CN109468350B

CN109468350B - 以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法

Info

Publication number: CN109468350B
Application number: CN201811423064.7A
Authority: CN
Inventors: 黄鹏; 曾建国
Original assignee: MICOLTA BIORESOURCE Inc
Current assignee: MICOLTA BIORESOURCE Inc
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109468350A

Abstract

本发明提供一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法，具体包括如下步骤：S1、博落回叶片原液前处理；S2、构建酵母工程菌；S3、以步骤S1前处理后的博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌；S4、收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得。本发明以博落回非传统药用部位叶片的粉末为底物前提饲喂酵母工程菌进行生物转化，使原料中的原阿片碱与别隐品碱转化成高价值的血根碱与白屈菜红碱，既可以提高血根碱与白屈菜红碱的含量，又可以省去传统提纯原阿片碱与别隐品碱的操作，从而降低血根碱和白屈菜红碱的生产成本以及实现博落回资源的综合利用。

Description

以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法

技术领域

本发明涉及血根碱和白屈菜红碱合成技术领域，具体涉及一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法。

技术背景

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)属于罂粟科博落回属植物，别名又叫号筒杆、落回、山号筒、山梧桐、三钱三等，生长于丘陵、低山、林边、草地、路旁，是一种野生草本植物。博落回主要分布于中国、东亚、北美洲和欧洲。博落回属植物包括博落回和小果博落回(M.microcarpa(Maxim)Fedde)两个种，作为一种传统中草药最早见于《本草拾遗》，在民间作为一种杀蛆青草药而广泛使用。随着研究的不断深入，发现博落回具有抑菌、抗炎、调节畜禽类肠道菌群等多重药理作用，博落回开始作为一种药源植物得到越来越广泛的应用。

博落回中含有的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱占博落回总生物碱的90％以上。现代药理研究表明原阿片碱、别隐品碱、白屈菜红碱和血根碱具有显著的生物活性，其中血根碱对治疗多种炎症有效，对畜禽类有较好的肠道菌群调节作用，目前已经作为饲用抗生素的替代品在欧洲等地区广泛销售。从2006年1月开始欧盟全面禁止在饲料中添加任何抗生素，导致血根碱的需求逐年增加。目前血根碱的主要来源是从博落回植株中提取，而博落回作为一种野生资源，这种获取方式导致其野生资源的存储量逐年减少。

现有的研究结果发现博落回的这4种主要生物碱在博落回中的分布呈现组织特异性。在成熟果荚中血根碱、白屈菜红碱占总碱的70％左右，原阿片碱和别隐品碱占30％左右；而在叶片中却相反，血根碱、白屈菜红碱占总碱的30％左右，原阿片碱和别隐品碱占70％左右。从生物合成途径上看(附图1)，原阿片碱和别隐品碱分别是血根碱和白屈菜红碱的前体物质，原阿片碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢血根碱(DHSAN)，然后二氢血根碱(DHSAN)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成血根碱(SAN)；别隐品碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)，然后二氢白屈菜红碱(DHCHE)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成白屈菜红碱(CHE)。

血根碱和白屈菜红碱是博落回提取物中最主要的有效成分，在果荚中含量仅为0.5～2％左右。而叶片中的总生物碱含量大约是果荚中的50％左右，生物学产量是果荚的一倍以上。目前博落回提取物绝大部分来源于野生资源的果荚，来源有限，血根碱含量低，从而造成血根碱价格昂贵，而限制了其产业的发展。另一方面，占总生物碱很大比例的前体类物质未转化完全，在提取过程中被当成废弃物未进行综合高效利用，导致资源的极大浪费。由于每提高0.1％植株中血根碱含量可降低10％的提取成本，而传统的栽培和育种进行改良所需周期长、受环境影响大、效率低、难以大规模种植和提升潜力有限，通过现代分子生物学技术体外构建工程化菌对前体物向终产物的有效转化是获得血根碱的新药源途径。

本发明拟提供一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法，具体包括如下步骤：

S1、博落回叶片原液前处理；

S2、构建酵母工程菌：

S3、以步骤S1前处理后的博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌；温度30°下，发酵培养24小时；

S4、收集步骤S3培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得血根碱和白屈菜红碱。

进一步地，

步骤S1博落回叶片原液前处理的方法具体如下：

(1)将博落回叶片放于35～45℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

(2)将步骤(1)制得的叶片粉末按比例加入一定体积pH＝8.0的TE缓冲溶液中，配置呈一定比例的缓冲液；

(3)将所述前体溶液4500～5500rpm离心4～6min，上清液过0.2～0.25μm滤膜，即得。

进一步地，

上述步骤(2)还包括将所述前体溶液放入高压蒸汽灭菌锅中110～120℃灭菌25～35min或者放入超声波清洗器中超声25～35min。

进一步地，

所述步骤(2)的前提溶液中叶片粉末的浓度为0.2～0.8g/mL。

进一步地，

步骤S2具体如下：

将博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因与辅酶基因CPR、二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因一起构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中，并进行转化，获得重组酵母工程菌株。

进一步地，

所述普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因包括MC11229、MC11218及MC11229opt，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。优选MC11229opt。

MC11229、MC11218基因是以罂粟和花菱草的P6H基因序列为参照，在博落回转录组数据中进行同源比对后找到2个同源性较高的基因序列，其在本申请人之前的专利(CN106119265A，专利名称：博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因)中，公开了其核苷酸序列和表达后的氨基酸序列，并进行了酵母异源表达验证。MC11229opt是对MC11229基因进行密码子优化后得到的优化序列基因，其也在本申请人的另外一项专利中公开并进行了酵母异源表达验证。

进一步地，

所述二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因包括MC6408、MC6407以及MC6408opt，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.6、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。优选MC6408opt。

MC6408、MC6407以其他物种(罂粟、花菱草)已公开在NCBI的合成血根碱与白屈菜红碱的黄素蛋白氧化酶相关基因序列为参照基因，在博落回De Novo全基因组序列中进行BLAST比对，找到2个同源性较高的基因序列，其在本申请人之前的专利(CN106047904A，专利名称：博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用)中，公开了其核苷酸序列和表达后的氨基酸序列，并进行了酵母异源表达验证。MC6408opt是对MC6408基因进行密码子优化后得到的优化序列基因，其也在本申请人的另外一项专利中公开并进行了酵母异源表达验证。

进一步地，

所述辅酶基因包括CuCPR，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，

所述表达载体的质粒选自PYES2。

进一步地，

所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

本发明的有益效果：

本发明构建的具有高效转化原阿片碱与别隐品碱生成血根碱和白屈菜红碱的酿酒酵母工程菌，以博落回非传统药用部位叶片的粉末为底物进行生物转化，实现博落回资源的综合利用，能为降低血根碱/白屈菜红碱的生产成本和工业化应用奠定基础。

由于，博落回叶片中原阿片碱与别隐品碱的含量大于血根碱与白屈菜红碱，而博落回提取物的主要有效成分是血根碱与白屈菜红碱。将博落回叶片原料液直接进行生物转化，使原料中的原阿片碱与别隐品碱转化成高价值的血根碱与白屈菜红碱，既可以提高血根碱与白屈菜红碱的含量，又可以省去传统提纯原阿片碱与别隐品碱的操作，从而降低血根碱和白屈菜红碱的生产成本，还可以实现博落回资源的综合利用，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径；

图2为本发明实施例不同前处理条件下制得的博落回叶片原液与构建的不同重组酵母工程菌发酵培养合成血根碱的催化效率比较；

图3为本发明实施例不同前处理条件下制得的博落回叶片原液与构建的不同重组酵母工程菌发酵培养合成白屈菜红碱的催化效率比较。

具体实施方式

为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。

本实施例提供一种以博落回叶片制得的原液作为底物前体饲喂酵母工程菌生物转化合成原阿片碱与别隐品碱生成血根碱和白屈菜红碱的方法。

1、博落回叶片原液前处理，具体包括如下步骤：

(1)将博落回叶片放于40℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

(2)取步骤(1)制得的叶片粉末0.5g加入100mLpH＝8.0的TE缓冲溶液中，配置成前体溶液；参照上述方法总共配置四份；

将其中两份前体溶液放入高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌30min；另外两份放入超声波清洗器中超声30min；

(3)将所述4份前体溶液在5000rpm离心5min，上清液过0.22μm滤膜，即得。

2、构建酵母工程菌，具体包括如下步骤：

(1)PCR引物设计：引物序列见表1，根据infusion引物的设计原则分别设计MC11229opt、CuCPR、MC6408opt基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成。

表1目的基因PCR引物序列与产物长度

(2)博落回cDNA的制备按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取博落回总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

(3)以博落回cDNA为模板，分别选用MC11229opt-His-F、MC11229opt-His-R引物，MC6408opt-Trp-F、MC6408opt-Trp-R引物；CuCPR-Leu-F引物、CuCPR-Leu-R引物为引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下表2：

表2目的基因PCR扩增反应体系

扩增条件：98℃预变性30sec，98℃10sec，58℃30sec，72℃2min(30个循环)，72℃2min，4℃保持。用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并测定含量。

(4)提取载体质粒：取3支经高压灭菌后的10mL离心管，分别加入5mL含100mg/LAmp的LB液体培养基，再分别加入200μL标签为PYES2-Ura、PYES2-Leu和PYES2-Trp的大肠杆菌菌液，放于台式恒温振荡仪中37℃，200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒测定含量。

用限制性内切酶KpnI-HF、XBa/Sph-HF将载体质粒PYES2-Ura、PYES2-Leu、PYES2-Trp回收产物分别进行双酶切，反应体系如下表3-5：

表3载体质粒PYES2-Ura双酶切反应体系

表4载体质粒PYES2-Leu双酶切反应体系

表5载体质粒PYES2-Trp双酶切反应体系

置于37℃反应30min，反应完成后在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测并测定含量。

(5)构建重组质粒PYES2-Ura+MC11229opt、PYES2-Leu+CuCPR、PYES2-Trp+MC6408opt，并对重组质粒PCR扩增，PCR反应体系如下表6：

表6重组质粒PCR扩增反应体系

扩增条件：94℃预变性5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，(35个循环)，72℃5min，4℃保持。经测序确认没有突变。

(6)构建重组酵母工程菌：将重组质粒PYES2-Ura+MC11229opt、PYES2-Leu+CuCPR、PYES2-Trp+MC6408opt转入酵母(ivf，购自Thermo Fisher Scientific公司)中，获得重组酵母工程菌株，记为MCY-3092(PYES2+MC11229opt+CuCPR+MC6408opt)，同时还将PY ES2-Trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株，记为MCY-3091；再在Ura、Leu和Trp三缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约l mm的单菌落。

以前处理后的四组博落回叶片原液作为底物，分别前体饲喂构建的酵母工程菌MCY-3091、MCY-3092；温度30°下，发酵培养24小时；

收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，制得样品。

将制备好的样品用UPLC-Q-TOF进行检测，以MCY-3060作为空白对照，在相同条件下加入不同处理后的TE缓冲溶液，检测到的血根碱和白屈菜红碱含量可作为加入叶片粉末后的TE缓冲溶液中固有的血根碱和白屈菜红碱含量。加入MCY-3092工程菌后血根碱和白屈菜红碱的具体结果见下表7-8及图2-3。经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。

表7不同博落回叶片原液与不同重组酵母工程菌发酵培养合成血根碱的含量测定

表8不同博落回叶片原液与不同重组酵母工程菌发酵培养合成白屈菜红碱的含量测定

上述结果表明：加入工程菌MCY-3092后，发酵液中血根碱的含量提高了约3倍，白屈菜红碱的含量提高了约2倍。不同叶片原料液前处理方式的结果表明，叶片原料液放入超声波清洗器中超声30min得到的血根碱和白屈菜红碱含量要高于在高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌30min的含量，并且工程菌在超声30min的叶片原料液中的催化效率也要高于高压蒸汽灭菌30min。可能的原因是超声波的处理方式比高温更能破坏植物细胞壁，功能酶更容易与底物进行反应。

以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。

序列说明：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3分别为MC11229、MC11218、MC11229opt的核苷酸序列；

SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6分别为MC6408、MC6407以及MC6408opt的核苷酸序列；

SEQ ID No.7分别为CuCPR的核苷酸序列；

SEQ ID No.8-15分别为引物MC11229opt-His-F、MC11229opt-His-R、MC6408opt-Trp-F、MC6408opt-Trp-R、CuCPR-Leu-F、CuCPR-Leu-R、PYES2-Detect-F、PYES2-Detect-R的序列。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南美可达生物资源股份有限公司

<120> 以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法

<130> 20181121

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> MC11229序列

<400> 1

atggctgctc ttcttgcctt ggttttcctc tacaatttca tcatcatctg gagctcatcc 60

ccaagaacca ctatcaacgg taagaaacaa attaggaagg cacccatggc agccggcgca 120

tggccgattc ttggtcacct tcatttgttt ggatccggtg agctgcctca caaaatgctt 180

gcagccatgg ctgaaaagta tggctccgcc ttcatgatga agttcggtaa gcacacaaca 240

ctagttgtga gtgacacccg catagtaaaa gaatgtttca ctactaatga taccctcttt 300

gctaaccgtc cttcgaccac cgcctttgat ctcatgactt atgccaatga ttccgttgct 360

ttcacaccct atggtcctta ttggcgagag cttagaaaga tatccactct caaacttctc 420

tctaaccacc gtctccaggc catcaaggac gttcgagcct ccgaggtgaa cgtatgcttc 480

agggaactat acaatttatg caataagcag aataaaaatg atggagctga tcatgttttg 540

gtggatatga agaaatggtt tgaagaggtc tcaaacaacg tcgtgatgag ggtaatcgtt 600

gggagacaga acttcgggtc taagattgtg cgtggtgagg aggaggccgt caattacaag 660

aaagtcatgg atgaactctt acgacttgct agtctgtcta tgttatctga tttcgctcct 720

ttacttggtt ggttggatat tttccaagga aacatgagcg ccatgaaacg aaatgccaag 780

aaagtcgaca ccatacttga gggctggttg gaagagcata ggaataagaa gaagaagagc 840

tcatcatcat catcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatctgg tgagaatgac 900

caagacttca tggatgttat gttgtcgatt attgaggaga ccaagttgtc tggccgtgat 960

gctgatactg ttattaaagc tacttgcttg gccatgatca tgggtgggac agacaccacg 1020

gcggtgagtc taacatggat cgtctcttta ctgatgaaca atcgtcatgt actgaagaag 1080

gctagagaag aattggacgc gctcgtgggg aaggatagac aagtggaaga ttcagatttg 1140

aagaatttgg tgtacatgaa tgccatcgtc aaggaaacga tgcgattatt cccattgggt 1200

gctcttcttg aacgtgaaac caaggaggac tgtgaggttg gtgggttcca gctccaaggt 1260

ggttcgcgtt tactagtgaa tgtatggaag ttacagcgag accccaacgt gtggtcggat 1320

ccaacagagt ttagaccaga gagatttcta tcggagaatg cggatataga cgtcgggggt 1380

caacatttcg aactactacc atttggggcc ggtagaaggg tgtgcccggg agtgtcgttc 1440

gcgctccaat tcatgcattt ggtactggct cgtctcatcc atggctatga attgggaacc 1500

cagaatgatg aggatgtgga tttaactgag agcacagaag gacatgttaa ccacaaagca 1560

tcccccctcg atctcatcct caccccacgc ctccatccca agctttatga gtattag 1617

<210> 2

<211> 1644

<212> DNA

<213> MC11218序列

<400> 2

atggaatatt catcccttct aactctccag tatggctgct ggtttgctcc atccatggct 60

gctgcccttc ttgccttagt ttttctctac tacaatctct tcttggcttc tccaaaaact 120

accaacaaga aaataattaa taagaaatta ttaccaccca tggcaacagg tgcatggcca 180

attcttggtc atctccatct gtttaaagag ggtgagttgc ctcaccacat gcttaaatcc 240

atggctgata agtacggccc tgccttcctc atgaatttcg ggcaacaccg atccctcgtt 300

gtgagcgatc atcgcttcgt taaagaatgt ttcactacta atgacacctt gttttgtaac 360

cgtccatcca ccacagcctt cgatgtcatg acttacgcca atgactcggt agctttcaca 420

ccttacagtc cttactggcg ggagcttaga aagatatcca ctctcaaact tctctctaac 480

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ttgtatgatt tatggaagaa taataaaact gatgagcagg gtgtcgtggg tgatgaacga 600

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attagagtaa tcgtgggtaa acataatttt gggactaaga ttgtgaatgg tgaaaaggag 720

gctgtcgaat acaagacaat catggatgag ctcttacgtc tcgctagtct atctttgtta 780

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aaacgaaatg gcaagaaact agacgttcta cttcaaaagt ggttggagga gcatcggaac 900

aagacgagct cacccgagga tgagcaagac ttcatggatg ttatgttgtc gatcgtcgag 960

gagagcaaac tgtctggcca cgacgctgat accgtcatta aagctacttg cctggccatg 1020

atcatgggtg ggacagacac cacggcggtg agtctaacat ggatcgtctc tttactgatg 1080

aacaatcgtc atgcactgaa aaaggctcga gaagaattag acgcgcatgt agggaaggat 1140

agacaagttg aagattcaga tttgaagaat ttggtttact tgaatgccat cgttaaggaa 1200

acgatgcgat tatacccact gggtactctt cttgaacgtg aaaccaagga agattgtgag 1260

gttggtgggt tccagctcca agccggcacg cgtttactag ttaacatatg gatggtacaa 1320

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atccatgggt atgaattggg aaccctaaat gatgaagatg tggacctaac tgagagcaca 1560

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gcttctttgg gaatttcgag ttcagctcgc gacgactttg ttcaatgtct ttccctccaa 120

caaccttcca tcccagtccc tatctacaca ccaaacacca cgaattatac aacacttttc 180

agatcctctg cacgaaacct tagatattta tctaacactt ctcttacacc tgaagttatt 240

attacaccta cccatgaatc ccatgttcaa gcagctgtta tttgctgtaa gaaacatggg 300

ttagacctca aagttcgaag cggtggccat gatgtcgaag gcctctctta tgcatccgat 360

aaaccatttg ttatcgttga cttggtcgat tatagaaacg tcaccgttga tctaaaagac 420

aacactgcat gggtccaagc tggtgcttcc cttggggaag tttattatag aattggagag 480

aagagcaaga cccttgggtt cccagccggg ttttgcccca ccgttggtgt tggtgggcat 540

attagtggag gtggattcgg tgctttggtg cgaaaatatg gccttgcatc tgatcaagtc 600

attgatgctt acatagtcac tgttgatggc aagattctta acaaagaaac aatgggagaa 660

gatctatttt gggccattag aggtggggga gcatcgagct tcggagttat tctctcatgg 720

aaaatcaaat tggttcctgt tccacctatt gttactgttg ccacggtcga tagaacctta 780

gaacaaggag caacaggcct tgttcataag tggcaatata tcgccgataa actcgatgca 840

gacctctaca tggcgcccac atttactgtg gttaattcta gtagacaagg tgagaaaacg 900

gtgcaagctc aattctcctt cttgttcctt ggcggtgttg acaagctcct ccaaatcatg 960

gaagctaact tccctgaatt gggtttgaag agaaacgaca ccatggaaat gagttgggtc 1020

gaatctcatg tctatttcta caggcgtgga agtccattag aacttctatt ggacagagat 1080

cctataatga agagcttcct caaagtaaaa tctgactatg taaaggaacc aatatcagaa 1140

gctggattag aagagatatg gaaaaggtat atcgaaggag atgcaccagc aatgctattc 1200

actccttttg gtggaaggat gaatgagatc tctgagtttg cacttcctta cccacataga 1260

gccggaaaca tatacaatat tatgtacgtc tcgaactggc tacaagaaag tgaatcagaa 1320

aaacagttag actggttgcg aaaattctac agtttcatgg gtcaatatgt ttctaagttc 1380

ccaagaagtg catatctcaa ctacaaggat cttgacttgg gagtaaataa caaccaggat 1440

ggtatctcag gttacttaaa tgcgaaaatt tggggaacta aatactttaa gcttaacttc 1500

gagagattgg tacttgtgaa gaccacggtt gatcctgaaa atttcttcaa gaacaaacaa 1560

agtattccat ccattacttc atag 1584

<210> 5

<211> 1575

<212> DNA

<213> MC6407序列

<400> 5

atggggttct caaaatctgc aatactttct atcttttctt tccttgtgtt ctcagcttct 60

ttagccattt caagttcagc tcgtgacgac tttgttcaat gtctttccct tcaaaaacct 120

tctgtcccag tgcctatata cacccctaac acggcgaatt atacaacagt tttcagatcc 180

tcagtacgaa acctcagata catatcgaac acttctctta cacctgaagt tattattaca 240

cctacccatg aatcccatgt tcaagcagct gttatttgct gtaagaaaca tgggttagac 300

ctcaaagttc gaagcggtgg ccatgacgtc gaaggcctct cttatgcatc cgataaacca 360

tttgttatcg ttgacttggt cgattataga aacgtcaccg ttgatctaaa agacaacact 420

gcatgggttc aagccggtgc ttccctcggg gaagtttatt atagaatcgg agagaagagc 480

aagacccttg ggttcccagc cgggttttgc cccaccgttg gagttggtgg acatattagt 540

ggaggtggat tcggtgcctt ggtgcgaaaa tatggccttg catctgatca agtcattgat 600

gcttacatag tcactgttga tggcaagatt cttaacaaag aaacaatggg agaagatcta 660

ttttgggcca ttagaggtgg gggagcatcg agcttcggag ttattctctc atggaaaatc 720

aaattggttc ctgttccacc tattgttact gttgccacgg tcgatagaac cttagaacaa 780

ggagcaacag gccttgttca taagtggcaa tatatcgccg ataaactcga tgcagacctc 840

tacatggcgc ccacatttac tgtggttaat tctagtagac aaggtgagaa aacggtgcaa 900

gctcaattct ccttcttgtt ccttggcggt gttgacaagc tcctccaaat catggaagct 960

aacttccctg aattgggttt gaagagaaac gacaccatgg aaatgagttg ggtcgaatct 1020

catgtctatt tctacaggcg tggaagtcca ttagaacttc tattggacag agatcctata 1080

atgaagagct tcctcaaagt aaaatctgac tatgtaaagg aaccaatatc agaagctgga 1140

ttagaagaga tatggaaaag gtatatcgaa ggagatgcac cagcaatgct attcactcct 1200

tttggtggaa ggatgaatga gatctctgag tttgcacttc cttacccaca tagagccgga 1260

aacatataca atattatgta cgtctcgaac tggctacaag aaagtgaatc agaaaaacag 1320

ttagactggt tgcgaaaatt ctacagtttc atgggtcagt atgtttctaa gttcccaaga 1380

actgcatatc tcaactacaa agatcttgac ttgggtgtca ataacaagga tggtgtcttc 1440

agttacttag atgccaaggt ttggggaatt aaatacttca agcttaacta cgaaagattg 1500

gtacttgtaa agaccacagt cgatcctgat aatttcttca agaacaaaca aagcattcca 1560

tccattactt cttag 1575

<210> 6

<211> 1584

<212> DNA

<213> MC6408opt序列

<400> 6

atgggttatt tttctagatc ttctgctatt ttgtctattt tttctttttt ggttttttct 60

gcttctttgg gtatttcttc ttctgctagg gatgacttcg tccagtgctt gtctttgcag 120

cagccatcta ttccagttcc aatttatact ccaaatacta ctaattatac tactttgttt 180

agatcttctg ctagaaattt gagatatttg tctaatactt ctttgactcc agaagttatt 240

attactccaa ctcacgaatc tcacgtccaa gctgctgtta tttgttgtaa aaaacatggt 300

ttggacttga aggttagatc tggtggtcac gacgtcgaag gtttgtctta cgcttcagat 360

aaaccatttg ttattgttga tttggttgat tatagaaacg ttactgttga tttgaaagat 420

aacactgctt gggtccaagc aggtgcttct ttgggtgaag tttattatag aattggtgaa 480

aaatctaaga ctttgggttt cccagctggt ttctgtccaa ctgttggtgt cggtggtcac 540

atttctggtg gtggtttcgg tgctttggtc aggaagtacg gtttggcttc tgaccaagtt 600

attgatgctt atattgttac tgttgacgga aaaattttga ataaagaaac tatgggtgaa 660

gacttgttct gggctattag gggtggtggt gcttcttctt tcggtgtcat tttgtcttgg 720

aagattaagt tggtcccagt cccaccaatt gtcacagtcg ctactgtcga caggactttg 780

gagcaaggtg ctactggttt ggttcataaa tggcaatata ttgctgataa attagatgct 840

gatttgtata tggctccaac ttttactgtt gttaactctt ctagacaagg tgaaaaaact 900

gttcaagctc aattttcttt cttgtttttg ggtggtgttg ataaattgtt gcaaattatg 960

gaagctaact tcccagaatt aggtttgaag agaaacgata caatggaaat gtcttgggtt 1020

gaatctcatg tttattttta tagaagaggt tctccattgg aattgttgtt ggacagagat 1080

ccaattatga aatcattttt gaaagttaaa tcagattatg ttaaggaacc aatttcagaa 1140

gctggtttgg aagaaatttg gaagagatac attgagggtg acgctcctgc tatgttgttc 1200

actccattcg gtggtagaat gaatgaaatt tctgagttcg ctttgcctta cccacacaga 1260

gctggtaaca tttacaatat tatgtatgtt tctaattggt tgcaagagtc tgaatctgaa 1320

aaacaattag attggttgag aaaattttat tcttttatgg gacaatatgt ttctaaattt 1380

ccaagatctg cttacttaaa ttataaagat ttggatttgg gtgtcaataa taatcaagat 1440

ggtatttctg gttacttgaa cgcaaaaatt tggggtacta agtattttaa attgaatttt 1500

gaaagattgg ttttggttaa aactactgtt gatccagaaa acttttttaa aaacaagcaa 1560

tctattccat ctattacttc ttaa 1584

<210> 7

<211> 2127

<212> DNA

<213> CuCPR

<400> 7

atgcaatcgg aatccagttc tatgaaggct tctccatttg acttcatgtc ggctataatt 60

aagggcagga tggatccgtc taattcttca tttcaatcga ctggcgaggg tgcctcagtt 120

attttcgaga atcgcgagct ggttgcgatc ttaactacct cgatcgctgt catgattggc 180

tgctttgttg ttcttgtgtg gcgaagatcc ggaaatcgaa aagttaagac tatagagctt 240

cctaagccgt tgcttgggaa ggagccagag ccagaagttg acgacgggaa gaagaaggtt 300

acgatattct ttggtacgca gactggtact gctgaaggct ttgcaaaggc tctatctgac 360

gaggcgaaag cacggtacga taaggccaag tttagagttg ttgatttgga tgattatggg 420

gctgacgaag atgaatacga acaaaaattg aaaaaggagt ctgtagctgt tttcttcttg 480

gcaacgtatg gcgatggaga gcccactgat aatgccgcaa gattctataa atggttcacc 540

gagggtaaag agagagggga atgtcttcag aacctcaatt atgcagtctt tggccttggc 600

aaccgacaat atgagcattt taataagatt gcaaaagtgg ttgatgagct gcttgagact 660

cagggtggta agcgccttgt aaaagttgga cttggagatg acgatcagtg catagaggat 720

gacttctctg cttggcgaga atcattgtgg cctgagttgg atcaattgct tcgggatgag 780

gatgatgcag caactgtgac cacaccttac acagctgcca tatcagaata ccgagtggta 840

ttccatgatc cttcagatgt aactgatgac aaaaagaact ggatgaatgc aaatggtcat 900

gctgtacatg acgcacaaca tccattcaga tctaatgtgg ttgtgagaaa ggagctccat 960

acacctgcgt ctgatcgttc ttgtactcat ctagagtttg atatttctga gtctgcactc 1020

aaatatgaaa caggggatca tgttggtgtt tactgtgaaa atttaaccga gactgttgat 1080

gaggctctaa atttattggg tttgtctcct gaaacgtatt tctccattca tactgataat 1140

gaggatggca cccaactagg tggaagctct ttaccacctc cttttccatc ctgcaccctc 1200

agaacagcat tgactcgata tgcagatctt ttaaattcac ccaaaaagtc agcattgctc 1260

gcattagcag cacatgcttc aaatcctata gaggctgacc gattaagata tcttgcatca 1320

cctgctggga aggatgaata ttctcagtct gtggttggta gccagaaaag cctgcttgaa 1380

gtcatggctg aatttccttc tgccaagcct ccacttggtg tcttctttgc agctgttgca 1440

ccacgtttac agcctcgatt ctactccata tcatcatctc caaggatggc tccatctaga 1500

attcatgtta cttgtgctct tgtctatgac aaaatgccaa ctggacgtat tcataaagga 1560

atttgctcta cttggatgaa gaattctgtg cccatggaga aaatccatga gtgcagttgg 1620

gctccaattt ttgtgaggca atcaaacttc aagcttcctt ctgatagtaa agtgcctatt 1680

atcatggttg gtcctggaac tggattggct cctttcagag gtttcttaca ggaaagatta 1740

gctttgaaag aatctggagt agaattgggg ccttccatat tgttctttgg atgcagaaac 1800

cgtgcaatgg attatatata cgaggatgag ctgaacaact ttgtcgagac tggtgctctc 1860

tccgagttgg ttatcgcctt ctcgcgtgaa ggtccaacga aagaatacgt gcaacataaa 1920

atgacagaga aggcgtcaga catctggaat ttgatatcac aaggtgctta cttatatgta 1980

tgcggtgatg caaagggaat ggctagagac gtccacagaa ctctccacac catcgtgcaa 2040

gaacagggat ctcttgacag ctcgaaagct gagagcatgg tgaagaatct acaaacgagc 2100

ggaaggtatc tgcgtgatgt gtggtga 2127

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-F

<400> 8

ttaagcttgg taccgatggc agctttgttg gctttg 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-R序列

<400> 9

gatgcggccc tctagttaat attcatacaa ttttgg 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> MC6408opt-Trp-F 序列

<400> 10

ggaatattaa gcttgatggg ttatttttct agatct 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> MC6408opt-Trp-R序列

<400> 11

gcggccctct agatgttaag aagtaataga tggaat 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-F序列

<400> 12

ggaatattaa gcttgatgca atcggaatcc agttct 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-R序列

<400> 13

gatgcggccc tctagtcacc acacatcacg cagata 36

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> PYES2-Detect-F序列

<400> 14

accccggatc ggactactag c 21

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> PYES2-Detect-R序列

<400> 15

tccttccttt tcggttagag cgga 24

Claims

1.一种以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，是一种将博落回叶片原液直接进行生物转化，使原液中的原阿片碱与别隐品碱转化成高价值的血根碱与白屈菜红碱的方法，具体包括如下步骤：

S1、博落回叶片原液前处理，具体如下：

（1）将博落回叶片放于35～45℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

（2）将步骤（1）制得的叶片粉末按比例加入一定体积pH=8.0的TE缓冲溶液中，配置呈一定比例的缓冲液，即前体溶液；前体溶液中叶片粉末的浓度为0.2～0.8g/mL；将所述前体溶液放入高压蒸汽灭菌锅中110～120℃灭菌25～35 min或者放入超声波清洗器中超声25～35 min；

（3）之后，将所述前体溶液4500～5500rpm离心4～6 min，上清液过0.2～0.25μm滤膜，即得；

S2、构建酵母工程菌：将博落回普罗托品-6-羟基化酶基因与辅酶基因CPR、二氢苯并菲啶氧化酶基因一起构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中，并进行转化，获得重组酵母工程菌株；

所述普罗托品-6-羟基化酶（P6H）基因包括MC11229、MC11218及MC11229opt，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3所示；

所述二氢苯并菲啶氧化酶（DBOX）基因包括MC6408、MC6407以及MC6408 opt，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；

所述辅酶基因包括CuCPR，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

S3、以步骤S1前处理后的博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌，温度30℃ 下，发酵培养24小时；

2.根据权利要求1所述的以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，所述表达载体的质粒选自PYES2。

3.根据权利要求1所述的以博落回叶片原液为底物合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。