WO2023136335A1 - タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法 - Google Patents

タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法 Download PDF

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nite
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paenibacillus
protein
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昭彦 小杉
綾香 鵜家
雅治 山下
三香子 北野
浩介 石井
Original Assignee
国立研究開発法人国際農林水産業研究センター
株式会社Ihi
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for decomposing cellulosic fibers containing protein using microorganisms.
  • Cellulosic fibers such as sugar cane, corn, and waste wood are converted into ethanol after decomposition of the cellulosic fibers, and are used not only as a new source of energy for fuel, but also as a raw material for saccharification. .
  • the chemical decomposition method uses alkali or acid to decompose cellulosic fibers, and acid decomposition has long been used.
  • Acidolysis includes a concentrated sulfuric acid saccharification method and a dilute sulfuric acid two-step saccharification method.
  • cellulose is decomposed by cellulolytic enzymes (mainly cellulases) or microorganisms that produce cellulolytic enzymes (Patent Document 1).
  • Enzymatic decomposition is advantageous in that the burden of waste liquid collection and treatment is lighter than that of acid decomposition, equipment costs such as chemical-resistant equipment can be reduced, and excessive decomposition does not occur and the sugar yield is high.
  • the present inventors have previously proposed a BSES method in which Clostridium microorganisms are cultured in the presence of ⁇ -glucosidase to saccharify cellulosic biomass in one step (see Patent Document 2).
  • waste materials containing cellulosic fibers contain many reusable components, but many of them are focused on applications other than decomposing and reusing cellulose.
  • barley lees which are waste materials from beer and whiskey brewing, are used as feed for livestock (especially cattle) because they contain protein, and there was little need to reuse cellulosic fibers.
  • the ability required for microorganisms that decompose barley meal is to produce cellulases and hemicellulases while producing proteolytic enzymes.
  • many of the fiber-degrading microorganisms known so far are either incapable of producing proteolytic enzymes even if they produce fiber-degrading enzymes, or have characteristics such as low activity that do not degrade fiber-degrading enzymes. There are many.
  • cellulase, hemicellulase, and the like, which are fiber-degrading enzymes are also proteins, it is conceivable that if microorganisms produce proteolytic enzymes, they will also degrade fiber-degrading enzymes.
  • the present invention is a method for decomposing cellulosic fibers containing protein with microorganisms.
  • the cellulosic fiber material containing protein is preferably barley lees discharged from the alcohol or beverage manufacturing plants and breweries, and the microorganisms are microorganisms having barley lees decomposition activity, such as Paenibacillus. ) microorganisms are preferred.
  • Genetically modified microbial strains having the gene sequences of Paenibacillus macerans may be used in the present invention.
  • the gene sequence of Paenibacillus macerans strain I-6 (NITE P-03556) or Paenibacillus macerans strain I-7 (NITE P-03557) is used as a genetically modified microorganism species having the gene sequence of Paenibacillus macerans.
  • Genetically modified microbial species having In the present invention genetic recombinants containing gene sequences of Paenibacillus macellans may also be used.
  • This self-replicating plasmid DNA can be used as a transforming plasmid for other microorganisms including P. macerans to transform a host, and the resulting transformant can be used to decompose barley meal.
  • a gene recombinant of Paenibacillus macerans, Paenibacillus macerans strain I-6 (NITE P-03556) or Paenibacillus macerans strain I-7 (NITE P-03557) may be used.
  • a gene necessary for decomposing barley meal of Paenibacillus macerans or Paenibacillus macerans strain I-6 (NITE P-03556) and Paenibacillus macerans strain I-7 (NITE P-03557) is further selected, It was clarified that barley meal can be decomposed using microbial strains extracted and introduced into other microbial strains by techniques such as genetic recombination.
  • P. macerans strain (DSM 24), isolated P. macerans (I-6 strain), P. macerans (I-7 strain) as the type strain, and Clostridium thermocellum
  • P. Fig. 2 is a diagram showing the efficiency of decomposing barley meal by cisolokensis (DSM101873), a genetic recombinant of chloramphenicol-resistant P. macerans I-7 strain (RI-7 strain).
  • the method of decomposing a cellulosic fiber material containing protein of the present invention is a method of decomposing barley meal, which is a representative cellulosic fiber material containing protein, using microorganisms exhibiting cellulase activity and proteolytic activity.
  • microorganisms exhibiting cellulase activity and proteolytic activity are preferably microorganisms belonging to the genus Paenibacillus.
  • Microorganisms of the genus Paenibacillus that can secrete cellulases and proteolytic enzymes include P. macerans, P. thermophilus, P. oralis, P. timonensis, P. barengoltzii, P. phoenicis, P. yonginensis P. konsidensis, P. curdlanolyticus, P. sanguinis, P. barengoltzii are preferred. More preferably, P.macerans and P.thermophilus (Reclassification into the same genus and congener: Hisami Kobayashiet-al. Reclassification of Paenibacillus thermophilus Zhou et al.
  • Microorganisms belonging to the genus Paenibacillus are known to be used as agricultural chemicals, to produce plant nutrients in the soil, and to decompose plant fibers. not known to do.
  • Examples of protein-containing cellulosic fibers include soybean meal, tea meal, crustacean shells, processed fish meat, tea leaves, coffee meal, and microbial pellets, in addition to barley meal.
  • the present invention also provides the DNA of strain I-6 (NITE P-03556) and strain I-7 (NITE P-03557).
  • This DNA can be used in whole or in part, combined with conventionally available plasmids to construct a transforming plasmid, and used to transform other microorganisms including microorganisms belonging to the genus P. macerans.
  • Escherichia coli-derived plasmids include, for example, Escherichia coli-derived plasmids (ColE plasmids such as pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 or pTrc99A; p15A such as pACYC177 or pACYC184; pMW118, pMW119, pMW218 or pMW219, etc.), Agrobacterium-derived plasmids (eg, pBI101, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.), and the like.
  • ColdE plasmids such as pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N,
  • the transforming plasmid according to the present invention can further contain a replication origin and an autonomously replicating sequence. By containing these, it can be stably replicated after being introduced into a host cell.
  • the transforming plasmid according to the present invention can contain a selection marker.
  • the selectable marker is not particularly limited, and examples thereof include drug resistance marker genes.
  • drug resistance marker genes are genes encoding resistance to ampicillin, tetracycline, chloramphenicol, kanamycin.
  • auxotrophic marker genes can also be mentioned as selectable markers.
  • a selectable marker is an auxotrophic marker that encodes an essential auxotrophic gene that is deleted in the bacterial strain.
  • a promoter sequence may also be included in order to express the gene at a high level. Suitable as promoters are all promoters known to the person skilled in the art, for example constitutive promoters (e.g. GAPDH promoter) or e.g. inducible promoters (e.g. Lac promoter, tac promoter, trc promoter, ⁇ PL promoter, ara promoter, cumate promoter, tet promoter, or sequences derived therefrom).
  • Methods for introducing the constructed plasmid into host cells include the calcium chloride method, calcium chloride/rubidium chloride method, electroporation method, electroinjection method, chemical treatment such as PEG, and methods using a gene gun. etc.
  • strain I-6 NITE P-03556
  • strain I-7 NITE P-03557
  • pI6ORI NITE-P03555
  • Cellulosic fibers containing proteins can be degraded by transforming microorganisms other than the genus Paenibacillus using a plasmid containing the pI6ORI sequence or a part of the sequence.
  • microorganisms other than the genus Paenibacillus include, for example, anaerobic microorganisms Clostridium thermocellum, Clostridiumstercorarium, Clostridiumthermolacticum, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor bescii, Caldicellulosiruptor obsidiansis, Thermoanaerobacter cellulolyticus, Anaerocellum thermophilum, Spirochata thermophilum (Spirochaeta thermophila), Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Fervidobacterium riparium, Fervidobacterium islandicum, Herbivorax succinocolla (Herbivorax saccincola), the aerobic microorganism Geobacillus stearothermophilus, the genus Thermus, such as Thermus thermophilus, and the genus Ther
  • Paenibacillus genus microorganism preferably I-6 strain (NITE P-03556) and I-7 strain (NITE P-03557)
  • the above-mentioned genetic recombinant microorganism species or a genetic recombinant transformed using the above-mentioned DNA sequence
  • a Paenibacillus genus microorganism and the genetically modified microbial species may be co-cultivated, and the microflora may be used to degrade protein-containing cellulosic fibers.
  • the present invention will be specifically described below with reference to examples, but it is clear that the microorganisms used in the method of the present invention are not limited to the markers, promoters and hosts described above.
  • Example 1 Isolation and identification of microbial strains that decompose barley meal
  • soil samples stored by the inventors were screened by the following method.
  • medium-temperature zone (37-45°C) and high-temperature zone (50-60°C) culture conditions good growth was observed with barley lees and water alone.
  • Those with a large difference in dry weight of barley lees were selected, and enrichment culture was repeated five times or more under anaerobic conditions for selection.
  • a culture with good growth and a large difference in dry weight was obtained at 45°C.
  • metagenomic analysis using next-generation sequencing to analyze 16S rRNA sequences to gain insight into the microbiota. was found to exist.
  • Paenibacillus macerans When viewed from the microflora, among them, Paenibacillus macerans accounted for about 65%, Clostridium genus about 30%, and Paenibacillus genus about 9%. From these results, it was clarified that Paenibacillus macerans and other species of microorganisms belonging to the genus Clostridium and Paenibacillus coexisted with good barley meal decomposing ability. In order to isolate Paenibacillus macerans, which is the main decomposer, colonies were isolated by the roll-tube method using the supernatant of barley lees treated with alkali under anaerobic conditions.
  • Genomic DNA used as a PCR template was prepared from each microorganism using the NucleoSpin® Microbial DNA Kit (Takara Bio). PCR amplification of the 16S rRNA gene was performed by the following PCR method.
  • Genomic DNA of strain I-6 (NITE P-03556) and strain I-7 (NITE P-03557) was extracted by the following procedure. First, strain I-6 (NITE P-03556) and strain I-7 (NITE P-03557) were cultured for 4 days using a medium containing the biomass fiber as a carbon source. The resulting culture was centrifuged at 10,000 rpm at 4° C. for 5 minutes to collect the cells cultured on each biomass. Next, the obtained cells were added with 10% SDS (sodium lauryl sulfate) to a final concentration of 0.5% and a proteinase K (1 mg/mL) solution to a final concentration of 5 ⁇ g/mL, It was made to react at 37 degreeC for 1 hour. Then, 10% cetyltrimethylammonium bromide-0.7M sodium chloride solution was added to a final concentration of 1%, and reacted at 65° C. for 10 minutes.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • a chloroform-isoamyl alcohol solution was added in an amount equal to the culture medium after the reaction, and the mixture was well stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to obtain an aqueous layer.
  • An equal amount of the phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture was again added to the resulting aqueous layer, and the mixture was stirred and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to obtain an aqueous layer.
  • 0.6 volumes of isopropanol was added to the resulting aqueous layer to precipitate the genomic DNA, which was then centrifuged to prepare the genomic DNA.
  • the prepared genomic DNA was then washed with 70% ethanol and dried. bottom.
  • oligonucleotide primer 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': SEQ ID NO: 1
  • 1492R oligonucleotide primer 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3': SEQ ID NO: 2
  • a comparison using the rpoB gene sequence was performed for further confirmation of the strain.
  • rpoB-1698F oligonucleotide primer (5-AACATCGGTTTGATCAAC-3: SEQ ID NO: 3) and rpoB-2041R oligonucleotide primer (5-CGTTGCATGTTGGTACCCAT-3: SEQ ID NO: 4) were used.
  • PCR was performed to amplify the 16S rRNA gene using ExTaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). The PCR conditions were 30 cycles of 98° C. for 1 minute, 55° C. for 1 minute, and 72° C. for 2 minutes. After confirming the band amplified by 0.8% agarose gel electrophoresis, the amplified PCR product was purified using the QIAGEN PCR purification kit (manufactured by QIAGEN).
  • Example 2 Wheat meal decomposition by Paenibacillus microorganisms
  • Analysis of the components of the barley lees used in Example 1 revealed 23.4% crude protein, 13.3% crude fat, 33.6% hemicellulose, 20% cellulose, 5.2% lignin, and 4.4% ash. It was found that the composition and composition ratio were completely different from those of general cellulose biomass. Based on this, we investigated whether or not Paenibacillus microorganisms can decompose cellulosic fibers containing proteins.
  • P. macerans strain obtained from the German Microorganism Cell Culture Collection (DSMZ), Clostridium thermocellum, P. curdlanolyticus, and P. cisolokensis (DSM101873) (both non-patent document 4). was used to confirm whether Paenibacillus microorganisms can decompose protein-containing cellulosic fibers.
  • DSM24 and Clostridium thermocellum (DSM1313), P. curdlanolyticus, P. The resolution was compared. In order to carry out anaerobic culture, the upper layer was replaced with nitrogen gas and sealed with a rubber stopper and an aluminum cap.
  • Decomposition measurement of barley meal was performed by inoculating the above-mentioned microorganisms with a 1% (v / v) syringe, culturing P. macerans strain (DSM 24) and P. curdlanolyticus at 37 ° C., P. macerans I-6 strain and Strain I-7 was cultured at 45°C, P. cisolokensis (DSM101873) was cultured at 50°C, and Clostridium thermocellum was cultured at 60°C. After 5 days, the remaining barley meal was dried and the percentage was obtained by subtracting the weight of the initial barley meal.
  • Biomass decomposition rate (%) ⁇ (biomass dry weight before decomposition [g/mL]) - (dry weight of residue contained in culture solution after decomposition [g/mL]) x 100 ⁇ /before decomposition Biomass dry weight [g/mL]
  • RI-7 in FIG. 1 is the barley meal degradability exhibited by the genetically modified I-7 of Examples 4 and 5 described later (see Example 5).
  • the type strains P. macerans (DSM 24), P. curdlanolyticus, and P. cisolokensis (DSM 101873) can also decompose barley meal, but have a very low saccharification rate.
  • the isolated P. macerans I-6 and P. macerans I-7 strains have about four times higher degradation rates than other type strains.
  • Clostridium thermocellum a cellulose/hemicellulose-degrading bacterium, cannot decompose at all. Therefore, it can be seen that the presence of cellulolytic enzymes and hemicellulolytic enzymes is of little use in decomposing barley meal.
  • Example 3 Protease activity and xylanase activity of Paenibacillus macerans
  • P. macerans I-6 and P. macerans I-7 not only have cellulose and hemicellulose degrading activity, but also probably effectively decompose proteins coating the surface of barley meal to expose fiber. It has been suggested that the decomposition may be accelerated by Therefore, it was confirmed whether or not there was protease activity.
  • the protease activity, cellulase activity, and xylanase activity were examined by exocytosis of P. macerans strain type strain (DSM24), I-6 strain, and I-7 strain. Enzyme activities were compared.
  • P. macerans DSM 24 has protease activity, cellulase and xylanase activities, but P. macerans strain I-6 or I-7 strain has about 3 times higher protease activity, It turns out that it has cellulase activity. There was not much difference with respect to xylanase activity. These results suggested that the protease activity might have an effect on barley meal degradation.
  • Example 4 Generation of chloramphenicol antibiotic-resistant P. macerans I-6 and I-7 strains
  • P. macerans I-6 and I-7 strains were generated using commercially available plasmid vectors. A chloramphenicol antibiotic resistant strain was generated.
  • P.macerans I-6 and I-7 strains were aerobically cultured in DSM 220 medium and cultured to a turbidity of around 0.5 at a wavelength of 600 nm. Washed twice with a buffer containing sucrose and 1 mM magnesium chloride. The washed P. macerans I-6 and I-7 strain cells were finally suspended in the above-mentioned buffer at about 300-fold volume, and pNW33N (Bacillus Genetic Stock Center) was used as a plasmid vector for transformation by the above-mentioned electroporation method. Using. After electroporation, P. macerans strains I-6 and I-7 were post-cultured in DSM 220 liquid medium at 45° C. for 3 hours and plated on DSM 220 plate medium containing 40 ⁇ g/mL chloramphenicol. and observed the appearance of transformants.
  • pNW33N Bacillus Genetic Stock Center
  • Example 5 A chloramphenicol-resistant genetic recombinant P. macerans (RI-7 strain) was subjected to a barley meal saccharification experiment.
  • strain RI-7 was inoculated into a medium containing pretreated barley lees and chloramphenicol at a concentration of 40 ⁇ g/mL. Even the barley lees culture medium containing chloramphenicol showed a saccharification rate equivalent to that of the non-genetically modified strain I-7 (see Fig. 1). From these results, it was clarified that the transgenic plant could maintain the saccharification efficiency and saccharify barley lees.
  • the pNW33N plasmid vector was used, but the sequence deposited as pI6ORI (NITE-P03555) can also be used for transformation.
  • the gene sequence of pI6ORI (NITE-P03555) is shown in SEQ ID NO:9.
  • the pI6ORI the DNA extracted from the Paenibacillus macerans I-6 and I-7 strains by the present inventors, has been internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary. Below is a statement identifying the deposit.
  • the Paenibacillus macerans strain I-7 isolated by the present inventors has been internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary. Below is a statement identifying the deposit.

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Abstract

麦粕のようなタンパク質を含むセルロース系繊維物の分解方法を提供する。パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物を用いて、タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する。タンパク質を含むセルロース系繊維物を微生物だけで分解でき、タンパク質とセルロース系繊維物を一段階で分解することができる。さらに、嫌気性条件下、微生物で処理を行うため、タンパク質を含むセルロース系繊維物中に含まれる有機物が発酵されて二酸化炭素を排出することも少ない。

Description

タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法
　本発明は、微生物を用いてタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法に関する。
　サトウキビ、トウモロコシ、廃木材等のセルロース系繊維物は、セルロース系繊維を分解した後、エタノールに変換され、新たな燃料用エネルギーとして活用されているだけでなく、糖化の原料としても活用されている。セルロース系繊維の分解には化学的分解法及び酵素分解法がある。
　化学的分解法は、アルカリ又は酸を利用してセルロース系繊維を分解するものであり、古くより酸分解がよく用いられている。酸分解には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがある。
　酵素分解法は、セルロース分解酵素（主にセルラーゼ）やセルロース分解酵素を生産する微生物によりセルロース分解を行うものである（特許文献１）。酵素による分解は、酸分解に比べ廃液回収や処理の負担が軽く、耐薬設備等の設備コストを低減できること、過分解が起こらずに糖の収率が高い等の利点がある。
　また、本発明者らは先に、β-グルコシダーゼの存在下でクロストリジウム属微生物を培養して、セルロース系バイオマスをワンステップで糖化するＢＳＥＳ法を提案している（特許文献２参照）。
　また一方、セルロース系繊維を含む廃材の中には再利用可能な成分を多く含むものもあるが、セルロースを分解して再利用する以外の用途に重点がおかれているものも数多くある。例えば、ビール、ウイスキー醸造の廃材である麦粕は、タンパク質を含むため、家畜（特に牛）の飼料として利用されており、セルロース系繊維を再利用する必要性は少なかった。
WO2017/221765公報 WO2013/137151公報
醸造協会誌・第90巻第2号（1995）ページ93－100 Lane, D. J., et al., "In Stackebrandt,E. and Goodfellow, M. (eds.), Nucleic acid techniques in bacterialsystematics", 16S/23S rRNA sequencing. p115-175, John Wiley & Sons, NewYork, 1991. Takai, K. and Horikoshi, K., "Rapid detection and quantification ofmembers of archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes",Appl. Environ. Microbiol., 66, p5066-5072, 2000. Yokota et al., Int J Syst EvolMicrobiol. 2016 Aug;66(8):3088-3094. doi: 10.1099/ijsem.0.001151.
　ところが、近年の酪農と肉牛肥育の衰退、安価な輸入飼料により、最近では麦粕を飼料として利用する機会は減少している。一方、２０３０年までの実質二酸化炭素排出０％を目標に、二酸化炭素排出削減努力が行なわれている。ところが、ビール、ウイスキー醸造では、既に省エネ化が進んでおり、これ以上の二酸化炭素の排出削減に目処を立てるのが極めて難しい状況にある。そこで注目されるのが、飼料としての利用機会が減少している麦粕の再活用である。排出される麦粕をバイオ燃料に転換出来れば、二酸化炭素排出削減が可能になる。
　本発明者らは、微生物を用いた麦粕の分解方法を検討していたところ、これまでセルロース分解に有用とされていた微生物では麦粕のセルロース繊維が効率よく分解されないという問題に遭遇した。
　ビールの主原料である麦は、通常麦芽の酵素で分解され、デンプンが液化し水溶液となる。そして水溶性物質を麦芽の穀皮で濾過をすると透明な濾液となり、これを麦汁と呼び、一方、濾材となった穀皮を主とする不溶性残渣を麦粕と呼んでいる。麦芽に含まれるデンプンはほぼ全量麦汁となるが、一方、麦粕中には高分子タンパク質と食物繊維、脂質が残存することになる。粕に残る成分は、タンパク質が２４～２８％、脂質８～１１％、食物繊維５５～６１％、糖質１～３％、灰分３～５％との報告がある（非特許文献１）。
　つまり、麦粕の植物繊維以外で最も多い成分はタンパク質であり、タンパク質は繊維の内側表面のアリューロン層に多く含まれる。従って、このタンパク質を破壊、分解しない限り植物繊維分解も効率的にできないことが推察された。実際、セルロース高分解菌と言われるクロストリジウム・サーモセラムでは、麦粕は全く分解できなかった。これはアリューロン層に含まれるタンパク質が邪魔をしてセルラーゼやヘミセルラーゼなど繊維分解酵素の分解を妨げているからと考えられた。
　従って、麦粕を分解する微生物に求められる能力は、タンパク質分解酵素を生産しながら、セルラーゼやヘミセルラーゼを生産することである。ところが、これまで知られている繊維分解微生物の多くは、繊維分解酵素を生産したとしても、タンパク質分解酵素を生産できないか、又は活性が低いなどの繊維分解酵素を分解しないような特徴を持つものが多い。また一方では、繊維分解酵素であるセルラーゼやヘミセルラーゼなどもタンパク質であることから、微生物がタンパク質分解酵素を生産するのであれば、繊維分解酵素をも分解してしまうことも考えられる。
　従って、麦粕のような植物繊維中にタンパク質を含むセルロース系繊維物を微生物で分解するためには、タンパク質分解酵素を生産しながら、そのタンパク質分解酵素耐性の持つ繊維分解酵素を生産できるような新しい微生物が必要である。
　本発明者らは、上記課題に注目して鋭意研究を行い、麦粕分解に適した微生物の探索を行ってきた結果、パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物、又はパエニバシラス（Paenibacillus）属微生物を含んだ微生物叢が麦粕のタンパク質層やセルロース繊維を分解することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、微生物によりタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法である。ここで、タンパク質を含むセルロース系繊維物は、前記アルコールや飲料製造工場や醸造所で排出される麦粕が好適であり、微生物とは、麦粕分解活性を有する微生物であって、パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物が好ましい。具体的には、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans又はP. maceransとも呼ぶ。）のI-6株（NITE　P-03556）及びI-７株（NITE　P-03557）、又は前記微生物種を含んだ微生物叢を用いることである。
　本発明においては、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種を用いてもよい。エニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種として、パエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランスI-7株（NITE　P-03557）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種を用いてもよい。
　本発明では、さらに、パエニバシラス・マセランスの遺伝子配列を含む遺伝子組換体を用いてもよい。パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を含む遺伝子組換体として、パエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）及びパエニバシラス・マセランスI-７株（NITE　P-03557）から得られたＤＮＡ配列又は上記I-6株及びI-7株由来の自己複製型プラスミドＤＮＡ配列（NITE　P-03555）を含む遺伝子組換体を開示する。この自己複製型プラスミドＤＮＡは、P. macerans属微生物を含め他の微生物への形質転換用プラスミドとして宿主の形質転換に使用され、得られた形質転換体を麦粕の分解に用いることができる。遺伝子組換体として、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランスI-7株（NITE　P-03557）の遺伝子組換体を用いてもよい。
　本発明では、さらに、前記パエニバシラス・マセランス、又はパエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）及びパエニバシラス・マセランスI-7株（NITE　P-03557）の麦粕分解に必要な遺伝子を選択、抽出し、他の微生物種へ遺伝子組換え等の技術により導入した微生物種を用いて麦粕を分解することを明らかにした。
　本発明の方法を用いることにより、タンパク質を含むセルロース系繊維物を微生物だけで分解することが可能であるため、環境に配慮した処理を行うことができる。また、タンパク質とセルロース系繊維物を一段階で分解することができるので、複雑な処理工程を必要としない。さらに、嫌気性条件下、微生物で処理を行うため、タンパク質を含むセルロース系繊維物中に含まれる有機物が発酵されて二酸化炭素を排出することも少ない。
基準株としてP. macerans株(DSM 24)、分離したP. macerans (I-6株）、P. macerans (I-7株）、さらに試験対象としてクロストリジウム・サーモセラム（Clostridiumthermocellum）、P. curdlanolyticus、P. cisolokensis （DSM101873）、遺伝子組換体としてクロラムフェニコール耐性付与P. macerans I-7株（RI-7株）による麦粕の分解効率を示す図である。 クロラムフェニコールを含むプレートにおいて、（Ａ）P. macerans I-7株（NITE　P-03557）と、（Ｂ）プラスミドｐＮＷ３３Ｎで形質転換したクロラムフェニコール耐性付与P. macerans I-7株の生育の結果を示す図である。
　本発明のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法は、セルラーゼ活性とタンパク質分解活性とを示す微生物を用いて、代表的タンパク質を含むセルロース系繊維物である麦粕を分解する方法であり、例えば、セルラーゼ活性とタンパク質分解活性を示す微生物は、パエニバシラス（Paenibacillus）属の微生物が好ましい。
　セルラーゼとタンパク質分解酵素を分泌可能なパエニバシラス（Paenibacillus）属の微生物としては、P. macerans, P.thermophilus, P. oralis, P. timonensis,P. barengoltzii, P. phoenicis,P. yonginensis P. konsidensis,P. curdlanolyticus, P. sanguinis, P. barengoltziiが好ましい。より好ましくは、P.macerans やP.thermophilus（同属同種に再編：Hisami Kobayashiet-al. Reclassification of Paenibacillus thermophilusZhou et al. 2013 as a later heterotypic synonym of Paenibacillusmacerans (Schardinger 1905)Ash et al. 1994. Int J Syst Evol Microbiol.2019 Feb;69(2):417-421. doi: 10.1099/ijsem.0.003160. Epub 2018 Dec 12.）を挙げることができる。後述する実施例にも示したが、これらの微生物は混合状態で分解を行っている場合もある。従って前記微生物での単独培養、又は前記微生物を含み、かつ他の微生物種も含む微生物叢を用いることもできる。
　なお、パエニバシラス（Paenibacillus）属の微生物は、農薬としての用途、植物の栄養素を土壌中で作り出すこと、植物繊維を分解することが知られているが、タンパク質を含むようなセルロース系繊維物を分解することは知られていない。タンパク質を含むセルロース系繊維物としては、麦粕以外にも大豆粕、茶粕、甲殻類の殻、加工魚肉、茶葉、コーヒー粕、微生物ペレットなどがある。
　また、本発明はI-6株（NITE　 P-03556）及びI-７株（NITE　P-03557）のＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、その全部あるいは一部を用い、従来公知の入手可能なプラスミドと組み合わせて形質転換用プラスミドを構築して、P. macerans属微生物を含め他の微生物を形質転換することができる。
　入手可能な公知のプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられる。
　本発明に係る形質転換用プラスミドは、さらに複製開始点や自律複製配列を含むことができる。これらを含むことで宿主細胞に導入された後に安定的に複製することができる。また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、選抜マーカーを含むことができる。選抜マーカーとしては特に限定されず、例えば薬剤耐性マーカー遺伝子を挙げることができる。例えば、薬剤耐性マーカー遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。さらに、栄養要求性マーカー遺伝子も選択マーカーとして挙げることができる。選択マーカーは、細菌株において欠失している必須栄養要求遺伝子をコードする栄養要求性マーカーである。これら選抜マーカーを含むことで、形質転換補助用プラスミドが導入された宿主細胞を効率的に選択することができる。また遺伝子を高発現させるためには、プロモーター配列を含ませても良い。
　プロモーターとして適しているのは、当業者に既知のすべてのプロモーター、例えば、構成性プロモーター（例えば、ＧＡＰＤＨプロモーター）、又は例えば、誘導性プロモーター（例えば、Ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ａｒａプロモーター、ｃｕｍａｔｅプロモーター、ｔｅｔプロモーター、又はそれらに由来する配列）である。
　構築されたプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、塩化カルシウム法又は塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
　I-6株（NITE　 P-03556）及びI-7株（NITE　P-03557）のＤＮＡとは、具体的には、ｐI6ORI（NITE-P03555）である。ｐI6ORIの配列もしくは、配列の一部を含むプラスミドを使い、Paenibacillus属以外の微生物を形質転換することで、タンパク質を含むセルロース系繊維物の分解をすることができる。
　Paenibacillus属以外の微生物としては、例えば、嫌気性微生物であるクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・ステコラリウム（Clostridiumstercorarium）、クロストリジウム・サーモラクティカム（Clostridiumthermolacticum）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、カルディセルロシルプター・ベシー（Caldicellulosiruptor bescii）、カルディセルロシルプター・オブシヂアンシス（Caldicellulosiruptor obsidiansis）、サーモアナエロバクター・セルロリティクス（Thermoanaerobacter cellulolyticus）、アナエロセーラム・サーモフィリム（Anaerocellum thermophilum）、スピロチャタ・サーモフィラ（Spirochaeta thermophila）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、フェルビドバクテリウム・リパリウム（Fervidobacterium riparium）、フェルビドバクテリウム・イスランディカム（Fervidobacterium islandicum）、ハービボラックス・サクシノコラ（Herbivorax saccincola）、好気性微生物であるジオバチルス・ステアロサーモフィリス（Geobacillusstearothermophilus）などのGeobacillus 属、サーマス・サーモフィリス（Thermus thermophilus）などサーマス属やサーモトガ・マリチア（Thermotoga maritima）などのサーモトガ属やカピリバクテリウム・サーモキチニコラ（Capillibacterium thermochitinicola）を挙げることができる。
　さらに前記Paenibacillus属微生物、好ましくはI-6株（NITE　P-03556）及びI-７株（NITE　P-03557）と上記遺伝子組換体微生物種、又は前記ＤＮＡ配列を用いて形質転換した遺伝子組換体Paenibacillus属微生物と上記遺伝子組換体微生物種を共培養し、微生物叢をタンパク質を含むセルロース系繊維物の分解に用いても構わない。
　以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の方法で用いられる微生物は、上述したマーカー、プロモーター、宿主に限定されないことは明らかである。
（実施例１）
（麦粕を分解する微生物株の単離と同定）
　発明者らが保存している土壌サンプルを用い、麦粕を分解できる微生物のスクリーニングを以下の方法で行った。
　まず、中温帯（３７～４５℃）と高温度帯（５０～６０℃）の培養条件で、麦粕と水だけで良好な増殖を示し、培養前の麦粕の乾燥重量と、培養後の麦粕の乾燥重量の差分が大きいものを選抜し、さらに嫌気性条件で集積培養を５回以上繰り返して選抜を行った。
　その結果、高温度帯のサンプルからは候補を見つけられなかったが、４５℃にて良好な増殖と乾燥重量差の大きい培養物を得た。
　微生物単離を行う前に、微生物叢に関して知見を得るために、次世代シーケンスを用いて１６ＳｒＲＮＡ配列を解析するメタゲノム解析を行ったところ、表１に示すように、培養物中には数種類の菌が存在していることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　微生物叢から見た場合、中でもPaenibacillus maceransが約６５％を占め、Clostridium属が約３０％、他にPaenibacillus属が約９％の微生物も混在していた。これらの結果から、Paenibacillus maceransを中心として、Clostridium属やPaenibacillus属微生物の他の種が共存していても良好な麦粕分解能を示すことが明らかとなった。
　分解の主役となるPaenibacillus maceransを分離するために、嫌気性条件下において麦粕アルカリ処理後の上澄み液を培地として用い、ロールチューブ法によりコロニーの単離を行った。各コロニーを形成した微生物に対して、前述した麦粕と水だけで培養を行ったところ、麦粕を効率的に分解するPaenibacillus macerans　I-6株（NITE　P-03556）及び Paenibacillus macerans　I-7株（NITE　P-03557）を単離した。
　さらに、単離株の特徴を１６ＳｒＲＮＡシーケンスによる系統樹解析により調べた。ＰＣＲテンプレートとして使用するゲノムＤＮＡは、NucleoSpin（登録商標）MicrobialDNAキット（タカラバイオ）を使用して各微生物から調製した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は以下のＰＣＲ法により行った。
（ゲノムＤＮＡの抽出）
　I-6株（NITE　P-03556）及びI-7株（NITE　P-03557）の分類学上の性質を明らかにするために、１６ＳｒＲＮＡ及びｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列解析を行った。ｒｐｏＢ遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニット遺伝子（ｒｐｏＢ））は細菌分類において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子以外で指標とされる遺伝子配列になるため、より確実に細菌同定が可能である。
　I-6株（NITE　P-03556）及びI-7株（NITE　P-03557）のゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。
　まず、前記バイオマス繊維物を炭素源として含む培地を用いて、それぞれI-6株（NITE　P-03556）及びI-7株（NITE　P-03557）を４日間培養した。得られた培養物を４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して、それぞれのバイオマスで培養した菌体を回収した。次いで、得られた菌体を、最終濃度０．５％となるように１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と、最終濃度５μｇ／ｍＬとになるようにプロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）溶液を加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、最終濃度１％となるように１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム－０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、６５℃で１０分間反応させた。
　反応後の培養液と等量のクロロフォルム－イソアミルアルコール溶液を加え、よく攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。得られた水層に再度、フェノール－クロロフォルム－イソアミルアルコール混合液を水層と等量加えて攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離を行い、水層を得た。
　次いで、得られた水層に対し、０．６倍容量のイソプロパノールを加えゲノムＤＮＡを析出させ、遠心分離を行ってゲノムＤＮＡを調製した後、調製したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。
（ゲノムＤＮＡの増幅）
　１６ＳｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーは、２７Ｆオリゴヌクレオチドプライマー（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’：配列番号１)、及び１４９２Ｒオリゴヌクレオチドプライマー(5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’：配列番号２）を用いた。
　菌種のさらなる確認のため、１６ＳｒＲＮＡ以外にもｒｐｏＢ遺伝子のシークエンスを利用した比較を行った。
　ｒｐｏＢ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマーは、ｒｐｏＢ－１６９８Ｆオリゴヌクレオチドプライマー（5-AACATCGGTTTGATCAAC-3：配列番号３）、及びｒｐｏＢ－２０４１Ｒオリゴヌクレオチドプライマー(5-CGTTGCATGTTGGTACCCAT-3：配列番号４)を用いた。
　ＰＣＲは、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクルの条件において増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、ＱＩＡＧＥＮ　ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、増幅されたＰＣＲ産物を精製した。
（塩基配列解析及び相同性検索）
　塩基配列解析及び相同性検索については、非特許文献１及び２に記載された手法に基づき、GenBank/EMBL/DDBJのデータベースを用いて、ＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）により実施した。
　得られたP. macerans I-6株（NITE　P-03556）及び P. macerans　I-7株（NITE　P-03557）の１６ＳｒＲＮＡシーケンスをそれぞれ配列番号５、配列番号６に示す。またP. macerans I-6株（NITE　P-03556）及び P. macerans　I-7株（NITE　P-03557）のｒｐｏＢ遺伝子シーケンスをそれぞれ配列番号７と配列番号８に示す。
（実施例２）
（Paenibacillus属微生物による麦粕分解能）
　実施例１で使用した麦粕の成分を分析したところ、粗タンパク質２３．４％、粗脂肪１３．３％、ヘミセルロース３３．６％、セルロース２０％、リグニン５．２％、灰分４．４％と、一般的なセルロースバイオマスとは全く異なる成分、成分比とは異なることが判明した。このことから、Paenibacillus属微生物がタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解可能かについて検討を加えた。
　比較対照として、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）から取得したP. macerans株(DSM24)、セルロース・ヘミセルロース高分解菌Clostridium thermocellumやP. curdlanolyticus、及びP. cisolokensis （DSM101873）（共に非特許文献４）を用いて、Paenibacillus属微生物がタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解できるかを確認した。
　ＮａＯＨによるアルカリ処理した４％（w/v）麦粕と滅菌蒸留水を用い、P. macerans株(DSM24）及び、Clostridium thermocellum(DSM1313), P. curdlanolyticus, P. cisolokensis（DSM 101873）とともに麦粕分解能を比較した。嫌気培養にするために上層を窒素ガスで置換し、ゴム栓とアルミキャップにて栓をした。
　麦粕の分解測定は、前記微生物を１％（v/v）シリンジにて接種し、P. macerans株（DSM 24）及びP. curdlanolyticusは３７℃で培養し、P. macerans I-6株及びI-７株は４５℃で培養、またP. cisolokensis （DSM101873）は５０℃にて培養、Clostridium thermocellumは６０℃にて培養を行った。５日間後、残った麦粕を乾燥させ、初発の麦粕の重量の差し引きにより割合を求めた。
　バイオマス分解率（％）＝｛（分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）－（分解後の培養液中に含まれた残渣の乾燥重量［ｇ／ｍＬ］）×１００｝／分解前のバイオマス乾燥重量［ｇ／ｍＬ］
　結果を図１に示す。なお、この試験は５回の反復試験から分解率の分布を示したものである。図１中のRI-7は、後述する実施例４及び５の遺伝子組換えI-7が示す麦粕分解能である（実施例５を参照）。
　タイプストレインであるP. macerans (DSM 24)、P. curdlanolyticus、 P. cisolokensis （DSM 101873）も麦粕は分解できるが非常に低い糖化率である。一方、分離したP. macerans I-6株やP. macerans I-7株は、他のタイプストレインに比較し、約４倍程度分解率が高いことがわかる。セルロース・ヘミセルロース分解菌であるClostridiumthermocellumは、逆に全く分解できない。従って、セルロース分解酵素やヘミセルロース分解酵素を有していても、麦粕分解にはほとんど役に立たないことが分かる。
（実施例３）
（Paenibacillus maceransのプロテアーゼ活性とキシラナーゼ活性）
　実施例２の結果より、P. maceransI-6とP.maceransI-7は、セルロースやヘミセルロース分解活性のみならず、恐らく麦粕表面をコーティングしているタンパク質を効果的に分解し繊維質を露出させることで分解を促進している可能性が示唆されている。
　そこで、プロテアーゼ活性があるかどうかを確認した。
　実施例２と同様に、アルカリ処理した麦粕を用い、プロテアーゼ活性と、セルラーゼ活性、キシラナーゼ活性とについて、P. macerans株タイプストレイン(DSM24)とI-6株、I-7株の菌体外酵素活性を比較した。
（プロテアーゼ活性測定）
　微生物の培養後の溶液に対し、１％カゼイン基質溶液を加え、恒温水槽（ヤマト科学社製）にて３７℃又は４５℃、５分間をプレインキュベーションした。その後、培養液を加え、３７℃又は４５℃、３０分間インキュベーションした。３０分後、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）試薬を加え酵素反応を停止させた。さらに３７℃で３０分間インキュベーションした後、遠心分離して上清を得た。
　この上清に炭酸ナトリウム試液を加えて攪拌し、さらにフォーリン試液を加えて攪拌し、恒温水槽にて３７℃、３０分間インキュベートした。発色した溶液は分光光度計（島津製作所社製）にて吸光度６６０ｎｍで測定した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのアミノ酸（チロシン）を遊離する酵素量と定義し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した（表２）。
　なお、酵素のタンパク質濃度の測定は、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher製)を用いて行った。タンパク質濃度定量用の標準物質としては、濃度既知のウシ血清アルブミン(Thermo Fisher製)を使用した。
（セルラーゼ活性及びキシラナーゼ活性測定）
　セルロースやキシラン基質に対するDSM 24とI-6株とI-7株の酵素活性を調べた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に上記で得た培養液及び１％カルボキシメチルセルロース及びキシラン基質を加え、４５℃で３０分間保温した後、遊離した還元糖濃度をソモギネルソン法によって定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した（表２）。
　なお、酵素のタンパク質濃度の測定は、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher製)を用いて行った。タンパク質濃度定量用の標準物質としては、濃度既知のウシ血清アルブミン(Thermo Fisher製)を使用した。
　比較結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、P. macerans DSM 24は、プロテアーゼ活性、セルラーゼ及びキシラナーゼ活性を有しているが、P. macerans I-6株又はI-7株の方が、約３倍高いプロテアーゼ活性、セルラーゼ活性を有することがわかる。キシラナーゼ活性に関してそれほど違いは無かった。これらの結果から、プロテアーゼ活性が麦粕分解に効果を示している可能性が示唆された。
（実施例４）
（クロラムフェニコール抗生物質耐性P. macerans I-6株とI-7株の作出）
　P. macerans I-6株とP. macerans I-7株の遺伝子組換体作出の可能性を確認するために、市販のプラスミドベクターを用いて、P. macerans I-6株とI-7株のクロラムフェニコール抗生物質耐性株を作出した。
　DSM 220培地で好気的に培養を行い、６００ｎｍの波長で０．５付近の濁度まで培養を行ったP.maceransI-6株とI-7株を遠心分離により集菌し、１０％シュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液により２回洗浄した。洗浄したP.maceransI-6株とI-7株菌体は最終的に３００倍程度、前記緩衝液に懸濁し、プラスミドベクターとしてｐＮＷ３３Ｎ（Bacillus GeneticStock Center）を用い前記エレクトロポレーション法により形質転換に用いた。
　エレクトロポレーション後、P. maceransI-6株とI-7株はDSM 220液体培地中にて３時間ほど４５℃にて後培養を行い、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍＬ濃度を含むDSM 220プレート培地に塗抹して形質転換体の出現を観察した。
　４５℃にて２日間培養した後、出現したコロニーを確認した。ｐＮＷ３３Ｎが含まれるP. macerans I-6株とI-7株はクロラムフェニコール耐性としてコロニーを形成し、形質転換を行っていないP. macerans I-6株とI-7株はクロラムフェニコールプレートに生育出来なかった。
　結果を図２に示す。図２（Ｂ）に示すｐＮＷ３３Ｎが組み込まれたP. macerans I-7株のプレートでは、コロニーが現れているが、図２（Ａ）に示すｐＮＷ３３Ｎを含まないI-7株のプレートにはコロニーが形成されていないことが分かる。このことから、P. macerans I-6株とI-7株に関し、プラスミドを用いた遺伝子組換体を容易に取得できることが理解できる。
（実施例５）
　クロラムフェニコール耐性となった遺伝子組換体P. macerans（RI-7株）に対して麦粕糖化実験を行った。実施例２と同様に、前処理をした麦粕と、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍＬ濃度とを含む培地にRI-7株を同様に接種した。
　クロラムフェニコールが含まれる麦粕培養液でも、遺伝子組換体でないI-7株と同等の糖化率を示した（図１を参照）。この結果から遺伝子組換体においても糖化効率を維持し麦粕を糖化出来ることが明らかとなった。
　なお、前記した各実施例においては、ｐＮＷ３３Ｎプラスミドベクターを用いたが、ｐI6ORI（NITE-P03555）として寄託されている配列を用いて形質転換することもできる。
　ｐI6ORI（NITE-P03555）の遺伝子配列を配列番号９に示す。
ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５５５
ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５５６
ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５５７
　本発明者等によってパエニバシラス・マセランスI-6株及びI-７株から抽出されたＤＮＡであるｐI6ORIは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに国際寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
　(a)寄託機関の名称・あて名
　　名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
　　あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室（郵便番号292-0818）
　(b)受領日（寄託日）：２０２２年１２月２７日
　(c)受託番号：
　　ｐI6ORI（受領番号　NITE ABP- 03555）
　本発明者等によって単離されたパエニバシラス・マセランスI-6株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに国際寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
　(a)寄託機関の名称・あて名
　　名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
　　あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室（郵便番号292-0818）
　(b)受領日（寄託日）：２０２２年１２月２７日
　(c)受託番号：
　　I-6（受領番号　NITE ABP- 03556）
　本発明者等によって単離されたパエニバシラス・マセランスI-7株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに国際寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
　(a)寄託機関の名称・あて名
　　名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
　　あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室（郵便番号292-0818）
　(b)受領日（寄託日）：２０２２年１２月２７日
　(c)受託番号：
　　I-7（受領番号　NITE ABP- 03557）

Claims (9)

  1. 　パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物を用いて、タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  2. 　前記タンパク質を含むセルロース系繊維物が麦粕である、請求項１記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  3. 　前記パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物が、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）である、請求項１記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  4. 　前記パエニバシラス（Paenibacillus）属微生物が、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）I-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）I-7株（NITE　P-03557）である、請求項１記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  5. 　パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種を用いて、タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  6. 　前記エニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種として、パエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランスI-7株（NITE　P-03557）の遺伝子配列を有する遺伝子組換え微生物種を用いる、請求項５記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  7. 　パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を含む遺伝子組換体を用いて、タンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  8. 　前記パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）の遺伝子配列を含む遺伝子組換体として、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）I-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）I-7株（NITE　P-03557）から得られたＤＮＡ配列又はプラスミドＤＮＡ配列（NITE　P-03555）を含む遺伝子組換体を用いる、請求項７記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。
  9. 　前記遺伝子組換体として、パエニバシラス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバシラス・マセランスI-6株（NITE　P-03556）又はパエニバシラス・マセランスI-7株（NITE　P-03557）の遺伝子組換体を用いる、請求項７記載のタンパク質を含むセルロース系繊維物を分解する方法。

     
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