CN107119034A - 一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ZmEDS基因及其编码蛋白，该基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS‑F303A、ZmEDS‑G411C、ZmEDS‑V306A和ZmEDS‑I279G。本发明还公开了一种ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS‑F303A、ZmEDS‑G411C、ZmEDS‑V306A和ZmEDS‑I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。ZmEDS及其定点突变基因所编码的蛋白在倍半萜类化合物的生产中可用于产生多种新的倍半萜类化合物，对倍半萜的生产及运用具有重要理论及实践意义。

Description

一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用
技术领域
本发明属于农作物基因工程领域，具体地说，涉及一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用。
背景技术
萜类化合物是自然界中数量最多、种类最广的一大类天然产物。根据其化学组成，可将萜类分为半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等。其中倍半萜类具有多种生理生化作用，如广泛的药用价值、抗虫抗菌活性、化感作用等。例如从黄花蒿中分离得到的倍半萜内酯青蒿素是治疗疟疾的有效成分。而玉米倍半萜合酶ZmTPS6/11则可催化倍半萜类底物法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)生成β-marcocarpene(T.G.Kollner，C.Schnee，S.Li，et al.Protonation of a neutral(S)-beta-bisabolene intermediateis involved in(S)-beta-macrocarpene formation by the maize sesquiterpenesynthases TPS6 and TPS11[J].Journal of Biological Chemistry.2008，283；20779-20788.)，在细胞色素P450氧化酶基因CYP71Z18的催化下形成玉米植保素zealexin A1，以参与玉米对抗病原真菌的侵染的防御反应(Mao H，Jiang L，Fei R，etal.Characterization of CYP71Z18indicates a role in maize zealexinbiosynthesis[J].Phytochemistry，2015，121：4-10.)。
倍半萜类生物合成是在萜类前体物质合成的基础上，通过异戊二烯基转移酶(Prenyl Transferases，PTS)的作用产生15个碳原子的FPP，FPP在不同的倍半萜合酶(sesquiterpene synthases)的催化下生成相应的倍半萜类化合物。目前见报道的多种具有重要生物活性的萜类往往具有多个氧化基团，但以往的研究表明萜类合酶只能催化产生具有全碳氢骨架的萜烯或只含一个氧原子的萜类一元醇(Tholl D.Biosynthesis andbiological functions of terpenoids in plants[J].Advances in BiochemicalEngineering/biotechnology，2015，148：63.)，萜类骨架需被下游的其他氧化酶进一步氧化修饰才能产生相应的活性产物。
因此，探究植物中倍半萜合酶的生理功能，对于植物生产中生物胁迫和非生物胁迫具有重要的指导及应用价值。另外，若可以利用萜类合酶直接催化底物生成更为丰富多样的萜类骨架，对于下游的具有生物活性的萜类化合物的生产及应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用，本发明通过大肠杆菌代谢工程，发现ZmEDS能够催化(E，E)-FPP产生含两个羟基的倍半萜二元醇eudesmane-2α，11-diol。本发明通过对ZmEDS进行定点突变、微生物代谢工程、产物分离纯化、核磁共振检测等技术，分离得到了eudesmane-2α，11-diol、3-epi-cryptomeridiol、2，3-epi-cryptomeridiol等三种倍半萜二元醇和valerianol、(+)-hedycaryol、2-epi-α-eudesmol、eremophil-6-en-11-ol等四种倍半萜一元醇。本发明证实通过对关键氨基酸残基定点突变可以改变ZmEDS的催化产物，为倍半萜类化合物的生产及改造萜类合酶来产生新的萜类化合物提供理论依据。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种ZmEDS基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因是玉米中与倍半萜类化合物合成代谢有关的基因。该基因的DNA序列由1674个碱基组成。
本发明还公开了一种ZmEDS基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该编码蛋白由557个氨基酸残基组成。
本发明通过对ZmEDS基因进行定点突变分别得到了4个编码ZmEDS的单氨基酸突变蛋白，分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，上述4个经定点突变得到的基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3～6所示。
本发明中含有ZmEDS基因的原核表达载体、细胞系及宿主菌和使用pET28/ZmEDS进行定点突变得到的4个原核表达载体、细胞系及宿主菌在本发明的保护范围之内。本发明中分别含有ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G质粒和pMEVT-MBIS质粒的大肠杆菌BL21菌种也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了利用硅胶柱层析、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、薄层色谱法(TLC)、核磁共振法(NMR)检测等技术，对ZmEDS及四个定点突变蛋白原核表达的三种倍半萜二元醇和四种倍半萜一元醇产物进行分离纯化的方法，此分离方法也在本发明的保护范围之内。
本发明还公开了一种ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G417C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在调节和生产植物二萜类化合物中的应用。
进一步地，该应用包括以下步骤：
1)将SEQ ID NO：1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间，得到重组质粒pET28a/ZmEDS；
2)对ZmEDS的303位、411位、306位和第279位四个氨基酸位点进行定点突变，制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G417C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒；分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQ ID NO：3-6所示；
3)pMEVT/MBIS载体中含有甲羟戊酸(MVA)途径中生成倍半萜前体FPP的一系列基因，包括来自大肠杆菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、异戊二烯焦磷酸异构酶基因(idi)、FPP合酶基因(ispA)和来自酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMG-CoA)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(MVD1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、经N端修饰的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGR)，为原核表达的体系中提供充足的FPP前体。(Martin VJJ，Pitera DJ，Withers ST，et al.Engineering amevalonate pathway in Escherichia coli for production ofterpenoids.NatureBiotechnology.2003，21(7)：796-802)。
将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同时加入25μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，其中，重组质粒各100-150ng，冰浴20min，42℃热激1min20s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1.5h，再涂布于含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天划线取平均菌落，置于同时含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；制备得到上述五种菌种，菌种为大肠杆菌BL21背景株系，且每个菌种分别含有两种质粒：
ΦpMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；
②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；
③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；
④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；
⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；
次日取2mL上述菌种置于50mL NZY液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃200rpm培养，菌液培养至A600达到0.8-1.0，向其中加入1M的IPTG终浓度至1mM，然后将菌液转至16℃，200rpm诱导培养24h；之后用等体积的正己烷萃取萜类产物，16℃200rpm萃取30min；振荡充分后，取出静置，取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1mL，转移至GC样品瓶中，制备得到倍半萜类化合物，用于GC-MS检测。
进一步地，步骤2中对pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变，制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G417C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒。具体方法为：4只PCR管中分别加入20μg pET28a/ZmEDS质粒作为模板，然后依次分别加入0.5μL前引物F、0.5μL后引物R，0.4μL高保真酶PrimerSTAR、0.4μL浓度为10mM的dNTP、4μL PS buffer，用无菌水补足至20μL，其中，ZmEDS-F303A对应引物F303A-F/F303A-R、ZmEDS-G411C对应G411C-F/G411C-R、ZmEDS-V306A对应V306A-F/V306A-R、ZmEDS-I279G对应I279G-F/I279G-R，引物序列分别如SEQ ID NO：11～18所示；将上述PCR管进行瞬时离心后，置于PCR仪进行反应，相应的PCR反应程序为：95℃5min；98℃10s，60℃15s，72℃7min10s，循环15次；72℃7min；PCR反应完成后，取5μL反应液用于1％的琼脂糖电泳检测，经100V 30min电泳后，若检测到有大小为7kb的核酸条带，则在相应剩余的15μL反应液中加入1.5μL限制性内切酶DpnI，瞬时混匀后，37℃进行过夜消化模板质粒；取10μL消化后的反应液加入25μL大肠杆菌TOP10感受态中，冰浴20min，42℃热激1min，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1h，涂布于含有硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天挑选单菌落，置于含硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养后，使用试剂盒提取质粒，并送样测序验证已在相应位点进行了定点突变，并且其他位点未发生突变；制备得到4种重组质粒分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，分别是在第303位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、第411位甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)、第306位缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)和ZmEDS蛋白序列上的第279位异亮氨酸(I)突变为甘氨酸(G)，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异。
进一步地，液体LB培养基具体为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0；121℃高压灭菌20min后，4℃保存；固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂。
进一步地，所述NZY液体培养基具体为：NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，酵母提取物5g，水解酪蛋白10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0；121℃高压灭菌20min后，4℃保存。
进一步地，倍半萜类化合物包括eudesmane-2α，11-diol、3-epi-cryptomeridiol、2，3-epi-cryptomeridiol三种倍半萜二元醇和2-epi-α-eudesmol、(+)-hedycaryol、eremophil-6-en-11-ol和valerianol四种倍半萜一元醇。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)GC-MS分析结果表明：ZmEDS蛋白酶催化FPP生成的主产物其分子量为240(m/z)，是一种倍半萜二元醇，其保留时间为15.365min，通过核磁共振分析鉴定该产物为eudesmane-2α，11-diol；ZmEDS-F303A蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，通过核磁共振分析鉴定该产物为(+)-hedycaryol，经高温后会转化为elemol，该化合物对应的保留时间为12.365min；ZmEDS-G411C蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，其保留时间为13.591min，通过核磁共振分析鉴定该产物为valerianol；ZmEDS-V306A蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为240(m/z)的倍半萜二元醇，其保留时间为14.965min，通过核磁共振分析鉴定该产物为3-epi-cryptomeridiol，次产物是两种分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，其保留时间分别为13.065min和13.3min，通过核磁共振分析鉴定两种产物分别为2-epi-α-eudesmol和eremophil-6-en-11-ol；ZmEDS-I279G蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为240(m/z)的倍半萜二元醇，其保留时间为15.2min，通过核磁共振分析鉴定该产物为2，3-epi-cryptomeridiol。
2)研究结果表明，本发明涉及玉米倍半萜合酶ZmEDS及其4个单氨基酸突变蛋白能够催化倍半萜底物FPP生成多种倍半萜产物。
3)本发明有助于利用上述5个倍半萜合酶的催化特性在工业上生产多种倍半萜类化合物，以及改造相关的倍半萜合酶运用于倍半萜类化合物的生产等具有重要理论及实践意义。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明构建的重组表达载体pET28a/ZmEDS；
图2是本发明ZmEDS催化FPP反应的产物经GC-MS检测的总离子色谱图；
图3是本发明ZmEDS催化FPP反应主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为240(m/z)，GC-MS检测的保留时间15.37min；
图4是本发明ZmEDS催化FPP反应主产物NMR结构解析；
图5是本发明ZmEDS-F303A催化FPP反应的产物经GC-MS检测的总离子色谱图；
图6是本发明ZmEDS-F303A催化FPP反应主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为222(m/z)，GC-MS检测的保留时间12.365min；
图7是本发明ZmEDS-F303A催化FPP反应主产物NMR结构解析；
图8是本发明ZmEDS-G411C催化FPP反应的产物经GC-MS检测的总离子色谱图；
图9是本发明ZmEDS-G411C催化FPP反应主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为222(m/z)，GC-MS检测的保留时间13.591min；
图10是本发明ZmEDS-G411C催化FPP反应主产物NMR结构解析；
图11是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应的产物经GC-MS检测的总离子色谱图；
图12是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为240(m/z)，GC-MS检测的保留时间14.965min；
图13是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应主产物NMR结构解析；
图14是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应次产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为222(m/z)，GC-MS检测的保留时间13.065min；
图15是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应次产物NMR结构解析；
图16是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应第三主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为222(m/z)，GC-MS检测的保留时间13.3min；
图17是本发明ZmEDS-V306A催化FPP反应第三主产物NMR结构解析；
图18是本发明ZmEDS-I279G催化FPP反应的产物经GC-MS检测的总离子色谱图；
图19是本发明ZmEDS-I279G催化FPP反应主产物的GC-MS检测质谱图，该产物分子量为240(m/z)，GC-MS检测的保留时间15.2min；
图20是本发明ZmEDS-I279G催化FPP反应主产物NMR结构解析。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
下列使用的所有化学药品，除正己烷和乙酸乙酯是色谱纯外，其余都是分析纯。GC-MS分析使用的是安捷伦6890-5973型号，HP-5GC柱，四级杆质谱仪，采用电子轰击(EI)模式。样品进样1μL，以不分流模式，初始温度70℃，炉温保持70℃2min，以10℃/min的速度升至250℃，保持250℃2min。MS数据收集从保留时间10min开始直至程序结束。
玉米Mo17株系的种子依次用75％酒精消毒10s、20％次氯酸钠溶液消毒10min，用无菌水清洗后，置于水-琼脂培养基上发芽。发芽7天后，无菌幼苗叶片使用无菌刀片割伤，用50μM MeJA处理24小时后用于RNA提取。50μM MeJA中添加0.1％(v/v)Tween20，以增加表面张力。
实施例1：玉米中ZmEDS基因的克隆及表达载体构建
ZmEDS在maizeGDB基因库中的编号是GRMZM2G010356，根据其编码区核苷酸序列，设计引物从玉米中克隆全长序列；引物如下：
ZmEDS-F：5’-ATGGCCCCGAGTAACATCGTC-3’；其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
ZmEDS-R：5’-CTAGAGAGGGAGCACTTGCTTGAGG-3’；其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
玉米叶片被50μM MeJA处理24h后用于提取RNA，使用反转录酶M-MLV(Takara)反转录得到cDNA。以cDNA为模板，ZmEDS-F和ZmEDS-R为引物，用高保真酶PrimeSTAR扩增ZmEDS编码区序列。PCR程序：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃1min50s，循环35次；72℃7min。扩增完成后，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并利用胶回收试剂盒(OMEGA)切胶回收目的片段。将胶回收得到的片段通过PCR反应添加polyA尾，使用pGM-T试剂盒(TIANGEN)将片段连接到pGM-T载体中，经测序确认与数据库中公布的ZmEDS编码区核苷酸序列有7个碱基的差异，分别是第109位A变为C、175位C变为T、217位A变为G、1544位C变为T、1555位C变为G、1599位A变为G和1674位G变为A，其中A代表腺嘌呤、T代表胸腺嘧啶、G代表鸟嘌呤、C代表胞嘧啶。该片段编码的氨基酸序列与数据库中公布的序列有5个氨基酸残基的差异，分别是第37位苏氨酸变为脯氨酸，59位精氨酸变为半胱氨酸、73位异亮氨酸变为缬氨酸、515位丙氨酸变为缬氨酸和519位亮氨酸变为缬氨酸，可能品种之间存在差异。
为了高效率地在大肠杆菌中表达ZmEDS蛋白，使用原核表达载体pET28-a(+)。根据pET28-a(+)的酶切位点及ZmEDS的核苷酸序列，选择NdeI和EcoRI两个酶切位点作为构建载体所需的酶切位点。ZmEDS的亚克隆引物为：
ZmEDS-NdeI-F：5’-AAACATATGGCCCCGAGTAACATCGTC-3’；其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；
ZmEDS-EcoRI-R：5’-AAAGAATTCTTAGAGAGGGAGCACTTGCTTG-3’；其核苷酸序列如SEQID NO：10所示；
其中，下划线所示序列为酶切识别位点。
以pGM-T/ZmEDS为模板，ZmEDS-NdeI-F和ZmEDS-EcoRI-R为引物，用高保真酶扩增得到片段，PCR反应条件为PCR程序：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃1min50s，循环35次；72℃7min。反应完成后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，经胶回收试剂盒回收目的片段。使用NdeI/EcoRI(Takara)分别对回收的片段和pET28-a(+)进行双酶切，然后使用胶回收试剂盒进行回收，使用T4DNA Ligase(Takara)将ZmEDS基因构建到pET28-a(+)上，最终构建的重组表达载体结构如图1所示。
实施例2：ZmEDS的四个定点突变基因的构建
对pET28a/ZmEDS的第279位、303位、306位和411位四个氨基酸位点进行定点突变。4只PCR管中分别加入20μg pET28a/ZmEDS质粒作为模板，然后依次分别加入0.5μL前引物F、0.5μL后引物R，0.4μL高保真酶PrimerSTAR、0.4μLdNTP(10mM)、4μL PS buffer，用无菌水补足至20μL，其中ZmEDS-F303A对应引物F303A-F/F303A-R、ZmEDS-G411C对应G411C-F/G411C-R、ZmEDS-V306A对应V306A-F/V306A-R、ZmEDS-I279G对应I279G-F/I279G-R，引物序列分别如SEQ ID NO：11～18所示。将上述PCR管进行瞬时离心后，置于PCR仪进行反应，相应的PCR反应程序为：95℃5min；98℃10s，60℃15s，72℃7min10s，循环15次；72℃7min。PCR反应完成后，取5μL反应液用于1％的琼脂糖电泳检测，经100V 30min电泳后，若检测到有大小为7kb的核酸条带，则在相应剩余的15μL反应液中加入1.5μL限制性内切酶DpnI，瞬时混匀后，37℃进行过夜消化模板质粒。取10μL消化后的反应液加入25μL大肠杆菌TOP10感受态中，冰浴20min，42℃热激1min，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1h，涂布于含有硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天挑选单菌落，置于含硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养后，使用试剂盒提取质粒，并送样测序验证已在相应位点进行了定点突变，并且其他位点未发生突变。
通过上述步骤，共得到4种重组质粒分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、第411位苯甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)、第306位缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)和第279位异亮氨酸(I)突变为甘氨酸(G)，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQ ID NO：3～6所示。
实施例3：ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G分别与pMEVT-MBIS原核表达
具体实施方式如下：将ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G分别与pMEVT-MBIS两种重组质粒各100-150ng同时加入25μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激1min20s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基(酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0。121℃高压灭菌20min，4℃保存。固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂)200μL复苏2h，再涂布于同时含有两种质粒抗性(氯霉素50mg/L，硫酸卡那霉素50mg/L)的固体LB培养基平板上。37℃倒置过夜培养，第二天平均挑选菌落，置于同时含有上述两种抗性的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜摇菌，制备得到5种菌种。这些菌种为大肠杆菌BL21背景株系，且每个菌种分别含有两种质粒：
①pMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；
②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；
③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；
④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；
⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；
次日取2mL上述菌种置于50mL NZY(NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，酵母提取物5g，水解酪蛋白10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0；121℃高压灭菌20min后，4℃保存)液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃200rpm培养，菌液培养至A600达到0.8-1.0，向其中加入1M的IPTG终浓度至1mM，然后将菌液转至16℃，200rpm诱导培养24h；之后用等体积的正己烷萃取萜类产物，16℃200rpm萃取30min。振荡充分后，取出静置，取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1mL，转移至GC样品瓶中，用于GC-MS检测。
实施例4：两种倍半萜二元醇和4种倍半萜一元醇的分离纯化
GC-MS分析结果表明：如图2所示，ZmEDS蛋白酶催化FPP生成的主产物其分子量为240(m/z)，是一种倍半萜二元醇，其保留时间为15.37min，质谱图如图3所示，通过核磁共振分析鉴定该产物为eudesmane-2α，11-diol，如图4所示；如图5所示，ZmEDS-F303A蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，通过核磁共振分析鉴定该产物为(+)-hedycaryol，结构如图7所示，通过查阅文献(Jones R V H，Sutherland MD.Hedycaryol，the precursor of elemol[J].Chemical Communications，1968(20)：1229-1230.)，证实该化合物经高温会转化为elemol，对应的保留时间为12.365min，质谱图如图6所示；如图8所示，ZmEDS-G411C蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，其保留时间为13.591min，质谱图如图9所示，通过核磁共振分析鉴定该产物为valerianol，结构如图10所示；如图11所示，ZmEDS-V306A蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为240(m/z)的倍半萜二元醇，其保留时间为14.965min，质谱图如图12所示，通过核磁共振分析鉴定该产物为3-epi-cryptomeridiol，结构如图13所示，其次主要产物是两种分子量为222(m/z)的倍半萜一元醇，其保留时间分别为13.065min和13.3min，质谱图分别如图14和图16所示，通过核磁共振分析鉴定两种产物分别为2-epi-α-eudesmol和eremophil-6-en-11-ol，结构分别如图15和图17所示；如图12所示，ZmEDS-I279G蛋白酶催化FPP生成的主产物是分子量为240(m/z)的倍半萜二元醇，其保留时间为15.2min，质谱图如图19所示，通过核磁共振分析鉴定该产物为2，3-epi-cryptomeridiol；
Eudesmane-2α，11-diol的分离纯化。培养菌液(含有pMEVT/MBIS和pET28a/ZmEDS质粒)2L，37℃200rpm培养，菌液养至A600达到0.8-1.0，向其中加入IPTG至终浓度为1mM，转至16℃200rpm诱导表达24h。诱导完成后，使用正己烷萃取萜类产物，通过旋转蒸发仪浓缩。浓缩蒸干后的产物用5mL正己烷重悬，通过硅胶柱层析法分离。使用正己烷(hexane，H)和乙酸乙酯(ethyl acetate，E)的混合试剂进行梯度洗脱，依次为纯H及体积比为H∶E＝20∶1、15∶1、10∶1、5∶1和2∶1，每个混合试剂的体积约40mL。选择H∶E＝5∶1的洗脱组分进行GC-MS检测，经确认目标化合物纯度高于95％后，送核磁共振检测。经确认该化合物为eudesmane-2α，11-diol，结构如图4所示，共得到约6.17mg。
(+)-Hedycaryol的分离纯化。培养菌液(含有pMEVT/MBIS和ZmEDS-F303A质粒)6L，37℃200rpm培养，菌液养至A600达到0.8-1.0，向其中加入IPTG至终浓度为1mM，转至16℃200rpm诱导表达24h。诱导完成后，使用正己烷萃取产物，通过旋转蒸发仪浓缩。浓缩蒸干后的产物用5mL正己烷重悬，通过硅胶柱层析法分离。使用正己烷和乙酸乙酯的混合试剂进行梯度洗脱，依次为纯H及体积比为H∶E＝20∶1、15∶1、10∶1和5∶1，每个混合试剂的体积约50mL，得到Fr.1～Fr.14共14个洗脱组分。选择Fr.9和Fr.10组分合并，使用体积比H∶E＝15∶1、10∶1和5∶1的混合试剂进行梯度洗脱，每个比例的体积约为10mL，共得到Fr.9.1～Fr.9.21共21个洗脱组分，经TLC检测，其中Fr.9.2～Fr.9.10含有目的化合物，将其合并后依次使用H∶E＝20∶1和10∶1的组分进行洗脱，得到Fr.9.2.1～Fr.9.2.11共11个洗脱组分，其中Fr.9.2.7～Fr.9.2.8含目的化合物，合并后约5.42mg。将其送核磁共振检测，经确认该化合物为(+)-Hedycaryol，其结构如图7所示。
Valerianol的分离纯化。培养菌液(含有pMEVT/MBIS和ZmEDS-G411C质粒)5L，37℃200rpm培养，菌液养至A600达到0.8-1.0，向其中加入IPTG至终浓度为1mM，转至16℃200rpm诱导表达24h。诱导完成后，使用正己烷萃取产物，通过旋转蒸发仪浓缩。浓缩蒸干后的产物用5mL正己烷重悬，通过硅胶柱层析法分离。使用正己烷和乙酸乙酯的混合试剂进行梯度洗脱，依次为纯H及体积比为H∶E＝20∶1、15∶1、10∶1、5∶1和2∶1，每个混合试剂的体积约150mL，得到Fr.1～Fr.32共32个洗脱组分。选择洗脱试剂为H∶E＝5∶1的Fr.9组分进行分离纯化，使用体积比H∶CH2Cl2＝5∶1、2∶1和1∶1的混合试剂进行梯度洗脱，每个比例的体积约为10mL，共得到Fr.9.1～Fr.9.20共21个洗脱组分，经TLC检测，其中Fr.9.8～Fr.9.15含有目的化合物，将其合并后约12mg。将其送核磁共振检测，经确认该化合物为valerianol，其结构如图10所示。
3-epi-cryptomeridiol、eremophil-6-en-11-ol和2-epi-α-eudesmol的分离纯化。培养菌液(含有pMEVT/MBIS和ZmEDS-V306A质粒)4L，37℃200rpm培养，菌液养至A600达到0.8-1.0，向其中加入IPTG至终浓度为1mM，转至16℃200rpm诱导表达24h。诱导完成后，使用正己烷萃取产物，通过旋转蒸发仪浓缩。浓缩蒸干后的产物用5mL正己烷重悬，通过硅胶柱层析法分离。使用正己烷和乙酸乙酯的混合试剂进行梯度洗脱，依次为纯H及体积比为H∶E＝20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1和1∶1，每个混合试剂的体积约50mL，得到Fr.1～Fr.42共42个洗脱组分。选择洗脱试剂为H∶E＝1∶1的Fr.36～Fr.37两个组分进行合并，使用体积比H∶E＝2∶1的混合试剂进行洗脱，洗脱体积约为15mL，共得到Fr.36.1～Fr.36.15共15个洗脱组分。经薄层色谱(TLC)检测，其中Fr.36.4～Fr.36.9含有目的化合物，将其合并。将合并后的样品使用CH2Cl2∶E＝5∶1进行洗脱，洗脱体积约20mL，共得到Fr.36.4.1～Fr.36.4.22共22个洗脱组分。将组分Fr.36.4.10～Fr.36.4.22合并，依次使用H∶CH，Cl，＝1∶1、CH2Cl2∶E＝2∶1进行洗脱，得到Fr.36.4.10.1～Fr.36.4.10.17共17个洗脱组分，其中两混合试剂的洗脱体积分别约为5mL和20mL。将Fr.36.4.10.8～Fr.36.4.10.14合并，约7.75mg，将其送核磁共振检测，经确认该化合物为3-epi-cryptomeridiol，其结构如图13所示。选择洗脱试剂为H∶E＝15∶1的Fr.14～Fr.15两个组分进行合并，使用体积比H∶CH2Cl2＝2∶1、1∶1和2∶1的混合试剂依次进行洗脱，各混合试剂的洗脱体积约为50mL，共得到Fr.14.1～Fr.14.55共55个洗脱组分。经GC-MS检测，其中Fr.15.34～Fr.36.35为同一化合物，其保留时间为13.065min，将其合并后送核磁共振检测，确认其为2-epi-α-eudesmol，其结构如图15所示。经GC-MS检测，其中Fr.15.37～Fr.36.42为同一化合物，保留时间为13.3min，将其合并后送核磁共振检测，确认其为eremophil-6-en-11-ol，其结构如图17所示。
2，3-epi-cryptomeridiol的分离纯化。培养菌液(含有pMEVT/MBIS和ZmEDS-I279G质粒)6L，37℃200rpm培养，菌液养至A600达到0.8-1.0，向其中加入IPTG至终浓度为1mM，转至16℃200rpm诱导表达24h。诱导完成后，使用正己烷萃取产物，通过旋转蒸发仪浓缩。浓缩蒸干后的产物用5mL正己烷重悬，通过硅胶柱层析法分离。使用正己烷和乙酸乙酯的混合试剂进行梯度洗脱，依次为纯H及体积比为10∶1、5∶1、2∶1和1∶1，每个混合试剂的体积约60mL，得到Fr.1～Fr.43共43个洗脱组分。选择洗脱试剂为H∶E＝1∶1的Fr.35～Fr.43组分合并，使用体积比CH2Cl2∶E＝3∶1和2∶1的混合试剂进行梯度洗脱，每个比例的体积约为10mL，共得到Fr.35.1～Fr.35.20共20个洗脱组分，将Fr.35.9～Fr.35.11合并，使用体积比CH2Cl2∶E＝4∶1、3∶1和2∶1的混合试剂进行梯度洗脱，每个比例的体积分别为5mL、15mL和15mL，将CH2Cl2∶E＝2∶1的洗脱组分进行合并，约14mg。将其送核磁共振检测，经确认该化合物为2，3-epi-cryptomeridiol，其结构如图20所示。
鉴于此，本发明利用微生物代谢工程，将玉米中的ZmEDS和其相应的四个定点突变基因与倍半萜前体质粒pMEVT-MBIS在大肠杆菌中进行共表达，可以生成eudesmane-2α，11-diol等三种倍半萜二元醇和(+)-hedycaryol等四种倍半萜一元醇。并且，利用硅胶柱层析法、TLC法、GC-MS检测、NMR检测等技术的连用，分离得到了数量可观的催化产物。本发明中的微生物代谢工程手段及产物分离技术对于上述七种倍半萜产物的生产应用奠定了基础。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用
<130> 2017
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1674
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
atggccccga gtaacatcgt cgttcagagc agcagcactc cgccggttgc cggcggcgac 60
gaggagttcg cgccgtctgt atggggagat ttcttcgtca cctatgcccc tcccgtctca 120
caggcatcag agcagcggat gagtgagaga gcggagctgc tcaaggcgca agtatgtcag 180
gcgttcgatg ctgccagcat ggatgttgca ggtctggtca cgtacgtcga caccctcgaa 240
cgcctcggct tagacaacca cttccgcgac ctcatcggag ctgccctgga acgaatcgga 300
gctgaggagc tgccggagca cggcggcggc ctgcacatcg tcgcgcttcg gtttcgcctg 360
ctccggcagc atgggatatg ggtatctaca gatgtgttcg acgcgttcag agaggacgcg 420
ggcggtttct gctcgagcct ctgcagtgac gaccctaggg gtctcctgag cttgtacaat 480
gcggctcaca tggcagtacc cggcgaggtg gtcctcgacg acgccatcgc cttcgcgagg 540
ggccgcctcc tggacatcat cagcaaaggc gaggtcaggt caccggtgtc agagcagatc 600
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aactttgtcc ttgtgagagc gcttcacctc agggagctga aggacctgtc actatggtgg 780
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<211> 557
<212> PRT
<213> 玉米(Zea mays)
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1 5 10 15
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20 25 30
Val Thr Tyr Ala Pro Pro Val Ser Gln Ala Ser Glu Gln Arg Met Ser
35 40 45
Glu Arg Ala Glu Leu Leu Lys Ala Gln Val Cys Gln Ala Phe Asp Ala
50 55 60
Ala Ser Met Asp Val Ala Gly Leu Val Thr Tyr Val Asp Thr Leu Glu
65 70 75 80
Arg Leu Gly Leu Asp Asn His Phe Arg Asp Leu Ile Gly Ala Ala Leu
85 90 95
Glu Arg Ile Gly Ala Glu Glu Leu Pro Glu His Gly Gly Gly Leu His
100 105 110
Ile Val Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Ile Trp Val
115 120 125
Ser Thr Asp Val Phe Asp Ala Phe Arg Glu Asp Ala Gly Gly Phe Cys
130 135 140
Ser Ser Leu Cys Ser Asp Asp Pro Arg Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ala His Met Ala Val Pro Gly Glu Val Val Leu Asp Asp Ala Ile
165 170 175
Ala Phe Ala Arg Gly Arg Leu Leu Asp Ile Ile Ser Lys Gly Glu Val
180 185 190
Arg Ser Pro Val Ser Glu Gln Ile Thr Arg Ala Leu Asp Ile Pro Leu
195 200 205
Pro Arg Phe Thr Arg Arg Leu Glu Thr Met His Tyr Ile Ala Glu Tyr
210 215 220
Glu His Glu Glu Ala His Asp Gly Leu Leu Leu Glu Leu Ala Arg Leu
225 230 235 240
Asn Phe Val Leu Val Arg Ala Leu His Leu Arg Glu Leu Lys Asp Leu
245 250 255
Ser Leu Trp Trp Arg Glu Leu Tyr Asn Thr Val Lys Leu Pro Tyr Ala
260 265 270
Arg Asp Arg Met Val Glu Ile Tyr Phe Trp Thr Cys Gly Met Leu His
275 280 285
Glu Glu Glu Tyr Ser Leu Ala Arg Met Phe Phe Ala Lys Thr Phe Gly
290 295 300
Met Val Ser Leu Met Asp Asp Thr Phe Asp Val His Ala Thr Leu Asp
305 310 315 320
Glu Cys His Lys Leu Lys Glu Ala Met Gln Arg Trp Asp Glu Ser Glu
325 330 335
Val Ser Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Arg Leu Leu Tyr Ile Lys Thr Leu
340 345 350
Ser Asn Phe Lys Glu Phe Glu Glu Ile Leu Glu Pro Asn Lys Lys Tyr
355 360 365
Arg Met Ala Tyr Thr Lys Glu Ala Tyr Lys Leu Cys Ser Lys Asn Tyr
370 375 380
Leu Lys Glu Ala Ile Trp Ser Asn Gln Lys Tyr Gln Pro Ser Phe Lys
385 390 395 400
Glu His Glu Glu Leu Ser Ile Met Thr Ser Gly Leu Pro Met Leu Thr
405 410 415
Ile Leu Thr Leu Met Gly Phe Gly Asp Glu Ala Thr Pro Glu Ala Phe
420 425 430
Glu Trp Val Ser Ser Val Pro Glu Met Val Arg Ala Gly Ser Gln Val
435 440 445
Thr Arg Phe Leu Asn Asp Leu Ser Ser Tyr Lys Leu Gly Lys Asn Lys
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465 470 475 480
Thr Gly Asp Glu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu Leu Glu Asn Arg
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Trp Arg Ile Leu Asn Gln Thr Arg Met Glu Ile Asp His Thr Leu Leu
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<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctatcaatca tgacctcatg tttgccgatg ctcacg 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
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<212> DNA
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<400> 16
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<213> 人工序列
<400> 17
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<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacaggtcca aaagtaaccc tccaccatac ggtcc 35

Claims (9)

1.一种ZmEDS基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的ZmEDS基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求2所述的ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，其特征在于，其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。
4.权利要求2所述的ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)将SEQ ID NO:1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间，得到重组质粒pET28a/ZmEDS；
2)对ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变，分别制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒；分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQ ID NO:3-6所示；
3)将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同时加入25μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，其中，重组质粒各100-150ng，冰浴20min，42℃热激1min20s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1.5h，再涂布于含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天划线取平均菌落，置于同时含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；制备得到上述五种菌种，菌种为大肠杆菌BL21背景株系，且每个菌种分别含有两种质粒：
①pMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；
②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；
③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；
④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；
⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；
次日取2mL上述菌种置于50mL NZY液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃200rpm培养，菌液培养至A600达到0.8-1.0，向其中加入1M的IPTG终浓度至1mM，然后将菌液转至16℃，200rpm诱导培养24h；之后用等体积的正己烷萃取萜类产物，16℃ 200rpm萃取30min；振荡充分后，取出静置，取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1mL，转移至GC样品瓶中，制备得到倍半萜类化合物，用于GC-MS检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2中对pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变，制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒具体为：4只PCR管中分别加入20μgpET28a/ZmEDS质粒作为模板，然后依次分别加入0.5μL前引物F、0.5μL后引物R，0.4μL高保真酶PrimerSTAR、0.4μL浓度为10mM的dNTP、用无菌水补足至20μL，其中，ZmEDS-F303A对应引物F303A-F/F303A-R、ZmEDS-G411C对应G411C-F/G411C-R、ZmEDS-V306A对应V306A-F/V306A-R、ZmEDS-I279G对应I279G-F/I279G-R，引物序列分别如SEQ ID NO:11～18所示；将上述PCR管进行瞬时离心后，置于PCR仪进行反应，相应的PCR反应程序为：95℃5min；98℃10s，60℃15s，72℃7min10s，循环15次；72℃7min；PCR反应完成后，取5μL反应液用于1％的琼脂糖电泳检测，经100V 30min电泳后，若检测到有大小为7kb的核酸条带，则在相应剩余的15μL反应液中加入1.5μL限制性内切酶DpnI，瞬时混匀后，37℃进行过夜消化模板质粒；取10μL消化后的反应液加入25μL大肠杆菌TOP10感受态中，冰浴20min，42℃热激1min，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1h，涂布于含有硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天挑选单菌落，置于含硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养后，使用试剂盒提取质粒，并送样测序验证已在相应位点进行了定点突变，并且其他位点未发生突变；制备得到4种重组质粒分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述液体LB培养基具体为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0；121℃高压灭菌20min后，4℃保存；固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述NZY液体培养基具体为：NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，酵母提取物5g，水解酪蛋白10g，去离子水1L，用1M的NaOH调pH值至7.0；121℃高压灭菌20min后，4℃保存。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述倍半萜类化合物包括eudesmane-2α,11-diol、3-epi-cryptomeridiol、2,3-epi-cryptomeridiol三种倍半萜二元醇和2-epi-α-eudesmol、(+)-hedycaryol、eremophil-6-en-11-ol和valerianol四种倍半萜一元醇。
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