CN117604006B - 一种橡胶树Hedycaryol合成酶基因及其用途 - Google Patents
一种橡胶树Hedycaryol合成酶基因及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的橡胶树Hedycaryol合成酶基因及其用途。本发明首次发现了一个橡胶树来源的倍半萜合成酶基因，并确定其核苷酸序列和氨基酸序列，该基因能够高效地合成Hedycaryol，可作为香料榄香醇的合成前体应用于香精香料行业。本发明通过将合成Hedycaryol的橡胶树合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功构建的Hedycaryol高产菌株，摇瓶产量高达3mg/L，为目前报道的最高产量，为Hedycaryol的工业化应用奠定了重要的基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种橡胶树Hedycaryol合成酶基因及其用途。
背景技术
萜类化合物是一类含有单个或重复异戊二烯单元的天然产物，一些萜类化合物因其独特的物理化学性质以及良好的生物活性，从而赋予其重要的科研与应用价值，已被广泛地应用于各种精细化工与生命健康行业。
Hedycaryol属于一种倍半萜化合物，该化合物作为中间体可以衍生合成多种高附加值的倍半萜化合物，特别是作为香料榄香醇的前体，具有十分重要的经济价值。
目前，橡胶树中能够合成化合物Hedycaryol的基因以及利用生物技术合成Hedycaryol的研究还未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种橡胶树Hedycaryol合成酶基因及其用途。本发明利用合成底盘筛选并鉴定橡胶树来源的基因，成功获得能够合成Hedycaryol的橡胶树新基因，并利用该基因成功实现了Hedycaryol的生物合成。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的是提供一种橡胶树Hedycaryol合成酶基因，所述橡胶树Hedycaryol合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二目的是提供Hedycaryol合成酶基因的扩增引物对，所述扩增引物对为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物为SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三目的是提供一种橡胶树Hedycaryol合成酶，所述橡胶树Hedycaryol合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第四目的是提供一种上述的橡胶树Hedycaryol合成酶在合成Hedycaryol中的应用。
本发明的第五目的是提供一种Hedycaryol的生产方法，利用上述的橡胶树Hedycaryol合成酶催化法尼基焦磷酸，得到Hedycaryol。
本发明的第六目的是提供一种重组表达载体，所述重组载体包含橡胶树Hedycaryol合成酶基因和表达载体；所述橡胶树Hedycaryol合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述载体包括酵母表达载体以及植物表达载体，所述表达载体可为pESC酵母表达载体。
本发明的第七目的是提供一种包含上述的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的工程菌。
本发明的第八目的是提供一种导入有上述的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的植物细胞或转基因植物。
本发明的第九目的是提供上述的重组表达载体在工程菌或植物细胞和转基因植物中生产Hedycaryol中的应用。
与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明首次发现了橡胶树来源的Hedycaryol合成酶基因，并确定其核苷酸序列和氨基酸序列，该基因能够高效地合成Hedycaryol，可作为香料榄香醇的合成前体应用于香精香料行业。
(2)本发明通过将合成Hedycaryol的橡胶树Hedycaryol合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功构建的Hedycaryol生产菌株，摇瓶产量高达3mg/L，为目前报道的最高产量，为Hedycaryol的工业化应用奠定了重要的基础。
(3)本发明通过在橡胶树中进行基因挖掘与功能表征，研究橡胶树中具有特殊功能的合成酶及其编码基因，对拓宽橡胶树除天然橡胶合成外的其他小分子化合物的研究与应用具有重要的价值，本发明鉴定到的橡胶树Hedycaryol合成酶基因对采用生物技术生产Hedycaryol提供了重要的基因合成元件与技术基础。
附图说明
图1为本发明的Y-HbHedS1菌株产物的GC-MS检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
DNA聚合酶、限制性内切酶和质粒提取试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA胶回收试剂盒和同源重组试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；pTOPO-Blunt Simple载体购自北京艾德莱生物科技有限公司，酵母表达质粒pESC购自Novagen公司；特异基因引物对P1/P2由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。
Hedycaryol的检测方法：采用Thermo TRACE GC Ultra系统和TSQ9000系统进行GC-MS检测。GC检测程序设定如下：初始烘箱温度为50℃，持续1分钟；然后以15℃/分钟的速度升至280℃，保持1分钟；接着以20℃/分钟的速度升至300℃，保持2分钟。挥发性等样品在240℃注入，MS转移温度保持在270℃。
YPDHG培养基：培养基组分为1％葡萄糖，1％半乳糖，2％胰蛋白胨和1％酵母抽提取物。
酵母菌株YZL141，菌株来源参考Shi Bin et al.“Systematic MetabolicEngineering of Saccharomyces cerevisiae for Lycopene Overproduction.”Journalof agricultural and food chemistry vol.67,40(2019):11148-11157.doi:10.1021/acs.jafc.9b04519。
酵母菌株JCR27，菌株来源参考Siemon,Thomas et al.“Semisynthesis ofPlant-Derived Englerin A Enabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene as Building Block.”Journal of the American Chemical Society vol.142,6(2020):2760-2765.doi:10.1021/jacs.9b12940。
橡胶树cDNA：从橡胶树胶乳中提取到总RNA，再反转录成第一链cDNA，该过程通常按照常规条件如《分子克隆实验指南(第四版)》(中文版)由科学出版社出版中所说的条件，或按照制造产商所建议的条件，其为本领域技术人员熟知的实验操作，本发明对此并无限定。
橡胶树Hedycaryol合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明首次从橡胶树中克隆得到Hedycaryol合成酶基因，可以用于高效合成Hedycaryol，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对橡胶树中Hedycaryol合成的基因以及Hedycaryol生物合成的空白，为橡胶树倍半萜及其生物合成的相关研究提供了理论与技术支持。
本发明提供的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的扩增引物对如下：
正向引物P1为：
5’-GGCCCGGGCGTCGACATGTCCACAAAAGTTGAGCACA-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物P2为：
5’-CGGATCTTAGCTAGCTTATGTTATTACGGGATTAATGAGTAGA-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明提供的扩增引物对可以快速准确地从橡胶树基因组中扩增得到橡胶树Hedycaryol合成酶基因，特异性好，效率高。
本发明提供的橡胶树Hedycaryol合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
橡胶树Hedycaryol合成酶在生产Hedycaryol中的应用。本发明中橡胶树Hedycaryol合成酶可以以法尼基焦磷酸为底物，催化合成Hedycaryol，可作为香料榄香醇的合成前体应用于香精香料行业。
本发明提供的一种Hedycaryol的生产方法，可利用本发明的橡胶树Hedycaryol合成酶催化法尼基焦磷酸，得到Hedycaryol。
本发明还提供含有橡胶树Hedycaryol合成酶基因的重组载体，将橡胶树Hedycaryol合成酶基因重组于表达载体中，构建生物合成模块，可以实现橡胶树Hedycaryol合成酶基因的简便快速利用，快速大量得到目标基因或目标蛋白。在本发明中，表达载体优选为pESC酵母表达载体。
本发明还提供含有橡胶树Hedycaryol合成酶基因的工程菌，工程菌包括橡胶树Hedycaryol合成酶基因和宿主细胞，橡胶树Hedycaryol合成酶基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
将橡胶树Hedycaryol合成酶基因导入宿主细胞中，可以快速大量得到目标基因和目标蛋白酶，工程菌构成的生物合成模块避免了目标基因使用时需要从橡胶树基因组中PCR扩增的繁琐操作。宿主细胞优选为酵母YZL141菌株或者酵母JCR27菌株。
本发明还提供导入有上述的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的植物细胞或转基因植物，橡胶树Hedycaryol合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。如本领域技术人员熟知的技术方法，通过将该橡胶树基因构建植物表达载体，通过农杆菌、原生质体以及基因枪等方法导入到植物细胞和愈伤组织中再生转基因植物合成和生产Hedycaryol。
本发明还提供一种橡胶树Hedycaryol合成酶的生产方法，培养本发明提供的工程菌，获得培养物，再从培养物中分离得到橡胶树Hedycaryol合成酶。
本发明还提供上述重组载体或工程菌或植物细胞或转基因植物在生产Hedycaryol中的应用。本发明提供的重组载体和工程菌可以直接进行培养、扩增和表达得到橡胶树Hedycaryol合成酶，得到的大量活性橡胶树Hedycaryol合成酶可以用于生产Hedycaryol。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
(1)基因克隆
本申请人对橡胶树的基因组序列进行了分析，发现了一个橡胶树倍半萜Hedycaryol合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
采集橡胶树热研7-33-97无性系胶乳，利用天根生化科技(北京)有限公司的总RNA提取试剂盒提取胶乳总RNA后，依据Fermentas cDNA第一链反转录试剂盒合成第一链cDNA。分别使用引物对P1-P2(见表1)利用RT-PCR方法从上述胶乳cDNA模板中克隆基因。所用PCR反应体系为(30μL)：水12.5μL，2x PrimerSTAR Max Permix 15μL，正反向引物(10μM)各1μL，cDNA模板0.5μL。RT-PCR反应体系为：95℃3min，95℃10s，54℃20s，72℃2min，33个循环，72℃10min，10℃保持。然后利用南京诺维赞生物科技有限公司DNA回收试剂盒回收基因片段，连接pTOPO-Blunt Simple载体，转化DH5α大肠杆菌感受态中进行氨苄青霉素抗性筛选，经菌液PCR验证后送DNA测序公司进行测序确证。
(2)重组表达载体构建
以测序无误的目的基因载体为模板利用上述RT-PCR方法克隆后切胶回收基因片段，利用诺维赞重组试剂盒与酵母线性化表达载体pESC进行连接(37℃反应30min)，转化DH5α大肠杆菌感受态进行氨苄青霉素抗性筛选，经菌液PCR验证(PCR体系和方法同上)后即获得含有正确目的基因的酵母表达载体，命名为pHbHedS。
(3)工程菌的构建与功能表征
①酵母感受态制备
将酵母YZL141菌株和JCR27菌株过夜培养后转接于50mL新鲜YPD培养基中，30℃培养至OD600约0.6—0.8，500g离心5min后悬浮于LiAC溶液中，经500g离心5min后，收集菌体重悬于1mL LiAC溶液中即制得感受态。
②酵母感受态转化
将上述表达载体pHbHedS通过PEG-LiAc转化方法转入YZL141和JCR27酵母感受态细胞中，放置于30℃静置30min，42℃热激10min，离心5min后涂布于SD筛选平板上，30℃静置培养3d，然后分别利用引物对P1-P2进行菌落PCR验证，将YZL141来源阳性菌命名为Y-HbHedS1。将转化JCR27的阳性菌命名为J-HbHedS1。
③功能表征
将低温保存的Y-HbHedS1菌株接种于5-10mL SD缺陷培养基中过夜培养，然后转接至YPDHG培养基中，加入0.5％—1％IPM(十四酸异丙酯)，30℃培养3d，4000rpm离心7min后收集IPM，制备测试样品后进行GC-MS检测。Y-HbHedS1菌株发酵样品的检测结果如图1所示，主产物经NIST数据库比对鉴定为Hedycaryol。
④发酵评价
待确定基因功能后，采用类似的方法将J-HbHedS1接种于50mL YPDH培养基中，加入0.5％—1％ IPM，30℃培养3d后，4000rpm离心7min收集IPM，制备测试样品进行GC定量检测。J-HbHedS1菌株的摇瓶产量约为3mg/L。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的橡胶树Hedycaryol合成酶基因在合成Hedycaryol中的应用。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的橡胶树Hedycaryol合成酶在合成Hedycaryol中的应用。
3. 包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的重组载体在合成Hedycaryol中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的重组载体包括pESC酵母表达载体以及转基因植物表达载体。
5.包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的橡胶树Hedycaryol合成酶基因的工程菌在合成Hedycaryol中的应用。
6.一种Hedycaryol的生产方法，其特征在于，利用权利要求2所述的橡胶树Hedycaryol合成酶催化法尼基焦磷酸，得到Hedycaryol。
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