CN102952813B - 蓝色天然染料的合成方法及提取工艺 - Google Patents

蓝色天然染料的合成方法及提取工艺 Download PDF

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Abstract

一种蓝色天然染料的合成方法及提取工艺，属于生物工程领域。本发明的目的是采用生物材料合成无毒环保蓝色天然染料的合成方法及提取工艺。本发明以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物C1:5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ　ID　NO：1。本发明的利用工程菌合成蓝色天然染料indigoidine的方法及其提取工艺染料产率高，不受原料来源限制，操作过程易控制，生产成本低。

Description

蓝色天然染料的合成方法及提取工艺
技术领域
本发明属于生物工程领域。
背景技术
近些年来，随着科技的进步及人们生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，尤其对无毒环保型染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。目前的染料按其来源，主要可以分为两大类：天然染料及合成染料。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。
发明内容
本发明的目的是采用生物材料合成无毒环保蓝色天然染料的合成方法及提取工艺。
本发明以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物C1: 5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ　ID　NO：1。
本发明上述基因翻译后得到的indigoidine合成酶，命名为SC-indC，其序列为： SEQ　ID　NO：2。
本发明以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物B1: 5'-aaGGATCCatgttcgacctggacggaac-3'和引物B2：5'-aaGAATTCtcagtcgaccgggggctgct-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成调控基因SC-indB，扩增得到的SC-indB基因序列为：SEQ　ID　NO：3。
本发明上述调控基因翻译后得到的indigoidine合成调控蛋白，命名为SC-indB，其序列为： SEQ　ID　NO：4。
本发明扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC；构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为C。
本发明扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC；扩增得到的SC-indB基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pACYCDuet-1质粒载体中，即得重组质粒pACYCDuet-1/SC-indB；构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC和pACYCDuet-1/SC-indB共转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为CB。
本发明合成蓝色天然染料的方法，
a、工程菌C的种子培养液；
b、制作indigoidine标准曲线；
c、工程菌C发酵液中indigoidine的提取；
d、工程菌C发酵液中indigoidine的合成。
本发明合成蓝色天然染料的方法，
a、工程菌CB的种子培养液；
b、制作indigoidine标准曲线；
c、工程菌CB发酵液中indigoidine的提取；
d、工程菌CB发酵液中indigoidine的合成。
本发明采用SC-indC合成蓝色天然染料的方法，
a、从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL上述中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌C的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
d、吸取1mL工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4～1.0时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃～25℃的摇床之中连续培养1～56个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液进行indigoidine的提取。
本发明采用SC-indC和SC-indB合成蓝色天然染料的方法，
a、从保存有工程菌CB的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌CB的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL及氯霉素25ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌CB的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌CB的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净的蓝色DMSO溶液；经液相色谱及质谱鉴定此化合物与工程菌C所产生的化合物相同，为indigoidine；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
d、吸取1mL工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度；待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养2～56个小时，每隔2小时吸取1mL工程菌CB的发酵液进行indigoidine的提取；根据标准曲线得到1mL工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到不同时间1L工程菌CB的发酵液中 indigoidine的总产量；经计算得知，控制工程菌CB的培养温度为18℃，添加终浓度为200uM IPTG时发酵液在600nm波长下吸光度为0.6，发酵时间为2～56个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量为0.59g/L～3.93g/L；当发酵时间为28个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine产量达到最高，为3.93g/L。
本发明与现有技术相比存在显著的进步和积极的效果：
1、首次从菌株ATCC49982中克隆得到SC-indC及SC-indB基因，并将这两个基因在工程菌BL21（DE3）中共表达，合成蓝色天然染料indigoidine。
2、本发明的利用工程菌合成蓝色天然染料indigoidine的方法及其提取工艺染料产率高，不受原料来源限制，操作过程易控制，生产成本低。
3、蓝色天然染料indigoidine的合成原料为菌体自身所含氨基酸，即谷氨酰胺，无毒无害，可以食用，易于降解，不会对生态环境造成污染。
附图说明
图1 为本发明利用工程菌C合成的蓝色天然染料indigoidine；图1中左侧为未转化重组质粒pET28a(+)/SC-indC的工程菌BL21（DE3）发酵液的图片；右侧为工程菌C发酵液的图片；
图2为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.4，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例7）；
图3为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例8）；
图4为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.8，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例9）；
图5为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为1.0，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例10）；
图6为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，培养温度为18℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例11）；
图7为本发明中当控制工程菌C在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.8，培养温度为18℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例12）；
图8为本发明中当控制工程菌CB在添加终浓度为200uM的IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，培养温度为18℃时，indigoidine产量随时间变化曲线图（实施例13）；
具体实施方式
本发明SC-indC及SC-indB基因的扩增及重组质粒的构建
用植物基因组DNA提取试剂盒纯化菌株编号为ATCC 49982的褐色产色链霉菌Streptomyces chromofuscus的基因组DNA；
以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物C1: 5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ　ID　NO：1。
本发明上述基因翻译后得到的indigoidine合成酶，命名为SC-indC，其序列为： SEQ　ID　NO：2。
本发明扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC。
本发明以纯化的褐色产色链霉菌基因组DNA作为模板，使用引物B1: 5'-aaGGATCCatgttcgacctggacggaac-3'和引物B2：5'-aaGAATTCtcagtcgaccgggggctgct-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成调控基因SC-indB，扩增得到的SC-indB基因序列为：SEQ　ID　NO：3。
本发明上述调控基因SC-indB翻译后得到的indigoidine合成调控蛋白命名为SC-indB，其序列为： SEQ　ID　NO：4。
本发明扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC；构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为C。
本发明扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC；扩增得到的SC-indB基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pACYCDuet-1质粒载体中，即得重组质粒pACYCDuet-1/SC-indB；构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC和pACYCDuet-1/SC-indB共转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为CB。
本发明合成蓝色天然染料的方法，
a、工程菌C的种子培养液；
b、制作indigoidine标准曲线；
c、工程菌C发酵液中indigoidine的提取；
d、工程菌C发酵液中indigoidine的合成。
本发明合成蓝色天然染料的方法，
a、工程菌CB的种子培养液；
b、制作indigoidine标准曲线；
c、工程菌CB发酵液中indigoidine的提取；
d、工程菌CB发酵液中indigoidine的合成。
本发明采用SC-indC合成蓝色天然染料的方法，
a、从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL上述中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌C的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
d、吸取1mL工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4～1.0时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃～25℃的摇床之中连续培养1～56个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液进行indigoidine的提取。
本发明采用SC-indC和SC-indB合成蓝色天然染料的方法，
a、从保存有工程菌CB的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌CB的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL及氯霉素25ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌CB的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌CB的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净的蓝色DMSO溶液；经液相色谱及质谱鉴定此化合物与工程菌C所产生的化合物相同，为indigoidine；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
d、吸取1mL工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度；待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养2～56个小时，每隔2小时吸取1mL工程菌CB的发酵液进行indigoidine的提取；根据标准曲线得到1mL工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到不同时间1L工程菌CB的发酵液中 indigoidine的总产量；经计算得知，控制工程菌CB的培养温度为18℃，添加终浓度为200uM IPTG时发酵液在600nm波长下吸光度为0.6，发酵时间为2～56个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量为0.59g/L～3.93g/L；当发酵时间为28个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine产量达到最高，为3.93g/L。
上述的褐色产色链霉菌（Streptomyces chromofuscus）购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），其编号为ATCC 49982；植物基因组DNA提取试剂盒及pET28a(+)和pACYCDuet-1质粒载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；限制性核酸内切酶NdeI、HindIII、BamHI和EcoRI购自宝生物工程（大连）有限公司；引物C1、C2、C3和C4订购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
（1） 重组质粒对工程菌BL21（DE3）的转化
参照《分子生物学实验指导》（第2版）介绍的方法，转化重组质粒pET28a(+)/SC-indC进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为C；共转化重组质粒pET28a(+)/SC-indC和pACYCDuet-1/SC-indB进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为CB；
上述的工程菌BL21（DE3）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（2） 工程菌种子培养液的制备
A、工程菌C的种子培养液的制备
    从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
B、工程菌CB的种子培养液的制备
从保存有工程菌CB的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌CB的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL及氯霉素25ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
上述的卡那霉素和氯霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（3） indigoidine标准曲线的制作
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
上述的卡那霉素、IPTG、甲醇、乙酸乙酯、正己烷和DMSO 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（4）工程菌C发酵液中indigoidine的提取
取1mL工程菌C的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
上述的甲醇和DMSO 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（5）工程菌CB发酵液中indigoidine的提取
取1mL工程菌CB的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净的蓝色DMSO溶液；经液相色谱及质谱鉴定此化合物与工程菌C所产生的化合物相同，为indigoidine；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量；
 上述的甲醇和DMSO 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（6）工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4～1.0时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃～25℃的摇床之中连续培养1～56个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；经计算得知，当控制工程菌C的培养温度为18℃～25℃，添加终浓度为200uM IPTG时发酵液在600nm波长下吸光度为0.4～1.0，发酵时间为1～56个小时时，工程菌C的发酵液中indigoidine的产量为0.88g/L～2.78g/L；其中在工程菌C的培养温度为18℃，添加终浓度为200uM IPTG时发酵液在600nm波长下吸光度为0.6，发酵时间为28个小时时，工程菌C的发酵液中indigoidine产量达到最高，为2.78g/L；
上述的卡那霉素和IPTG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
（7）工程菌CB发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）B.中得到的工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度；待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养2～56个小时，每隔2小时吸取1mL工程菌CB的发酵液按照步骤（5）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线得到1mL工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到不同时间1L工程菌CB的发酵液中 indigoidine的总产量；经计算得知，控制工程菌CB的培养温度为18℃，添加终浓度为200uM IPTG时发酵液在600nm波长下吸光度为0.6，发酵时间为2～56个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量为0.59g/L～3.93g/L；当发酵时间为28个小时时，工程菌CB的发酵液中indigoidine产量达到最高，为3.93g/L；
上述的卡那霉素、氯霉素和IPTG 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
 实施例1  重组质粒对工程菌BL21（DE3）的转化
参照《分子生物学实验指导》（第2版）介绍的方法，转化重组质粒pET28a(+)/SC-indC进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为C；共转化重组质粒pET28a(+)/SC-indC和pACYCDuet-1/SC-indB进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为CB。
实施例2  工程菌种子培养液的制备
A工程菌C的种子培养液的制备
    从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
B工程菌CB的种子培养液的制备
从保存有工程菌CB的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌CB的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL及氯霉素25ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0。
实施例3  indigoidine标准曲线的制作
吸取1mL实施例2A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线。
实施例4  工程菌C发酵液中indigoidine的提取
取1mL工程菌C的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量。
实施例5  工程菌CB发酵液中indigoidine的提取
取1mL工程菌CB的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净的蓝色DMSO溶液；经液相色谱及质谱鉴定此化合物与工程菌C所产生的化合物相同，为indigoidine；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量。
实施例6 工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL实施例2A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养22个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到不同发酵时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图2所示：
由图2可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.4，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为13小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为0.88g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例7工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL实施例2A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养22个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图3所示：
由图3可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为13小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为1.73g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例8工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养22个小时；每隔1小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图4所示：
由图4可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.8，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为13小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为1.55g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例9 工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到1.0时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养22个小时；每隔半小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图5所示：
由图5可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为1.0，培养温度为25℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为13小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为1.33g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例10 工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养56个小时；每隔2小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图6所示：
由图6可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，培养温度为18℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为28小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为2.78g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例11 工程菌C发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）A.中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养56个小时；每隔2小时吸取1mL工程菌C的发酵液按照步骤（4）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌C的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌C的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图7所示：
由图7可知，当控制工程菌C在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.8，培养温度为18℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为28小时时，工程菌C的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为2.54g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
实施例12 工程菌CB发酵液中indigoidine的合成与产量计算
吸取1mL步骤（2）B.中得到的工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度；待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于18℃的摇床之中连续培养56个小时，每隔2小时吸取1mL工程菌CB的发酵液按照步骤（5）所述过程进行indigoidine的提取；根据标准曲线计算得到1mL工程菌CB的发酵液中indigoidine的产量进而计算得到不同时间1L工程菌CB的发酵液中 indigoidine的总产量；产量如图8所示：
由图8可知，当控制工程菌CB在添加终浓度为200uM IPTG时，发酵液在600nm波长下的吸光度为0.6，发酵温度为18℃时，indigoidine产量随时间的增长逐渐升高；在发酵时间为28小时时，工程菌CB的发酵液中 indigoidine产量达到最高值，为3.93g/L；随后indigoidine的产量开始下降。
<110>  东北电力大学
<120>  蓝色天然染料的合成方法及提取工艺
<160>  4
<210>  1
<212>  DNA
<400>  1
ATGAGCGTAGAGACCATCCCCTGCTCTCGTCGTGCCGCCCTCGGCCTGCCCGGCCTGTTGCGCGAACGAGCTCGGGCCACCCCCGACCGGACAGCCGCCGTTCACGAGCACCAGAGCCTGACATTCGCCCAGTTGACGGAGGACAGCTCCCATGTGGGAGCGCTCCTGCGGCAGGCCGGGGTGGGCCGGGACAGCCGGGTCGGCGTGTTCATGGAGCCGTCGCTCGACCTGCTGACGGGCGTCTGGGGAATCCTGTGGGCCGGCGGATGCTACGTACCGTTGTCCCCGGAATACCCGGAGGAGAGGATCGCGTACATGCTGGCGGACGCCGGCGTCGACATCGTTCTCACCCAGGAATTCCTTCGGTCGACCCTTCAGGAGCTCGCTCCGGCCGGGGTCGTTGTTCTCACTCTCGACGAGATGTTGAGGACGGCGGAGAGGGACGGCAGTGCATTCGGCCGGCCGGAGCCCGAGGTACGGCCCGACGATCTCGCCTATGTCATCTACACCTCCGGCAGCACCGGAAAGCCAAAAGGTGTGATGGTCGAGCACCGGAGCATCGTGAGTCAAATGCGATGGCTGCACGACGAGTGCGGTATCGATGAAAACGAAATAATACTGCAGAAGACCCCGATGAGTTTCGATGCCGCGCAGTGGGAATTACTCGCCCTCGCCTGCGGCAGCACCGTGGTGATGGGATCCTCCGGTATCTACCGCGACCCCGAGGCGATCATCTCCACCGTCCAACGGCACGGCGTGACCACCCTCCAGTGCGTGCCCACCCTGCTCCAGGCGCTCCTGGACACCGAGAAGTTCCCCGACTGCGGGACCCTGCGCCGCATCTTCAGCGGGGGCGAGGCGCTCTCCCGGAGTCTCGCCGCGCAGTGCCTGGACACCATGCCGGGGGCCCGTCTGGTCAACCTCTACGGCCCCACCGAGTGCACCATCAACGCCTCGTCCTTCGTGGTGGACCGCGCCGCGCTGGAGGACGGGCCGCTCGTCATGCCGATCGGCACCCCCGTGCACGACACCTCCCTGCACGTCCTGAGACCGGACGGTGCGCCGGTCTCCGCCGGGGAGATCGGCGAACTGTACATCGGCGGTGTGCAGGTGGCCCGCGGCTACCTCGGCCGCCCGGACCTGACCGGCGACCGGTTCATGGCCGACCCCTTCTCCGACGCGCCCGGCTCCCGCCTCTACCGGACCGGCGACCTCGCCCATGTCAACGCGGACGGCACGGTGCAGTTCGTCGGACGCGCCGACAACCAGGTCAAGCTGCGCGGCTACCGGGTCGAACTGGACGAGATACGCCAGACCGTCGAGACGCACGACTGGGTCCGCGCCGCGGCCGTCCTGCTCCGCGACGACGCCACCACGGGCTTCCAGAACCTCGTCGCCTTCGTCGAGCTCAACCCCAAGGAAGCCGCCCTGATGGACCAGGGCAACCACGGCTCCCACCACCAGTCCAAGGCCAGCCGGCTCCAGGTCAGGGCCCAACTGGCCCACCCCGGCTGCCGCGACGACGCCGATCTGGCCGGCCGGGCGGCCATCGACCTGCCCGGCGCCGAGGCCACCCCCGGGCAGCGGGCCCTCGCCTTCTCCCGCAAGACGTACCGCTTCTACGAGGGCTCCCCGGTGACCCGGGACGACATCCTGCACCTGCTCGGCCCCCGTCCCCGGCCGCGGCCGTCCGCCCGTACCTCCGACATCGTCGGCCGCGACGAACTCGGTACGATCCTGCGGAACTTCGGCCGTCACCTCAGCGACCAGAGGCTGCTGCCCAAGTACGCCTACGCCTCACCCGGCTCCCTGTACGCGACGCAGTTGTACGTCGAGATCGGCGGCGGGCACGACGTTCCCGCGGGCCTGTACTACTACCACCCGCTCCACCACCGGCTGGTGCTCGTCGGCCCGGCCTCCGAGACCGAGACCTCCCCGGTACGGATCCACTTCCTCGGCAAGCACGGCGCCATCGAGCCGGTCTACCGCAACAACGTCCGCGAGGTCCTGGAGATCGAGGCGGGCCACATGGTCGGCCTGTTCGAGGAGGTGCTGCCGGCCCACGGCCTGCGCATCGCCGCGGCCGCGTACCAACCGGCCGTCAGACACCGTCTCGACTGCGCGCCGGAGGACCACTACCTGGGCAGCTTCGACCTCCTTCCGCAGGCGCGGGGCGCGTCCGAGGACACCGACACCCTCGACATCTACGTCCAGGCCCACTCCACCCGGATCGAGGGCCTGCCGCCGGGTCAGTACCGGTACACCGGCGCCGGCCTCGTCCGTATCGGCGACGACGTGATCCTCAAGAAGCACGTCATCGCCATCAACCAGCGGGTCTACGAGCGTTCCGACTTCGGTATCAGCCTGGTCGCCACCGGTTCCGCCTCCTGGCGGCGCTATCTCGACCTGGGTCGCGGGCTCCAGCGCCTCCAGATGAACGACCTGCACCTCGGCTTCATGTCCTCGGGCTACAGCTCGAAGTCCGGTAACGACCTGCCGTCGGCCAAGCGGCTGGGCCGGATCCTCGCCGACGGCGGGTTGCCCGCCGGACCGTCGTACTTCTGCGTCGGCGGGCGTGTCAGCGACGCGCAGTGGCGCGGCGAGGACATGAAGGAGGACGTGGTCCACATGCAGGGGCCCGCCGAGCTGATCAAGGAGGATCTGGCCGCGCTGCTGCCCCGCTACATGCTGCCCAACCGGATCGTCGTCCTGGACCGGCTGCCCCAGACCGCCAACGGCAAGATCGACCTGAAGGCCCTGCAGACCACTCAGGAAGCCCAACTGACCGTCGGCGAACGCGCTTTCATGGCTCCGCGCACCCCGCTGGAGCGGCGGATCCGCGACATCTGGCAGGCGGTGCTCAAGCGGGACCAGGTCTCCGTCACCGACGACTTCTTCGAACTGGGCGGGAACTCCCTGCTCGCCGTGGCTCTGGTCAGCCGCCTGAACGCGGACTTCGGCGGCGCGATCCCCCTGCAGATCCTGTTCGAGGCCCCCACCGTGGAGAGGCTCGCCGCGGCCCTGGAGGCCACGTCACCCCGGCCCGCCTCCCGTCTGGTGCCGCTCCAGCCCGAGGGCAGGGGCACCCCGCTGTACTGCTGGCCGGGCCTCGGCGGCTACCCCATGAACCTGCGTCCGCTGGCCGCGGCCCTGGGCACGGAGCGGCCCGTCCACGGGGTCCAGGCCCACGGCATCAACCCCGGCGAGTTCCCCTACGACGATGTCCGTGCCATGGCCGCCGCCGATGTCGAGGCGATCCGGGAGATCCAGCCCCACGGCCCGTACCTGCTGTGCGGATACTCCTTCGGCGCCCGGGTCGCCTTCGAGGCCGCGCGCCAGTTGGAACAGGCGGGCGAGCAGGTGGAGCAGTTGTTCCTCGTGGCTCCCGGCCAGCCGCGGCTGCGCCCCGAGGACGCCGTCGGCGCGACCGGCCGGGCGGACTTCACGGACCGCGCCTTCCTCGCCCTGCTCTTCTCCGTCTTCGCCGGCACGCTCAGCGGCCCGCGACTGGACCAGTGCCTGCGCACCGTCACCGACGAGGACGGCTTCGTCGCATTCGTCACCGCGTCCTTCCCGGGACTCGGCGAGGAGCTGGTACGGGCGGTCACCGGGATCGTACGCCGCACGTACTCCCTCACCTACGAGTTCCACGAGCTGCGCGGACGCCGTCTCGACGCGCCCGTGACCCTGGTCAGGGCCACCGACGACAACTACTCCTTCATCGAGCACGAGGGCGGGTACTCCGCCCGGCCGCCCGCCGTCCACCAACTGCGGTCCGGCCACTACGAACTGCTGCGCGAGCCGCATGTCGCCCGGCTCGCCGCTGTCCTCAACGACCGGCTGTCCGCCGGTCCCAGCACGTCCCCCCGTCACAGCCAGCCGGCGCAAGCCACGGTCCAGGAGGTCGGAGTGCCCCACATCAACATCAAGCACTTCCCGGTGTCGATCACCGAGGAGAAGGAGCTGGAGCTGGTCGCCGCGGTCACCACGGCCGTGCGCAACGCCTTCGGCTGCACCGAGGAGGTCGTCTCCATCGCCCTGGAGCCCGTCGCCCAGGAGGTGTGGAACGAGCGGGTCTACATCCCCGAGATCGTCGCCCGGCAGGAGTTGCTGCGCAAGACGCCCAACTACTGA
 
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ATGTTCGACCTGGACGGAACCCTCGTCGACTCGCCCCGGGCGATCGTGGAGGCGTTCGCCGCCGCTTTCTGGGCGATGGGCCTCGCGCCCCGGGACCCGGCGGACATCCGGGCCACCATCGGCCTGCCCCTGGAGCAGGCGTTCGGGAAACTGCTGGGAGTACCGCAGAACGACCCCTCGGTCGCCGACGGCGTGGCCCGCTACCAGGAGGCGTTCCGCACCCTCATCCTCCCCCGCGCCCACTCGCTGGTCTTCCCCGGCGTCCCCGAGGGCCTCGCCGAACTGCGCCGTCACGGTGTCGTGGTGACGGTGGCCACGAGCAAGTTCCATGCCAGCGCCGATGCCCTGCTCACCGCCGCGGGCCTGCGCGACCACGTCACCACACTGGTCGGCGCCGACGACGTCACCCGTCCCAAGCCGCACCCCGAGTCGGGGCTGCTGATCCTCGGAGAGCTCGGCGCCCGGCCCGAGCACGCCGTGATGGTCGGCGACACCACCCACGACCTGAAGATGGCCGCGGCGGCCGGCCTGGCGTCCGTGGCGGTCACCTACGGGGTCCACGAGCGGGCGGAGCTGGAGACGGCCTCACCGACACACGTCGCCGACACGTTCGCCCAGGCCGTGGAGCAGATCCTCGCCGTCCTGCCGGCCGACGGCGGACCGGAGGACACCGGCACCGTCGAGAGCCTCCTGGACGACAGCACGTACCACATCGAGTTCAACGGCCACCTCACCAACCACATCAAGCACGCCGTCGTCGCCCTCGCCGGCCTCGGTGTCGACCCCGGCCGGATCAAGGCGTACCACGACAACTACATCGCCCTCACGCCGTACGGCTGCCGCGTCGAGCCGGCCAGACCTCCCCAGCGACTGATCGACGACGGCAACTGGCTCGAACACCTCGGCCGGCGCGAGGACTTCGCCGCGTACTGCGCGTTCTTCGACCGGCGCGAACGGGAACTGGGCATGGCGGGTCTGCTACGGCAGTACGTACCGCGCCTGCTCGCGGGCTGGGCCGGTGCGCTCCAGCACGCGACCATCCACCTGGGCTGGGCCCTGGACGCCGGCAACCGCCGCATGGCCATCGAGGGCATCGCCTACCTGGCCTTCGCGTACGTCGACTGCCATCCCGAACGCGCCGTGCCCTCGGAAGCGCCCGGCACCGACAAGCCCGGGGACTCGCTGCTGAGCATCGCCCGCCACTGGGAGGAGAACGGGCCCCGGCTCGGCGCCTGGGTCGAGGACCTGGTCGGAACCACGAGCGCCGACATCCACCCCGAACTCCTGCGGTCCGGGCTGCAGTACCGGATCGCCCGGATGCTCGGCGAGGGCCATCCGCTGATGTACGGGACACCCTCCTGGATCGCCGCGCAGGACCCCGACACCAGTTGGGAGCAGCTCGCCTACCTCGTCACCGTTCTCTACCTGACCGAACCGGGAGACTTCCTCCTGCTGCACCTGGTCACCGCGCTCCACGCGATGCGTCACATCGCGGACGCCCTCCCCGCCGAGCAGCAGCGGCGAGCGGTCGCGTGCTACTGGACCGGCATCCTCGGTGTGCTCTTCTCCCGGGGCCACTTCGTCGCCCCTTCGAAGCTGACCGCGATCGACAGCCTCTTCGACACCGCCCTGGACGACCTGGACGACCCGCGCTGGGCCCGGGAGTGGGACTGGCACATCGCGCGGGCCGTGGAGGAGGAAGAGGAGCACAACGCCAAGCTCGTCTACGTGATGCGCGAGTTGTGGCGCGGCTCGGGCGGCAGGTCCGTGTACCGCGTCGCCGCCGGGCAGTTCACCACCACCCCGGAGCTCCCCGCCACCTTCGAGCAGCCCCCGGTCGACTGA
 
 
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MFDLDGTLVDSPRAIVEAFAAAFWAMGLAPRDPADIRATIGLPLEQAFGKLLGVPQNDPSVADGVARYQEAFRTLILPRAHSLVFPGVPEGLAELRRHGVVVTVATSKFHASADALLTAAGLRDHVTTLVGADDVTRPKPHPESGLLILGELGARPEHAVMVGDTTHDLKMAAAAGLASVAVTYGVHERAELETASPTHVADTFAQAVEQILAVLPADGGPEDTGTVESLLDDSTYHIEFNGHLTNHIKHAVVALAGLGVDPGRIKAYHDNYIALTPYGCRVEPARPPQRLIDDGNWLEHLGRREDFAAYCAFFDRRERELGMAGLLRQYVPRLLAGWAGALQHATIHLGWALDAGNRRMAIEGIAYLAFAYVDCHPERAVPSEAPGTDKPGDSLLSIARHWEENGPRLGAWVEDLVGTTSADIHPELLRSGLQYRIARMLGEGHPLMYGTPSWIAAQDPDTSWEQLAYLVTVLYLTEPGDFLLLHLVTALHAMRHIADALPAEQQRRAVACYWTGILGVLFSRGHFVAPSKLTAIDSLFDTALDDLDDPRWAREWDWHIARAVEEEEEHNAKLVYVMRELWRGSGGRSVYRVAAGQFTTTPELPATFEQPPVD

Claims (4)

1.一种含有合成蓝色天然染料的基因的重组菌，以纯化的褐色产色链霉菌（Streptomyces chromofuscus）ATCC 49982的基因组DNA作为模板，使用引物C1: 5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ　ID　NO：1，其特征在于：扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC，构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为C。
2.一种含有合成蓝色天然染料的基因的重组菌，以纯化的褐色产色链霉菌ATCC 49982的基因组DNA作为模板，使用引物C1: 5'-aaTTAATTAAGGAGGAGCCCATatgagcgtagagaccatccc-3'和引物C2：5'-aaGCTAGCAAGCTTtcagtagttgggcgtcttgc-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成酶基因SC-indC，扩增得到的SC-indC基因序列为：SEQ　ID　NO：1；以纯化的褐色产色链霉菌ATCC 49982基因组DNA作为模板，使用引物B1: 5'-aaGGATCCatgttcgacctggacggaac-3'和引物B2：5'-aaGAATTCtcagtcgaccgggggctgct-3'通过聚合酶链式反应扩增indigoidine合成调控基因SC-indB，扩增得到的SC-indB基因序列为：SEQ　ID　NO：3，其特征在于：扩增得到的SC-indC基因通过限制性核酸内切酶NdeI和HindIII连接到pET28a(+)质粒载体中，即得重组质粒pET28a(+)/SC-indC；扩增得到的SC-indB基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pACYCDuet-1质粒载体中，即得重组质粒pACYCDuet-1/SC-indB，构建得到的重组质粒pET28a(+)/SC-indC和pACYCDuet-1/SC-indB共转化进入工程菌BL21（DE3）中，命名转化后的工程菌为CB。
3.利用权利要求1所述的重组菌合成蓝色天然染料的方法，其特征在于：
a、从保存有工程菌C的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌C的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL上述中得到的工程菌C的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌C的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌C的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到indigoidine的粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净indigoidine的蓝色DMSO溶液；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量。
4.利用权利要求2所述的重组菌合成蓝色天然染料的方法，其特征在于：
a、从保存有工程菌CB的固体培养基上挑取单个菌落于5mL含50ug/mL卡那霉素和25ug/mL氯霉素的LB培养基之中，于37 ℃，300rpm摇床中培养12小时，即得工程菌CB的种子培养液；所述固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；琼脂2%；pH 7.0；灭菌后添加卡那霉素 50ug/mL及氯霉素25ug/mL；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；
b、吸取1mL工程菌CB的种子培养液加入到1L 含50ug/mL卡那霉素的LB培养基之中，于37℃，300rpm的摇床中发酵培养；所述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1%； 酵母提取物 0.5%；NaCl 1%；pH 7.0；用分光光度计于600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为200uM的IPTG到上述发酵液中；将发酵液置于25℃的摇床之中连续培养5个小时；取200mL上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌CB的细胞；将去除细胞后的发酵液于21000×g离心10分钟得到粗提物；将粗提物用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除粗提物中的有机物；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次上述粗提物，从而得到纯净的化合物，经液相色谱及质谱鉴定此纯净化合物为indigoidine；将提纯后的indigoidine在天平上称重，每1mg所得提纯的indigoidine中加入1mL DMSO超声溶解，使indigoidine的最终浓度为1mg/mL；将此1mg/mL的indigoidine标准溶液用DMSO分别稀释得到 0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL的6种不同浓度的标准溶液；用分光光度计于600nm波长下分别检测上述6种不同浓度标准溶液的吸光度；以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到indigoidine的标准曲线；
c、取1mL工程菌CB的发酵液于离心管中21000×g离心10分钟，去除发酵液上清得到蓝色沉淀；将蓝色沉淀用1mL甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复3次，用于去除沉淀中的其它有机物，得到粗提物；将上述粗提物用1mLDMSO超声溶解并于离心机中850×g离心5分钟去掉不溶于DMSO的物质，得到纯净的蓝色DMSO溶液；经液相色谱及质谱鉴定此化合物与工程菌C所产生的化合物相同，为indigoidine；取1mL上述蓝色DMSO溶液于比色皿中，用分光光度计于600nm波长下检测其吸光度；根据标准曲线计算得到1mL 发酵液中indigoidine的产量，进而计算得到1L发酵液中indigoidine的总产量。
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An indigoidine biosynthetic gene cluster from Streptomyces chromofuscus ATCC 49982 contains an unusual IndB homologue";Dayu Yu et al.;《J Ind Microbiol Biotechnol》;20121010;第40卷(第1期);161-165 *
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