CN107723300B - 过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及CgGsh1基因的克隆及利用该基因在产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)中的过表达，获得2‑苯乙醇耐受性及产量均提高的产甘油假丝酵母重组菌株。方法是，利用如SEQ ID No.2和3所示的引物扩增产甘油假丝酵母基因组DNA片段，确定该扩增的DNA片段序列与酿酒酵母Gsh1基因为同源性序列，命名为CgGsh1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。利用CgGsh1基因与GAP强启动子构建了过表达重组载体pGAPa‑CgGsh1，通过化学转化法将该重组载体导入尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母中，获得重组菌株。与空载对照菌株相比，重组菌株在高浓度2‑苯乙醇(4g/L)外界环境下具有较明显的生长优势。且在发酵结束时，重组菌株的生长量提高了8.0％，2‑苯乙醇的产量提高了9.1％，达到3.6g/L。

Description

过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及 产量

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及产甘油假丝酵母CgGsh1基因的克隆及利用该基因在该菌株中的过表达，进而提高菌株2-苯乙醇耐受性及产量。

背景技术

2-苯乙醇，因具有淡雅、细腻而持久的玫瑰香气，广泛应用于食品、化妆品和日化用品等产业中。2-苯乙醇的化学合成法存在产物纯化困难、危害人类健康和环境安全等诸多弊端。且随着生活水平的提高和对健康的关注，各行业更倾向使用天然的2-苯乙醇。然而，天然的2-苯乙醇主要存在于玫瑰、茉莉、水仙等植物精油中，天然含量较低，提取损耗大，往往不能满足人们的需求。

目前微生物合成2-苯乙醇的途径主要有2种，莽草酸途径和艾利希途径。莽草酸途径主要以葡萄糖为底物从头合成2-苯乙醇，但由于该途径代谢支路长，存在多种反馈抑制作用等缺点，产量较低，一般仅为400-500mg/L。当在培养基中添加L-苯丙氨酸时，微生物可以直接利用L-苯丙氨酸通过艾利希途径大量合成2-苯乙醇，但由于高浓度的2-苯乙醇对菌株具有较大的毒害作用，因此产量大都低于4g/L。

谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽，它是一种细胞保护剂和信号分子。研究表明，当细胞受到外界逆境时，会直接或间接地受到代谢过程的影响而产生活性氧ROS。谷胱甘肽作为生物体内的主要抗氧化物质，能够抵抗ROS对疏基的破坏，保护细胞中的蛋白质和酶类不被氧化。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，具有高效的2-苯乙醇合成能力，及较完整的基因改造工具，为进一步分子改造菌株提高2-苯乙醇的耐受性及产量提供了有利的基础。

发明内容

本发明的目的是通过过表达谷胱甘肽合成途径中的谷氨酸半胱氨酸连接酶基因CgGsh1，提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先克隆了产甘油假丝酵母中的Gsh1同源基因，申请人将其命名为CgGsh1基因，通过在GAP强启动子控制下，在尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母中过表达CgGsh1基因，导致产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量均得到提高。具体操作步骤为：

步骤1：以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物CgGsh1F(SEQ ID No.2)和CgGsh1R(SEQ ID No.3)PCR扩增CgGsh1基因。

步骤2：利用限制性酶切位点将其插入到产甘油假丝酵母过表达重组载体pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得重组载体pGAPa-CgGsh1。该载体筛选标记为尿嘧啶合成基因Ura5(SEQ ID No.4)，整合位点为5.8s。

步骤3：经限制性内切酶Hind III线性化后，通过醋酸锂(LiAC)转化法将其导入尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母感受态细胞中，线性化的重组载体pGAPa-CgGsh1通过同源重组整合到产甘油假丝酵母的5.8s序列。经MM平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，获得过表达CgGsh1基因的产甘油假丝酵母重组菌株。

步骤4：验证该基因CgGsh1在提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明通过过表达产甘油假丝酵母菌株CgGsh1基因，导致在4g/L 2-苯乙醇中，重组菌株2-苯乙醇的耐受性有明显提高。

2.本发明通过过表达产甘油假丝酵母菌株CgGsh1基因，导致重组菌株2-苯乙醇的生物量及产量分别提高了8.0％和9.1％，产量达到3.6g/L。

附图说明

图1谷胱甘肽合成途径的概要。

图2CgGsh1基因的克隆。

图3重组载体pGAPa-CgGsh1构建流程图。

图4产甘油假丝酵母过表达CgGsh1原理示意图。

图5梯度稀释点板验证重组菌株2-苯乙醇的耐受性。

图6重组菌株摇瓶发酵合成2-苯乙醇。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述。

实施例1

重组载体pGAPa-CgGsh1的构建

以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物CgGsh1F和CgGsh1R PCR扩增CgGsh1基因。连接T-Vector pMD19simple(Ts)，送至上海生工测序。测序正确后将CgGsh1与产甘油假丝酵母整合表达载体pGAPa经Stu I和Sac II双酶切后，连接获得重组载体pGAPa-CgGsh1。

实施例2

挑取一环尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母菌株接种在液体YPD培养基，30℃过夜培养。取100μL过夜培养液转接到新鲜YPD中，30℃培养4-6小时，使培养液0D₆₀₀达到0.8-1.2，离心收集菌体。重组载体pGAPa-CgGsh1经Hind III线性化后，用醋酸锂转化法，将其转入尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母菌株感受态细胞中，涂布在MM平板，30℃培养2-3天获得单菌落。挑取单菌落提取基因组进行PCR验证正确后，获得重组菌株。

实施例3

分别挑取1环空载对照菌株及重组菌株接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。测其OD₆₀₀，并用无菌水稀释至OD₆₀₀为1。按照10倍稀释方法分别获得OD₆₀₀为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的菌液。取上述菌液2uL依次点板在含不同浓度2-苯乙醇(0g/L，1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，3.5g/L，4.0g/L)的YPD平板上，30℃培养48h，观察对照菌株及重组菌株的生长情况。结果表明：在高浓度2-苯乙醇(4.0g/L)中，重组菌株的生长情况有明显优于对照菌株。

实施例4

分别挑取1环空载对照菌株及重组菌株接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入含有30mL发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH₂PO₄ 5g/L，酵母粉4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，余量为水)的250mL锥形瓶中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，时间为72h，发酵结束。

发酵液中2-苯乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)分析，具体如下：将发酵液进行离心，10,000r/min，离心后再用0.45μm微孔滤膜过滤处理，测量设备采用高效液相色谱仪(Agilent,USA)，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,10μm；Ailite,中国)，流动相为甲醇:水＝50:50(v/v)，流动相流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长260nm，进样10μL。发酵过程中对菌株的生长情况及2-苯乙醇的产量进行检测。与空载对照菌株相比，发酵结束时，重组菌株的生物量提高了8.0％，2-苯乙醇的产量提高了9.1％，达到3.6g/L。

序列表

<110> 江南大学

<120> 过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量

<130> 20171128

<141> 2017-11-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1980

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenes)

<400> 1

atgggattgt tgtctttagg tacaccactc cattggaacg agtccaagaa attggctgat 60

catgtgaggg aaaacggtat tactcagcta ctcaattctt atcggatttc acagcccagg 120

gacaacgata ccttttattg gggcgatgag attgaatata tgatggtgtc gtttaatgag 180

agggagaaat cattaaaact gtctattgat cacgatttcg tcttggataa cttatcagaa 240

gagggtaaga gtttccagaa atctcttgat aatgacgtgc tttttcatcc cgaatacgga 300

cgttttatgc ttgaggcaac tccactgaga ccatacaatg gtgatcacct gaaggattat 360

ttctatgtcg aggagaatat gcatattaga cgtaaattgg cgattgagga aattgaggat 420

ccaaacgttt atccactgac attgacttcg ttccccttga tgggggtcaa agatttttgt 480

tctccttcaa ctattgttca ggggaattca tcaaaatcgt tgttcttgcc cgatgaaatc 540

atcaataagc atgtaaggtt cccaactttg acggcaaaca tccgtcgtcg ccgtggccaa 600

aaggttgcaa taaatatccc tctctataag gatgtcaata caagatcttt ggatgcaaga 660

gatccttcta ttccaagaag atcgctcttc ccctattctg ataaggaggc ccattataat 720

tcccttcatc cagctgctaa acccggtcat atatatatgg attcaatggg atttggtatg 780

ggctcatctt gtttacaagt cacaatgcag gcaaagaata tcaacgatgc acgctacctc 840

tttgattcct tggttaatat tgcgcctttt atgttggcag ttactgccgc agcacctgtt 900

ttcaggggac atttggccga ccaagatgtt aggtggaatg ttatctctgc ctcggttgat 960

gatagaactc cttttgaaag gaacgaagaa gcactaccag aacatccatt atacggtggc 1020

catgaagatc acctacaggg aaagtcaagg atgcaaaaga ttcctaaatc tagatatgat 1080

tcaatcgatc aatatttagg tggctcaaaa ttcttcaaat cagaatacaa tgatattgat 1140

gtaccaataa atcaggaaat tctgaatcgg ttaatacaga atggtatgga tgaagatttg 1200

tctagacatt ttgcgcattt attcattagg gatccactag ttttattctc tgagaggata 1260

gagcaggata acgaaagttc aatggatcat tttgagaaca tccaatcaac caactggcaa 1320

acccttagat tcaaggttcc atcacaagat tccacaccgg gctcaaacaa accaggatgg 1380

agggttgaat taagaccaat ggaaatctca attaccgatt tcgagaatgc agcgtattct 1440

gtgttttcta tattattaag tcgtgcaatt ttacatttcc aactaaacaa ctacctacca 1500

atatctaaag tagaagaaaa tatgaagaca gcccatcata gagatgcagt caataacgat 1560

ctgttcttta tacgaaccaa cattaatgat tctggagatg caactattaa agaattatca 1620

ttgaatgaga tattcaatgg ttctcctaac ttcaaagggt tcctaccgat tgtacgtgaa 1680

tatgttgata ttgccttccc ggaaattgac actgtctcat caaagaaatt agagatgtat 1740

ttcaatctca tttcgggaag agccagtggc tcaatattaa caactgcaaa attcatgaga 1800

gagatgatcg tcaaccatag agattatcgg aaggatagca ttgttcccga atccgctgca 1860

tatgagtttt gtcagtttgc caagaaattg agtgtatatg agccggaagc agtttcccaa 1920

ttttttagta cgcaaattgc acagtatttg aatgataata aatatcatga aatattttaa 1980

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gaaggcctat gggattgttg tctttaggta cac 33

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tccccgcggt taaaatattt catgatattt attatcattc 40

<210> 4

<211> 1611

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenes)

<400> 4

ctcgaaaacg gcgacggtat tagacgtccc gattgtaatt gacttagtcc tcttaggttc 60

actatttgcc tcttgtggtt cttatcaaaa ttgttgccgg ttgtggcagc tggagtagtg 120

cttatagtac tgaatgatga tgacgatgac aatctcctct ttggcctgat tgactttggc 180

agtgaatgaa aatgctgtag tgatgattta ttggaccttt gagaagtaga tagccctgtt 240

attattggcg taactccatt tacttcataa ggtgagcctg gtggtgatat cgaaatctgc 300

tgtaatatat tcataatatt attagtggtc aatgatgtct cattatacac gttctcactt 360

gacataatgt aattgtgctt cctgccttgt tccttagagt atattctaaa ttactatagt 420

aaacaccttt aaatgtattc caaaatttgt caaaagtgat caaaccaatc agttgggcgg 480

ccaagttccc ctctgatttc tgtctttgtc gataagtagg gaataaccga tagagtggat 540

atttttattc gtgatgattt tttttttctc gccatttctc atttttgcta tgattcatga 600

gagaaaaaaa gtgtttttgt ctaatccaga aactatcttt aaaagttaat tttcatataa 660

ttgagtgtct tgaatcacct ggtcaagtca gatcattcag atcgcatata tttaattagc 720

atgccttcat acaaggaaac atttcttcaa gctgctttag atgctgaagc tcttaaattt 780

ggtactttca ctttaaagag tggaagaata tctccatatt tcttcaatat gggattattc 840

agcactgcaa agaccttgag tacattaggt gaatcttatg cacgtgccat cgttgagtcg 900

ggaattgaat ttgatatatt atttggtcca gcttataagg gtatcccact agcggcaatc 960

actgttacaa aattgtacga aatcggcggt gcaaaatatg ccaacattgg ctattctttc 1020

aacaggaagg aaaagaaaga ccatggtgaa ggaggttcta ttgtcggatg caatatgaag 1080

ggtaaaaaga ttctaatcat tgatgacgtt atgaccgcag gtactgccat caatgaagca 1140

tttggtatta tttctgcaga aggtggtaat gctgttggtt gcattattgc tttggataga 1200

atggaaacta ccaaggactc caatgactct gcaactaaca ttgttgcaaa aagatacggc 1260

gtccctgttt tctctatcgt ttgctttgat gacattattg aggtcttgaa agatcagctt 1320

tctgaagaac aaatggagaa aatcaacgaa tacaggaaac agtatgttcc agctaaatag 1380

agcacctcct tcttagtata cgtctcttat tatacagaaa tatttgctta gattttttac 1440

ttatcatata tataattcca attgttgact aacctctaat tctttggatt ttatgtttta 1500

tctttttggc ttcaacgggc ttctctgtct cagcggcaga tttcatataa gcacctgcag 1560

tttctgggtg tttcataatg aggaatgagt gcattggtac aatggtgttc a 1611

Claims (4)

1.一种来源于产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有提高2-苯乙醇耐受性及产量的CgGsh1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.克隆权利要求1所述基因的引物CgGsh1 F和CgGsh1 R，其核苷酸序列如下所示：

CgGsh1 F：5’-GAAGGCCTATGGGATTGTTGTCTTTAGGTACAC-3’；

CgGsh1 R：5’-TCCCCGCGGTTAAAATATTTCATGATATTTATTATCATTC-3’。

3.一种利用CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量的方法，其包括如下步骤：

步骤1:设计如权利要求2所述的引物，从产甘油假丝酵母基因组中克隆具有提高2-苯乙醇耐受性及产量的CgGsh1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

步骤2:利用限制性酶切位点将其插入到产甘油假丝酵母整合表达载体pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达重组载体pGAPa-CgGsh1。

步骤3:通过醋酸锂(LiAC)转化法将其导入尿嘧啶营养缺陷型产甘油假丝酵母感受态细胞中，获得过表达CgGsh1基因的产甘油假丝酵母重组菌株。

4.权利要求1所述的基因在提高2-苯乙醇耐受性及产量中的应用，所述应用为将权利要求1所述的基因在产甘油假丝酵母中表达。

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