法：
(1)取200μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50mM、含5mM Cu2+，pH5.0)于96孔酶标板中，80℃水浴保温1min；
(2)加入10μL稀释到适当浓度的LAC/LACM混匀，再次放入80℃水浴保温1min；
(3)再加入30μL ABTS(50mM)吹吸混匀，80℃恒温水浴反应10min，在反应开始和结束后，在420nm下记录反应初始和结束后的OD值。
计算酶活力：
式中：△OD＝OD结束-OD初始；
V1代表反应体系总体积(μL)；
△t代表反应时间(min)；
V2加入酶液体积(μL)；
ε代表产物在420nm处摩尔吸光系数36mM-1cm-1；
d代表96孔酶标板的内径/光程的厚度(cm)。
酶比活力(U/mg)＝酶活力/蛋白浓度。
最终计算得野生型LAC与各单突变体比活力如下：
漆酶 比酶活(U/mg)
WT 6.6
D221Y 9.8
E231D 8.2
Y441H 12.4
Y441F 8.5
4、以ABTS为底物，测定LACM的热稳定性。在80℃的保温条件下，测定不同时间后LACM的酶活力，以未经保温处理的LACM活力为100％，计算相应的残余酶活性。
经过检测，得到在80℃下热稳定性高于野生型的突变体D221Y、E231D、Y441H、Y441F。最终计算得野生型LAC与各突变体的半衰期如下：
漆酶 半衰期(min)
WT 42.7
D221Y 82.2
E231D 61.1
Y441H 71.9
Y441F 59.8
按照实施例2的方法，在上述热稳定性提高的单突变体基础上进行组合突变，获得突变体E231D/Y441H、D221Y/Y441H、D221Y/Y441F、E231D/Y441F、D221Y/E231D的编码基因及重组菌：包含E231D/Y441H突变体基因lacm5的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm5；包含D221Y/Y441H突变体基因lacm6的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm6；包含D221Y/Y441F突变体基因lacm7的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm7；包含E231D/Y441F突变体基因lacm8的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm8；包含D221Y/E231D突变体基因lacm9的阳性转化子E.coli BL21/pET-lacm9。
按照实施例3的方法进行表达和纯化后，对组合突变体漆酶进行比酶活测定，最终计算得野生型LAC与各组合突变体的比酶活力如下：
5、将上述组合突变体E231D/Y441H、D221Y/Y441H、D221Y/Y441F、E231D/Y441F、D221Y/E231D按照实施例3进行热稳定性检测，最终计算得野生型与各组合突变体80℃下半衰期如下：
漆酶 半衰期(min)
WT 42.7
E231D/Y441H 101.6
D221Y/Y441H 71.1
D221Y/Y441F 71.5
E231D/Y441F 72.0
D221Y/E231D 64.5
实施例4漆酶突变体在枯草芽孢杆菌中的表达及制备
将漆酶突变体E231D/Y441H编码基因lacm5以及野生型漆酶编码基因lac分别与表达质粒pLY-3通过连接得到新的重组质粒pLY-3-lacm5和pLY-3-lac；
将重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌WB600，经卡纳霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到突变体重组菌WB600/pLY-3-lacm5和野生型漆酶重组菌WB600/pLY-3-lac。
将重组菌株WB600/pLY-3-lacm5、WB600/pLY-3-lac分别接种于5mL的发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h(发酵培养基(g/L)：玉米粉64，豆饼粉40，加入2.7淀粉酶，Na2HPO4 4，KH2PO4 0.3，其余为水；90℃保温30min再121℃灭菌20min)。
使用实施例3-3中的ATBS法测定枯草芽孢杆菌发酵所得漆酶酶活力(发酵液离心取上清测定酶活)。在枯草芽孢杆菌中野生型酶活为34.3U/mL、E231D/Y441H的发酵酶活为79.5U/mL。
实施例5漆酶突变体在解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
将漆酶突变体E231D/Y441H编码基因lacm5以及野生型漆酶编码基因lac分别与表达质粒pLY-3通过连接得到新的重组质粒pLY-3-lacm5和pLY-3-lac；
将重组质粒分别转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，经卡纳霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到突变体重组菌CGMCC No.11218/pLY-3-lacm5和野生型漆酶重组菌CGMCC No.11218/pLY-3-lac。
将重组菌株CGMCC No.11218/pLY-3-lacm5、CGMCC No.11218/pLY-3-lac分别接种于5mL的发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h(发酵培养基(g/L)：玉米粉64，豆饼粉40，加入2.7淀粉酶，Na2HPO4 4，KH2PO4 0.3，其余为水；90℃保温30min再121℃灭菌20min)。
使用实施例3-3中的ATBS法测定解淀粉芽孢杆菌发酵所得碱性蛋白酶活力(发酵液离心取上清测定酶活)。在解淀粉芽孢杆菌野生型酶活为67.9U/mL、E231D/Y441H的发酵酶活为160.6U/mL。
实施例6漆酶突变体降解玉米秸秆与甘蔗渣的应用
1.玉米秸秆和甘蔗渣的前期处理
玉米秸秆和甘蔗渣来源于中国江苏本地企业。首先用去离子水清洗以去除表面的脏污，随后放置于60℃的恒温烘干箱中进行烘干，使得水分含量达2％以下，将这些干燥过的原料用粉碎机进行粉碎，并用40目网筛过滤，以确保它们成为均匀的粉末，最后，常温放置以备后续使用。
2.漆酶协同纤维素酶酶促糖化
在处理好的玉米秸秆和甘蔗渣分别作为待降解样品，分别加入本发明的野生型漆酶和突变体漆酶E231D/Y441H，在加/不加介体1-羟基苯并三唑(HBT)与商品纤维素酶(Cellic CTec2)协同处理时，测定还原糖糖化效率。具体如下：
实验分为三组：
(1)待降解样品+商品纤维素酶；
(2)待降解样品+WT/突变体漆酶+商品纤维素酶；
(3)待降解样品+WT/突变体漆酶+HBT+商品纤维素酶；
糖化反应采用20mL的体系：根据上述实验分组按以下剂量加入/不加各成分，取0.5g待降解样品于50mL离心管中，加入WT/突变体漆酶50U、5mM介体HBT、商品纤维素酶2.5U，再加入pH 5.0的含5mM Cu2+柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液补齐到20mL，在50℃、150r/min水浴摇床反应6h，反应结束后，取样煮沸10min终止反应，离心取上清液，利用二硝基水杨酸(DNS)方法测定其还原糖浓度。
1、在玉米秸秆中的糖化结果
与只加纤维素酶处理相比，加漆酶和纤维素酶处理时，突变体E231D/Y441H处理还原糖含量提高了136％，WT处理还原糖含量提高了24％；当再加入HBT介体时，突变体E231D/Y441H处理还原糖含量提高了223％，WT还原糖含量提高了158％。
组别 还原糖相对含量(％)
纤维素酶 100
纤维素酶+WT 124
纤维素酶+E231D/Y441H 236
纤维素酶+WT+HBT 258
纤维素酶+E231D/Y441H+HBT 323
2、在甘蔗渣处理中的糖化结果
与只加纤维素酶处理相比，加漆酶和纤维素酶处理时，突变体E231D/Y441H处理还原糖含量提高了128％，WT处理还原糖含量提高了20％；当再加入HBT介体时，突变体E231D/Y441H处理还原糖含量提高了236％，WT还原糖含量提高了132％。
组别 还原糖相对含量(％)
纤维素酶 100
纤维素酶+WT 120
纤维素酶+E231D/Y441H 228
纤维素酶+WT+HBT 232
纤维素酶+E231D/Y441H+HBT 336
以上结果表明漆酶协同纤维素酶处理秸秆和甘蔗渣，可以提高酶促糖化效率，在加或者不加介体处理时，突变体加纤维素酶处理玉米秸秆和甘蔗渣的糖化效率均比WT更高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (8)

1.一种漆酶突变体，其特征在于，所述漆酶突变体是在SEQ ID NO.1所示野生型漆酶基础上，发生包含D221Y、E231D、Y441H或Y441F突变中的至少一种获得的。
2.如权利要求1所述的一种漆酶突变体，其特征在于，
所述漆酶突变体为D221Y突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述漆酶突变体为E231D突变体，氨基酸序列如具有SEQ ID NO.5所示；
所述漆酶突变体为Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述漆酶突变体为Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述漆酶突变体为E231D/Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述漆酶突变体为D221Y/Y441H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述漆酶突变体为D221Y/Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述漆酶突变体为E231D/Y441F突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述漆酶突变体为D221Y/E231D突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
3.权利要求1或2所述漆酶突变体的编码基因。
4.包含权权利要求3所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株。
5.权利要求4所述重组质粒或重组菌株在生产权利要求1或2所述漆酶突变体中的应用。
6.权利要求1或2所述漆酶突变体的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是在降解木质纤维素、纸浆漂白等工业领域的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，是利用所述突变体漆酶与介体1-羟基苯并三唑协同纤维素酶降解玉米秸秆或甘蔗渣中的应用。
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