CN104039973A - 基因工程酵母细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产高水平的乙酰乙酰辅酶A的酵母细胞。还涉及一种用于制造这种酵母细胞的方法以及这种酵母细胞在生产乙酰辅酶A衍生产物的方法中的应用。

Description

基因工程酵母细胞
技术领域
本发明涉及生产高水平的乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的酵母细胞。本发明还涉及用于制造这种酵母细胞的方法，以及这样的酵母细胞在生产乙酰辅酶A衍生的产物的方法中的应用。
背景技术
具有广泛工业利益的天然产物在工程化宿主细胞(即所谓的细胞工厂)中的生物合成可以放出这些天然资源的尚未实现的商业潜力。因此，开发可以有效地将廉价的碳源转换成所谓的前体代谢产物并进一步转化成目标产物的细胞工厂平台的兴趣与日俱增。其中的一个关键的代谢产物是乙酰辅酶A，其被用作前体用于生产各种各样的工业上感兴趣的产物，包括类异戊二烯(主要用作调味料和香料，生物柴油，抗疟药物和抗癌药，抗生素，橡胶，膳食补充剂，食品成份和维生素)、聚酮(抗生素，抗癌药和免疫抑制剂)、脂质(如膳食补充剂，药品和生物柴油)、聚羟基烷酸酯和1-丁醇(图1)。
在前一项研究中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的丙酮酸脱氢酶旁路的工程化显示增强了乙酰辅酶A的供应并增加了倍半萜化合物的紫穗槐二烯的生产(Metab Eng2007,9:160；WO2007024718)。这是通过乙醛脱氢酶的过度生产和将异源沙门氏菌(Salmonella enterica)乙酰辅酶A合成酶的变体引入宿主细胞中来达到的。
然而，仍然需要进一步提高乙酰辅酶A的生产，直至当其满足应当增加任何所需的乙酰辅酶A衍生产物的生产。本发明使用结合的推-拉-阻断策略(push-pull-block)解决了这一问题，从而提供了可用于提高生产乙酰辅酶A衍生产物的细胞工厂平台。这里通过使用由乙酰辅酶A衍生的3种不同的化合物来举例说明。
发明内容
在第一方面，本发明提供了通过将醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)的过表达修饰的酵母细胞，其特征在于进一步过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
另一个方面，本发明提供了制备修饰的酵母细胞的方法，包括过表达醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，其特征在于所述方法还包括过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
又一个方面，本发明提供了一种生产升高水平的乙酰辅酶A衍生的产物的方法，其包含在有利于所述产物的生产的条件下培养本发明的酵母细胞，所述酵母细胞能够生产这样的产物。
附图说明
图1：酿酒酵母中的乙酰辅酶A代谢的简化概述。乙酰辅酶A是一个关键的初级代谢产物，其定位于三个不同的亚细胞区室：细胞质(C)、线粒体(A)和过氧化物酶体(B)。在三个区室之间没有乙酰辅酶A的直接传输，并且三个区室中乙酰辅酶A的生物合成涉及到不同的代谢路径。在线粒体中，乙酰辅酶A由丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物而形成。在细胞质中，乙酰辅酶A由乙酸酯通过乙酰辅酶A合成酶而形成。在过氧化物酶体中，乙酰辅酶A可由乙酸酯(也通过乙酰辅酶A合成酶，未示出)形成，也可由脂肪酸通过β-氧化而形成。在线粒体中，在乙酰辅酶A的主要命运是通过三羧酸(TCA)循环的氧化。过氧化物酶体中的乙酰辅酶A可以通过乙醛酸循环(GYC)被转化为C4有机酸(苹果酸和琥珀酸)，所述有机酸可被转移到线粒体中通过苹果酸酶和TCA循环进行氧化。乙酰辅酶A在细胞质中的主要命运是作为细胞脂质(脂肪酸和麦角固醇)的前体。许多工业上感兴趣的生物技术产物均源自乙酰辅酶A并且大多数的这些产物合成发生在细胞质中。因此，所有这些产物的酵母细胞工厂平台应使碳重定向于细胞质中的乙酰辅酶A。
图2：用于提高细胞质中乙酰辅酶A的生产的推-拉-阻断代谢工程策略的说明(乙酰辅酶A定位的三个细胞区室如图1所描绘的)。通过过表达编码NADP-依赖性乙醛脱氢酶的内源ALD6和来自沙门氏菌(ACSSE)的编码乙酰辅酶A合成酶的异源ACS变体，可以确保在细胞质中流动(flux)由乙醛定向到乙酰辅酶A(该策略的推部分)。通过进一步过表达编码乙醇脱氢酶的ADH2，进一步保证了生产的乙醇可以被转换回乙醛并由此进一步转化为乙酰辅酶A(策略的拉部分)。为了在期望的路径上拉乙酰辅酶A，我们过表达编码乙酰乙酰辅酶A合成酶的ERG10，所述合成酶催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(AcAcCoA)，因为这种代谢物是用于评估乙酰辅酶A平台菌株的三种产物的常见的前体。除了过表达之外，涉及乙酰辅酶A的消耗的反应被删除(策略的阻断部分)。这涉及乙醛酸循环(GYC)的两个关键反应，即由CIT2编码的过氧化物酶体柠檬酸合酶和由MLS1编码的细胞质苹果酸合酶。附图中的该路径图是代谢的简化视图，例如过氧化物酶体中柠檬酸合成酶使用的乙酰辅酶A是由乙酸酯通过Acs1p在此合成的。
图3：质粒pIYC05和pIYC08的图谱。
图4：质粒pICK01、pAK01和pPHB-pha的图谱以及α-檀香烯(A)、1-丁醇(B)和PHB(C)重组生物合成路径的示意图。
图5：酵母乙酰辅酶A的代谢工程提高了α-檀香烯(A)、1-丁醇(B)和聚羟基丁酸酯(PHB)(C)的生产。重组生物合成路径的示意图在上部分中示出。下述的酶来源于其它生物：Sts,黄皮(Clausena lansium)；PhaA,PhaB,PhaC,真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)；Hbd,Crt,AdhE2,拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)；Ter,齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。过表达截断版本的内源HMG1(tHMG1)用于α-檀香烯的生产。所有的工程化酿酒酵母菌株在文中都有记载。培养物生长在含有20ml定义的基本培养基(具有20克/升葡萄糖作为碳源)的100ml摇瓶中。α-檀香烯水平通过GC-MS定量，1-丁醇和PHB水平通过HPLC定量。tHMG1，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；Sts，α-檀香烯合酶；PHaA，乙酰辅酶A乙酰转移酶；PhaB，乙酰乙酰辅酶A还原酶；PhaC，聚(3-羟基丁酸酯)聚合酶；Hbd，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶；Crt，巴豆酸酶；Ter，反式烯酰辅酶A还原酶；AdhE2，丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶。
图6：Adh2和Erg10的过表达进一步提高了共表达ACSSE和ALD6的酵母细胞中α-檀香烯的效价。在表达下述基因的酵母菌株中α-檀香烯积聚的对比：(i)截短版本的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)基因和α-檀香烯合酶基因(Sts)(菌株SCIYC40)；(ii)tHMG1和Sts基因连同ACSSE和ALD6基因(菌株SCIYC41)；tHMG1、Sts、ACSSE、ALD6基因连同Adh2和Erg10(菌株SCIY42)。
具体实施方式
本发明的酵母细胞具有惊人的优势，生产增高水平的乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A，从而能够生产增高水平的由它们衍生的有用产物，例如萜类化合物、1-丁醇和聚羟基丁酸酯等。
酵母细胞可以是任何类型的酵母细胞。优选地，所述酵母细胞能够产生乙醇。更优选地它是从酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis genera)的酵母中选出。最优选地，它是酿酒酵母。
该策略包括将来自乙醇的碳通过乙醛推至乙酰辅酶A。这是通过过表达醇脱氢酶(例如酿酒酵母中的内源性ADH2基因)和醛脱氢酶(如酿酒酵母中的NADP依赖性ALD6基因)和乙酰辅酶A合成酶(例如来自肠道沙门氏菌(ACSSE)的ACS变体(L641P))来实现的。ACSSE含有点突变，可防止酶被乙酰化抑制(J Biol Chem2005,280:26200)，并且该变体的应用在细胞质中特别有效地将流动由乙醛重定向到乙酰辅酶A。
为了确保乙酰辅酶A朝着三种目标产物方向的拉动，同样过表达乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，所述转移酶催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(AcAcCoA)。AcAcCoA是用于评估的乙酰辅酶A平台菌株的三种产物的常见的前体。在酿酒酵母中，ERG10基因编码乙酰辅酶A C-乙酰转移酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述酵母细胞通过缺失编码细胞质苹果酸合酶基因或来自酵母细胞基因组的编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因被进一步修饰。这种缺失具有避免乙酰辅酶A在乙醛酸循环中被消耗的优点，从而增加乙酰辅酶A在其他路径(如那些生成萜类化合物、1-丁醇或聚羟基丁酸酯的路径)中的可用性。
为了进一步降低来自前体乙酰辅酶A池的碳损失，优选清除涉及乙酰辅酶A消耗的反应。这涉及除去乙醛酸循环(GYC)的两个关键反应，即酿酒酵母中分别由CIT2和由MLS1编码的过氧化物酶体柠檬酸合酶和胞质苹果酸合酶。
本发明的酵母细胞可以通过包含过表达醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶的方法来制得。
在本发明的一个优选实施方案中，所述方法还包括从酵母细胞基因组中缺失编码细胞质苹果酸合酶的基因或编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因。
醛脱氢酶、ACS、醇脱氢酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、细胞质苹果酸合酶、过氧化物酶体柠檬酸合成酶和酵母细胞如上文涉及酵母细胞的本发明的任何实施方案中所定义。
醛脱氢酶、ACS、醇脱氢酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶的过表达可以使用附加型酵母表达载体进行或通过使用现有技术中公知的方法的基因组整合进行。这些方法是标准方法，但可以例如按照Methods in Yeast Genetics,2005Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory press中所描述的来进行。
苹果酸合酶和柠檬酸合酶基因的缺失可通过本领域技术人员公知的用于基因缺失的任何方法来进行，诸如例如无克隆基于PCR的等位基因置换方法(如在Genome Res.1997,7:1174所述的)或任何其它基因缺失方法。
通过在合适的条件下培养本发明的酵母细胞，可以产生次级代谢物。优选地，以增加的水平产生所述代谢物，即将培养本发明的酵母细胞与培养未转化的酵母细胞相比较时产生了更多的次级代谢产物。
酵母细胞必须能够产生所希望的次级代谢产物。这意味着酵母细胞天然能够生产这样的次级代谢产物或者替代地用生产这类代谢物所必需的另外的基因转化酵母细胞。如上所述的酵母细胞的进一步修饰具有增加未如此修饰的酵母细胞产生次级代谢产物的水平的效果。
例如，当次级代谢产物是萜类化合物时，酵母细胞可以被转化以表达或过表达能够催化无环萜前体向此类萜类化合物转化的萜合成酶。取决于所打算要生产的萜类化合物，这适用于所有的无环萜前体，诸如例如焦磷酸牻牛儿酯、焦磷酸法呢酯和焦磷酸牻牛儿基牻牛儿酯。萜类化合物是因它们的风味和香味、化妆品、医药和抗微生物性质而公知的天然产物。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元形成，并通过这些单元存在于它们的结构中的数目来分类。因此单萜、倍半萜和二萜分别是含有10、15和20个碳原子的萜。例如倍半萜广泛存在于植物界中。许多单萜、倍半萜和二萜分子因它们的风味和香味特性以及它们的化妆品、医药和抗菌效果而公知。超过300种倍半萜烃和3000倍半萜类化合物已经被鉴定出来，并且每年有许多新的结构被鉴定出来。通过不同的方式如水蒸气蒸馏法或溶剂萃取得到的植物提取物作为萜的来源。萜分子通常原样使用，但在某些情况下，使用化学反应将萜转化为其它高价值分子。当今使用的大多数萜是提取自不同生物体(植物、海洋生物...)的天然产物。然而，大多数这些源生物体不适合于生产商业上可行数量的大规模种植，也不适合于遗传操作以增加其生产能力。此外，许多这些天然产物具有复杂的结构且目前尚无化学手段可用。
优选的倍半萜的例子包括α-檀香烯、广藿香醇、β-檀香烯、朱栾倍半萜、荜澄茄醇、客烯(zizaene)、紫穗槐4,11-二烯、葎草烯、马兜铃烯、佛手柑油烯(bergamotene)、姜烯、金合欢烯、石竹烯、异胡萝卜烯、倍半松油烯(sesquithujene)、阿维醇(avermitilol)、桉叶油醇、岩兰螺旋二烯(vetispiradiene)、长叶烯、环古巴莰烯(cyclocopacamphene)、异长叶烯、大根香叶烯、双环大根香叶烯、红没药醇、大根香叶二烯醇(germacradienol)、四甲基环癸二烯异丙醇(hedycaryol)、巴巴烯(barbatene)、表雪松醇、表马兜铃、倍半香桧烯、枯烯(cuprene)、蛇床烯、古巴烯、大果烯(macrocarpene)、杜松醇、臭根醇(intermedeol)、橙花叔醇、穆罗拉-3,5-二烯(muurola-3,5-diene)、姜黄烯和表β-檀香烯。更优选的倍半萜类包括α-檀香烯、广藿香醇、β-檀香烯、朱栾倍半萜、荜澄茄醇、客烯、紫穗槐4,11-二烯，甚至更优选地，所述倍半萜烯是广藿香醇或α-檀香烯。
优选的双萜的例子包括香紫苏醇、赖百当烯二醇(labdendiol)和紫杉烯。优选的单萜类的例子包括柠檬烯、蒎烯、月桂烯、莰烯、水芹烯、萜品油烯、罗勒烯、里哪醇、桉树脑、香叶醇、萜品烯、葑醇、蒈烯、桧烯。
可以使用本发明的方法制成的代谢物的另一个例子是1-丁醇。1-丁醇被认为是一种可能的汽油替代品，因为它具有更高的能量密度，而它与乙醇相比具有更低的腐蚀性和水溶性。
可以使用本发明的方法制成的代谢物的另一个例子是聚羟基丁酸酯(PHB)。PHB是商业有趣的可生物降解的生物聚合物家族的成员之一。
本发明的酵母细胞可以培养于任何类型的适合于这样的酵母物种的生长培养基中。这种培养基在本领域中是公知的且在此不保证更详细的描述，这在任何情况下是不能穷尽的。生长培养基优选还适于用于过度表达上述基因的启动子的类型。例如，如果过表达的基因由葡萄糖调节启动子控制，生长培养基优选包含葡萄糖。
实施例
现在通过下列实施例的方式进一步详细说明书本发明。
实施例1
酵母菌株和培养基
将酿酒酵母菌株CEN.PK113-11C(MATa SUC2MAL2-8cura3-52his3-Δ1,由德国University of Frankfurt的P.友情提供)用作背景菌株。在该研究中使用的所有酵母菌株总结于表1中。
在适当情况下，将工程化的酵母菌株在无尿嘧啶和/或组氨酸的合成右旋糖(SD)(Metabolic Engineering2009,11:391)培养基中进行选择。酿酒酵母菌株生长于含20g/L葡萄糖的定义基础培养基(Yeast1992，8:501)中。为了生产α-檀香烯，将10％(V/V)十二烷覆盖物添加到OD600为1的培养物中以在有机相中捕获α-檀香烯。
实施例2
ALD6、ACS SE 、ADH2和ERG10酵母表达质粒
为了提供葡萄糖基培养物中的基因表达，所有的酵母表达质粒都是基于带有组成型启动子PTEF1和PPGK1的两个载体pSP-G1和pSP-G2(Yeast2010,27:955)(参见表2，本研究中使用质粒的列表)。
为了提供每种终止子(分别为TADH1和TCYC1)下游的附加的限制性酶识别位点，使用引物17和18通过对整个表达盒进行PCR扩增(见表3，在本研究中使用的引物列表)，用PvuII剪切并连接回载体骨架分别生成pSP-GM1和pSP-GM2。含PTEF1-PPGK1双向启动子盒的来自PSP-GM1的2.1kb PvuII片段随后被克隆到pESC-HIS(Stratagene)的PvuII位点产生pIYC04。
划线部分为限制性位点。
使用引物对1和2从酿酒酵母CEN.PK113-5D(MATa SUC2MAL2-8c ura3-52)的染色体DNA制备物中PCR扩增ALD6(SEQ IDNO:42)。使用这些引物，将核苷酸序列5'-AAAACA-3'(Kozak序列)即刻引入ALD6的起始密码子的上游以改善翻译效率(NucleicAcids Res.1987,15:3581)。将这种策略应用于所有该研究中使用的其它基因。具有L641P突变的沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶(ACSSE)基因(J.Biol.Chem.2005,280:26200),ACSSE是密码子优化的(SEQ ID NO:52)并且通过DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)合成用于酵母中的高水平表达。将含Kozak序列和ALD6的编码序列的1.5-kb BamHI/XhoI片段、以及含Kozak序列和ACSSE编码序列的2.0-kb NotI/PacI片段相继地插入pIYC04的相应位点，得到质粒pIYC05(图3)。
为了在葡萄糖基HXT7启动子的控制下表达ADH2基因，使用引物对3和4将HXT7的0.6-kb启动子区域从CEN.PK113-5D进行PCR扩增。扩增产物用BamHI/FseI剪切，并引入到pSP-GM1的BamHI和FseI位点以取代PGK1启动子，生成质粒pIYC06。使用引物对5和6，从CEN.PK113-5D将含1,047-bp的ADH2(SEQID NO:41)的完整序列和包含其天然终止子的434-bp下游序列的1.5-kb片段通过PCR扩增出来。类似地，使用引物对7和8将ERG10(SEQ ID NO:43)的1.2-kb区域从CEN.PK113-5D通过PCR扩增出来。随后将含Kozak序列和ADH2的1.5-kb BamHI/XhoI片段以及含Kozak序列和ERG10的1.2-kb SpeI/SacI片段相继插入到pIYC06的相伴位点中，得到质粒pIYC07。
为了过表达来自单一质粒的ALD6、ACSSE、ADH2和ERG10，于是构建pIYC08。使用引物9和10从pIYC07通过PCR扩增出含TEF1启动子、ERG10和ADH1终止子的2.0-kb片段以引入MreI/Kpn2I位点。得到的DNA用MreI/Kpn2I剪切并插入到pIYC05的MreI/Kpn2I位点以获得质粒pIYC05-1。类似地，使用引物11和12从pIYC07通过PCR扩增含HXT7启动子、ADH2和其天然终止子的基因盒以引入两个AscI位点。使用AscI消化扩增的产物并且随后将其克隆到pIYC05-1的AscI位点上，生成pIYC08(图3)。
实施例3
α-檀香烯和tHMG1酵母表达载体的构建
为了构建(+)-α檀香烯的表达载体，使用引物19和20将檀香萜合酶(Sts)的cDNA(SEQ ID NO：46)从质粒Cont2B-27-pET101通过PCR扩增出来(WO2009109597，GenBank登记号(accessionnumber)：HQ452480)，用NotI/PacI剪切，并连接到NotI/PacI限制性载体pSP-G1上(Yeast2010，27:954)。随后，使用酿酒酵母CEN.PK113-5D的基因组DNA作为模板以及引物31和32将tHMG1通过PCR扩增出来，用BamHI/NheI剪切并连接到用BamHI和NheI限制后的相同载体中(Nature2006，440:940)。这导致表达质粒pICK01的形成(图4)。
实施例4
聚羟基丁酸酯路径表达载体的构建
通过使用多拷贝质粒将聚羟基丁酸酯的生物合成路径导入酿酒酵母菌株CEN.PK113-11C。PHB的生物合成路径中涉及三种酶，由phaA基因编码的β-酮硫解酶、由phaB基因编码的乙酰乙酰辅酶A还原酶和由phaC基因编码的PHA合酶。通过DNA2.0基于来自真氧产碱杆菌H16的原始pha基因的序列，合成并且密码子优化phaA(SEQ ID NO：53)、phbB(SEQ ID NO：54)和phaC(SEQ IDNO：55)以用于在酿酒酵母中表达。分别将phaA和phaB克隆到PGK1和TEF1启动子的pSP-GM2质粒下游的SacI/SpeI和SalI/BamHI位点，生成pSP-GM2-phaAB。将PhaC克隆到TEF1启动子的pSP-GM2下游的XhoI/KpnI位点。使用引物13和14扩增phaC的片段、TEF1启动子和CYC1终止子并在MfeI位点连接到pSP-GM2-phaAB上，得到质粒pPHB-pha(图4)。
实施例5
丁醇路径表达载体的构建
两个质粒用于表达丁醇路径基因。编码丁醛脱氢酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、反式烯酰辅酶A还原酶的四个基因是从一个质粒中表达，而硫解酶基因(ERG10)从另一个质粒中表达。
使用SpeI和SacI在TEF1启动子调控下将来自CEN.PK113-5D的ERG10从pIYC07克隆到pIYC04以产生pCS01。
编码丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶(adhE2)、3羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)和巴豆酸酶(crt)的基因来自拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。反式烯酰-CoA还原酶(ter)来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。所有这些基因均被密码子优化以用于在酵母中高水平表达并且通过DNA2.0合成。
使用NotI和PacI在TEF1启动子调控下将AdhE2(SEQ ID NO:50)克隆到pSP-GM1。然后使用BamHI和NheI在PGK1启动子调控下将Ter(SEQ ID NO:51)克隆到相同的质粒中。这生成了质粒pAK0。
使用NotI和PacI在TEF1启动子调控下将Crt(SEQ ID NO:48)克隆到pSP-GM1，然后使用BamHI和NheI在PGK1启动子的调控下将hbd(SEQ ID NO:47)克隆到相同的质粒中。然后使用引物15和16将包含这两种基因以及它们的启动子的基因盒从该质粒中扩增出来，该基因盒包含Kpn2I和MreI限制性位点。然后将该基因盒克隆到pAK0中，生成pAK1(图4)。
实施例6
cit2和mls1的缺失
使用无克隆基于PCR的等位基因置换方法(Genome Res.1997,7:1174)进行基因缺失。为了缺失cit2(SEQ ID NO:44)，使用下述寡核苷酸通过PCR从CEN.PK113-5D的基因组DNA分别扩增cit2开放阅读框的5’和3’区域：CIT2-UP-正向、CIT2-UP-逆向、CIT2-DOWN-正向、CIT2-DOWN-逆向(参见表4，用于基因缺失的引物列表)。使用下述寡核苷酸从质粒pUG6(Guldener et al.,1996)中以两个重叠部分扩增KanMX表达模块(expression module)：KanMX-UP-正向、KanMX-UP-逆向、KanMX-DOWN-正向、KanMX-DOWN-逆向。
划线序列对应于重叠核苷酸。
通过PCR将片段CIT2-UP/KanMX-UP和KanMX-DOWN/CIT2DOWN相互融合。通过同源重组将两个融合片段整合到基因组中。对于KanMX表达模块的环出诱变(loop-out),按照之前记载的步骤进行(Guldener et al.,1996)。随后，将校正的转化体重新划线接种于含5-氟乳清酸的培养基中用于以URA3标记进行质粒pSH47的环出诱变，以及尿嘧啶营养缺陷型重新利用。由此，得到菌株SCIYC06(MATa MAL2-8c SUC2ura3-52cit2Δ::lox)。
相同的方法用于MLS1(SEQ ID NO:45)缺失。用于实施MLS1基因缺失的寡核苷酸列于表4中。
每种基因的缺失通过诊断PCR(diagnostic PCR)来验证，其通过使用来自每种菌株的基因组DNA作为模板，并且每种基因使用两对引物：一个位于整合位点之外而另一个在整合片段之内。用于菌株确认的所有的引物列于表5中。
最后，通过使菌株SCIYC06(MATa SUC2MAL2-8c ura3-52cit2Δ)和CEN.PK110-10C(MATαSUC2MAL2-8c his3-Δ1,由P.友情提供)杂交、接着进行四分体解剖(tetrad dissection)，构建了菌株SCIYC32(MATa SUC2MAL2-8c ura3-52his3-Δ1cit2Δ)。类似地，通过使菌株SCIYC07(MATa SUC2MAL2-8cura3-52mls1Δ)和CEN.PK110-10C)杂交、接着进行解剖，构建了菌株SCIYC33(MATa SUC2MAL2-8c ura3-52his3-Δ1mls1Δ)。
实施例7
用于α-檀香烯、1-丁醇和PHB的生产的工程化酵母菌株的构 建
通过标准乙酸锂法(Nucleic Acids Res.1992,20:1425)进行所有酵母菌株转化。从每种转化筛选出3～10个菌落以用于最佳生产转化体的选择。
通过将质粒pICK01和pIYC04转化到菌株CEN.PK113-11C中，随后在SD-URA-HIS板上筛选，构建了生产α-檀香烯的菌株SCIYC40。将质粒pICK01和pIYC08共转化到菌株CEN.PK113-11C中，并且在SD-URA-HIS板上筛选来构建SCIYC42。类似地，将这两个质粒分别共转化到SCIYC32和SCIYC33中得到SCIYC45和SCIYC46。
通过用pIYC08和pAK1(分别)转化CEN.PK113-11C、SCIYC33和SCIYC32来构建生产1-丁醇的菌株pAKY1、pAKY和pAKY3。通过用pCS01和pAK1(分别)转化CEN.PK113-11C、SCIYC33和SCIYC32来构建菌株pAKY4、pAKY5和pAKY6。通过用pIYC04和pAK1转化CEN.PK113-11C来构建菌株pAKY0。在SD-URA-HIS板上筛选菌株。
通过转化质粒pPHB-pha和pIYC04至菌株CEN.PK113-11C中，随后在SD-URA-HIS板上筛选，构建了作为对照的生产PHB的菌株SCKK005。将质粒pPHB-pha和pIYC08共转化到菌株CEN.PK113-11C中来构建SCKK006。类似地，分别将这两个质粒共转化到SCIYC32和SCIYC33中得到SCKK009和SCKK010。
实施例8
α-檀香烯、1-丁醇和PHB的生产、纯化以及定量分析的方法
为了检验来自上述不同菌株的α-檀香烯、1-丁醇和PHB的生产，通过接种在600nm下获得0.02最终光密度(OD600)的量的预培养物，在100ml无挡板烧瓶中起始20mL培养物。菌株在30℃下以180转轨道振荡在具有下述组成的定义基础培养基中生长：7.5g/L(NH4)2SO4；14.4g/L KH2PO4；0.5g/L MgSO4.7H2O；2ml/L痕量金属溶液(每升,pH4.0:EDTA(钠盐),15.0g；ZnSO4·7H2O,0.45g；MnCl2·2H2O,1g；CoCl2·6H2O,0.3g；CuSO4·5H2O,0.3g；Na2MoO4·2H2O,0.4g；CaCl2·2H2O,0.45g；FeSO4·7H2O,0.3g；H3BO3,0.1g和KI,0.10g)。通过添加2M NaOH将矿物培养基的pH调节到6.5并且与碳源溶液分开进行高压灭菌处理。以20g/L的浓度添加葡萄糖。将维生素溶液(每升,pH6.5:生物素,0.05g；对-氨基苯甲酸,0.2g；烟酸,1g；泛酸钙,1g；吡哆醇盐酸,1g；盐酸硫胺素,1g和肌醇,25g)过滤灭菌并以1ml/L的浓度无菌地添加到高压灭菌处理后的培养基中。为了制备预培养物，含5mL的定义培养基(如上所述)的培养试管用目标单菌落接种。这些接种物在30℃下220r.p.m.轨道振荡中培养直至OD600为1-2。
为了生产α-檀香烯，在OD600为1的主要培养物中添加10％(v/v)十二烷以在有机相中捕获α-檀香烯。取样该十二烷层并将其在癸烷中稀释以通过GC-MS测定α-檀香烯的生产。
用装有SLB-5ms毛细管柱(30m,0.25mm直径,0.25μm膜厚；Supelco,Bellefonte,PA,USA)的气相色谱-质谱(Thermo Scientific,Waltham,MA)对α-檀香烯进行分析。载气为1.2毫升/分钟恒定流量的氦气。分流/不分流进样器是在无分流模式下使用。初始炉温为80℃和进样器温度为250℃。炉温以10℃/min的速率升高到120℃并且随后以3℃/min的速率升至160℃。然后以10℃/分钟的梯度升至270℃并在该温度下保持5分钟。通过在50-650的m/z范围扫描以产生全质谱来进行代谢物的鉴定。使用标准曲线进行α-檀香烯的定量。
如先前所描述的，对PHB进行分析(Appl.Environ.Microbiol.1983,46:1339；Appl.Environ.Microbiol.2006,72:3412)。通过离心(10分钟，5000×g)从培养物中收集超过10毫克的细胞。将得到的细胞沉淀物洗涤一次并冻干。将干燥的细胞在1毫升的浓硫酸中煮沸60分钟，然后用4ml的14mM的H2SO4稀释。将样本离心(15分钟,16,000×g)以除去细胞碎片，并且将上清液用配备有Aminex HPX-87H离子排阻柱(300×7.8mm；Bio-Rad Hercules,CA)和UV检测仪的高压液相色谱仪(Dionex-HPLC,Sunnyvale,CA)进行分析。与样本并行处理的市售PHB(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)用作标准物。HPLC是在60℃和0.6毫升/分钟流速的5mMH2SO4下运行。
为了分析1-丁醇的水平，在不同时间点收集样品，离心并过滤。然后将样本用配备有Aminex HPX-87H离子排阻柱(300×7.8mm；Bio-Rad Hercules,CA)和RI检测仪的高压液相色谱仪(Dionex-HPLC,Sunnyvale,CA)进行分析。将市售1-丁醇用作标准物。HPLC在45℃和0.6ml/min的5mM H2SO4下运行。
实施例9
乙酰辅酶A平台菌株的评估
为了评估乙酰辅酶A平台菌株，评估了α-檀香烯的生产，α-檀香烯是一种天然存在的倍半萜且是α-檀香醇的生物合成的前体，檀香油的重要组成部分。如图4A所示，檀香烯在单一酶促步骤中直接来源于倍半萜的生物前体的法呢基焦磷酸酯(FPP)。为了增加FPP的生产，通过过表达3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶1(tHMG1)的催化结构域将酵母的内源性甲羟戊酸路径解除管制(J Biol Chem1999,274:316171)，之前显示出导致酵母中异戊二烯类生产的改善(Nature2006,440:940)。为了克服酵母中表达植物基因的困难，将编码α-檀香烯合酶的Sts cDNA进行密码子优化以用于在酿酒酵母中高水平表达。用含tHMG1和Sts的质粒pICK01转化作为参照菌株的转基因酵母菌株SCYC040(表1)。在摇瓶培养物中，在48小时的生长之后产生了2.08mg/L的α-檀香烯(图5A)。通过使质粒pICK01和表达ALD6、ACSSE、ADH2和ERG10的质粒pIYC08共表达，α-檀香烯的生产增加至3.65毫克/升(图5A，菌株SCYC042)。结合CIT2缺失和与质粒pIYC08的共表达获得的菌株SCYC045能够产生4.98mg/L的α-檀香烯(图5A)。此外，当在得到的菌株SCYC046的MLS1缺失菌株中共表达质粒pIYC08时，α-檀香烯的生产进一步增加至8.29mg/L(图5A)，这表示相对于对照菌株4倍的提高。为了进一步评估当前策略并与过表达ACSSE和ALD6的之前发表的文献(Metab Eng2007,9:160)的比较，这两个基因用质粒pICK01共表达(图6，菌株SCIYC41)。结果显示额外的ADH2和ERG10的过表达导致了在α-檀香烯最终效价的25％的增加(图6，菌株SCIYC42)并且连同阻断策略，α-檀香烯的生产中获得了2～4倍的增加(图6A)。
接着，在乙酰辅酶A平台菌株中评估1-丁醇的生产。1-丁醇已被普遍认为是一种可能的汽油替代品，因为它具有更高的能量密度，而它比乙醇的腐蚀性小且水溶性低(Nat Chem Biol2011,11:262)。从乙酰辅酶A生产1-丁醇所需的反应和相应的酶概括于图4B中。通过选择利用NADH作为辅因子的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(Hbd)、巴豆酸(Crt)和来自拜氏梭菌的双官能的丁醛和丁醇脱氢酶(AdhE2)(Microb Cell Fact2008,7:8)、以及来自齿垢密螺旋体的NADH依赖性巴豆酰辅酶A特异性反式烯酰辅酶A还原酶(Ter)(Nat Chem Biol2011,7:222)对合成路径进行组装。编码这些酶的基因是化学合成的，以进行密码子优化并将其克隆到附加体质粒中，生成1-丁醇生产质粒pAK01(图4B)。为了检验组装的路径生产1-丁醇的能力，将表达这些外源基因的酿酒酵母培养物生长于含有2％葡萄糖的基本培养基中。观察到2.17mg/L的1-丁醇(图4B，菌株SCAK00)，其类似于以前在酿酒酵母(21)中产生的量。然后，同时用包含ALD6、ACSSE、ADH2和ERG10的质粒pIYC08共表达功能路径(图5B中，菌株SCAK01)，并且得到9.40mg/L的1-丁醇的效价，其与不使用乙酰辅酶A路径工程化的对照菌株相比有～4倍的增加(图5B)。这些结果表明，保证用于丁醇生产的前体乙酰CoA的有效供给是重要的。这两个质粒系统在MLS1缺失的菌株中(图5B中，菌株SCAK02)的进一步评估导致了1-丁醇生产的额外1.7倍的增加，至14.04毫克/升。当将过表达与CIT2缺失组合时，导致的菌株(图5B中，菌株SCAK03)能够产生16.26mg/L的1-丁醇，该生产水平比先前的报道(Microb Cell Fact2008,7:8)高接近8倍。
最终检测乙酰辅酶A平台菌株对PHB的生产，其为商业感兴趣的生物可降解的生物聚合物(Microbiol Mol Biol Rev1999,63:21)的家族成员。为了在酿酒酵母中生产PHB，通过来自真氧产碱杆菌用于单体生物合成(phaA和phaB)以及聚合(PhaC)的三基因路径的转化来实现合成路(J Biol Chem1989,264:15293；J Biol Chem1989,264:15298；J Biotechnol2006,124:561)。将编码phaA、pHaB和phaC的合成的、密码子优化的基因克隆到单一表达载体中，得到pPHB-pha(图4C)。，在定义基础培养基中生长120小时之后，该合成路径在对照菌株中的表达产生了浓度为13.39mg/L的PHB(图5C，菌株SCKK005)。当包含ALD6、ACSSE、ADH2和ERG10的质粒pIYC08与PHB生产载体共表达时，PHB积聚到240.99mg/L，与对照菌株(图5C，菌株SCKK006)(J Biotechnol2006,124:561)相比有18倍的增加。然而，这两种质粒在CIT2缺失或MLS1缺失的菌株中的同时共表达没有进一步提高PHB的生产，这表明阻断策略对于PHB的生产不起作用(图5C，菌株SCKK09和SCKK10)。这有可能由于在此用于评估PHB的生产的分批次发酵中，PHB主要生成于二阶段转移的乙醇阶段的事实所造成的。携带CIT2或MLS11缺失的菌株无法在例如乙醇、乙酸酯作为唯一碳源的C2化合物之上生长，因此，这些菌株在乙醇生长阶段不能提供用于PHB生产的必需的吉布斯自由能和氧化还原等价物。

Claims (15)

1.一种通过醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)的过表达修饰的酵母细胞，其特征在于醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶被进一步过表达。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其特征在于编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因或编码细胞质苹果酸合酶的基因已被从酵母细胞基因组中删除。
3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其特征在于所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。
4.根据权利要求3所述的酵母细胞，其特征在于所述醛脱氢酶是ALD6，醇脱氢酶是ADH2，乙酰乙酰辅酶A合成酶是ERG10，过氧化物酶体柠檬酸合酶是CIT2且细胞质苹果酸合酶是MLS1。
5.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其特征在于在ACS包含防止酶被乙酰化抑制的点突变。
6.根据权利要求5所述的酵母细胞，其特征在于ACS是来自肠道沙门氏菌的变体L614P。
7.一种制造修饰的酵母细胞的方法，其包含过表达醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，其特征在于所述方法进一步包含过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包含从酵母细胞基因组中缺失编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因或编码细胞质苹果酸合酶的基因。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述醛脱氢酶是ALD6，醇脱氢酶是ADH2，乙酰乙酰辅酶A合成酶是ERG10，过氧化物酶体柠檬酸合酶是CIT2且细胞质苹果酸合酶是MLS1。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的方法，其特征在于所述ACS如权利要求5或6中所定义。
12.一种用于生产增加水平的衍生自乙酰辅酶A的产物的方法，包含在有利于所述产物的生产的条件下培养权利要求1至6任一项所述的酵母细胞，该细胞能够生产这样的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于该产物衍生自乙酰乙酰辅酶A。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述产物选自于由萜类化合物、1-丁醇和聚羟基丁酸酯组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述萜类化合物是α-檀香烯。
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