CN109468351B - 高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其分别从已知的普罗托品‑6‑羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因及细胞色素P450还原酶基因中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因，然后对选出的最优基因进行密码子优化；再将优化基因序列构建到表达载体上，之后转入酵母工程菌中进行转化获得重组酵母工程菌株；最后用博落回的叶片原料液前体饲喂重组酵母工程菌进行发酵，即得。本发明从基因水平、发酵工艺等多方面上提高血根碱和白屈菜红碱的酶催化效率，利用博落回的非传统药用部位叶片原料液直接与工程菌进行发酵，将叶片中生物碱含量高的原阿片碱和别隐品碱转化成高价值的血根碱和白屈菜红碱，以实现博落回资源的综合利用。

Description

高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法

技术领域

本发明涉及血根碱和白屈菜红碱酶催化合成技术领域，具体涉及一种高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法。

技术背景

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)属于罂粟科博落回属植物，别名又叫号筒杆、落回、山号筒、山梧桐、三钱三等，生长于丘陵、低山、林边、草地、路旁，是一种野生草本植物。博落回主要分布于中国、东亚、北美洲和欧洲。博落回属植物包括博落回和小果博落回(M.microcarpa(Maxim)Fedde)两个种，作为一种传统中草药最早见于《本草拾遗》，在民间作为一种杀蛆青草药而广泛使用。随着研究的不断深入，发现博落回具有抑菌、抗炎、调节畜禽类肠道菌群等多重药理作用，博落回开始作为一种药源植物得到越来越广泛的应用。

博落回中含有的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱占博落回总生物碱的90％以上。现代药理研究表明原阿片碱、别隐品碱、白屈菜红碱和血根碱具有显著的生物活性，其中血根碱对治疗多种炎症有效，对畜禽类有较好的肠道菌群调节作用，目前已经作为饲用抗生素的替代品在欧洲等地区广泛销售。从2006年1月开始欧盟全面禁止在饲料中添加任何抗生素，导致血根碱的需求逐年增加。目前血根碱的主要来源是从博落回植株中提取，而博落回作为一种野生资源，这种获取方式导致其野生资源的存储量逐年减少。

现有的研究结果发现博落回的这4种主要生物碱在博落回中的分布呈现组织特异性。在成熟果荚中血根碱、白屈菜红碱占总碱的70％左右，原阿片碱和别隐品碱占30％左右；而在叶片中却相反，血根碱、白屈菜红碱占总碱的30％左右，原阿片碱和别隐品碱占70％左右。从生物合成途径上看(附图1)，原阿片碱和别隐品碱分别是血根碱和白屈菜红碱的前体物质，原阿片碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢血根碱(DHSAN)，然后二氢血根碱(DHSAN)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成血根碱(SAN)；别隐品碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)，然后二氢白屈菜红碱(DHCHE)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成白屈菜红碱(CHE)。

血根碱和白屈菜红碱是博落回提取物中最主要的有效成分，在果荚中含量仅为0.5～2％左右。而叶片中的总生物碱含量大约是果荚中的50％左右，生物学产量是果荚的一倍以上。目前博落回提取物绝大部分来源于野生资源的果荚，来源有限，血根碱含量低，从而造成血根碱价格昂贵，而限制了其产业的发展。另一方面，占总生物碱很大比例的前体类物质未转化完全，在提取过程中被当成废弃物未进行综合高效利用，导致资源的极大浪费。由于每提高0.1％植株中血根碱含量可降低10％的提取成本，而传统的栽培和育种进行改良所需周期长、受环境影响大、效率低、难以大规模种植和提升潜力有限，通过现代分子生物学技术体外构建工程化菌对前体物向终产物的有效转化是获得血根碱的新药源途径。

生物转化(biotransformation)也叫生物催化(biocatalysis)，是指利用微生物全细胞或提取酶作为催化剂对外源底物进行结构修饰或定向合成而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是生物体系中酶的催化反应。这种特定的酶催化反应具有以下特点：(1)具有高度的立体选择性。(2)反应条件温和，生产安全，不造成环境污染和后处理简单。(3)目标明确，副产物少，成本低。(4)微生物转化可以减少反应步骤。

本发明拟提供一种酵母工程菌高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，具体包括如下步骤：

S1、对参与血根碱和白屈菜红碱生物合成的基因进行密码子优化：首先根据血根碱和白屈菜红碱的生物合成途径，分别从已知的普罗托品-6-羟基化酶(P6H)、二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因及细胞色素P450还原酶(CPR)基因中通过异源表达和结果比对分析，分别筛选出表达效率高的最优基因，然后对筛选出的最优基因进行密码子优化；

S2、将优化后的基因序列构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中进行转化获得重组酵母工程菌株；

S3、将博落回的叶片原料液与步骤S3构建的重组酵母工程菌进行发酵，然后收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得血根碱和白屈菜红碱。

进一步地，

步骤S1中的最优基因包括普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因MC11229，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，MC11229进行密码子优化后的序列记为MC11229opt，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，

步骤S1中的最优基因还包括二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因MC6408，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；MC6408进行密码子优化后的序列记为MC6408opt，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，

步骤S1中的最优基因还包括黄瓜细胞色素P450还原酶基因CuCPR，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

进一步地，

步骤S2具体如下：

将博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt与辅酶基因CuCPR、二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因优化序列MC6408opt一起构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中，并进行转化，获得重组酵母工程菌株。

进一步地，

步骤S2中，所述表达载体的质粒选自PYES2。

进一步地，

步骤S2中，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

进一步地，

步骤S3中博落回叶片原液的制备方法如下：

(1)将博落回叶片放于35～45℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

(2)然后将制得的叶片粉末按比例加入一定体积pH＝8.0的TE缓冲溶液中，配置呈一定比例的缓冲液；

(3)最后将所述缓冲液先放入高压蒸汽灭菌锅中110～120℃灭菌25～35min或者放入超声波清洗器中超声25～35min，然后4500～5500rpm离心4～6min，上清液过0.2～0.25μm滤膜，即得。

进一步地，步骤S3中的发酵条件具体如下：

将上述方法制得的博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌；温度30°下，发酵培养24小时。

本发明的有益效果：

本发明将博落回中参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因MC11229，根据酵母菌偏爱的密码子，进行密码子优化后，然后将得到的优化序列，整合到酿酒酵母中进行异源表达实现血根碱与白屈菜红碱的微生物转化，与未经优化的功能基因相比，能极大提高其酶催化效率，提高催化产物二氢血根碱及血根碱的含量，降低二氢血根碱及血根碱的生产成本。

本发明将博落回中参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因MC6408，根据酵母菌偏爱的密码子，进行密码子优化后，然后将得到的优化序列MC6408opt，整合到酿酒酵母中进行异源表达实现血根碱与白屈菜红碱的微生物转化，与未经优化的功能基因相比，能极大提高其酶催化效率，提高催化产物二氢血根碱及血根碱的含量，降低血根碱的生产成本。

本发明构建的具有高效转化原阿片碱与别隐品碱生成血根碱和白屈菜红碱的酿酒酵母工程菌，以博落回非传统药用部位叶片的粉末为底物进行生物转化，同时还对工程菌的发酵条件进行了优化，实现博落回资源的综合利用，能为降低血根碱/白屈菜红碱的生产成本和工业化应用奠定基础。

由于，博落回叶片中原阿片碱与别隐品碱的含量大于血根碱与白屈菜红碱，而博落回提取物的主要有效成分是血根碱与白屈菜红碱。将博落回叶片原料液直接进行生物转化，使原料中的原阿片碱与别隐品碱转化成高价值的血根碱与白屈菜红碱，既可以提高血根碱与白屈菜红碱的含量，又可以省去传统提纯原阿片碱与别隐品碱的操作，从而降低血根碱和白屈菜红碱的生产成本，还可以实现博落回资源的综合利用，具有较高的应用价值。

综上，本发明从比较、筛选出参与合成血根碱与白屈菜红碱的最优功能基因，并且对筛选出的最优功能基因进行密码子优化，得到酶催化效率更高的基因优化序列，以期从基因水平上提高血根碱和白屈菜红碱的含量；同时将其构建到酵母工程菌中，并且对酵母工程菌的发酵条件进行了研究和优化，以期建立一个高产血根碱和白屈菜红碱的标准化微生物发酵工艺。最后，为实现博落回资源的综合利用，将博落回的非传统药用部位叶片原料液直接与工程菌进行发酵，将叶片中生物碱含量高的原阿片碱和别隐品碱转化成高价值的血根碱和白屈菜红碱具有较高的实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径；

图2为不同P6H基因催化产生二氢血根碱的含量结果图；

图3为优化前后的MC 11229基因催化产生二氢血根碱含量测定结果图；

图4为不同DBOX基因催化产生血根碱的含量结果图；

图5为优化前后的MC6408催化产生血根碱含量测定结果图；

图6为不同CPR基因催化产生二氢血根碱含量测定结果图；

图7为不同前体溶液催化效率比较图；

图8为不同底物浓度催化效率比较图；

图9为不同前处理条件下制得的博落回叶片原液与构建的不同重组酵母工程菌发酵培养合成血根碱的催化效率比较图；

图10为不同前处理条件下制得的博落回叶片原液与构建的不同重组酵母工程菌发酵培养合成白屈菜红碱的催化效率比较图。

具体实施方式

为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。

如附图1的博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径所示：普罗托品-6-羟基化酶(P6H)参与了血根碱(SAN)和白屈菜红碱(CHE)生物合成的步骤，其能催化别隐品碱(ALL)生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)以及催化原阿片碱(PRO)生成二氢血根碱(DHSAN)。由于P6H属于细胞色素P450氧化还原酶，作为一种单加氧酶，需要与细胞色素P450还原酶(CPR)共表达才能发挥蛋白催化作用，CPR在反应中起到传递电子的作用。二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因参与了血根碱(SAN)和白屈菜红碱(CHE)生物合成的步骤，其能催化二氢白屈菜红碱(DHCHE)生成白屈菜红碱(CHE)以及催化二氢血根碱(DHSAN)生成血根碱(SAN)。

一、筛选最优基因并对最优基因进行密码子优化

(一)P6H最优基因的筛选与优化

在本申请人之前的研究中，在以罂粟和花菱草的P6H基因序列为参照，在博落回转录组数据中进行同源比对后找到2个同源性较高的基因序列(编号为MC11229和MC11218，参照专利：CN106119265A，博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因)，并进行了酵母异源表达验证。

本发明首先通过酵母表达系统比较罂粟、花菱草和博落回中P6H基因的酶催化效率，筛选出最优的P6H基因，具体是分别将三个物种的P6H基因组合模式植物及拟南芥(A.thaliana)中的CPR(AtCPR)基因转入酿酒酵母中构建酵母工程菌。再通过饲喂底物(原阿片碱标准品)的方式，利用UPLC-QQQ MS定量分析比较最终获得的产物量(二氢血根碱)来比较酶催化效率。

1、基因的获得

PsP6H为罂粟(学名：Papaver somniferumL.)的P6H基因，EcP6H为花菱草(学名：Eschscholtzia californica Cham.)的P6H基因，基因PsP6H(GenBank KC154002)、PsCPR(GenBank KF661328)序列信息来源于NCBI，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

MC11229、MC11218为博落回的P6H基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3所示。按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取博落回总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

2、然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，引物序列表见下表1-1：

表1-1引物序列表

PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/LdNTP mix 0.4μl，0.5U/μL高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃2分30秒，35个循环；72℃10分钟。

3、表达载体构建：用限制性内切酶KpnI-HF、XBaI将载体质粒PYES2-Ura、PYES2-Leu回收产物分别进行双酶切，反应体系如下小表1-2：

表1-2双酶切反应体系

用限制性内切酶KpnI-HF、Sph-HF将载体质粒PYES2-Trp进行双酶切，反应体系如下1-3：

表1-3PYES2-Trp双酶切反应体系

将扩增得到的片段与具有对应氨基酸缺陷的载体(Invitrogen)PYES2连接，测序确认没有突变。

4、利用酵母表达系统验证上述各P6H基因的转化效率

将PYES2-Trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株MCY-3060；将重组质粒PYES2-Ura+MC11218，PYES2-Ura+MC11229，PYES2-Ura+PsP6H，PYES2-Ura+EcP6H分别和PYES2-Leu+AtCPR转入酵母(ivf)中，获得重组酵母工程菌株MCY-3061(PYES2+MC11218+AtCPR)、MCY-3062(PYES2+MC11229+AtCPR)、MCY-3063(PYES2+PsP6H+AtCPR)、MCY-3064(PYES2+EcP6H+AtCPR)。然后再分别在色氨酸(Trp)单缺陷以及亮氨酸(Leu)与尿嘧啶(Ura)双缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

诱导酵母表达蛋白，然后进行前体饲喂收集酵母，裂解后用甲醇抽提化合物,样品制备好后用UPLC-Q-TOF进行检测，测定结果如下表1-4及图2所示。

MCY-3060是转入空载体的酵母工程菌，作为空白对照。MCY-3060在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱和血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3061、MCY-3062、MCY-3063、MCY-3064均检测到了二氢血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表1-4二氢血根碱含量测定结果

通过比较PsP6H、EcP6H、MC11229和MC11218基因的酶催化效率，我们发现MC11229+AtCPR工程菌催化产生了最高含量的二氢血根碱91.143±52.096ng﹒mL-1。且博落回的MC11229基因的催化效率是PsP6H基因的9.6倍，是EcP6H基因的5.7倍，同时是MC11218基因的9.6倍。

5、最优P6H基因MC11229的优化

选取MC11229(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)作为最优基因，根据酿酒酵母偏爱的密码子，进行密码子优化后，得到基因优化序列MC11229opt，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

(1)制备博落回cDNA，然后利用正向引物和反向引物对基因进行PCR扩增，引物序列表见下表1-5：

表1-5PCR引物序列与产物长度

用限制性内切酶将载体质粒PYES2-Ura、PYES2-Leu、PYES2-His回收产物分别进行双酶切，PYES2-Ura、PYES2-Leu双酶切反应体系同表1-2，PYES2-His的双酶切反应体系见下表1-6：

表1-6PYES2-His双酶切反应体系

将扩增得到的片段与具有对应氨基酸缺陷的载体(Invitrogen)PYES2连接，测序确认没有突变。

将基因序列MC11229opt构建到表达载体上，并以优化前的基因序列MC11229为参照，按照同样的方法构建重组表达载体，获得重组表达载体PYES2-His+MC11229opt、PYES2-Ura+MC11229，同时还构建重组表达载体PYES2-Leu+CuCPR。

将重组表达载体PYES2-Ura+MC11229、PYES2-His+MC11229opt分别与PYES2-Leu+CuCPR转入酵母(ivf，购自Thermo Fisher Scientific公司)中，获得酵母工程菌株MCY-3072(PYES2-Ura+MC11229+CuCPR)MCY-3083(PYES2+MC11229opt+CuCPR)，同时还将PYES2-Trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株MCY-3060，作为空白对照；然后再分别在组氨酸(His)与Leu双缺陷以及Trp、Leu与Ura三缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时。

收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，即得样品。将制备好的样品用UPLC-Q-TOF进行检测，结果如下表1-6和图3所示。

本发明以MCY-3060作为空白对照，在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱和血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3072、MCY-3083均检测到了二氢血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。具体结果见表1-7：

表1-7优化前后的MC 11229基因二氢血根碱含量测定结果

上表1-7的结果以及附图3表明，MC11229opt+CuCPR工程菌催化产生的二氢血根碱含量比MC11229+CuCPR的高，优化后的基因MC11229opt相比优化前的基因MC11229使得催化产物的含量得到了提高。具体地，优化后的酵母工程菌MC11229opt+CuCPR使得二氢血根碱的含量从20.096ng﹒mL-1提高到了26.944ng﹒mL-1，提高了34％。

(二)DBOX最优基因的筛选与优化

二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)既可以催化二氢白屈菜红碱(DHCHE)生成白屈菜红碱(CHE)又可以催化二氢血根碱(DHSAN)生成血根碱(SAN)。本发明以PsDBOX、MC6408和MC6407基因为研究目标，分别与PsP6H和AtCPR转入酿酒酵母中构建酵母工程菌。再以原阿片碱为底物，与工程菌共同进行发酵培养后，利用UPLC-QQQ MS定量分析血根碱的含量，比较PsDBOX、MC6408和MC6407基因的酶催化效率。

1、基因的获得

PsDBOX为罂粟(学名：Papaver somniferumL.)的DBOX基因，PsDBOX序列信息来源于NCBI，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

MC6408、MC6407为博落回的P6H基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8所示。按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取博落回总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

2、然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，引物序列表见下表2-1：

表2-1PCR引物序列与产物长度

3、参照上述P6H最优基因的筛选与优化构建重组表达载体：

4、将重组质粒PYES2-Trp+PsDBOX，PYES2-Trp+MC6408，PYES2-Trp+MC6407分别和PYES2-Ura+PsP6H与PYES2-Leu+AtCPR转入酵母(ivf)中，获得重组酵母工程菌株MCY-3065(PYES2+PsP6H+AtCPR+MC6407)、MCY-3066(PYES2+PsP6H+AtCPR+MC6408)、MCY-30667(PYES2+PsP6H+AtCPR+PsDBOX)。然后再在Trp、Leu与Ura三个缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

诱导酵母表达蛋白，然后进行前体饲喂收集酵母,裂解后用甲醇抽提化合物,样品制备好后用UPLC-Q-TOF进行检测，测定结果如下表2-2及图4所示。

以MCY-3060作为空白对照，MCY-3060在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3065和MCY-3066均检测到了血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表2-2血根碱含量测定结果

上述结果表明：工程菌PsP6H+AtCPR+MC6408催化产生的血根碱含量最高，其计算得出博落回的MC6408基因的酶催化效率最高。

5、最优DBOX基因MC6408的优化

选取MC6408(其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)作为最优基因，根据酿酒酵母偏爱的密码子，进行密码子优化后，得到基因优化序列MC 6408opt，其核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。

(1)制备博落回cDNA，然后利用正向引物和反向引物对基因进行PCR扩增，引物序列表见下表2-3：

表2-3PCR引物序列与产物长度

3、参照上述P6H最优基因的筛选与优化构建重组表达载体。

4、将基因序列MC6408opt构建到表达载体上，并以优化前的基因序列MC6408为参照，按照同样的方法构建重组表达载体，获得重组质粒PYES2-Trp+MC6408、PYES2-Trp+MC6408opt，同时构建重组质粒PYES2-Leu+CuCPR、PYES2-Ura+MC11229；

将重组表达载体PYES2-Ura+MC6408、PYES2-His+MC6408opt分别与PYES2-Leu+CuCPR转入酵母(ivf，购自Thermo Fisher Scientific公司)中，获得酵母工程菌株MCY-3084(PYES2+MC11229+CuCPR+MC6408)、MCY-3085(PYES2+MC11229+CuCPR+MC6408opt)，同时还将PYES2-Trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株MCY-3060，作为空白对照；然后再分别在组氨酸(His)与Leu双缺陷以及Trp、Leu与Ura三缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时。收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，即得样品。

将制备好的样品用UPLC-Q-TOF进行检测，结果如下表2-3和图5所示：

以MCY-3060作为空白对照，在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱和血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3084、MCY-3085均检测到了血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。具体结果见表2-3：

表2-3优化前后的MC6408基因血根碱含量测定结果

上表2-3的结果以及附图5表明，工程菌MC11229+CuCPR+MC6408opt催化产生的血根碱含量比MC11229+CuCPR+MC6408高，优化后的基因MC6408opt相比优化前的基因MC6408使得催化产物的含量得到了提高。具体地，优化后的MC11229+CuCPR+MC6408opt酵母工程菌使得血根碱的含量从51.770ng﹒mL-1提高到了56.361ng﹒mL-1，提高了8.9％。

(三)最优CPR基因的筛选

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase,CPR)作为P450s电子传递链的重要功能单位，将电子供体NADPH的电子经过黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenosinedinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)2个辅基传递给P450s，在P450s介导的氧化还原反应中起限速作用，是氧化还原反应中的关键酶。找到能在酵母表达系统中高效表达的CPR基因对于提高血根碱的含量具有非常重要的意义。在本申请人之前的研究中在博落回转录组数据中找到2个CPR的基因序列(编号为MC19967和MC13802)，并且进行了酵母异源表达验证。

本发明以CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802基因为研究目标，与MC11229重新构建酵母工程菌后。再通过饲喂底物的方式，利用UPLC-QQQ MS定量分析比较最终获得的产物量来比较CPR的酶催化效率。

1、基因的获得

CuCPR为黄瓜细胞色素P450还原酶(Cucumis sativus Linn.CPR)(由合作团队中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄三文研究团队提供)；PsCPR为罂粟细胞色素P450还原酶；AtCPR为拟南芥细胞色素P450还原酶；Mc19967和Mc13802为博落回细胞色素P450还原酶基因。

CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10–14所示。PsCPR、AtCPR序列信息来源于NCBI，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。按照多糖多酚植物总

RNA提取试剂盒提取博落回总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

2、然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，引物序列表见下表3-1：

表3-1PCR引物序列与产物长度

3、参照上述P6H最优基因的筛选与优化构建重组表达载体。

将重组质粒PYES2-Leu+CuCPR，PYES2-Leu+PsCPR，PYES2-Leu+Mc19967，PYES2-Leu+Mc13802分别与PYES2-Ura+MC11229转入酵母(ivf)中，获得酵母工程菌株MCY-3072(PYES2+MC11229+CuCPR)、MCY-3073(PYES2+MC11229+PsCPR)、MCY-3074(PYES2+MC11229+Mc19967)、MCY-3075(PYES2+MC11229+Mc13802)，然后再在Leu与Ura双缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时。收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，即得样品。

将制备好的样品用UPLC-Q-TOF进行检测，结果如下表3-2和图6所示。

MCY-3060作为空白对照，在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3062、MCY-3072、MCY-3073、MCY-3074、MCY-3075均检测到了二氢血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表3-2不同物种CPR催化生成二氢血根碱含量结果

上述结果显示，MCY3072工程菌催化产生的二氢血根碱94.194±24.981ng﹒mL-1是MCY3062的4.3倍，是MCY3074的3.7倍，是MCY3075的1.9倍，是MCY3073的1.7倍。即MC11229+CuCPR工程菌催化产生了最高含量的二氢血根碱，催化效率最好。这表明，在此试验条件下，CuCPR和MC11229在酵母中有高效表达。

(四)以上述(一)、(二)、(三)分别筛选和/或优化后的基因MC11229opt、MC6408opt、CuCPR构建最佳酵母工程菌合成血根碱和白屈菜红碱。

MC11229opt、MC6408opt、CuCPR的引物设计参照上表1-5,2-3.

参照上述P6H最优基因的筛选与优化构建重组表达载体，将重组质粒PYES2-Ura+MC11229opt、PYES2-Leu+CuCPR、PYES2-Trp+MC6408opt转入酵母(ivf)中，获得最佳重组酵母工程菌株MCY-3092(PYES2+MC11229opt+CuCPR+MC6408opt)。

1、配置不同的前体饲喂溶液，筛选最佳发酵条件

培养液5000rpm离心5min，弃上清。

(1)加入2mL含有终浓度分别为10μM、100μM、1mM、2mM原阿片碱、pH＝8.0的TE缓冲溶液。每个样品平行重复3份。30℃振荡培养16h。

(2)分别加入2mL含有终浓度为10μM原阿片碱、pH＝5.8和pH＝8.0的TE缓冲溶液和2mL含有终浓度为10μM原阿片碱、pH＝5.8和pH＝8.0的SD/Dropout缺陷型半乳糖液体培养基。每个样品平行重复3份。30℃振荡培养16h。

加入上述配置的不同pH的TE缓冲溶液和SD/Dropout缺陷型半乳糖液体培养基的相同浓度原阿片碱后，温度30°下，发酵培养24小时；收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，制得样品；检测到的血根碱具体结果见表4-1和图7。

同上，加入上述不同浓度原阿片碱pH＝8.0的TE缓冲溶液后，检测到血根碱的具体结果见表4-2和图8。经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表4-1不同前体溶液血根碱含量测定结果

表4-2不同底物浓度血根碱含量测定结果

上述结果表明：以pH＝5.8和pH＝8.0的TE缓冲溶液为前体溶液时，在pH＝8.0的TE缓冲溶液中工程菌催化产生的血根碱含量较高；以pH＝5.8和pH＝8.0的SD/Dropout缺陷型半乳糖液体培养基作为前体溶液时，工程菌在pH＝8.0前体溶液中催化产生的血根碱含量较高。而在相同pH不同前体溶液的情况下，工程菌在TE缓冲溶液中催化产生的血根碱含量较高。因此我们可以得出工程菌在pH＝8.0的TE缓冲溶液中催化效率最高，是最佳的前体饲喂条件。

2、以博落回叶片原液饲喂上述构建的最佳酵母工程菌合成血根碱与白屈菜红碱。

博落回叶片中原阿片碱与别隐品碱的含量大于血根碱与白屈菜红碱，而博落回提取物的主要有效成分是血根碱与白屈菜红碱。将博落回叶片原料液直接进行生物转化，以使原料中的原阿片碱与别隐品碱转化成高价值的血根碱与白屈菜红碱，一方面提高血根碱与白屈菜红碱的含量，另一方面省去传统提纯原阿片碱与别隐品碱的操作，从而降低血根碱和白屈菜红碱的生产成本，实现博落回资源的综合利用。

2.1博落回叶片原料液的前处理

(1)将博落回叶片放于40℃的恒温干燥箱中烘干，并用干磨机粉碎；

1)秤取0.5g粉末加入100mL pH＝8.0的TE缓冲溶液中；放入高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌30min。

2)秤取0.5g粉末加入100mL pH＝8.0的TE缓冲溶液中；放入超声波清洗器中超声30min。

(3)5000rpm离心5min，上清过0.22μm滤膜，备用。

2.2制备样品：菌株培养液5000rpm离心5min，弃上清；加入2mL 8.2.2中制备好的过膜上清液。每个样品平行重复3份，30℃振荡培养16h。

在相同条件下加入上述不同处理后的TE缓冲溶液，温度30°下，发酵培养24小时；收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，制得样品。MCY-3060作为空白对照，检测到的血根碱和白屈菜红碱含量可作为加入叶片粉末后的TE缓冲溶液中固有的血根碱和白屈菜红碱含量。加入MCY-3092工程菌后血根碱和白屈菜红碱的具体结果见表4-3、表4-4和图9、图10。经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表4-3植物组织发酵培养血根碱含量测定结果

编号	处理方式	血根碱含量(平均值±标准差)/ng·mL<sup>-1</sup>	转化率/％
				MCY3060	TE灭菌	25.445±2.789	/
MCY3060	TE超声	31.205±0.784	/
				MCY3092	TE灭菌	65.007±10.961	4.04
MCY3092	TE超声	85.415±11.887	6.40

表4-4植物组织发酵培养白屈菜红碱含量测定结果

上述结果表明：加入工程菌MCY-3092后，发酵液中血根碱的含量提高了约3倍，白屈菜红碱的含量提高了约2倍。不同叶片原料液前处理方式的结果表明，叶片原料液放入超声波清洗器中超声30min得到的血根碱和白屈菜红碱含量要高于在高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌30min的含量，并且工程菌在超声30min的叶片原料液中的催化效率也要高于高压蒸汽灭菌30min。

综上，本发明从比较、筛选出参与合成血根碱与白屈菜红碱的最优功能基因，并且对筛选出的最优功能基因进行密码子优化，得到酶催化效率更高的基因优化序列，以期从基因水平上提高血根碱和白屈菜红碱的含量；同时将其构建到酵母工程菌中，并且对酵母工程菌的发酵条件进行了研究和优化，以期建立一个高产血根碱和白屈菜红碱的标准化微生物发酵工艺。最后，将博落回的非传统药用部位叶片原料液直接与工程菌进行发酵，将叶片中生物碱含量高的原阿片碱和别隐品碱转化成高价值的血根碱和白屈菜红碱具有较高的实际应用价值，实现了博落回资源的综合利用。

以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。

序列说明：

SEQ ID No.1-5分别为MC11229、MC11229opt、MC11218、PsP6H、EcP6H的核苷酸序列；

SEQ ID No.6-9分别为MC6408、MC6408opt、MC6407以及PsDBOX的核苷酸序列；

SEQ ID10-14分别为CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802的核苷酸序列；

SEQ ID No.15-44分别为引物PsP6H-Ura-F、PsP6H-Ura-R、EcP6H-Ura-F、EcP6H-Ura-R、MC11229-Ura-F、MC11229-Ura-R、MC11218-Ura-F、MC11218-Ura-R、AtCPR-Leu-F、AtCPR-Leu-R、YES2-Detect-F、YES2-Detect-R、MC11229opt-His-F、MC11229opt-His-R、CuCPR-Leu-F、CuCPR-Leu-R、MC6408-Trp-F、MC6408-Trp-R、MC6407-Trp-F、MC6407-Trp-R、PsDBOX-Trp-F、PsDBOX-Trp-R、MC6408opt-Trp-F、MC6408opt-Trp-R、PsCPR-Leu-F、PsCPR-Leu-R、Mc19967-Leu-F、Mc19967-Leu-R、Mc13802-Leu-F、Mc13802-Leu-R的序列。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南美可达生物资源股份有限公司

<120> 高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法

<130> 20181123

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> MC11229序列

<400> 1

atggctgctc ttcttgcctt ggttttcctc tacaatttca tcatcatctg gagctcatcc 60

ccaagaacca ctatcaacgg taagaaacaa attaggaagg cacccatggc agccggcgca 120

tggccgattc ttggtcacct tcatttgttt ggatccggtg agctgcctca caaaatgctt 180

gcagccatgg ctgaaaagta tggctccgcc ttcatgatga agttcggtaa gcacacaaca 240

ctagttgtga gtgacacccg catagtaaaa gaatgtttca ctactaatga taccctcttt 300

gctaaccgtc cttcgaccac cgcctttgat ctcatgactt atgccaatga ttccgttgct 360

ttcacaccct atggtcctta ttggcgagag cttagaaaga tatccactct caaacttctc 420

tctaaccacc gtctccaggc catcaaggac gttcgagcct ccgaggtgaa cgtatgcttc 480

agggaactat acaatttatg caataagcag aataaaaatg atggagctga tcatgttttg 540

gtggatatga agaaatggtt tgaagaggtc tcaaacaacg tcgtgatgag ggtaatcgtt 600

gggagacaga acttcgggtc taagattgtg cgtggtgagg aggaggccgt caattacaag 660

aaagtcatgg atgaactctt acgacttgct agtctgtcta tgttatctga tttcgctcct 720

ttacttggtt ggttggatat tttccaagga aacatgagcg ccatgaaacg aaatgccaag 780

aaagtcgaca ccatacttga gggctggttg gaagagcata ggaataagaa gaagaagagc 840

tcatcatcat catcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatctgg tgagaatgac 900

caagacttca tggatgttat gttgtcgatt attgaggaga ccaagttgtc tggccgtgat 960

gctgatactg ttattaaagc tacttgcttg gccatgatca tgggtgggac agacaccacg 1020

gcggtgagtc taacatggat cgtctcttta ctgatgaaca atcgtcatgt actgaagaag 1080

gctagagaag aattggacgc gctcgtgggg aaggatagac aagtggaaga ttcagatttg 1140

aagaatttgg tgtacatgaa tgccatcgtc aaggaaacga tgcgattatt cccattgggt 1200

gctcttcttg aacgtgaaac caaggaggac tgtgaggttg gtgggttcca gctccaaggt 1260

ggttcgcgtt tactagtgaa tgtatggaag ttacagcgag accccaacgt gtggtcggat 1320

ccaacagagt ttagaccaga gagatttcta tcggagaatg cggatataga cgtcgggggt 1380

caacatttcg aactactacc atttggggcc ggtagaaggg tgtgcccggg agtgtcgttc 1440

gcgctccaat tcatgcattt ggtactggct cgtctcatcc atggctatga attgggaacc 1500

cagaatgatg aggatgtgga tttaactgag agcacagaag gacatgttaa ccacaaagca 1560

tcccccctcg atctcatcct caccccacgc ctccatccca agctttatga gtattag 1617

<210> 2

<211> 1617

<212> DNA

<213> MC11229opt序列

<400> 2

atggcagctt tgttggcttt ggtcttttta tacaatttta ttattatttg gtcttcttca 60

ccaagaacta ctattaatgg taaaaagcag attagaaaag ctccaatggc tgctggtgct 120

tggccaattt tgggtcactt gcacttgttc ggttcaggtg agttgccaca caagatgttg 180

gcagctatgg ctgaaaaata tggttctgct tttatgatga agtttggtaa acatactaca 240

ttggtcgttt cagacacaag aattgttaaa gaatgtttta ctactaatga tacattgttt 300

gctaacagac catctactac tgctttcgat ttgatgactt atgctaatga ttctgttgct 360

tttactccat atggtccata ttggagagaa ttgagaaaga tttctacatt gaaattgttg 420

tcaaaccata gattgcaagc aattaaggat gttagagctt ctgaagttaa tgtttgtttt 480

agagaattat ataatttgtg taataaacaa aacaaaaatg acggtgctga tcatgttttg 540

gtcgatatga aaaagtggtt tgaagaagtt tctaacaatg ttgttatgag agttattgtt 600

ggtagacaaa attttggttc taaaattgtt agaggtgaag aagaagcagt taattacaaa 660

aaagttatgg atgaattgtt gagattggct tcattgtcta tgttgtctga cttcgctcca 720

ttgttgggtt ggttggatat ttttcaaggt aacatgtctg ctatgaaaag aaatgctaaa 780

aaagttgata caattttgga aggttggttg gaggaacata gaaataagaa aaagaagtct 840

tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcatcttctt cttcttcagg tgaaaatgat 900

caagatttca tggatgttat gttgtctatt attgaagaaa ctaagttgtc tggtagagat 960

gctgatactg ttattaaagc tacttgtttg gctatgatta tgggtggtac tgatactact 1020

gctgtttctt tgacttggat tgtttctttg ttgatgaata atagacatgt cttgaagaag 1080

gctagagagg agttggacgc tttggtcggt aaagacagac aggtcgagga ctcagacttg 1140

aagaacttgg tttatatgaa tgctattgtt aaagaaacta tgaggttgtt cccattgggt 1200

gctttgttgg agagggaaac taaggaggac tgcgaagtcg gtggtttcca gttgcagggt 1260

ggttctaggt tgttggtcaa tgtctggaag ttgcaaaggg acccaaacgt ctggtctgat 1320

ccaactgagt tcaggccaga gaggttcttg tctgagaacg ctgatattga cgtcggtggt 1380

cagcactttg agttgttgcc attcggagct ggtagaaggg tctgtccagg tgtctctttc 1440

gctttgcagt tcatgcactt ggtcttggct aggttgattc atggttatga attgggtact 1500

cagaatgacg aggacgtcga cttgactgag tcaacagagg gtcacgtcaa tcacaaggct 1560

tctccattgg atttaatttt gactccaaga ttacatccaa aattgtatga atattaa 1617

<210> 3

<211> 1644

<212> DNA

<213> MC11218序列

<400> 3

atggaatatt catcccttct aactctccag tatggctgct ggtttgctcc atccatggct 60

gctgcccttc ttgccttagt ttttctctac tacaatctct tcttggcttc tccaaaaact 120

accaacaaga aaataattaa taagaaatta ttaccaccca tggcaacagg tgcatggcca 180

attcttggtc atctccatct gtttaaagag ggtgagttgc ctcaccacat gcttaaatcc 240

atggctgata agtacggccc tgccttcctc atgaatttcg ggcaacaccg atccctcgtt 300

gtgagcgatc atcgcttcgt taaagaatgt ttcactacta atgacacctt gttttgtaac 360

cgtccatcca ccacagcctt cgatgtcatg acttacgcca atgactcggt agctttcaca 420

ccttacagtc cttactggcg ggagcttaga aagatatcca ctctcaaact tctctctaac 480

caccgcctcc aggccatcaa gaacctccga gaaggggagg tgaatgtatg cttcaggggg 540

ttgtatgatt tatggaagaa taataaaact gatgagcagg gtgtcgtggg tgatgaacga 600

gcagctccgg ttttggtcga tatgaagaaa tggttcgaag aggtggcaaa caatgtagtg 660

attagagtaa tcgtgggtaa acataatttt gggactaaga ttgtgaatgg tgaaaaggag 720

gctgtcgaat acaagacaat catggatgag ctcttacgtc tcgctagtct atctttgtta 780

tccgatttcg cccctttact tggttggttt gatctcttcc aagggcacgt tcgcaccatg 840

aaacgaaatg gcaagaaact agacgttcta cttcaaaagt ggttggagga gcatcggaac 900

aagacgagct cacccgagga tgagcaagac ttcatggatg ttatgttgtc gatcgtcgag 960

gagagcaaac tgtctggcca cgacgctgat accgtcatta aagctacttg cctggccatg 1020

atcatgggtg ggacagacac cacggcggtg agtctaacat ggatcgtctc tttactgatg 1080

aacaatcgtc atgcactgaa aaaggctcga gaagaattag acgcgcatgt agggaaggat 1140

agacaagttg aagattcaga tttgaagaat ttggtttact tgaatgccat cgttaaggaa 1200

acgatgcgat tatacccact gggtactctt cttgaacgtg aaaccaagga agattgtgag 1260

gttggtgggt tccagctcca agccggcacg cgtttactag ttaacatatg gatggtacaa 1320

cgagacccag ccgtgtggac tgatccaaca aaatttatac cggagaggtt cctaacggag 1380

aaggcggaca tagacgtcgg gggtcagcat ttcgaactta taccattcgg ggcgggtaga 1440

agggtgtgcc ccggggtgtc cttcgcactc caattcctac atttggtatt ggctcgactc 1500

atccatgggt atgaattggg aaccctaaat gatgaagatg tggacctaac tgagagcaca 1560

gaaggacatg ttaaccacaa agcatcccct ctcgatctcc tcctcacccc acgcttcagc 1620

aaccctaagc tctatgatta ttaa 1644

<210> 4

<211> 1626

<212> DNA

<213> PsP6H序列

<400> 4

atggatttct catcactact attactactt ctaaacacat ggatttcagc ttattccatg 60

gctgctcttc ttgccttagt tcttgtctac aatctcagga tgacgaagtc atcatcttcc 120

aaaaccactt ctctgaaggg caagaagatt attactaggc caccagcagt aacaggcgca 180

tggccggttt ttggtcacct gcatttgttt ggatcaggtg agcatccaca tgagatgttg 240

tcaaagttgg cagaaaaata tggaccttcc tttacaatga agttcgggaa gcacacaaca 300

ctagttgtga gcgatacccg agtcgtcaaa gaatgtttta caactaatga taccctcttc 360

tccaaccgcc catccaccat agctttcgat cttatgactt atgcaaccga ctccatagct 420

ttcactcctt atagtcctta ctggcgtgaa ctcaggaaga tatctactct caaacttctc 480

tctaacaacc gtcttgaatc gatcaaacaa cttcgaacct cagaggtgag cgtatgcttc 540

aaggaactat acgacctaac caacaaaaaa aacgataacg gagctccagt tccaatcgat 600

ttgaagagat ggtttgatga ggtttcaaac aatgtaatta tgagagtaat ctttgggaaa 660

caaaattttg gatccaagat tgtactcggg gaagatcaag aggcagtcca ttataaaaaa 720

atcatggacg aactttcacg tctttctagt ttgactatgt tgtcggacat ggttccttta 780

cttggttggt tggattactt caaaggcgat ttgagggcaa tgaaacgaaa cggcaaagaa 840

cttaactcca tactccagaa atggttggag gaacataaaa gcaagaaaag ttcagatgct 900

cgacaagatt tcatggatgt tatgttgtca atttccaagg acacccaact ctatggccac 960

gaccaagata cttttattaa agctacttgt cttgccatga tcatgggtgg aacaaacagt 1020

acggaagtgg ctctaacatg gatcttgtcc ttacttatga acaacagatg cgcattgcat 1080

aaggctcgag aagaaataga cttactcgtt gggaaggata gacaagtgga agattcagat 1140

gtcaagaatt tgacatacat gaatgccatc attaaagaaa caatgcgatt atacccatta 1200

ggttttcttc tagaacgcga taccaaggaa gactgtgaag ttagcgggtt caacatcaaa 1260

ggtggtacaa gattactgat aaatgtgtgg aagttacaac gagacccgaa cgtgtggaca 1320

gaccccatgg aattcaaacc agagagattt ctaacagaga atgcagacat agatgttggt 1380

ggtcaacatt tcgaactact gccatttggt gctggtagaa gggtgtgtcc tggtgtgtcc 1440

ttcgcactac agttcatgca tttggttctc gcccgtctta tccatggcta tgatatggaa 1500

accctaaatg gtgaagatgt tgatttgagt gttagtagcg ggggacatgt taacatcaaa 1560

tcaaccccac ttgagctcat ccttactcct cgccttcacc cagagcttta cgattgtgaa 1620

acataa 1626

<210> 5

<211> 1575

<212> DNA

<213> EcP6H序列

<400> 5

atggattcct taatgcttgc ttatttgttt ccaatttcag ttgcttctat tattgctttt 60

gttttcctct acaatctctt ttcttcaaga actcttaaaa ataagaagat taggacagca 120

cccatggcaa caggtgcttg gcctgttctt ggtcatctcc atctctttgg ttctggtgaa 180

ttgcctcata aaatgttagc tgccatggct gacaagtatg gctcagcctt caggatgaag 240

ttcggtaaac acacaacact agttgtgagt gatacccgta tcgttaaaga atgtttcact 300

accaacgata ccctcttctc taaccgtcct tccactaaag cttttcaact catgacttac 360

gataatgagt cggttgcctt tacaccttac ggttcttact ggcgcgagat tagaaagata 420

tccactctta aacttctatc caaccatcgt ctccaagcca tcaaggacgt aagagcctcg 480

gaggtaaacg tctgcttcaa aaccttatac gaccagtgta agaatccaag tggatcagct 540

cctattttga tcgatatgaa gaaatggttc gaagaggtct cgaacaacgt ggtgatgagg 600

gtaattgtgg ggagacaaaa ctttgggtct aagattgtgc aaggtgagga ggaagctatc 660

cattacaaga aggtcatgga tgagctctta cgtctcgcta gcttgtctat gttctcggat 720

tttgctcctt tacttggttt cgtggacatc tttcaaggaa acttgagtgc catgaaacga 780

aacgccaaga aggtagatgc aatcctggag aactggttgg aagagcatcg caagaagaag 840

aactcagttg ctgaaagcca gcaagatttc atggatgtta tgttgtcgat tgttgaggag 900

agcaagttgt ctggtcacga tgctgatgcc gtaattaaag ctacttgtct agccatgatc 960

atgggcggaa cagataccac agcagtgagt ctaacatgga tcatttcttt attaatgaat 1020

aatcgtcacg ctttgaagaa agctcgagaa gagttagatg cactagtagg aaaggacaga 1080

caagttgaag attcggattt gaagaattta gtttacatga atgctattgt taaggaaaca 1140

atgagaatgt acccattagg tactcttctc gaacgtgaga ctaaggagga ttgtgagatc 1200

gacgggtttc atgtcaaagg tgggactagg ttgctagtga atgtgtggaa gttgcaacga 1260

gacccaaatg tatgggttga tccaacagaa tttagacccg aaagatttct aacggagaat 1320

gcagatatag atgttggagg tcagcatttt gagttgctac catttggagc aggacgaagg 1380

gtgtgccctg gggtgtcgtt tgcactacaa ttcatgcatt tagtacttgc tcgcctcatc 1440

catggatacg atttgaatac tctaaacgaa gaaaatgtgg atctgacgga gagcccagaa 1500

ggacatgtga accacaaagc atcgcctctt gatctcatcc tcacccctcg tctacattac 1560

aagttgtacg aatag 1575

<210> 6

<211> 1584

<212> DNA

<213> MC6408序列

<400> 6

atggggtact tctcaagatc atctgcaatc ctctcaatct tttctttcct tgtcttctca 60

gcttctttgg gaatttcgag ttcagctcgc gacgactttg ttcaatgtct ttccctccaa 120

caaccttcca tcccagtccc tatctacaca ccaaacacca cgaattatac aacacttttc 180

agatcctctg cacgaaacct tagatattta tctaacactt ctcttacacc tgaagttatt 240

attacaccta cccatgaatc ccatgttcaa gcagctgtta tttgctgtaa gaaacatggg 300

ttagacctca aagttcgaag cggtggccat gatgtcgaag gcctctctta tgcatccgat 360

aaaccatttg ttatcgttga cttggtcgat tatagaaacg tcaccgttga tctaaaagac 420

aacactgcat gggtccaagc tggtgcttcc cttggggaag tttattatag aattggagag 480

aagagcaaga cccttgggtt cccagccggg ttttgcccca ccgttggtgt tggtgggcat 540

attagtggag gtggattcgg tgctttggtg cgaaaatatg gccttgcatc tgatcaagtc 600

attgatgctt acatagtcac tgttgatggc aagattctta acaaagaaac aatgggagaa 660

gatctatttt gggccattag aggtggggga gcatcgagct tcggagttat tctctcatgg 720

aaaatcaaat tggttcctgt tccacctatt gttactgttg ccacggtcga tagaacctta 780

gaacaaggag caacaggcct tgttcataag tggcaatata tcgccgataa actcgatgca 840

gacctctaca tggcgcccac atttactgtg gttaattcta gtagacaagg tgagaaaacg 900

gtgcaagctc aattctcctt cttgttcctt ggcggtgttg acaagctcct ccaaatcatg 960

gaagctaact tccctgaatt gggtttgaag agaaacgaca ccatggaaat gagttgggtc 1020

gaatctcatg tctatttcta caggcgtgga agtccattag aacttctatt ggacagagat 1080

cctataatga agagcttcct caaagtaaaa tctgactatg taaaggaacc aatatcagaa 1140

gctggattag aagagatatg gaaaaggtat atcgaaggag atgcaccagc aatgctattc 1200

actccttttg gtggaaggat gaatgagatc tctgagtttg cacttcctta cccacataga 1260

gccggaaaca tatacaatat tatgtacgtc tcgaactggc tacaagaaag tgaatcagaa 1320

aaacagttag actggttgcg aaaattctac agtttcatgg gtcaatatgt ttctaagttc 1380

ccaagaagtg catatctcaa ctacaaggat cttgacttgg gagtaaataa caaccaggat 1440

ggtatctcag gttacttaaa tgcgaaaatt tggggaacta aatactttaa gcttaacttc 1500

gagagattgg tacttgtgaa gaccacggtt gatcctgaaa atttcttcaa gaacaaacaa 1560

agtattccat ccattacttc atag 1584

<210> 7

<211> 1584

<212> DNA

<213> MC6408 opt序列

<400> 7

atgggttatt tttctagatc ttctgctatt ttgtctattt tttctttttt ggttttttct 60

gcttctttgg gtatttcttc ttctgctagg gatgacttcg tccagtgctt gtctttgcag 120

cagccatcta ttccagttcc aatttatact ccaaatacta ctaattatac tactttgttt 180

agatcttctg ctagaaattt gagatatttg tctaatactt ctttgactcc agaagttatt 240

attactccaa ctcacgaatc tcacgtccaa gctgctgtta tttgttgtaa aaaacatggt 300

ttggacttga aggttagatc tggtggtcac gacgtcgaag gtttgtctta cgcttcagat 360

aaaccatttg ttattgttga tttggttgat tatagaaacg ttactgttga tttgaaagat 420

aacactgctt gggtccaagc aggtgcttct ttgggtgaag tttattatag aattggtgaa 480

aaatctaaga ctttgggttt cccagctggt ttctgtccaa ctgttggtgt cggtggtcac 540

atttctggtg gtggtttcgg tgctttggtc aggaagtacg gtttggcttc tgaccaagtt 600

attgatgctt atattgttac tgttgacgga aaaattttga ataaagaaac tatgggtgaa 660

gacttgttct gggctattag gggtggtggt gcttcttctt tcggtgtcat tttgtcttgg 720

aagattaagt tggtcccagt cccaccaatt gtcacagtcg ctactgtcga caggactttg 780

gagcaaggtg ctactggttt ggttcataaa tggcaatata ttgctgataa attagatgct 840

gatttgtata tggctccaac ttttactgtt gttaactctt ctagacaagg tgaaaaaact 900

gttcaagctc aattttcttt cttgtttttg ggtggtgttg ataaattgtt gcaaattatg 960

gaagctaact tcccagaatt aggtttgaag agaaacgata caatggaaat gtcttgggtt 1020

gaatctcatg tttattttta tagaagaggt tctccattgg aattgttgtt ggacagagat 1080

ccaattatga aatcattttt gaaagttaaa tcagattatg ttaaggaacc aatttcagaa 1140

gctggtttgg aagaaatttg gaagagatac attgagggtg acgctcctgc tatgttgttc 1200

actccattcg gtggtagaat gaatgaaatt tctgagttcg ctttgcctta cccacacaga 1260

gctggtaaca tttacaatat tatgtatgtt tctaattggt tgcaagagtc tgaatctgaa 1320

aaacaattag attggttgag aaaattttat tcttttatgg gacaatatgt ttctaaattt 1380

ccaagatctg cttacttaaa ttataaagat ttggatttgg gtgtcaataa taatcaagat 1440

ggtatttctg gttacttgaa cgcaaaaatt tggggtacta agtattttaa attgaatttt 1500

gaaagattgg ttttggttaa aactactgtt gatccagaaa acttttttaa aaacaagcaa 1560

tctattccat ctattacttc ttaa 1584

<210> 8

<211> 1575

<212> DNA

<213> MC6407序列

<400> 8

atggggttct caaaatctgc aatactttct atcttttctt tccttgtgtt ctcagcttct 60

ttagccattt caagttcagc tcgtgacgac tttgttcaat gtctttccct tcaaaaacct 120

tctgtcccag tgcctatata cacccctaac acggcgaatt atacaacagt tttcagatcc 180

tcagtacgaa acctcagata catatcgaac acttctctta cacctgaagt tattattaca 240

cctacccatg aatcccatgt tcaagcagct gttatttgct gtaagaaaca tgggttagac 300

ctcaaagttc gaagcggtgg ccatgacgtc gaaggcctct cttatgcatc cgataaacca 360

tttgttatcg ttgacttggt cgattataga aacgtcaccg ttgatctaaa agacaacact 420

gcatgggttc aagccggtgc ttccctcggg gaagtttatt atagaatcgg agagaagagc 480

aagacccttg ggttcccagc cgggttttgc cccaccgttg gagttggtgg acatattagt 540

ggaggtggat tcggtgcctt ggtgcgaaaa tatggccttg catctgatca agtcattgat 600

gcttacatag tcactgttga tggcaagatt cttaacaaag aaacaatggg agaagatcta 660

ttttgggcca ttagaggtgg gggagcatcg agcttcggag ttattctctc atggaaaatc 720

aaattggttc ctgttccacc tattgttact gttgccacgg tcgatagaac cttagaacaa 780

ggagcaacag gccttgttca taagtggcaa tatatcgccg ataaactcga tgcagacctc 840

tacatggcgc ccacatttac tgtggttaat tctagtagac aaggtgagaa aacggtgcaa 900

gctcaattct ccttcttgtt ccttggcggt gttgacaagc tcctccaaat catggaagct 960

aacttccctg aattgggttt gaagagaaac gacaccatgg aaatgagttg ggtcgaatct 1020

catgtctatt tctacaggcg tggaagtcca ttagaacttc tattggacag agatcctata 1080

atgaagagct tcctcaaagt aaaatctgac tatgtaaagg aaccaatatc agaagctgga 1140

ttagaagaga tatggaaaag gtatatcgaa ggagatgcac cagcaatgct attcactcct 1200

tttggtggaa ggatgaatga gatctctgag tttgcacttc cttacccaca tagagccgga 1260

aacatataca atattatgta cgtctcgaac tggctacaag aaagtgaatc agaaaaacag 1320

ttagactggt tgcgaaaatt ctacagtttc atgggtcagt atgtttctaa gttcccaaga 1380

actgcatatc tcaactacaa agatcttgac ttgggtgtca ataacaagga tggtgtcttc 1440

agttacttag atgccaaggt ttggggaatt aaatacttca agcttaacta cgaaagattg 1500

gtacttgtaa agaccacagt cgatcctgat aatttcttca agaacaaaca aagcattcca 1560

tccattactt cttag 1575

<210> 9

<211> 1614

<212> DNA

<213> PsDBOX序列

<400> 9

atgatgatga gttcatctaa tattctcccc ttagttacat tccttgtatt agtattcttc 60

tcaagtggtt cttgggcagc taataattca cttaatggag attttctcca atgcattaag 120

aagaatgagt actcctcaat tccaatccca atttttacac ctgataattc ttcatttaca 180

actatctttc ggtcttcggc tcggaacctt agatttctaa cacccaactc aacacaaaca 240

cctcagttta taatcacacc aacccatgaa tctcatgttc aatcagctgt tgtttgttct 300

caaaaacatg ggtttgatct taaagtacga agtggtggtc atgacgtcga aggtttatct 360

tacgtatctg acacgccata cgtcttggtc gacttaatta attttcgaaa cattattgtt 420

gatttgaaag aaaagactgc atggattcaa gctggtgctt cacttggaga ggtttattat 480

caagctgcaa acaagagcaa caacaccctt ggatttccgg caggattttg tcctactgta 540

ggtgttgctg gacacattag tggaggtggg tttggtgcct tggtacgaaa atatggcctt 600

gcgtcagacc aggtcattga tgctcgcatt gtcactgttg acggcaaaat ttacaccaaa 660

gaaaccatgg ggaaagatct gtattgggct attagaggag gtggtgctaa taactttgga 720

gtgcttcttt cctggaaggt caagttggtt cctgtcacac ccgtcgtgac tgttgctacg 780

atcagcagaa cattagaaca aggtgccacg gacctagttc ataagtggca atttgttgcc 840

gatagactcc acgaggacgt atacattggg ctcacatttt cggtcgctaa ctctagccga 900

gcaggaggaa aaacggtatc agttcaattc gcgttcttgt tcttaggagg cagtgacaga 960

cttcttgaac tcatggagga gagcttccct gaattgggtt tgaagcgaaa tgaaactact 1020

gaaatgaaat gggttgaatc tcatgtatac ttctacgcac gaggtagacc aatcgagcta 1080

ttatgggata gagatcatgc aacaaagagt ttcctaaaaa taaaagctga ttacgtgagg 1140

gaaccaatat caaaatccgg tttagaagct atttggagaa ggtttgtagg aggagattca 1200

ccagcaatgt tatggactcc ttttggtggt agaatgaacg agatttcgga atttgaaact 1260

ccttacccac atagagctgg caatatttac aacattatgt acgtcggaaa ttggatgaat 1320

gagactgaat cagagaagca gattgattgg atgagaaggt tttataactc catggctcgt 1380

tatgtttcca agaatccaag atcagcatat atcaactaca aagatctcga cttaggagtt 1440

aaccgtaaca acgttagcga ggcggtgggg tacgtacaag caagatcatg gggtagaaaa 1500

tacttcaaaa gtaactttga aagattagtc aaagttaaga gcatggttga tcctggtaat 1560

ttcttcaaga acaaacaaag tattcctcct gttagtactt ggggcaagca gtag 1614

<210> 10

<211> 2127

<212> DNA

<213> CuCPR序列

<400> 10

atgcaatcgg aatccagttc tatgaaggct tctccatttg acttcatgtc ggctataatt 60

aagggcagga tggatccgtc taattcttca tttcaatcga ctggcgaggg tgcctcagtt 120

attttcgaga atcgcgagct ggttgcgatc ttaactacct cgatcgctgt catgattggc 180

tgctttgttg ttcttgtgtg gcgaagatcc ggaaatcgaa aagttaagac tatagagctt 240

cctaagccgt tgcttgggaa ggagccagag ccagaagttg acgacgggaa gaagaaggtt 300

acgatattct ttggtacgca gactggtact gctgaaggct ttgcaaaggc tctatctgac 360

gaggcgaaag cacggtacga taaggccaag tttagagttg ttgatttgga tgattatggg 420

gctgacgaag atgaatacga acaaaaattg aaaaaggagt ctgtagctgt tttcttcttg 480

gcaacgtatg gcgatggaga gcccactgat aatgccgcaa gattctataa atggttcacc 540

gagggtaaag agagagggga atgtcttcag aacctcaatt atgcagtctt tggccttggc 600

aaccgacaat atgagcattt taataagatt gcaaaagtgg ttgatgagct gcttgagact 660

cagggtggta agcgccttgt aaaagttgga cttggagatg acgatcagtg catagaggat 720

gacttctctg cttggcgaga atcattgtgg cctgagttgg atcaattgct tcgggatgag 780

gatgatgcag caactgtgac cacaccttac acagctgcca tatcagaata ccgagtggta 840

ttccatgatc cttcagatgt aactgatgac aaaaagaact ggatgaatgc aaatggtcat 900

gctgtacatg acgcacaaca tccattcaga tctaatgtgg ttgtgagaaa ggagctccat 960

acacctgcgt ctgatcgttc ttgtactcat ctagagtttg atatttctga gtctgcactc 1020

aaatatgaaa caggggatca tgttggtgtt tactgtgaaa atttaaccga gactgttgat 1080

gaggctctaa atttattggg tttgtctcct gaaacgtatt tctccattca tactgataat 1140

gaggatggca cccaactagg tggaagctct ttaccacctc cttttccatc ctgcaccctc 1200

agaacagcat tgactcgata tgcagatctt ttaaattcac ccaaaaagtc agcattgctc 1260

gcattagcag cacatgcttc aaatcctata gaggctgacc gattaagata tcttgcatca 1320

cctgctggga aggatgaata ttctcagtct gtggttggta gccagaaaag cctgcttgaa 1380

gtcatggctg aatttccttc tgccaagcct ccacttggtg tcttctttgc agctgttgca 1440

ccacgtttac agcctcgatt ctactccata tcatcatctc caaggatggc tccatctaga 1500

attcatgtta cttgtgctct tgtctatgac aaaatgccaa ctggacgtat tcataaagga 1560

atttgctcta cttggatgaa gaattctgtg cccatggaga aaatccatga gtgcagttgg 1620

gctccaattt ttgtgaggca atcaaacttc aagcttcctt ctgatagtaa agtgcctatt 1680

atcatggttg gtcctggaac tggattggct cctttcagag gtttcttaca ggaaagatta 1740

gctttgaaag aatctggagt agaattgggg ccttccatat tgttctttgg atgcagaaac 1800

cgtgcaatgg attatatata cgaggatgag ctgaacaact ttgtcgagac tggtgctctc 1860

tccgagttgg ttatcgcctt ctcgcgtgaa ggtccaacga aagaatacgt gcaacataaa 1920

atgacagaga aggcgtcaga catctggaat ttgatatcac aaggtgctta cttatatgta 1980

tgcggtgatg caaagggaat ggctagagac gtccacagaa ctctccacac catcgtgcaa 2040

gaacagggat ctcttgacag ctcgaaagct gagagcatgg tgaagaatct acaaacgagc 2100

ggaaggtatc tgcgtgatgt gtggtga 2127

<210> 11

<211> 2052

<212> DNA

<213> PsCPR序列

<400> 11

atggggtcaa acaacctggc aaactctatc gagtctatgc ttgggatatc tattggaagt 60

gaatacattt cagatcctat ctttatcatg gtaaccaccg tggcttctat gctaataggc 120

tttgggtttt tcgcatgcat gaaaagttcc tcatcacaat caaaacctat tgaaacatac 180

aaacctatca ttgataagga ggaagaggaa atcgaagtcg accctgggaa gataaagctc 240

acaatctttt tcgggacaca aacaggaaca gctgaaggat tcgcaaaggc cttggctgaa 300

gagatcaaag ctaagtacaa aaaggccgtg gttaaggtgg ttgaccttga tgattatgcc 360

gcggaggatg atcagtacga ggaaaaactc aaaaaggaaa gtctcgtgtt tttcatggtt 420

gctacttatg gggacggaga accaacggat aatgccgcaa gattctacaa gtggtttact 480

caagagcacg aaagaggtga atggttacaa cagctgactt atggtgtatt cggcttgggt 540

aatagacaat acgaacattt caataagatt gcagtagacg ttgatgaaca attaggaaag 600

caaggcgcaa agagaatagt tcaagtaggt ttaggtgacg atgatcaatg tatcgaagat 660

gatttcacag catggagaga actcttatgg actgaactag accagcttct caaggacgaa 720

gatgccgctc cttctgtcgc tactccatac attgcaacag taccagagta cagagtcgtt 780

attcatgaaa ccactgttgc ggctctagat gataagcata tcaacacagc caacggagat 840

gttgcgttcg atattctgca tccatgtaga acgattgttg cacaacagag agaacttcat 900

aagccaaagt ccgaccgaag ctgcattcac ttggaatttg atatctctgg ttcctccttg 960

acatacgaaa ctggtgatca tgtaggagtt tacgcggaaa actgtgacga gactgtcgag 1020

gaagcaggaa agttattggg ccagccactt gatttgttat tctctatcca cacggataaa 1080

gaggacggtt ctccacaagg ttcatcttta cctcctccat tccctggtcc atgtacttta 1140

cgtagtgctc tagcaagata cgcagactta ttgaatccac cacgtaaggc ctctctaata 1200

gctctttctg ctcatgcctc tgttccatca gaggctgaaa gactaaggtt tttgtcatct 1260

ccattgggca aaaacgaata ctcaaaatgg gtagtaggct ctcaaagatc attgttagag 1320

attatggctg aatttccatc tgctaagcct cctttgggtg tgtttttcgc tgctgttgca 1380

cctcgactac caccaagata ctatagcatt tctagttctc caaagtttgc tccatccaga 1440

atacatgtta catgcgccct ggtatatggt caatcaccaa ctggtagagt ccacagggga 1500

gtctgcagca cgtggatgaa gcacgccgtt cctcaagata gttgggctcc tatcttcgtt 1560

agaacttcca atttcaagtt accagccgac ccaagtaccc caatcatcat ggtgggacca 1620

ggtacaggcc tagctccatt tcgaggcttc ctccaagaga gaatggcttt gaaagagaac 1680

ggtgcgcaac ttggccctgc cgttttgttt ttcggatgta ggaacagaaa catggatttc 1740

atatacgaag atgaacttaa caatttcgtc gaacgtggtg tcatttctga gctagtaatc 1800

gccttctcaa gagagggtga gaaaaaggaa tatgtgcaac acaagatgat ggaaaaagct 1860

accgatgttt ggaatgttat ctctggggat ggttatctgt acgtctgtgg cgatgcaaag 1920

ggcatggcta gagatgtcca tagaacactg cacacaattg ctcaagagca aggtccaatg 1980

gaatcatccg ccgcagaagc agcagtcaaa aagttacaag ttgaagagag atacttgaga 2040

gatgtatggt aa 2052

<210> 12

<211> 2079

<212> DNA

<213> AtCPR序列

<400> 12

atgacttctg ctttgtatgc ttccgatttg tttaagcagc tcaagtcaat tatggggaca 60

gattcgttat ccgacgatgt tgtacttgtg attgcaacga cgtctttggc actagtagct 120

ggatttgtgg tgttgttatg gaagaaaacg acggcggatc ggagcgggga gctgaagcct 180

ttgatgatcc ctaagtctct tatggctaag gacgaggatg atgatttgga tttgggatcc 240

gggaagacta gagtctctat cttcttcggt acgcagactg gaacagctga gggatttgct 300

aaggcattat ccgaagaaat caaagcgaga tatgaaaaag cagcagtcaa agtcattgac 360

ttggatgact atgctgccga tgatgaccag tatgaagaga aattgaagaa ggaaactttg 420

gcatttttct gtgttgctac ttatggagat ggagagccta ctgacaatgc tgccagattt 480

tacaaatggt ttacggagga aaatgaacgg gatataaagc ttcaacaact agcatatggt 540

gtgtttgctc ttggtaatcg ccaatatgaa cattttaata agatcgggat agttcttgat 600

gaagagttat gtaagaaagg tgcaaagcgt cttattgaag tcggtctagg agatgatgat 660

cagagcattg aggatgattt taatgcctgg aaagaatcac tatggtctga gctagacaag 720

ctcctcaaag acgaggatga taaaagtgtg gcaactcctt atacagctgt tattcctgaa 780

taccgggtgg tgactcatga tcctcggttt acaactcaaa aatcaatgga atcaaatgtg 840

gccaatggaa atactactat tgacattcat catccctgca gagttgatgt tgctgtgcag 900

aaggagcttc acacacatga atctgatcgg tcttgcattc atctcgagtt cgacatatcc 960

aggacgggta ttacatatga aacaggtgac catgtaggtg tatatgctga aaatcatgtt 1020

gaaatagttg aagaagctgg aaaattgctt ggccactctt tagatttagt attttccata 1080

catgctgaca aggaagatgg ctccccattg gaaagcgcag tgccgcctcc tttccctggt 1140

ccatgcacac ttgggactgg tttggcaaga tacgcagacc ttttgaaccc tcctcgaaag 1200

tctgcgttag ttgccttggc ggcctatgcc actgaaccaa gtgaagccga gaaacttaag 1260

cacctgacat cacctgatgg aaaggatgag tactcacaat ggattgttgc aagtcagaga 1320

agtcttttag aggtgatggc tgcttttcca tctgcaaaac ccccactagg tgtatttttt 1380

gctgcaatag ctcctcgtct acaacctcgt tactactcca tctcatcctc gccaagattg 1440

gcgccaagta gagttcatgt tacatccgca ctagtatatg gtccaactcc tactggtaga 1500

atccacaagg gtgtgtgttc tacgtggatg aagaatgcag ttcctgcgga gaaaagtcat 1560

gaatgtagtg gagccccaat ctttattcga gcatctaatt tcaagttacc atccaaccct 1620

tcaactccaa tcgttatggt gggacctggg actgggctgg caccttttag aggttttctg 1680

caggaaagga tggcactaaa agaagatgga gaagaactag gttcatcttt gctcttcttt 1740

gggtgtagaa atcgacagat ggactttata tacgaggatg agctcaataa ttttgttgat 1800

caaggcgtaa tatctgagct catcatggca ttctcccgtg aaggagctca gaaggagtat 1860

gttcaacata agatgatgga gaaggcagca caagtttggg atctaataaa ggaagaagga 1920

tatctctatg tatgcggtga tgctaagggc atggcgaggg acgtccaccg aactctacac 1980

accattgttc aggagcagga aggtgtgagt tcgtcagagg cagaggctat agttaagaaa 2040

cttcaaaccg aaggaagata cctcagagat gtctggtga 2079

<210> 13

<211> 2061

<212> DNA

<213> Mc19967序列

<400> 13

atggcttcga attttgctaa ttcgctcgaa tcgatcttcg gaatctcatt aggatcatca 60

gaatacgttt ctgaaccgat tcttattatc atcacaacct cagttgcagt gttaattgga 120

cttggtttct tcatatggat gaaatcttct acttcttcga ggccggttga acctctgaag 180

ccggtgtcgt ttatgaaaga agaagaggaa gttgaagttg atccgggaaa aactaagatc 240

acgatcttct ttggtactca aactggcact gctgaaggat ttgccaaggc attggcagaa 300

gagattaagg caagatacga gaaagcagtt gtcaaagtaa ttgacctgga tgattatgcg 360

gcagaagatg atctgtatga ggagaaacta aagaaagaga ctttagcgtt tttcatgcta 420

gccacttatg gtgatggtga gccaacggac aatgctgcga gattttacaa atggtttact 480

caggaacatg aaaggggagt ctggctccag caactaactt atggtgtttt tggtctgggt 540

aaccgtcaat atgagcattt caataaggtc aacggaattc gtgttgcttc tttgataggt 600

gcaaagcgtc ttgttccagt ggggctcggt gatgacgatc aatgcattga agatgacttc 660

agcgcttggc gagaattatt gtggacggaa ttggatcagg tactccgaga tgaggatggt 720

cctaatacag tatctactcc gtatactgct gctgttcctg aatatcgggt agtgattcat 780

gatcctactg ttacagcctt ggatgataaa caattaagta cggcaaatgg gattgttgct 840

tttgatattc accatccttg cagagccaat gttgctgttc aaagagagct ccacaaacct 900

gattctgaca gatcttgcat acatctggag tttgacatat caggcactgg ccttacatat 960

gaaactggag accatgtggg tgtttatact gagaactgtg atgaaactgt tgaggaagga 1020

ggaaaaatgt tgggtcaacc catggatcta ctgttttcgc ttcacaccga taaagaggat 1080

gggacaccct tgggcagctc gctaccacct cctttccctg gtccttgcac cttacgaact 1140

gcactggcac gttatgctga tctcttgaat cctcctagaa aggctgctct gattgctttg 1200

gctgctcatg catctgtacc tagtgaagca gagaaactaa agtttttgtc atcacctcag 1260

ggaaaggatg aatattcaca atgggttgtt ggaagtcaga gaagtcttct ggaagtaatg 1320

gctgaatttc catcagcaaa acctcctctt ggtgttttct ttgcagcagt agcccctcgc 1380

ttacagcctc gatactattc tatctcatcc tctcctagat ttgctccttc aagaattcat 1440

gtaacctgcg ccttggttta tggtccaagt cctacaggaa ggattcaccg aggagtgtgt 1500

tcaacatgga tgaagcatgc agttgctcta gagaaaagcc atgactgtag ctgggctccg 1560

gtttttgttc gaacatcaaa ttttaagtta ccagccgacc cttcaattcc aatcgtcatg 1620

gtgggacctg gtacaggtct agctcctttc agaggatttc tgcaggaaag actggccctt 1680

aaagaagatg gtgctcaact tggtcctgca atgctctttt ttggctgtag gaatcgcaga 1740

atggacttca tttatgaaga tgaactcaac aactttgttg aacaaggagc gatatcggag 1800

ctgattgttg ccttctcacg tgaaggagaa aagaaggaat atgttcaaca taagatgatg 1860

gagaaagcag cacaattatg gagtgtaata tctagtggcg gttatctctg tgtgtgtggt 1920

gatgctaagg gaatggccag agatgttcat cggacattgc ataccattgc tcaagagcag 1980

ggaggtatgg actcatctgg tgccgagtcc acagtaaaga aactccagat ggaagggcga 2040

tatcttagag atgtgtggtg a 2061

<210> 14

<211> 2097

<212> DNA

<213> Mc13802序列

<400> 14

atggagtcaa gttccatgaa aatctctctg tttgatctca tgtctgcgtt agttaacgga 60

aagttagatc cgtcggattc tagtgcagct attttgattg agaatcgcga gcttttaatg 120

atcttaacaa ccgcgatcgc tgtttttatt ggctgtggat ttctctacgt ttggagaaga 180

tctttgaaga aatcgagcaa aattgttgaa cctccgaaaa tttcgatcat taaggagtcg 240

gaaccggaga ttgatgacgg taagaagaag gttacgatct tcttcggtac acaaactggt 300

acagctgaag gattcgcaaa ggcacttgcg gaagaggcta aagcacgata tgataaagcc 360

atctttaaag tggttgatct ggatgattac gcagctgacg atgatgaatt tgaagagaaa 420

ttgaagaaag aaactttagc acttttcttt ttggcaacat atggagacgg tgaaccgaca 480

gacaatgctg ccagatttta taaatggttt acagagggaa aagagaagga actctggctt 540

cagaatcttc attatggtgt gttcggtctt ggcaatagac agtatgaaca tttcaataag 600

gtctttaatg tgttccttgt cactttaata ggtgggaagc gtcttgttcc tgtgggcctt 660

ggagacgatg atcaatgcat agaagatgac ttcacagcat ggcgagaatt ggtatggcct 720

gaattggatc agttgctcct tgatgaaaat gatgcaacaa gtgtttctac cccttacact 780

gctgctgtag cagaatatag agtggtattc catgatgctg cagatgcacc tctacaggaa 840

aaaaattgga gtaatgcaaa tggccatgct gttcatgaca ttctacaccc atgcagagcc 900

aatgtggctg taagaaggga gcttcacaca ccagcttcag atcgttcttg tattcatctg 960

gaattcgaca tttcaggctc tgggctttct tatgaaacag gagaccatgt tggtgtatat 1020

tctgagaatt gtattgaaac tgtggaggaa gcggagaggt tgttgggtta ttcatcagat 1080

actttctttt ccatccatgt tgataaagag gatggcacac caattagtgg aagcgcatta 1140

cctccccctt ttccatctcc ctgcacttta agagctgcac tgacccgata tgcagatctg 1200

ttgaattttc ctaagaaggc tgctctgcat gctttagctg cttatgcatc tgatccaaag 1260

gaagctgagc gattaagatt tcttgcatca cctgctggga aggatgaata tgcacagtgg 1320

gtagttgcaa gtcagagaag tctgctagag gtcatggctg aatttccatc agcaaagcct 1380

cctcttggag ttttctttgc tgcaatagct ccgcgcttgc agcccagata ctattcgatt 1440

tcgtcctccc ataggatggc accctctaga attcatgtca catgtgcatt agtgtatgag 1500

acaacaccag caggtcgggt tcacaaagga gtgtgttcaa cctggatgaa gaattctgtg 1560

cctttggaag aaagccgtaa ttgcagctgg gcaccaattt ttgtgagaca atctaatttc 1620

aaacttccta ctgattctac cgtaccaatt atcatgattg gccctgggac tgggttggct 1680

ccttttaggg gattcatgca ggatcgacta gctctgaaag aagctggtgt agaactggga 1740

cccgcaatac tgttctttgg atgcaggaac agaaggatgg attacatata cgaagaggag 1800

ttgaatggct ttgtggaagc aggtgctatc tctgagctgg ttgttgcttt ctcacgggag 1860

gggcctacaa aggaatatgt ccagcataag atgctggaga aggcctccga tatctggaat 1920

atgatctctc agggtggtta tctttatgtc tgtggtgatg ccaaaggcat ggccagggat 1980

gtgcatcgaa ctcttcacac cattgttcaa gagcagggat ctttggacag ctccaagact 2040

gaaagcttag tgaagaacct gcagatggac gggaggtatc tacgtgatgt ctggtga 2097

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> PsP6H-Ura-F序列

<400> 15

ggaatattaa gcttgatgga tggatttctc atcactacta 40

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> PsP6H-Ura-R序列

<400> 16

gatgcggccc tctagctatt atgtttcaca atcgtaaag 39

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> EcP6H-Ura-F序列

<400> 17

ggaatattaa gcttgatgga ttccttaatg cttgcttatt tgttt 45

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> EcP6H-Ura-R序列

<400> 18

gatgcggccc tctagctatt cgtacaactt gtaatgtaga cgagg 45

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> MC11229-Ura-F序列

<400> 19

ggaatattaa gcttgatggc tgctcttctt gccttggt 38

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> MC11229-Ura-R序列

<400> 20

gatgcggccc tctagctaat actcataaag cttgggatgg aggcgtgg 48

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> MC11218-Ura-F序列

<400> 21

ggaatattaa gcttgatgga atattcatcc cttctaactc tccagtatgg ctgc 54

<210> 22

<211> 49

<212> DNA

<213> MC11218-Ura-R序列

<400> 22

gatgcggccc tctagttaat aatcatagag cttagggttg ctgaagcgt 49

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> AtCPR-Leu-F序列

<400> 23

ggaatattaa gcttgatgac ttctgctttg tatgct 36

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> AtCPR-Leu-R序列

<400> 24

gatgcggccc tctagtcacc agacatctct gaggta 36

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> YES2-Detect-F序列

<400> 25

accccggatc ggactactag c 21

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> YES2-Detect-R序列

<400> 26

tccttccttt tcggttagag cgga 24

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-F序列

<400> 27

ttaagcttgg taccgatggc agctttgttg gctttg 36

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-R序列

<400> 28

gatgcggccc tctagttaat attcatacaa ttttgg 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-F序列

<400> 29

ggaatattaa gcttgatgca atcggaatcc agttct 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-R序列

<400> 30

gatgcggccc tctagtcacc acacatcacg cagata 36

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> MC6408-Trp-F序列

<400> 31

ggaatattaa gcttgatggg gtacttctca agatcatctg 40

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> MC6408-Trp-R序列

<400> 32

gcggccctct agatgctatg aagtaatgga tggaatactt 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> MC6407-Trp-F序列

<400> 33

ggaatattaa gcttgatggg gttctcaaaa tctgcaatac 40

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> MC6407-Trp-R序列

<400> 34

gcggccctct agatgctaag aagtaatgga tggaatgctt 40

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> PsDBOX-Trp-F序列

<400> 35

ggaatattaa gcttgtggag aaggtttgta ggagga 36

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> PsDBOX-Trp-R序列

<400> 36

gcggccctct agatgctact gcttgcccca agtact 36

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> MC6408opt-Trp-F序列

<400> 37

ggaatattaa gcttgatggg ttatttttct agatct 36

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> MC6408opt-Trp-R序列

<400> 38

gcggccctct agatgttaag aagtaataga tggaat 36

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> PsCPR-Leu-F序列

<400> 39

ggaatattaa gcttgatggg gtcaaacaac ctggca 36

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> PsCPR-Leu-R序列

<400> 40

gatgcggccc tctagttacc atacatctct caagta 36

<210> 41

<211> 48

<212> DNA

<213> Mc19967-Leu-F序列

<400> 41

ggaatattaa gcttgatggc ttcgaatttt gctaattcgc tcgaatcg 48

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> Mc19967-Leu-R序列

<400> 42

gatgcggccc tctagtcacc acacatctct aagatatcgc ccttc 45

<210> 43

<211> 39

<212> DNA

<213> Mc13802-Leu-F序列

<400> 43

ggaatattaa gcttgatgat ggagtcaagt tccatgaaa 39

<210> 44

<211> 37

<212> DNA

<213> Mc13802-Leu-R序列

<400> 44

gatgcggccc tctagttcac cagacatcac gtagata 37

Claims (3)

1.一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、对参与血根碱和白屈菜红碱生物合成的基因进行密码子优化：首先根据血根碱和白屈菜红碱的生物合成途径，分别从已知的普罗托品-6-羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因及细胞色素P450还原酶基因中通过异源表达和结果比对分析，分别筛选出表达效率高的最优基因，然后对筛选出的普罗托品-6-羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因最优基因进行密码子优化，具体如下：

从已知的普罗托品-6-羟基化酶基因MC11229和MC11218中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因MC11229，然后对筛选出的最优基因MC11229进行密码子优化得到优化后的基因MC11229opt；其中：MC11229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，MC11229opt的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，MC11218的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

从已知的二氢苯并菲啶氧化酶基因MC6408和MC6407中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因MC6408，然后对筛选出的最优基因MC6408进行密码子优化得到优化后的基因MC6408opt；其中：MC6408的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，MC6408 opt的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，MC6407的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

从已知的细胞色素P450还原酶基因CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因CuCPR，CuCPR的核苷酸序列如SEQID No.10所示；

S2、将博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt与辅酶基因CuCPR、二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列MC6408 opt一起构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中，并进行转化，获得重组酵母工程菌株；

S3、将博落回的叶片原料液与步骤S3构建的重组酵母工程菌进行发酵，发酵条件为：将博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌；温度30°下，发酵培养24小时；然后收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得血根碱和白屈菜红碱；

博落回叶片原液的制备方法如下：

(1)将博落回叶片放于35～45℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

(2)然后将制得的叶片粉末按比例加入一定体积pH＝8.0的TE缓冲溶液中，配置呈一定比例的缓冲液；

(3)最后将所述缓冲液先放入高压蒸汽灭菌锅中110～120℃灭菌25～35min或者放入超声波清洗器中超声25～35min，然后4500～5500rpm离心4～6min，上清液过0.2～0.25μm滤膜，即得。

2.根据权利要求1所述的高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，步骤S2中，所述表达载体的质粒选自PYES2。

3.根据权利要求1所述的高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，步骤S2中，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

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