CN107429223A

CN107429223A - 从头微生物合成萜类的方法

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Publication number: CN107429223A
Application number: CN201680014850.4A
Authority: CN
Inventors: J·施拉德尔; M·布赫豪普特; F·松塔格; C·克罗纳; H·布吕泽; H·施罗德; R·派尔泽
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-12-01
Also published as: US20180105838A1; MX2017011681A; WO2016142503A1; DE102015103608A1; JP2018507698A; EP3268467A1

Abstract

本发明涉及微生物产生萜烯。用于微生物产生萜类的已知方法大多基于糖的直接转化。因此，需要用于微生物产生萜烯的备选性底物，尤其备选性碳源。本发明涉及含有重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌中异源表达，其中所述至少一种具有酶活性的多肽选自异源甲羟戊酸途径酶、异源萜烯合酶和任选地异戊二烯基二磷酸前体的异源合酶。本发明进一步尤其涉及一种从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜的方法。

Description

从头微生物合成萜类的方法

本发明涉及甲基营养细菌、从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜的方法和甲基营养细菌从甲醇和/或乙醇从头微生物合成萜类的用途。本发明涉及白色生物技术领域。

作为生产香精、香料和化妆品物质和生物燃料物质的环境友好型可能方式，已经对各种微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)描述了萜类的微生物合成法(Martin等人,2003,Nature Biotechnology 21,796-802；Asadollahi等人,2008,Biotechnology and Bioengineering 99,666-677；Chandran等人,2011,Process Biochemistry 46,1703-1710)。在这些当中，可观的增长潜力归因于未来数年间微生物产生萜烯，这尤其因化石资源稀缺和世界人口日益增长伴随需要环境友好地合成化学物质所致(Peralta-Yahya等人,2010,Biotechnol J 5,147-62；Ajikumar等人,2008,Molecular pharmaceutics 5,167-90)。

微生物产生萜类的已知方法大多基于直接转化糖、尤其葡萄糖或与食物生产处于竞争的底物如丙三醇、或复杂底物如蛋白质水解物(Yoon等人,2009,Journal ofBiotechnology,140,218-226；Sarria等人,2014,ACS Synthetic Biology 3(7),466–475)。利用这类物质作为生物技术的底物伴随多个缺点，所述缺点以及伦理因素尤其与未来波动和假定增长的价格水平及地区因素和季节因素相关。另外，复杂培养基或含糖培养基的使用总是伴随产品加工和无菌性要求的成本增加。因此，需要用于生物技术中的备选性底物、尤其备选性碳源，其尽可能弥补上述缺点。

US 2008/0274523 A1中描述了萜类、尤其紫穗槐-4,11-二烯或萜烯混合物的微生物产生。但是，根据该专利，仅使用单糖葡萄糖作为碳源。特别地，其中未描述用于发酵的备选性碳源。另外，根据US 2008/0274523 A1，需要异源表达乙酰乙酰-CoA合酶(乙酰乙酰-CoA硫解酶)。

根据US 2003/0148479 A1，提出在大肠杆菌中微生物生物合成异戊烯基焦磷酸(IPP)，其中培养在LB培养基中进行。在这种情况下，需要异源表达乙酰乙酰-CoA合酶(乙酰乙酰-CoA硫解酶)，并且另外，向培养基添加甲羟戊酸途径的各种中间体。未提出用于发酵的备选性碳源。

US 2011/0229958 A1显示了用来在大肠杆菌中产生异戊二烯化合物的微生物。再次需要异源表达乙酰乙酰-CoA合酶(乙酰乙酰-CoA硫解酶)，并且向培养基添加甲羟戊酸。未提出用于发酵的价廉备选性碳源。

对于WO 2014/014339 A2，描述了用于合成单萜的重组红杆菌属(Rhodobacter)宿主细胞。作为碳源，提出了一种并未更详细表征的糖。未提到用于发酵的备选性碳源。

已经提出在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中从头产生单萜香叶酸(Mi等人,2014,Microbial Cell Factories 13:170)。但是，根据这个提议，仅使用含有LB的培养基中的丙三醇作为碳源。特别地，其中未提出用于发酵的备选性碳源。

使用复杂培养基或其组成并未适当表征的那些培养基阻碍了简单和价廉地生产所需产品。

因此根据第一方面，本发明的目的在于克服已知重组微生物就生物合成萜类而言的缺点。根据本发明的又一个方面，将要提供能够实现从备选性碳源从头微生物合成萜类的细菌。这里，细菌应当理想地能够依赖备选性碳源作为唯一碳源生长，尤其不应当需要添加成本高昂的底物添加物，如乙酰乙酸酯或D,L-甲羟戊酸。根据本发明的又一个方面，将要提供从备选性碳源从头微生物合成萜类的发酵方法，所述发酵方法能够实现所获得的萜烯产物的简单下游纯化。特别地，倍半萜和二萜应当以高产率可产生。根据又一个方面，该方法在摇瓶中及在用于生物技术放大时在发酵器中的转化和产率应当非常有前景或足够。

这些问题由权利要求和下文中描述的实施方案解决。

本发明的第一实施方案涉及一种含有重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌表达，其中所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-至少一种异源甲羟戊酸途径酶，其选自羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶；

-异源萜烯合酶和

-异戊二烯基二磷酸前体合酶，

尤其，本发明还涉及一种含有异源萜烯合酶和重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌表达，特征在于所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-至少一种异源甲羟戊酸途径酶，其选自羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶；和

-异戊二烯基二磷酸前体合酶。

同样地，本发明还涉及一种含有异源羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)和羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)作为异源甲羟戊酸途径的酶和重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌中表达，特征在于所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-异源甲羟戊酸途径的至少一种其他酶，其选自甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶；

-异源萜烯合酶和

-异戊二烯基二磷酸前体合酶。

特别优选地，本发明的细菌含有至少以下酶：

-异源羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)和羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)和至少一种选自甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的酶和特别优选地全部这些酶；和

-异源萜烯合酶，

最优选地，细菌额外地还含有异戊二烯基二磷酸前体合酶。

在本发明的上下文中，“异源”应当是理解为意指酶或一组酶，例如那些甲羟戊酸途径酶，所述酶不天然地出现在现在根据本发明将要含有该酶或该组酶的生物中。因此，异源萜烯合酶或异源甲羟戊酸途径酶不应当出现在本发明的甲基营养细菌中，反而衍生自一个或多个其他物种。

本发明的细菌令人惊讶地能够实现从备选性碳源(如甲醇和/或乙醇)从头微生物合成萜类。借助异源表达的否则不天然存在于这种细菌中的甲羟戊酸途径(MVA途径)酶，所述细菌可以依赖甲醇和/或乙醇作为唯一碳源生长并以高产率从头合成所需萜类。

所使用的甲基营养细菌的具体特征在于初级代谢(这里为乙基丙二酸单酰-CoA途径(EMCP))中存在乙酰乙酰-CoA分子。乙酰乙酰-CoA是甲羟戊酸途径中的第一分子。无论如何预料不到本发明重组甲基营养细菌的活力。因此，当撤除初级代谢的代谢物时，可肯定地假设可观的通量失衡。在这个方面，异源表达否则不天然出现在这种细菌中的至少一种甲羟戊酸途径酶的本发明细菌依赖甲醇和/或乙醇生长是令人惊讶的。另外，初级代谢中存在乙酰乙酰-CoA分子令异源表达乙酰乙酰-CoA合酶多余。根据本发明的又一步优选改良，甲基营养细菌不含编码乙酰乙酰-CoA合酶(乙酰乙酰-CoA硫解酶)异源表达的重组DNA。

在本发明的意义下，异戊二烯基二磷酸前体合酶尤其将异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)酶促转化成异戊二烯基二磷酸前体，其中异戊二烯基二磷酸前体优选地选自法呢基二磷酸(FPP)(C15)和香叶基香叶基二磷酸(GGPP)(C20)。

形成的非环状异戊二烯基二磷酸类(在此同义于异戊二烯基二磷酸类)–FPP和GGPP–是多种萜类的前体。异源萜烯合酶的底物优选地选自所述异戊二烯基二磷酸前体。

根据一个优选实施方案，本发明的甲基营养细菌含有重组DNA，所述重组DNA编码具有酶活性的多肽供所述细菌中异源表达，其中具有酶活性的多肽包括以下酶：

-异源甲羟戊酸途径(MVA途径)的酶，即羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶；

-异源萜烯合酶和

-异戊二烯基二磷酸前体合酶、尤其异源的异戊二烯基二磷酸前体合酶。

本发明的优选细菌特征在于，至少一种异源甲羟戊酸途径酶，即选自羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊二烯基焦磷酸异构酶的酶，含有与根据SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列分别具有至少60％同一性的肽序列，或由能够在严格杂交条件下与编码特定肽序列的相应核酸序列杂交的核酸序列编码。

对于含有与根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6的肽序列分别具有至少60％同一性的肽序列的酶，应当优选地理解，这些酶含有在每种情况下与根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5或SEQ ID No.6的特定肽序列之一至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的肽序列。不言而喻，具有特定肽序列的酶的这类变体应当还优选地基本上具有含有特定肽序列的上述酶的生物学活性。可以容易地用针对这种生物学活性的活性试验检查情况是否这这样，所述试验是现有技术中已知的或在实际实施例中描述。在此期间，一般用序列比较算法确定肽序列同一性。为此，将二个序列在其整个长度范围内或在先前限定的片段的长度范围内彼此比较，所述的片段构成二个序列之一的至少一半氨基酸。在比较窗口(即二个序列中待比较的区域)内部，确定相同位置处或可比性位置处相同氨基酸的数目。为此，可能需要向序列中引入空位。在本发明背景下，氨基酸序列应当特别优选地用现有技术中已知的算法，尤其用NCBI主页上可获得的以下算法之一进行比对：BLASTp、PSI-BLAST、PHI-BLAST或DELTA-BLAST(还参见Johnson 2008,Nucleic Acids Res 36(网络服务器专刊):W5-9；Boratyn2012,Biol Direct.17(7):12；Ye 2012,BMC Bioinformatics 13:134；Ye 2013,NucleicAcids Res 41:(网络服务器专刊):W34-40；Marchler-Bauer 2009,Nucleic Acids Res 37(数据库专刊):D205-10和Papadopoulos 2007,Bioinformatics 23(9):1073-9)。优选地，应当为此使用指定的标准设置。

此外，根据本发明待使用的酶的变体可以优选地由能够在严格杂交条件下与编码特定肽序列的核酸序列杂交的核酸序列编码。在本发明的意义下，严格杂交条件在Southern 1975,J.Mol.Biol.98(3):503-517中描述。再次不言而喻的是，酶的这类变体应当基本上具有含有特定肽序列的上述酶的生物学活性。

根据本发明的又一个方面，本发明的甲基营养细菌含有重组DNA，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌中异源表达，其中具有酶活性的多肽包括以下酶：

-异源甲羟戊酸途径(MVA途径)酶，即羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶，其中酶含有与根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列分别具有至少60％同一性的肽序列或由能够在严格杂交条件下与编码特定肽序列的相应核酸杂交的核酸序列编码。

-异源萜烯合酶和

根据本发明细菌的有利实施方案，异源甲羟戊酸途径酶，即羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶各自相互独立地具有与根据SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％同一性的肽序列。

根据本发明细菌的优选实施方案，异源甲羟戊酸途径酶是来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶，其分别具有根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列。

根据本发明细菌的又一个方面，编码所述异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA包含以下多核苷酸，所述多核苷酸各自相互独立地具有与根据SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的核苷酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％同一性，或包含这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含在严格杂交条件下与根据SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的核苷酸序列杂交的核酸序列。

在这个方面，一般用序列比较算法确定核酸序列同一性。为此，将二个序列在其整个长度范围内或在先前限定的片段的长度范围内彼此比较，所述的片段构成二个序列之一的至少一半核苷酸。在比较窗口(即二个序列中待比较的区域)内部，确定相同位置处或可比性位置处相同核苷酸的数目。为此，可能需要向序列中引入空位。在本发明背景下，氨基酸序列应当特别优选地用现有技术中已知的算法，尤其用NCBI主页上可获得的以下算法之一实施比对：BLASTn、megablast或不连续blast(参见Johnson 2008,Nucleic AcidsRes.1；36(网络服务器专刊):W5-9)。优选地，应当在这种比对中使用指定的标准设置。

特别地，根据本发明使用的多核苷酸是来自黄色粘球菌的基因hmgs(SEQ IDNo.7)、hmgr(SEQ ID No.8)、mvaK1(SEQ ID No.9)、mvaK2(SEQ ID No.10)、mvaD(SEQ IDNo.11)和fni(SEQ ID No.12)。根据这个实施方案变型，细菌的异源甲羟戊酸途径酶具有根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列。

使用原核MVA基因，尤其来自黄色粘球菌的MVA基因，与优点相关。如来自黄色粘球菌的约70％的可比性GC含量产生非常好的密码子适应指数(密码子适应指数，CAI)，例如对于MVA基因，其在约0.7和约0.9之间。

根据本发明的又一个方面，编码所述异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA安置在一个单一操纵子中。这种能够借助一个单一启动子实现更好的表达共调节。如果需要，其他异源基因也可以整合入这个操纵子。

编码所述异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA也同义地称作MVA基因。

根据有利的进一步拓展，至少一个所述MVA基因的核糖体结合位点(RBS)就细菌中异源表达的翻译起始方面优化。

根据一项有利的实施方案，异源异戊烯基焦磷酸异构酶的RBS基因就翻译起始方面优化。该基因、尤其黄色粘球菌基因fni的这种RBS优化变体具有50至200,000、优选地50至100,000、特别优选地50,000至100,000的TIR(根据Salis 2011的翻译起始速率)。

根据又一项有利的实施方案，异源羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)基因的RBS就翻译起始方面优化。该基因、尤其来自黄色粘球菌的hmgs基因的这种RBS优化变体具有50至100,000、优选地50至50,000、特别优选地1,000至50,000的TIR。

根据本发明的又一个优选实施方案，细菌的重组DNA还编码至少一种异源萜烯合酶，其中萜烯合酶选自倍半萜合酶和二萜合酶。认识到，由所述萜烯合酶形成的倍半萜和二萜是有生物技术价值的产物。

根据一个改良，至少一种异源萜烯合酶是倍半萜合酶。倍半萜合酶优选地是合成环状倍半萜的酶，其中倍半萜是尤其选自α-葎草烯、檀香烯的各种差向异构体如α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯或α-外型-香柠檬烯和红没药烯如β-红没药烯。

倍半萜合酶更优选地是α-葎草烯合酶或檀香烯合酶。这里应当指出，檀香烯合酶尤其具有非常宽的产物谱，并且因此庞大种类的不同檀香烯型倍半萜是可获得的。

倍半萜合酶优选地是植物来源的倍半萜合酶。优选地，倍半萜合酶是来自生物的酶，其中生物选自姜属(Zingiber)和檀香属(Santalum)。也可以使用具有适当适用性的来自其他生物的倍半萜合酶。

根据又一个方面，倍半萜合酶包含与下述多肽具有至少60％同一性的肽序列，所述多肽选自根据SEQ ID No.15的肽序列的多肽、根据SEQ ID No.45的肽序列的多肽和根据SEQ ID No.46的肽序列的多肽。

在本发明的意义下，倍半萜合酶也可以是具有适宜活性的酶，所述酶由包含在严格杂交条件下与编码根据SEQ ID No.:15、45或46的多肽之一的核苷酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸编码。

倍半萜合酶的所述肽序列更优选地与下述多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％的同一性，所述多肽选自根据SEQ ID No.15的肽序列的多肽、根据SEQ ID No.45的肽序列的多肽和根据SEQ ID No.46的肽序列的多肽的多肽。

优选地倍半萜合酶是含有适宜活性的多肽的酶，来自红球姜(Zingiberzerumbet)、檀香(Santalum album)或大花澳洲檀香(Santalum spicatum)。

倍半萜合酶尤其是来自红球姜的α-葎草烯合酶，其含有SEQ ID No.15的肽序列的多肽。根据进一步发展，含有根据SEQ ID No.15的多肽肽序列的α-葎草烯合酶由包含具有根据SEQ ID No.16的核酸序列的多核苷酸的重组DNA编码。所述根据SEQ ID No.16的核酸序列是针对扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AM1中表达作密码子优化的红球姜基因zssI。

根据一个备选实施方案，倍半萜合酶尤其是来自檀香的檀香烯合酶SsaSSy，其含有SEQ ID No.45的多肽肽序列。

根据又一个备选实施方案，倍半萜合酶优选地是来自大花澳洲檀香的檀香烯合酶SspiSSy，其含有SEQ ID No.46的多肽肽序列。

根据替代性改良，至少一种异源萜烯合酶是二萜合酶。二萜合酶优选地是合成二萜的酶，其中二萜选自香紫苏醇、顺-冷杉醇、冷杉二烯(abitadiene)、异海松二烯(isopimaradiene)、泪杉醇和落叶松醇(larixol)。优选地，植物来源的二萜合酶尤其来自鼠尾草属(Salvia)或冷杉属(Abies)。

根据又一个方面，二萜合酶包含这样的肽序列，所述肽序列与具有根据SEQ IDNo.47的肽序列的多肽具有至少40％同一性。

在本发明的意义下，二萜合酶也可以是具有适宜活性的酶，所述酶由包含在严格杂交条件下与编码根据SEQ ID No.47的多肽的核苷酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸编码。

所述二萜合酶的肽序列更优选地与具有根据SEQ ID No.47的肽序列的多肽拥有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％的同一性。

二萜合酶还优选地选自二种共表达的单官能I型和II型二萜合酶SsLPS(香紫苏(Salvia sclarea)LPP合酶和SsSCS香紫苏的香紫苏醇合酶)(Caniard等人,BMC PlantBiol 2012Jul 26；12:119)、双官能I型/II型二萜合酶，来自香脂冷杉(Abies balsamea)的顺-冷杉醇合酶AbCAS(Zerbe等人,J Biol Chem 2012Apr 6；287(15):12121-31)、来自普通烟草的LPP合酶NtCPS2和顺-冷杉醇合酶NtABS(Sallaud等人,Plant J 2012 Oct；72(1):1-17)。

根据一个方面，二萜合酶尤其是来自香脂冷杉的双官能I型/II型二萜合酶顺-冷杉醇合酶AbCAS，其含有根据SEQ ID No.47的多肽肽序列。

特别优选地，顺-冷杉醇合酶是由针对扭脱甲基杆菌(M.extorquens)AM1作密码子优化的多核苷酸编码，尤其特别优选地由具有SEQ ID No.:50的序列的多核苷酸编码。

如上文已经陈述，异戊二烯基二磷酸前体–如FPP或GGPP–形成萜烯合酶的相应底物。因此，本领域技术人员认识到，在选择某些萜烯合酶期间必须选择合适的合酶以提供适宜的异戊二烯基二磷酸前体。

根据又一项有利的实施方案，倍半萜合酶基因的RBS就翻译起始方面优化。该基因的这种RBS优化变体具有至少50,000、尤其50,000至400,000、优选地200,000至300,000、特别优选地210,000至250,000的TIR(翻译起始率)。

根据又一个实施方案，如果需要，除编码至少一种异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA之外，细菌还具有编码至少一种异戊二烯基二磷酸前体合酶的重组DNA。

异戊二烯基二磷酸前体合酶是内源或异源酶。在内源异戊二烯基二磷酸前体合酶情况下，编码它的基因优选地借助合适的启动子过量表达。

根据优选的实施方案，除编码至少一种异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA之外，细菌还含有编码至少一种异源异戊二烯基二磷酸前体合酶的重组DNA。如果需要，在相应的内源酶之外，异源的异戊二烯基二磷酸前体合酶可以是可表达的。

异戊二烯基二磷酸前体合酶是选自法呢基二磷酸合酶(FPP合酶)和香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)的酶。认识到，分别从所述合酶形成异戊二烯基二磷酸前体FPP和GGPP是合成有生物技术价值的倍半萜和二萜的重要前体分子。

根据一个改良，异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源FPP合酶，其中这种酶可以是真核或原核异源FPP合酶。异源FPP合酶可以例如是细菌来源的或衍生自真菌。

异源FPP合酶尤其是来自真菌、优选地来自酵母、如酵母属(Saccharomyces)的酶。

根据又一个方面，FPP合酶包含与根据SEQ ID No.13的肽序列具有至少60％同一性的肽序列。FPP合酶尤其是真核FPP合酶。

在本发明的意义下，FPP合酶也可以是具有适宜活性的酶，所述酶由包含在严格杂交条件下与编码根据SEQ ID No.:13的多肽的核苷酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸编码。

根据又一个实施方案，FPP合酶的所述肽序列优选地与SEQ ID No.13拥有至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％的同一性。

根据本发明细菌的又一个方面，编码FPP合酶的重组DNA包含这样的多核苷酸，所述多核苷酸与根据SEQ ID No.14的核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％的同一性。

FPP合酶优选地是来自酿酒酵母的FPP合酶。也可以使用具有适当适用性的来自其他生物的FPP合酶。FPP合酶尤其是来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20，其含有根据SEQ IDNo.13的多肽。

根据一个实施方案，具有根据SEQ ID No.13的多肽的酿酒酵母FPP合酶ERG20尤其由具有根据SEQ ID No.14的序列的多核苷酸编码。

根据又一个改良，异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)。异源GGPP合酶尤其是来自细菌、植物或真菌的适宜酶。优选地，GGPP合酶是来自生物的酶，其中生物优选地选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌、红豆杉属(Taxus)植物和酵母属(Saccharomyces)真菌。来自肠杆菌科细菌的合适GGPP合酶可以例如是来自泛菌属(Pantoea)细菌的适宜酶。

根据又一个方面，GGPP合酶包含与下述多肽具有至少60％同一性的肽序列，所述多肽选自根据SEQ ID No.43的肽序列的多肽、根据SEQ ID No.44的肽序列的多肽和根据SEQ ID No.42的肽序列的多肽。

在本发明的意义下，GGPP合酶也可以是具有适宜活性的酶，所述酶由包含在严格杂交条件下与编码根据SEQ ID No.:43、44或42的多肽之一的核苷酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸编码。

GGPP合酶的所述肽序列更优选地与下述多肽拥有至少65％、至少70％、至少75％、任选地至少80％、尤其至少85％、更具体地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％和特别优选地至少99％的同一性，所述多肽选自根据SEQ ID No.43的肽序列的多肽、根据SEQ ID No.44的肽序列的多肽和根据SEQ ID No.42的肽序列的多肽的多肽。

GGPP合酶优选地是来自成团泛菌(Pantoea agglomerans)或菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)或酿酒酵母的具有适宜活性的多肽的酶。

根据又一个方面，GGPP合酶是选自以下的酶：具有根据SEQ ID No.43的肽序列的成团泛菌GGPP合酶crtE、具有根据SEQ ID No.44的肽序列的加拿大红豆杉GGPP合酶和具有根据SEQ ID No.42的肽序列的酿酒酵母GGPP合酶BTS1。也可以使用具有适当适用性的来自其他生物的GGPP合酶。

根据有利的进一步发展，重组DNA即异源异戊二烯基二磷酸前体合酶(如FPP或GGPP合酶)基因的RBS就翻译起始方面优化。该基因的这种RBS优化变体具有500至100,000、优选地10,000至50,000、特别优选地20,000至40,000的TIR(翻译起始速率)。

根据本发明的有利实施方案，改造编码异源萜烯合酶和异源异戊二烯基二磷酸前体合酶的基因的RBS到这样的程度，从而异源萜烯合酶的TIR值高于异源异戊二烯基二磷酸前体合酶的TIR值。因此可以避免有时具有毒性作用的异戊二烯基二磷酸前体堆积。

如果需要，重组DNA针对本发明细菌中的表达作密码子优化。例如，编码异源萜烯合酶的基因针对本发明细菌作密码子优化。以这种方式，可以改善甲基营养细菌中的表达。

根据细菌的又一个实施方案，重组DNA编码FPP合酶-来自酿酒酵母的ERG20FPP合酶，并且重组DNA编码倍半萜合酶-来自红球姜的α-葎草烯合酶。

根据一个实施方案，优选地进一步开发细菌至下述效果：异源表达所述酶的重组DNA配有常见启动子或几种相互独立可诱导的启动子。这可以对相应基因差异地设置。这里，诱导型启动子可以在性质上不同，从而可相互独立地调节它们。优选地，表达本文所提到的酶的全部基因配有相同的常见诱导型启动子。

诱导型启动子系统原则上是本领域技术人员已知的。优选地，本文使用非常“紧密”的启动子系统。以这种方式，重组基因的表达可以在培养时在所需的时间点人为地开启。特别地，为了调节MVA途径基因的表达，一个特别“紧密的”启动子系统是有优势的，原因在于否则可能出现影响生长的效果。特别优选的是cumate诱导型系统。

根据细菌的有利实施方案，重组DNA在每种情况下可在质粒上表达或可染色体表达。这也可以对相应基因差异地设置。用于稳定整合入基因组的合适染色体位点和技术是本领域技术人员已知的。出于定位于质粒表达的目的，将具有重组DNA的合适质粒通过转化引入细菌。因此优选地通过用一种或多种携带相关重组DNA的质粒转化，获得本发明的细菌。

根据一个优选的实施方案，本发明细菌含有通过转化引入的至少一种质粒，其中至少一种质粒包含以下重组DNA：

-编码如上文提到的至少一种异源甲羟戊酸途径酶的重组DNA，其中甲羟戊酸途径酶选自羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶；

-任选地编码如上文提到的至少一种异源异戊二烯基二磷酸前体合酶的重组DNA；和

-编码如上文提到的至少一种异源萜烯合酶的重组DNA。

在本发明的意义下，甲基营养细菌尤其是变形杆菌。优选的甲基营养变形杆菌选自甲基杆属(Methylobacterium)和甲基单胞菌属(Methylomonas)。更优选地，甲基营养变形杆菌是甲基杆菌属(Methylobacterium)的菌株、尤其是扭脱甲基杆菌的菌株。特别优选菌株扭脱甲基杆菌AM1或菌株扭脱甲基杆菌PA1。

另外，优选缺少类胡萝卜素生物合成活性、优选地在基因crtNb(diapolycopene氧化酶)中具有缺陷的甲基营养细菌菌株、尤其甲基杆菌属和甲基单胞菌属菌株、优选地扭脱甲基杆菌AM1或PA1(Van Dien等人,2003,Appl Environ Microbiol 69,7563-6)。这种菌株没有类胡萝卜素生物合成活性，尤其缺少diapolycopene氧化酶活性。因而可能进一步改善萜烯合成速率。

本发明的又一个方面涉及一种用于从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜的方法，所述方法包括以下步骤：

-制备含甲醇和/或乙醇的水介质，

-在生物反应器的所述培养基中培养如上文提出的一个实施方案中所述的甲基营养细菌，其中甲醇和/或乙醇由细菌转化成萜烯，

-分离生物反应器中形成的倍半萜或二萜。

使用的水介质可以含有甲醇、乙醇或甲醇和乙醇的混合物。如果需要，可以向其添加其他底物。可以有利的是，甲醇或乙醇完全含于水介质中，即从甲醇或从乙醇进行从头微生物合成倍半萜或二萜。

甲醇的使用带来许多优点：甲醇可以按石油化学方式生产并且还从可再生原料或未来甚至从CO₂生产。不存在季节性因素(天气和年份时间)和地区因素，这令长期生产规划成为可能。除此之外，以下是可能的：与糖相反，甲醇的价格未来将下降，原因在于许多生产厂已规划或在建。甲醇是相对于否则常用的糖底物而言备选的碳源。

在甲醇中，碳具有与碳水化合物/糖相比较低的氧化水平，乙醇中也是如此。因此，在甲醇氧化成CO₂时，可以比糖完全氧化成CO₂的情况下释放更多电子。为了合成强烈还原的化合物如萜类，因此尽可能使用具有低氧化水平的碳源是有利的。甲醇和乙醇比来自糖的碳更好地满足这些先决条件。因此，甲醇/乙醇的使用比从糖开始更有利于产生萜类。

乙醇的使用带来许多优点：乙醇可作为“天然”底物获得，例如从生物质量发酵获得，即生物乙醇。

另外，使用生物乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜尤其能够实现形成的倍半萜和二萜产物为“天然香味物质”的有利的宣称。乙醇是否则常用的糖底物的备选碳源。

本发明细菌按要求依赖甲醇并且还依赖乙醇生长，在每种情况下甲醇和乙醇均作为唯一碳源。在该方法的进一步发展中，所述培养基中含有甲醇和/或乙醇作为培养所述细菌的唯一碳源。因而，尤其理解的是，没有将其他碳源人为地添加至培养基或以大比例含有。显而易见，痕量的其他碳源并非总可避免，并且可以含有这些碳源而不脱离本发明方法的所述进一步发展的范围。

根据方法的有利实施方案，进行甲醇和/或乙醇的有限补料分批发酵。

在方法的优选实施意义下，从生物反应器原位取出倍半萜或二萜，即尤其原位取出发酵器中的产物(ISPR)。除实际产品合成之外，工业生物技术的一个重要方面还是其生产。原位取出产物(ISPR)减少产物对微生物的毒性作用并且还降低方法的成本。本文中尤其通过反萃取萜烯实现ISPR。在这个过程中，萜烯优选地转移入排出气流并且随后溶解于有机溶剂中。这是特别有利，与采用糖生长的常规微生物之相反，因为还原型底物甲醇或乙醇，所以将所述甲基营养细菌在明显更高的通气速率培养，并且与此同时，因而明显有利于反萃取挥发性发酵产物、尤其所形成的倍半萜或二萜。

在方法的又一个发展中，培养在水-有机双相体系中进行，其中有机相尤其由脂族烃化合物、尤其链烷、优选地十二烷或癸烷构成。形成的萜类在所述有机相中具有良好溶解度。

根据方法的有利实施方案，培养在基本上恒定的pH进行。特别地，在>30％的溶解氧水平和/或约1g/L的甲醇或乙醇浓度进行该方法。

在方法的又一个发展中，达到超过0.75、0.8、0.9g/l、优选地超过1.0g/l、更优选地超过1.5g/l的萜烯浓度，所述浓度分别基于水相的体积。

本发明的又一个方面涉及含有甲醇或乙醇的培养基培养如上文描述的一个实施方案中所述的重组甲基营养细菌的用途，用于从甲醇和/或乙醇从头微生物合成萜类。甲醇或乙醇极限培养基的使用降低污染风险，原因是甲醇和乙醇对许多微生物有毒或抑制其生长，并且还在产品生产期间降低成本，原因是不必从实际产品移除复杂组分。

众多事实显示与糖相比，使用甲醇和/或乙醇的优点：i)糖并不仅是葡萄糖，照例需要将其纯化，以保障产率，其中评价的纯化过程与成本相关，ii)未来数年预期糖价上升，而甲醇和乙醇价格可能将降低，原因是产能明显增长，iii)与基于糖的发酵相比，甲醇和乙醇明显降低污染风险，这减少灭菌成本，并且iv)与含有葡萄糖或其他糖源(如玉米浆或木质纤维素)作为碳源的培养基相反，甲醇或乙醇极限培养基不含复杂的化学化合物，这简化纯化方法。

合适的发酵培养基可以例如具有以下组成：水、甲醇或乙醇和选自PIPES、NaH₂PO₄、K₂HPO₄、MgCl₂、(NH₄)₂SO₄、CaCl₂、柠檬酸钠、ZnSO₄、MnCl₂、FeSO₄、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、CuSO₄和CoCl₂的其他组分。

可以通过阻碍所用的变形杆菌中类胡萝卜素合成，实现所形成萜烯的进一步增加。为此目的，有利地使用缺少类胡萝卜素生物合成活性、尤其缺少diapolycopene氧化酶活性的所述甲基杆菌属或甲基单胞菌属菌株。因此可以实现超过1.5g/l、尤其约1.65g/l的萜烯最大浓度(各自基于水相的体积)。

已经提到的缺少类胡萝卜素生物合成活性、尤其缺少diapolycopene氧化酶活性的本发明扭脱甲基杆菌AM1突变体显示萜烯产量增加。特别地，超过1.5g/l、尤其约1.65g/l的α-葎草烯最大浓度由缺少类胡萝卜素生物合成活性的扭脱甲基杆菌AM1突变体形成。

这里值得注意的是，已经根据本发明在例如不必要外部添加昂贵乙酰乙酸锂或DL-甲羟戊酸的情况下达到上述萜类浓度。另外，对此而言，尤其并不绝对必需其他用于菌株优化的昂贵措施。甲基营养细菌的可观潜力和用于生物技术产生萜类的所述方法已经随此而来。另外，有利的是已经使用廉价甲醇或乙醇极限培养基达到上述浓度。与现有技术相反，不需要基于TB或LB的发酵培养基。又一个优点源自所获得萜烯产物的纯化过程简化，原因是可以使用明确限定的极限培养基。可以最大限度减少昂贵的副产物移除过程。此外，本文描述的菌株开创了甲醇或乙醇作为唯一碳源用于生长的用途。

本发明的又一个方面涉及如上文描述的一个实施方案中所述的甲基营养细菌的用途，用于从甲醇和/或乙醇从头微生物合成萜类。

根据本发明方法形成的萜类选自倍半萜(C15)和二萜(C20)。

在本发明方法的意义下，萜类在一方面是倍半萜。有生物技术意义的倍半萜因此例如包括选自以下的倍半萜：α-葎草烯、檀香烯的各种差向异构体如α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-外型-香柠檬烯。红没药烯如β-红没药烯也是通过本发明方法可获得的倍半萜。合适的倍半萜合酶原则上是本领域技术人员已知的。上述甲基营养细菌因此可以任选地配备编码合适倍半萜合酶的适宜重组基因。特别地，这种甲基营养细菌以及MVA途径的异源表达基因还含有上述意义下的FPP合酶。

在本发明方法的意义下，萜类在另一方面是二萜。有生物技术意义的二萜因此例如包括选自以下的二萜：香紫苏醇、顺-冷杉醇、冷杉二烯、异海松二烯、泪杉醇和落叶松醇。合适的二萜合酶原则上是本领域技术人员已知的。上述甲基营养细菌因此可以任选地配备编码合适二萜合酶的适宜重组基因。特别地，这种甲基营养细菌以及异源表达的MVA途径基因还含有上述意义下的GGPP合酶。

根据本发明方法的一个特别优选的实施方案，下式I的倍半萜α-葎草烯

由甲醇和/或乙醇从头合成。

根据本发明方法的其他优选实施方案，选自以下的檀香烯型倍半萜：式II的α-檀香烯、式III的β-檀香烯、式IV的表-β-檀香烯和式V的α-外型-香柠檬烯

从甲醇和/或乙醇从头合成。这里应当指出，檀香烯合酶拥有非常宽的产物谱，并且因此庞大种类的不同檀香烯型倍半萜是可获得的。

根据本发明方法的其他优选的实施方案，二萜类式VI的香紫苏醇和式VII的顺-冷杉醇

从甲醇和/或乙醇从头合成。

在本发明的意义下，生物反应器可以是培养细菌的任何合适容器。在最简单的情况下，这理解为意指摇瓶。特别地，将其理解为意指发酵器。生物反应器可以适合连续操作、不连续操作、补料分批操作或批量生产。

本发明的又一个方面涉及通过根据所提出实施方案之一的方法可获得的所述倍半萜(C15)和二萜(C20)。

下文描述本发明细菌、方法和用途的其他实施方案：

1.含有重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌表达，特征在于所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-异源萜烯合酶和

-任选地异戊二烯基二磷酸前体合酶。

2.如实施方案1中所述的细菌，特征在于至少一种异源甲羟戊酸途径酶含有与根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列分别具有至少60％同一性的肽序列。

3.如实施方案1或2中所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶选自倍半萜合酶和二萜合酶。

4.如实施方案3中所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶是倍半萜合酶，其中倍半萜合酶是合成环状倍半萜的酶，并且倍半萜尤其选自a-葎草烯和檀香烯的差向异构体，如α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯或α-外型-香柠檬烯，和红没药烯如b-红没药烯。

5.如实施方案3中所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶是二萜合酶，尤其合成二萜的酶，二萜尤其选自香紫苏醇、顺-冷杉醇、冷杉二烯、异海松二烯、泪杉醇和落叶松醇。

6.如实施方案1至5之一中所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是选自法呢基二磷酸合酶(FPP合酶)和香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)的酶。

7.如实施方案1至6之一中所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源FPP合酶，其中异源FPP合酶是真核或原核FPP合酶。

8.如实施方案1至6之一中所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源GGPP合酶，其中异源GGPP合酶是来自从细菌、植物和真菌选出的生物的酶。

9.如实施方案1至8之一中所述的细菌，特征在于异源表达所述酶的重组DNA配有常见的诱导型启动子或几种相互独立可诱导的启动子。

10.如实施方案1至9之一中所述的细菌，特征在于重组DNA在每种情况下相互独立地在质粒上可表达或可染色体表达。

11.如1至10中一个实施方案所述的细菌，特征在于细菌是甲基营养变形杆菌，尤其甲基杆菌属或甲基单胞菌属的细菌，优选地细菌扭脱甲基杆菌。

12.如实施方案1至11之一中所述的细菌，特征在于细菌是缺少类胡萝卜素生物合成活性、尤其缺少diapolycopene氧化酶活性的菌株。

13.一种从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜的方法，包括以下步骤：

-制备含甲醇和/或乙醇的水介质，

-在生物反应器的所述培养基中培养如实施方案1至12之一中所述的甲基营养细菌，因而甲醇和/或乙醇由细菌转化成萜烯，

-分离生物反应器中形成的倍半萜或二萜。

14.如实施方案13中所述的方法，特征在于，所述培养基中含有甲醇和/或乙醇作为培养所述细菌的唯一碳源。

15.如实施方案13或14中所述的方法，特征在于进行甲醇和/或乙醇的有限补料分批发酵。

16.如实施方案13至15之一中所述的方法，特征在于，培养在水-有机双相体系中进行，其中有机相尤其由脂族烃化合物、优选地十二烷或癸烷构成。

17.如实施方案13至16之一中所述的方法，特征在于实现从生物反应器原位取出倍半萜或二萜，即原位取出产物(ISPR)。

18.如实施方案13至17之一中所述的方法，特征在于，在基本上恒定的pH、>30％的溶解氧水平和/或约1g/L的甲醇或乙醇浓度进行培养。

19.如实施方案13至18之一中所述的方法，特征在于，达到超过1g/l、优选地超过1.5g/l的萜烯浓度，所述浓度分别基于水相的体积。

20.含有甲醇和/或乙醇的培养基培养如实施方案1至12之一中所述的重组甲基营养细菌的用途，用于由甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜。

21.如实施方案1至12之一中所述的甲基营养细菌的用途，用于由甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜。

本发明不限于上文描述的实施方案之一，而以庞大种类方式可修改。本领域技术人员认识到，可以容易地改造本发明的实施方案、尤其描述的细菌菌株和发酵条件，而不脱离本发明的范围。因此可构思简单的改造用于从甲醇或乙醇产生任何倍半萜。本发明能够实现从碳源甲醇或乙醇生物产生萜类，不与食物竞争。本发明的其他特征、细节和优点从权利要求的措辞和以下基于附图的实际实施例描述得出。

专利申请中援引的全部文献参考的内容因而通过参考相应的具体公开内容并完整纳入。

附图

图1显示扭脱甲基杆菌AM1的中心代谢的示意性概述，包括通过脱氧木酮糖-5-磷酸途径(DXP)合成内源萜烯、异源整合的甲羟戊酸途径(由二个框指示)、异源α-葎草烯合酶zssI和异源FPP合酶ERG20。扭脱甲基杆菌没有IPP异构酶(fni)。异源整合的MVA基因涉及羟甲基戊二酰-CoA合酶(hmgs)、羟甲基戊二酰-CoA还原酶(hmgr)、甲羟戊酸激酶(mvaK)、磷酸甲羟戊酸激酶(mvaK2)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvaD)和异戊烯基焦磷酸异构酶(fni)。其他基因：dxs：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，dxr：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶，hrd：HMB-PP还原酶，ispA：内源FPP合酶；分子缩略语：2PG：2-磷酸甘油酸，3PG：3-磷酸甘油酸，1,3-DPG：1,3-双磷酸甘油酸，GA3P：3-磷酸甘油醛，PEP：烯醇丙酮酸，HMG-CoA：羟甲基戊二酰-CoA，DXP：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，MEP：2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸酯，HMB-PP：(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸，IPP：异戊二烯基焦磷酸，GPP：香叶基焦磷酸，FPP：法呢基焦磷酸。

图2显示α-葎草烯标准品(上半小图，黑线)和来自含有pFS33的扭脱甲基杆菌的样品(pCM80-zssI，上半小图，浅灰色线)的色谱比较结果。内标物球姜酮在11.5分钟后洗脱。通过比较色谱图下所示的质谱，鉴定pFS33样品中的α-葎草烯。

图3显示扭脱甲基杆菌AM1对α-葎草烯的耐受性，所述α-葎草烯直接溶解于水相中或溶解于作为第二有机相的十二烷相中。在无α-葎草烯的相应培养基中的最大生长速率(μ_max)与不同α-葎草烯浓度时的生长速率(μ)比较。可以见到，α-葎草烯仅对扭脱甲基杆菌具有最小生长抑制作用，甚至在浓度1g/l也是如此。十二烷相中的α-葎草烯比水相中具有略微较少的影响，原因是其更少接触细胞。

图4显示携带质粒pFS33(pCM80-zssI)、pFS34(pCM80-zssI-ERG20)、pFS45(pHC115-zssI)、pFS46(pHC115-zssI-ERG20)、pFS49(pQ2148F-zssI)和pFS50(pQ2148F-zssI-ERG20)的扭脱甲基杆菌AM1的α-葎草烯产生。黑色柱部分显示无诱导情况下的产生，而灰色柱部分代表有诱导情况下的产生。pCM80携带组成型启动子。分别在培养(pFS33、34)后和诱导(pFS45、46、49、50)后48小时比较浓度。

图5显示携带质粒的扭脱甲基杆菌的α-葎草烯产生，所述质粒具有处于各种组合的针对α-葎草烯合酶(zssI)、FPP合酶(ERG20)和IPP异构酶(fni)优化的核糖体结合位点(RBS)。在y-轴上括号中描述基因的翻译起始速率。浓度是来自三(3)个转化体的产物平均浓度，其中将每个转化体在二份独立的培养物中培育。黑色柱：仅含有zssI的质粒(pFS49、pFS57)；阴影柱：含有zssI和ERG20的质粒(pFS50、pFS58、pFS60a、pFS60b)；灰色柱：含有zssI、ERG20和六个甲羟戊酸途径基因的质粒(pFS61b、pFS62a、pFS62b)。

图6A：来自大肠杆菌的未皂化的类胡萝卜素提取物的色谱图(n＝502nm)，所述大肠杆菌借助pACCRT-MN(A1)表达来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)和来自扭脱甲基杆菌类胡萝卜素生物合成缺陷菌株CM502(A2)的diapophytoene合酶和diapophytoene去饱和酶。以箭头指示番茄红素的理论保留时间。B：诱导后48小时摇瓶中携带质粒pFS62b(pQ2148F-zssI^225k-ERG20^22k-fni^65k-MVA)的扭脱甲基杆菌AM1和CM502的α-葎草烯产生(n＝3)。

图7：发酵5中的细胞干重和从携带pFS62b的菌株CM502形成的α-葎草烯浓度(根据表3)。时间点0给出了用cumate诱导的时间点，由点垂线代表。从相同样品通过三倍分析确定α-葎草烯浓度的标准偏差。黑色方块：α-葎草烯浓度；灰色圆形：细胞干重。

图8显示顺-冷杉醇标准品(上半小图，标记的线)和来自含有ppjo16的扭脱甲基杆菌的样品(pQ2148F-AbCAS-ERG20F96C-MVA，上半小图，标记的线)的色谱比较结果。内标物球姜酮在11.3分钟后洗脱。通过比较色谱图下方所示的质谱，鉴定16s6样品中的顺-冷杉醇。

图9显示檀香木油(上半小图(a)，暗灰色线)和来自含有ppjo03的扭脱甲基杆菌的样品(pQ2148F-SanSyn-ERG20-MVA，上半小图(a)，黑线)的色谱比较结果。通过比较色谱图下所示的质谱(b、c)，鉴定ppjo03样品中的α-檀香烯。

实施例

以下实施例起到说明本发明的作用。它们不得解读为就保护范围而言限制。

实施例1：重组产生α-葎草烯

1.材料和方法

1.1化学品、培养基和细菌菌株

将扭脱甲基杆菌AM1(Peel和Quayle,1961.Biochem J.81,465-9)在30℃在极限培养基中培养，其中对于摇瓶中培养，使用根据Kiefer等人,2009(PLoS ONE.4,e7831)的培养基。发酵培养基含有终浓度的30mM PIPES、1.45mM NaH₂PO₄、1.88mM K₂HPO₄、1.5mM MgCl₂、11.36mM(NH₄)₂SO₄、20μM CaCl₂、45.6μM柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇*2H₂O)、8.7μM ZnSO₄*7H₂O、15.2μM MnCl₂*4H₂O、36μM FeSO₄*7H₂O、1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄*4H₂O、0.3μM CuSO₄*5H₂O和12.6μM CoCl₂*6H₂O。

将大肠杆菌菌株DH5(Gibco-BRL，罗克韦尔，美国)在37℃在溶源性肉汤(LB)培养基(Bertani,1951.J.Bacteriol.62,293-300)中培养。对于大肠杆菌和扭脱甲基杆菌，按浓度10μg/ml使用盐酸四环素。使用Cumate(4-异丙基苯甲酸)作为诱导物，从溶解于乙醇(摇瓶中培养)或甲醇(生物反应器中培养)中的100mM母液稀释的终浓度为100μM。

Cumate、盐酸四环素、α-葎草烯、球姜酮和(RS)-甲羟戊酸锂盐购自Sigma-Aldrich(Steinheim,DE)。十二烷购自VWR(达姆施塔特,DE)。

1.2遗传操作和质粒构建

根据本领域技术人员已知的程序开展标准克隆技术。如Toyama等人(Toyama等人,1998,FEMS Microbiol.Lett.166,1-7)中所述，将质粒转化入扭脱甲基杆菌AM1或CM502。

借助核糖体结合位点计算器设计核糖体结合位点(RBS)(Salis,2011,Methods inEnzymology,V.Christopher编著,19-42.Academic Press)。用CAI计算器确定密码子适应指数(CAI)(Puigbo等人,2008,BMC Bioinformatics.9,65)。

1.3克隆来自黄色粘球菌的甲羟戊酸途径(MVA)基因

来自黄色粘球菌DSM16525的基因组DNA购自DSMZ(布伦瑞克，DE)。通过重叠延长PCR移除编码HMG-CoA合酶的hmgs的EcoRI限制性位点，同时插入一个沉默突变(gaattc至gagttc)。为此，借助引物HMGS-fw和HMGS-over-rev扩增该基因的第一部分，同时HMGS-over-fw和HMGS-rev用于第二部分。将所得到的PCR产物作为“mega”引物连同HMGS-fw和HMGS-rev一起用于最终扩增无EcoRI限制性位点的hmgs(SEQ ID No.7)。

从质粒pUC18-mva-op切出来自黄色粘球菌的甲羟戊酸途径操纵子，其含有分别编码HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的基因hmgr(SEQ ID No.8)、mvaK1(SEQ ID No.9)、mvaK2(SEQ ID No.10)、mvaD(SEQ ID No.11)和fni(SEQ ID No.12)(Mi等人,2014,Microbial cellfactories.13,170)。

1.4克隆含有α-葎草烯合酶的质粒

修饰质粒pQ2148(Kaczmarczyk等人,2013,Appl.Environ.Microbiol.79,6795-802)的多克隆位点以增加克隆灵活性。为此，通过加热含有10μM每种引物的100μl复性缓冲液(10mM TRIS pH 7.5、50mM NaCl、1mM EDTA)15分钟，随后缓慢冷却至室温维持三小时，使引物pQF-MCS-fw和pQF-MCS-rev复性。将复性的引物连接入已经用SpeI和XhoI切割的pQ2148，产生质粒pQ2148F。

最初源自红球姜的α-葎草烯合酶基因zssI(Yu等人,2008,Planta.227,1291-9)(登录号AB263736.1)针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化，获得根据SEQ ID No.16的DNA序列。使用引物ZSSI-fw和ZSSI-rev，扩增根据SEQ ID No.16的密码子优化基因以插入pCM80(Marx和Lidstrom,2001,Microbiology.147,2065-2075)和pHC115(Chou和Marx,2012,Cellreports.1,133-40)。使用引物ZSSI-RBS-fw和ZSSI-rev，扩增针对pQ2148F的RBS优化变体(翻译起始速率(TIR)为221,625)。TIR为221,625的zssI的RBS优化变体含有核酸序列AGCTTAAGGATAAAGAAGGAGGTAAAAC(SEQ ID No.41)。用引物ERG20-fw和ERG20-rev从基因组DNA扩增来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20基因。用组合ERG20-rev-2的引物ERG20-RBS35k-fw或ERG20-RBS20k-fw扩增的RBS优化变体，产生二种ERG20PCR产物，各自具有TIR为36,800或22,000的RBS。TIR为22,000的ERG20的RBS优化变体含有核酸序列ACATCAAACCAAAGGACTTTACAGGTAGTAGAA(SEQ ID No.39)。TIR为36,800的ERG20的RBS优化变体含有核酸序列GAGAAGAGCAGACTCGATCATAACAGGGGACTAG(SEQ ID No.40)。

将zssI PCR产物用SphI和XbaI消化并插入相同方式消化的质粒pCM80，产生质粒pFS33。随后将ClaI和SnaB1消化的来自ERG20的PCR产物克隆入pFS33的相同限制性位点，产生pFS34。利用限制性切割位点XbaI和BamH1，将不含EcoRI限制性位点的hmgs基因(参见上文)插入ERG20之后。将黄色粘球菌甲羟戊酸操纵子用BamH1和EcoRI从pUC18-mva-op切出并再插入相同方式消化的pFS34-hmgs，产生pFS44。

通过以下方式构建质粒pFS45(pHC115-zssI)、pFS46(pHC115-zssI-ERG20)和pFS47(pHC115-zssI-ERG20-hmgs-MVAop)：用AflII和EcoRI从pFS33切出zssI、从pFS34切出zssI-ERG20并从pFS44切出zssI-ERG20-hmgs-MVAop，随后将它们插入相同方式消化的pHC115中。

通过以下方式构建质粒pFS49(pQ2148F-zssI)和pFS50(pQ2148F-zssI-ERG20)：用AflII和XbaI从pFS33和pFS34分别切出zssI和zssI-ERG20，随后将它们插入相同方式消化的pQ2148F中。将Hmgs和MVAop通过XbaI和EcoRI从pFS44切出并随后插入pFS50的相同限制性位点，产生pFS52(pQ2148F-zssI-ERG20-hmgs-MVAop)。

将具有优化RBS的α-葎草烯合酶基因zssI的PCR产物用SpeI和XbaI消化并连接入相同方式消化的pQ2148F，产生pFS57。将具有优化RBS的ERG20的PCR产物用ClaI和XbaI克隆在来自pFS57的zssI之后，产生pFS58(pQ2148F-zssI^RBSopt-ERG20)。将Hmgs-MVAop如对pFS52所述那样插入pFS58，产生pFS59。将ERG20的RBS变体(TIR＝35,000和20,000)用ClaI和XbaI消化并插入相应切割的pFS57，分别产生pFS60a(zssI^RBSopt-ERG20^35k)和pFS60b(zssI^RBSopt-ERG20^20k)。hmgs-MVAop向pFS60a和pFS60b的插入分别产生质粒pFS61a(zssI^RBSopt-ERG20^35k-hmgs-MVAop)和pFS61b(zssI^RBSopt-ERG20^35k-hmgs-MVAop)。通过将最初复性的引物fni-RBSopt-fw和fni-RBSopt-rev(复性方法参见上文)插入限制性位点HpaI和BamH1，将IPP异构酶基因fni的RBS针对pFS61a和pFS61b优化。所得到的质粒pFS62a和pFS62b相对于fniRBS具有65,000的TIR。本文中，基因fni的优化RBS具有核苷酸序列gttctaggaggaataata(SEQ ID No.48)。在质粒pFS61a和pFS61b中并且另外在pFS62a和pFS62b中，基因hmgs的优化RBS具有TIR为189的核苷酸序列SEQ ID No.90。表1中显示所用引物、质粒和菌株的概述。

表1：所用引物、质粒和菌株。加下划线和斜体的序列(全部5’-->3’)表示限制性酶的识别位点。粗体字母显示核糖体结合位点(RBS)的序列。au：根据Salis Lab RBS计算器的翻译起始速率(TIR)；op：操纵子；MVA：甲羟戊酸途径。

1.5在水-有机双相摇瓶培养物中产生α-葎草烯

在含有盐酸四环素的甲醇极限培养基中培养含有α-葎草烯生产质粒的扭脱甲基杆菌AM1或CM502(参见上文)。将预培养物从琼脂平板接种到具有5ml培养基的试管中并且在30℃和180转/分钟振摇48-72小时。将100ml带挡板的摇瓶中具有12ml培养基的主培养物用预培养物接种至OD₆₀₀ 0.1。在30℃和120转/分钟培养16小时后，主培养物达到早期指数生长期(OD₆₀₀ 0.3-0.6)。接下来，添加cumate供诱导并添加3ml十二烷作为有机相。在48小时温育后，将15ml的总培养物体积滗析并在3220g离心10分钟。1ml十二烷上层用于分析α-葎草烯。将细胞沉淀物重悬于1ml dH₂O中以分析胞内α-葎草烯。

1.6扭脱甲基杆菌AM1的十二烷和α-葎草烯耐受性

将扭脱甲基杆菌AM1预培养物在具有5ml甲醇极限培养基(MM)的试管中培养48小时。通过含有15ml MM的培养物和含有12ml MM和3ml十二烷的培养物的生长比较(OD₆₀₀)，研究扭脱甲基杆菌AM1对20％(v/v)十二烷的耐受性。从一份预培养物接种含有和不含十二烷的用于生长比较的培养物。

以两种方式测试α-葎草烯耐受性：对直接添加至水相的α-葎草烯的耐受性和对溶解于有机十二烷层中的α-葎草烯的耐受性。对于第一实验，向100ml带挡板的含有15ml MM的摇瓶添加溶解于乙醇中的纯α-葎草烯，α-葎草烯终浓度为1000、500、250、100、50、25、10和5mg/L。向MM添加相应量的乙醇作为阴性对照。将具有不同浓度α-葎草烯和相应阴性对照的烧瓶用不含α-葎草烯的预培养物接种至OD₆₀₀ 0.1。历经30小时记录OD₆₀₀。

对于所述第二实验，配制溶解于十二烷中的纯α-葎草烯和具有1000、500、100、50和10mg/Lα-葎草烯的溶液。从不含十二烷的扭脱甲基杆菌AM1预培养物，接种对于每个α-葎草烯浓度各自具有12ml MM和3ml十二烷的两种培养物至OD₆₀₀ 0.1。使用含有十二烷、不含α-葎草烯的培养物作为阴性对照。历经30小时测量OD₆₀₀。

1.7α-葎草烯分析

用NaSO₄干燥1ml十二烷样品。作为内标物，向225μl十二烷样品添加25μl 1mM溶解于十二烷中的球姜酮。

如下提取胞内α-葎草烯：将重悬的细胞沉淀物与大约300mg 0.2mm玻璃球一起置于4ml GC容器中。将细胞强烈涡旋混合3x 30秒，期间进行冰冷却。将裂解的细胞用1ml己烷提取三次，随后借助氮气流缩减体积至1ml。作为内标物，向225μl样品添加25μl 1mM溶解于己烷中的球姜酮。

通过配备Equity 5柱(Supelco，30m x 0.25mm x 0.25μM)的GC-MS(GC17A连同Q5050质谱仪,Shimadzu,Kyoto,日本)分析和定量α-葎草烯。如下进行两次测量：载气：氦气；在250℃分流进样(8:1)；流量：2.2ml/分钟；界面温度：250℃；程序：80℃保持3分钟，16℃/分钟至240℃，保持2分钟。α-葎草烯的保留时间是9.3分钟，并且球姜酮的保留时间是11.5分钟。通过将质谱的三个主要裂解行为与可商业获得的α-葎草烯标准品(相对强度在括号中)：93(15.5),41(11.4),80(6.7)比较，鉴定样品中的α-葎草烯。为了定量，使用α-葎草烯浓度为4500、2250、900、675、450、225、90、67.5、22.5、9和4.5μM各自伴以100μM球姜酮的校准曲线。

1.8类胡萝卜素提取和分析

为了提取类胡萝卜素，将扭脱甲基杆菌AM1或大肠杆菌的细胞通过离心沉淀，用ddH₂O洗涤并在黑暗下冻干。

对于未皂化的提取物，添加2ml甲醇至50mg分解的冻干细胞，随后在65℃温育30分钟。在离心后(10分钟，4000g，4℃)，将上清液用氮气干燥并重悬于0.5ml石油醚(40-60℃):二乙醚:丙酮:甲醇(40:10:15:5)混合物中。通过离心(5分钟，16,000g，4℃)移除沉淀的蛋白质并且用氮气干燥后，将上清液溶解于100μl四氢呋喃(THF)中供HPLC分析。对于皂化的提取物，用10％KOH溶液(溶解于甲醇中)移除蛋白质后，将上清液在室温温育2小时。随后将上层有机相用氮气干燥并溶解于100μl THF中供HPLC分析。

用Shimadzu SCL10系统(SPD10A UV/VIS检测器，SPD-M10A二极管阵列探测器，SIL10A自动进样器，CTO-10AC柱温箱；分别来自Shimadzu,Kyoto,日本)进行HPLC分析。在反相C18柱(250mm x 4.5mm x 5μ；Alltech,Deerfield,美国)上使用梯度程序乙腈:甲醇:2-丙醇(85:10:5)作为溶剂A和100％2-丙醇作为溶剂(Solv.)B，分离类胡萝卜素类。在32℃按流量1ml/分钟，运行以下洗脱程序：100％Solv.A，0％Solv.B 0-31分钟；0％Solv.A，100％Solv.B 31-36分钟；100％Solv.A和0％Solv.B 36-45分钟。通过二极管阵列探测器监测波长范围190-600nm。番茄红素的保留时间是25.38分钟。通过与来自大肠杆菌的类胡萝卜素提取物比较鉴定diapolycopene，所述大肠杆菌借助pACCRT-MN表达来自金黄色葡萄球菌的diapophytoene合酶和diapophytoene去饱和酶(参见表1)。

1.9发酵

补料分批培养在2.4l KLF2000发酵器(Bioengineering AG,Wald,瑞士)中进行，所述发酵器具有一个来自Mettler-Toledo(Greifensee，瑞士)的pH和pO₂电极、二台六叶涡轮搅拌器和一台向下桨式搅拌器。以流量50l/h提供过滤除菌的空气或氧。全部实验均在30℃和在pH 6.75进行，通过自动引入NH₄OH(30％)调节后者。通过调整搅拌速度自动调节溶解氧(DO)的浓度，所述搅拌速度始于700转/分钟。用BINOS 1001气体分析仪(RosemountAnalytical,Hanau,DE)测量排气中的氧和二氧化碳。在线监测甲醇浓度并且每半小时用配备透析探头的ProcessTRACE 1.21MT系统(Trace Analytics,Braunschweig,DE)调节之。如下设置甲醇进料：低于1g/l浓度和低于0.5g/l浓度时，通过Watson-Marlow 505Du蠕动泵(Cornwall,England)引入0.79g(1ml)和1.42g(1.8ml)甲醇。除直接安装在液相上作为机械消泡器的六叶涡轮搅拌器之外，手工添加消泡B乳液(Sigma-Aldrich)以减少起泡。

在900ml发酵培养基原位灭菌后(参见上文)，用已经在摇瓶中生长72小时的预培养物接种发酵器OD₆₀₀为0.5-1。在达到OD₆₀₀ 5-10后，添加100μM来自甲醇中新鲜制备的母液的cumate和15％十二烷。诱导后甲醇进料速率加倍。将诱导的培养物进一步培养120小时，并且手工抽取样品，测定来自水相的细胞干质量及其OD6₀₀并且如上文所述测量有机十二烷相中的α-葎草烯。

2.结果

2.1使用带组成型启动子的质粒产生α-葎草烯(对比实施例)

扭脱甲基杆菌AM1内源产生法呢基焦磷酸(FPP)汇集物，然而后者转化成甲萘醌、藿烷类和类胡萝卜素类(参见图1)。原则上，这种细菌可能通过整合异源α-葎草烯合酶合成α-葎草烯。质粒pCM80携带pmxaF强启动子并且选择其作为表达α-葎草烯合酶基因zssI的载体。在pCM80中引入来自红球姜的该基因的密码子优化变体，获得pFS33。为了进一步增加α-葎草烯产生，来自酿酒酵母的FPP合酶(ERG20)克隆入pFS33中zssI基因之后，获得pFS34(pCM80-zssI-ERG20)。

培养在上文描述的条件下进行，作为水-有机双相培养物，其中使用十二烷作为有机相。α-葎草烯的强疏水性导致完全积累在十二烷相中，因为检测不到胞内α-葎草烯。

两个优点尤其衍生于此：可以直接测量十二烷相中的α-葎草烯浓度并且通过高沸点的十二烷减少α-葎草烯蒸发。另外，扭脱甲基杆菌AM1耐受20％十二烷，未观察到任何毒性作用或对生长的影响。

含有质粒pFS33的扭脱甲基杆菌AM1(下文又缩写为：AM1)能够产生α-葎草烯，如图2中与α-葎草烯标准品相比，具有相似保留时间和质谱的峰所示。与此相反，对含有空载体对照的扭脱甲基杆菌AM1不可检出α-葎草烯。

对AM1_pFS33并且还对AM1_pFS34测量到2.3mg/Lα-葎草烯。来自pFS34的FPP合酶ERG20似乎不增加α-葎草烯浓度。未知此现象的更详细原因。

2.2异源甲羟戊酸途径的整合(MVA)

然而令人惊讶地，本文中可以发现，异源表达MVA途径酶尤其导致α-葎草烯形成改善。

这越发难以置信，因为MVA前体，乙酰乙酰-CoA，是扭脱甲基杆菌初级代谢的组分(参见图1)。通过对异源引入的MVA途径撤退乙酰乙酰-CoA，将会预期扭脱甲基杆菌初级代谢的可观失衡。

这种担忧首先得到以下初步实验证实。含有zssI、ERG20和黄色粘球菌MVA基因hmgs、fni、hmgr、mvaK、mvaK2和mvaD的pFS44向电感受态扭脱甲基杆菌AM1的转化在甲醇极限培养基上和琥珀酸极限培养基上均未产生可察觉的生长。MVA途径的组成型表达似乎并未被扭脱甲基杆菌良好耐受。

2.3α-葎草烯对扭脱甲基杆菌AM1的毒性

为了确立扭脱甲基杆菌是否完全适合作为萜类生产菌株，首先检查细菌是否在生长方面受较高浓度的萜类抑制。

萜类经常对细菌具有毒性作用。通过在不同浓度的α-葎草烯存在下分析生长，研究α-葎草烯对扭脱甲基杆菌的毒性。将含有α-葎草烯的十二烷层添加至扭脱甲基杆菌培养物作为第二相。在第二种方法中，直接添加α-葎草烯至水相。图3中展示的结果显示，扭脱甲基杆菌合适作为萜类、尤其α-葎草烯的生产平台。

2.4使用cumate诱导型启动子产生α-葎草烯

为了MVA基因的诱导型表达，使用以下具有诱导型启动子的合适质粒系统。为此，将α-葎草烯合酶基因单独、与FPP合酶ERG20组合及与ERG20基因和MVA途径基因组合，克隆入携带cumate诱导型启动子的质粒pHC115(Chou和Marx,2012)，分别产生质粒pFS45、pFS46和pFS47。

在转化后，获得pFS45和pFS46的菌落，但是几乎不可检出pFS47的菌落。在不受其约束的情况下，图4中对pFS45和pFS46所示的数据可能解释这个现象：无诱导时已经产生超过50％的α-葎草烯。pHC115的基因表达并非严紧，并且MVA基因的剩余表达对扭脱甲基杆菌生长具有不良作用。

质粒pQ2148含有非常严紧的cumate诱导型2148启动子。将ZssI单独和再次与ERG20组合及与MVA基因组合时引入pQ2148F，获得pFS49(zssI)、pFS50(zssI-ERG20)和pFS52(zssI-ERG20-MVA)。在转化入扭脱甲基杆菌后，获得pFS49、pFS50的菌落并且还获得pFS52的菌落，即便甚至在30℃生长8天后，pFS52的菌落仍非常小。α-葎草烯浓度在AM1_pFS49中达到11mg/L并且在AM1_pFS50中达到17mg/L(参见图4)，与pFS34和pFS46相比，这在zssI-ERG20构建体中为6倍或1.6倍增长。与pHC115构建体相比，背景产生(即无诱导)仅是5％。

可以通过多种手段实现代谢中通量失衡的补偿。因此，例如启动子强度、诱导物浓度、质粒拷贝数或其组合可能是关键的。本文中现在令人惊讶地发现，不同核糖体结合位点(RBS)的翻译起始速率(TIR)对改善萜烯合成重要。

首先，质粒pFS57(zssI^225k)，pFS58(zssI^225k-ERG20)和pFS59(zssI^225k-ERG20-MVA)中α-葎草烯合酶RBS的TIR增加146倍(参见表2)。

表2：各种质粒的黄色粘球菌异源甲羟戊酸途径基因hmgs(羟甲基戊二酰-CoA合酶)和fni(IPP异构酶)、FPP合酶ERG20和α-葎草烯合酶zssI的天然和优化核糖体结合位点(RBS)的翻译起始速率(TIR)。生长：转化后甲醇琼脂上形成AM1菌落：++++：类似空载体(3-4天)，+++：4-5天，++：5-6天，+：6-7天，-：8天后无可察觉的菌落；wt：RBS未知的扭脱甲基杆菌AM1天然FPP合酶；中间体：AAc-CoA：乙酰乙酰-CoA；HMG-CoA：羟甲基戊二酰-CoA；IPP：异戊烯基焦磷酸；DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸；FPP：法呢基焦磷酸：

§各种菌落大小

如可以在图5中见到，在没有额外提供MVA途径前体的情况下，单独优化zssI的RBS不导致α-葎草烯产生(pFS57和pFS58)。与zssI RBS未优化的含有pFS52的菌株相比，具有pFS59(zssI^225k-ERG20-MVA)的转化体生长缓慢(参见表2)。

相对于zssI RBS的TIR，ERG20RBS的TIR按约1:10(pFS61b)的比率增加(参见表2)。在无MVA的情况下，ERG20的RBS优化结合zssI RBS优化并未导致增加α-葎草烯形成(pFS60a和pFS60b，参见图5)。

RBS优化的α-葎草烯合酶、RBS优化的FPP合酶和存在MVA酶的组合导致能够实现良好生长的质粒pFS61b(ERG20的TIR是22,000)。一些具有pFS61b的AM1转化体实现直至60mg/L的α-葎草烯浓度(平均产量是35mg/L)，尽管观察到高度波动。

优化IPP异构酶的RBS导致α-葎草烯平均产量进一步增加并且导致各转化体之间α-葎草烯产量的高度波动情况缩减。在质粒pFS62a和pFS62b中，fni RBS的TIR增加至65,000(参见表2)。与AM1_pFS61b相比，菌株AM1_pFS62b和AM1_pFS62a显示生长进一步改善。

采用菌株AM1_pFS62b，形成58mg/L的α-葎草烯浓度，与AM1_pFS61b相比，各转化体之间变异性显著减少(参见图5)。48小时诱导后，光密度是约3，这对应于细胞干重1g/l。

根据最后描述的实施方案，通过改造α-葎草烯合酶、FPP合酶和IPP异构酶的RBS，在扭脱甲基杆菌中实现MVA途径的异源表达。含有pFS62b(zssI^220k-ERG20^20k-fni^65k-MVA)的扭脱甲基杆菌达到58mg/L的α-葎草烯浓度。与在缺少异源MVA途径的情况下过量表达α-葎草烯合酶和过量表达FPP合酶的菌株相比，这无论如何是三倍增加。

2.5类胡萝卜素生物合成缺陷型扭脱甲基杆菌菌株中产生α-葎草烯

扭脱甲基杆菌中类胡萝卜素生物合成与α-葎草烯合酶竞争前体FPP(参见图1)。根据又一个实际实施例，类胡萝卜素合成缺陷型突变体的使用或许能够进一步增加α-葎草烯产生。为此，使用无色扭脱甲基杆菌AM1突变株CM502(Van Dien等人,2003)。从菌株CM502提取和分析类胡萝卜素(参见上文)显示，它产生diapolycopene，但不产生番茄红素，后者具有相同的紫外光谱，但是保留时间不同(参见图6A)。数据显示，菌株CM502是diapolycopene氧化酶突变体(crtNb)，因为它仍产生diapolycopene，但不产生酯化/糖基化的衍生物。

相对于具有质粒pFS62b的扭脱甲基杆菌AM1野生型，具有质粒pFS62b的菌株ΔcrtNb的α-葎草烯产生再次显著增加约30％(参见图6B)。无论如何，因此可以在摇瓶中实现75mg/lα-葎草烯的生产滴度。

这里值得注意的是，已经在例如不必要外部添加昂贵乙酰乙酸锂或DL-甲羟戊酸的情况下达到上述浓度，例如58mg/L或75mg/Lα-葎草烯。另外，有利的是已经使用廉价甲醇极限培养基实现上述浓度。与现有技术相反，不需要基于TB或LB的发酵培养基。这导致又一个优点，即所获得萜烯产物的纯化过程简化，原因是可以使用明确限定的极限培养基。可以最大限度减少繁琐的副产物移除过程。此外，本文描述的菌株开创了*甲醇作为唯一碳源用于生长的用途。

2.6在补料分批培养中产生α-葎草烯

为了检验本发明基于扭脱甲基杆菌的α-葎草烯生产过程的生产率，进行甲醇的有限补料分批发酵。利用上文描述的水-有机双相培养物。

将含有质粒pFS62b的扭脱甲基杆菌AM1或ΔcrtNb培育直至OD₆₀₀5-10，之后用cumate诱导α-葎草烯合成途径表达并添加十二烷相。在恒定pH、溶解氧水平>30％和甲醇浓度约1g/L时进行又一个培养。每个发酵实现平均OD₆₀₀值80-90(参见表3)，对应于约30g/l的细胞密度。如图7中所示，α-葎草烯产生具有生长依赖性。高α-葎草烯浓度0.73g/l至1.02g/l由含有质粒pFS62b的菌株扭脱甲基杆菌AM1形成。最高α-葎草烯浓度1.65g/l由具有质粒pFS62b的菌株扭脱甲基杆菌ΔcrtNb形成，与具有质粒pFS62b的菌株AM1的最高浓度1.02g/l相比增加57％(参见表3)。最高产品浓度1.65g/l意味与通过摇瓶中培养达到的最高浓度相比增加22倍，其中α-葎草烯/OD₆₀₀比率恒定处于约20mg*l^-1/OD₆₀₀。

依据甲醇从头可合成α-葎草烯的最大理论可能产率是0.26g/g。发酵5中实现的最大产率0.031g_-葎草烯/g_MeOH(参见表3)对应于最大理论产率的12％。

表3：用含有质粒pFS62b的菌株AM1和ΔcrtNb进行的甲醇的有限补料分批发酵的方法特性。在达到早期指数生长期(OD₆₀₀约10)后实施Cumate诱导。显示的值代表诱导后在每个时间点的量值。n.d.：未测定；cdw：细胞干重；STY：空间时间产率：

a：最大理论产率为0.26g/g_MeOH

b：诱导(t＝0)后直至方法结束的平均STY

实施例2：重组产生顺-冷杉醇

1材料和方法

1.1化学品、培养基和细菌菌株

将扭脱甲基杆菌AM1(Peel和Quayle,1961.Biochem J.81,465-9)在30℃在含有123mM甲醇的根据Kiefer等人(Kiefer等人,2009)的极限培养基中培养。

将大肠杆菌菌株DH5α(Gibco-BRL，罗克韦尔，美国)在37℃在溶源性肉汤(LB)培养基(Bertani,1951.J.Bacteriol.62,293)中培养。对于大肠杆菌和扭脱甲基杆菌，按浓度10μg/ml使用盐酸四环素。将Cumate(4-异丙基苯甲酸)作为诱导物使用并且以终浓度100μM使用，所述浓度始自100mM溶解于乙醇中的母液。

Cumate、盐酸四环素和球姜酮购自Sigma-Aldrich(Steinheim，DE)。顺-冷杉醇购自Toronto Research Chemicals(Toronto,CA)。十二烷购自VWR(达姆施塔特,DE)。

1.2遗传操作和质粒构建

根据本领域技术人员已知的程序开展标准克隆技术。如Toyama等人(Toyama,Anthony和Lidstrom 1998)中所述，用质粒转化扭脱甲基杆菌AM1。

借助核糖体结合位点计算器设计核糖体结合位点(RBS)(Salis 2011)。

1.3克隆用于产生顺-冷杉醇的质粒

从质粒pfs62b开始，构建用于合成顺-冷杉醇的质粒。

为了构建ppjo16(pQ2148F-AbCAS-ERG20F96C-MVA)，最初源自香脂冷杉的顺-冷杉醇合酶基因AbCAS(Zerbe等人,2012,J Biol Chem,287,12121-31)(登录号JN254808.1)针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化，获得根据SEQ ID No.50的DNA序列。使用引物pj05和pj25，扩增根据SEQ ID No.50的密码子优化基因以插入pfs62b。AbCAS基因的RBS具有核酸序列TATTAATATTAAGAGGAGGTAATAA(SEQ ID No.51)，翻译起始速率(TIR)为233,000。通过采用引物pj26、pj16、pj17和pj10的诱变PCR，从ERG20获得来自酿酒酵母的GGPP合酶ERG20F96C(SEQ ID No.52)的基因(Ignea等人,2015,Metabolic Engineering,27,65-75)。将ERG20F96C的RBS的TIR设定在10,000并且具有核酸序列CTTAAACTAACCGAGATAGGAACGAATTTTACAA(SEQ ID No.53)。通过以下方式构建质粒ppjo16：借助Gibson克隆法，将源自AbCAS和ERG20F96C的PCR产物插入用SpeI和XbaI切割的载体pfs62b.2。

为了构建质粒ppjo17(pQ2148F-NtLPPS-NtABS-ERG20F96C-MVA)，来自普通烟草(Nicotiana tabacum)的LPP合酶基因NtLPPS(Sallaud等人,2012,Plant J,72,1-17)(登录号HE588139.1)和来自普通烟草的顺-冷杉醇合酶基因NtABS(Sallaud等人,2012,Plant J,72,1-17)(登录号HE588140.1)针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化，分别获得DNA序列SEQID No.54和SEQ ID No.55。对于基因NtLPPS，相应的RBS具有145,000的TIR，DNA序列为CAACGGCCCTTACAAAAGGAGGTTAATTATT(SEQ ID No.56)，并且对于基因NtABS，则具有130,000的TIR，DNA序列为GATAGAAACCCTTAATTAAGAAGGAGGTCCTTA(SEQ ID No.57)。使用引物pj05和pj27，扩增根据SEQ ID No.54的密码子优化基因NtLPPS，并且为了扩增密码子优化的NtABS(SEQ ID No.55)，使用引物pj28和pj29。对于质粒ppjo17，通过采用引物pj30、pj16、pj17和pj10的诱变PCR，获得基因ERG20F96C(SEQ ID No.52)。将ppjo17中ERG20F96C的RBS的TIR设定在9,500并且具有核酸序列AACCACTAAGAACACAGACTTATACACAGGAGGAT(SEQ ID No.58)。通过以下方式构建质粒ppjo17：借助Gibson克隆法，将源自NtLPPS、NtABS和ERG20F96C的PCR产物插入SpeI和XbaI切割的载体pfs62b中。

表4中显示所用引物、质粒和菌株的概述。

表4：

1.4在水-有机双相摇瓶培养物中产生顺-冷杉醇

在含有盐酸四环素-5的甲醇极限培养基中培养含有顺-冷杉醇生产质粒的扭脱甲基杆菌AM1(参见上文)。将预培养物从琼脂平板接种到具有5ml培养基的试管中并且在30℃和180转/分钟振摇48小时。将100ml带挡板的摇瓶中具有12ml培养基的主培养物用预培养物接种至OD₆₀₀ 0.1。在30℃培养16小时后，主培养物达到早期指数生长期(OD₆₀₀0.3-0.6)。接下来，添加cumate供诱导并添加3ml十二烷作为有机相。在48小时温育后，将15ml的总培养物体积滗析并在3220g离心10分钟。1ml十二烷上层用于分析顺-冷杉醇。

1.5顺-冷杉醇分析

用NaSO₄干燥1ml十二烷样品。作为内标物，向225μl十二烷样品添加25μl含有1mM球姜酮的十二烷溶液。

通过配备Equity 5柱(Supelco，30m x 0.25mm x 0.25μM)的GC-MS(GC17A连同Q5050质谱仪,Shimadzu,Kyoto,日本)分析和定量顺-冷杉醇。如下进行测量：载气：氦气；在250℃分流进样(2:1)；流量：2.2ml/分钟；界面温度：250°5C；程序：80℃保持3分钟，16℃/分钟至240℃，保持2分钟。顺-冷杉醇的保留时间是14.1分钟，并且球姜酮的保留时间是11.3分钟。通过将质谱中的三个主要裂解行为与可商业获得的顺-冷杉醇标准品(相对强度在括号中)：119(15.9),134(30.3),191(6.0)比较，鉴定样品中的顺-冷杉醇。为了定量，使用顺-冷杉醇浓度为100、50、20、10、5、2、1μM各自伴以100μM球姜酮的校准曲线。

2结果

2.1使用带组成型启动子的质粒产生顺-冷杉醇(对比实施例)

为了用扭脱甲基杆菌AM1以及来自黄色粘球菌的甲羟戊酸操纵子产生顺-冷杉醇，表达GGPP合酶ERG20F96C(来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20的变体)和其他基因。GGPP应当由普通烟草的双官能顺-冷杉醇合酶AbCAS直接转化成顺-冷杉醇或借助来自普通烟草的LPP合酶NtLPPS从GGPP形成LPP而逐步转化成顺-冷杉醇，其中LPP随后应当由同样源自普通烟草的顺-冷杉醇合酶NtABS转化成顺-冷杉醇。总体上，构建用于合成顺-冷杉醇两种质粒变体(ppjo16和ppjo17)。

用质粒ppjo16或ppjo17转化扭脱甲基杆菌AM1后，第一菌落在30℃温育6天后出现。对于分别具有ppjo16和ppjo17的AM1，在每种情况下在这个时间点可见一个克隆；与此相比，采用空载体pQ2148F时可观察到远多于3,000个转化体。仅在30℃温育总计8天后，其他的、但明显更小的具有含有顺-冷杉醇生产质粒的转化体的菌落也出现。这些观察结果显示，大概因为对扭脱甲基杆菌有毒的异戊二烯基磷酸中间体堆积，顺-冷杉醇生产质粒明显地损害生物生长，并且因而形成抑制者(suppressor)。

将6天后可见到和每种情况下六个小菌落的分别具有ppjo16和ppjo17的两种AM1转化体在新鲜的琼脂平板上铺开并在30℃温育6天。甚至对于先前小的转化体，再铺种后，形成大菌落，即抑制者。因此，由于不可能在不形成抑制者的情况下选择性培养具有质粒ppjo16或ppjo17的转化体，仅可以测试抑制者的产物形成。为此，为了获得足够的细胞群，将新出现的抑制者铺种到又一个新鲜的琼脂平板上并且在30℃温育7天。

培养在上文描述的条件下进行，作为水-有机双相培养物，其中使用十二烷作为有机相。

含有质粒ppjo16的扭脱甲基杆菌AM1的抑制突变体(命名为16s6)能够产生顺-冷杉醇，如图1中与顺-冷杉醇标准品相比，具有相同保留时间和质谱的峰所示。与此相反，对含有空载体对照(pQ2148F)的扭脱甲基杆菌AM1不可检出顺-冷杉醇。对于具有ppjo16的扭脱甲基杆菌AM1的抑制突变体16s6，十二烷相中测量到21.1mg/L顺-冷杉醇，其对应于培养液中5.3mg/L顺-冷杉醇的产物浓度。从抑制突变体16s6分离质粒ppjo16并接着对质粒测序后，可以鉴定产生该抑制者的突变。在质粒的启动子区，确切地在AbCAS基因的起始密码子之前115个核苷酸，缺失总计28个核苷酸的序列。SEQ ID No.59代表质粒ppjo16中启动子区的序列，而来自抑制突变体16s6的质粒ppjo16中突变型启动子的序列按SEQ ID No.60记录。

实施例3：重组产生檀香烯

1材料和方法

1.1化学品、培养基和细菌菌株

将扭脱甲基杆菌AM1(Peel和Quayle,1961.Biochem J.81,465-9)在30℃在含有123mM甲醇的根据Kiefer等人(Kiefer等人,PLoS One,e7831)的极限培养基中培养。

将大肠杆菌菌株DH5α(Gibco-BRL，罗克韦尔，美国)在37℃在溶源性肉汤(LB)培养基(Bertani 1951)中培养。对于大肠杆菌和扭脱甲基杆菌，按浓度10μg/ml使用盐酸四环素。将Cumate(4-异丙基苯甲酸)作为诱导物使用，溶解于乙醇中，并且以终浓度100μM使用，所述浓度始自100mM母液。

Cumate、盐酸四环素、球姜酮和檀香木油购自Sigma-Aldrich(Steinheim,DE)。十二烷购自VWR(达姆施塔特,DE)。

1.2遗传操作和质粒构建

根据本领域技术人员已知的程序开展标准克隆技术。如Toyama等人(Toyama等人,FEMS Microbiology Letters,166,1-7)中所述，用质粒转化扭脱甲基杆菌AM1。借助核糖体结合位点计算器设计核糖体结合位点(RBS)(Salis,2011,Methods in Enzymology,V.Christopher编著,19-42.Academic Press)。

1.3克隆用于产生檀香烯的质粒

从质粒pQ2418F、pfs60b和pfs62b开始，构建用于合成檀香烯的质粒。

为了构建ppjo01_woMVA(pQ2148F-SSpiSSY-ERG20)和ppjo01(pQ2148F-SSpiSSY-ERG20-MVA)，最初源自大花澳洲檀香的檀香烯合酶基因SSpiSSY(Jones等人,2011,Journalof Biological Chemistry,286,17445-17454)(登录号HQ343278.1)针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化，获得根据SEQ ID No.61的DNA序列。使用引物SSpiSSY_RBSopt_fw和SSpiSSY_rev，扩增根据SEQ ID No.61的密码子优化基因以插入pfs60b(Sonntag等人,2015)。将SSpiSSY PCR产物用SpeI和ClaI消化并插入相同方式消化的质粒pfs60b，产生质粒ppjo01_woMVA。通过以下方式构建质粒ppjo01：用XbaI和EcoRI从ppjo01_woMVA切下基因SSpiSSY和ERG20，随后插入按相同方式消化的pfs62b。在两种质粒ppjo01和ppjo01_woMVA中，SSpiSSY具有核酸序列TGTTACACCCACAGAACAAACCCGAGGTAACT(SEQ ID No.62)，TIR为44,000；ERG20的RBS拥有核酸序列ACATCAAACCAAAGGACTTTACAGGTAGTAGAA(SEQ ID No.63)，TIR为20,000。

为了构建ppjo03(pQ2148F-SanSyn-ERG20)，最初源自黄皮(Clausena lansium)的檀香烯合酶基因SanSyn(Scalcinati等人,2012,Metabolic Engineering,14,91-103；Scalcinati等人,2012,Microb Cell Fact,11,117)(登录号HQ452480.1)针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化，获得根据SEQ ID No.64的DNA序列。使用引物pj05和pj06，扩增根据SEQ ID No.64的密码子优化基因以插入pfs62b。SanSyn基因的RBS具有核酸序列GAAGAAGGAGGTAGTCATAAAGAAGGAGGTAACTA(SEQ ID No.65)，TIR为233,000。通过以下方式构建质粒ppjo03：借助Gibson克隆法，将源自SanSyn的PCR产物插入SpeI和Bsu36I切割的载体pfs62b。将ERG20的RBS的TIR设定在22,000并且具有核酸序列TCCCCAGCGCGCCCCCCAATTCAGGATAACATAG(SEQ ID No.66)。

为了构建ppjo04_woMVA(pQ2148F-ERG20fusSSpiSSY)和ppjo04(pQ2148F-ERG20fusSSpiSSY-MVA)，用引物ERG20-fus_fw和ERG20-fus_rev扩增带C末端(GGGGS)x2接头的FPP合酶基因ERG20，以插入pQ2418F(Sonntag等人,Metab Eng,32,82-94)。将基因SSpiSSY(SEQ ID No.61)用引物SSpiSSY_RBSopt_fw和SSpiSSY_rev扩增，用BamHI和EcoRI消化并插入按相同方式消化的质粒pQ2418F-ERG20fus，产生质粒ppjo04_woMVA。通过以下方式构建质粒ppjo04：用AseI和EcoRI从ppjo04_woMVA切下基因ERG20fus，随后插入按相同方式消化的pfs62b。在两种质粒ppjo04和ppjo04_woMVA中，ERG20具有核酸序列AAACATAGCATATTAGCAGATTAAGGACATACGT(SEQ ID No.67)，TIR为53,000。

为了构建ppjo05(pQ2148F-SSpiSSYfusERG20-MVA)，用引物pj01和pj08扩增密码子优化的檀香烯合酶基因SspiSSY(SEQ ID No.61)。使用引物pj09和pj10，扩增带有N末端(GGGGS)x2接头的FPP合酶ERG20基因。将该融合蛋白的TIR设定在402,000并且具有核酸序列CCCCTTCCCTTATTTAAACCAGAGGAGGTAACAAA(SEQ ID No.68)。通过以下方式构建质粒ppjo05：借助Gibson克隆法，将源自SSpiSSY和fusERG20的PCR产物插入SpeI和XbaI切割的载体pfs62b。

为了构建ppjo06(pQ2148F-SSpiSSY-ERG20_RBSmax)，用引物pj01和pj77扩增密码子优化的檀香烯合酶基因SSpiSSY(SEQ ID No.61)。SSpiSSY基因的优化RBS具有根据SEQID No.68的核酸序列，TIR为402,000。使用引物pj10和pj78，扩增FPP合酶ERG20基因。将该ERG20的TIR设定在1,344,000并且具有核酸序列AACCAAATAGGATTAGCACAGAAGGGGGTAATA(SEQ ID No.69)。通过以下方式构建质粒ppjo06：借助Gibson克隆法，将源自SSpiSSY和ERG20的PCR产物插入SpeI和XbaI切割的载体pfs62b。

类似于葎草烯合成质粒pfs62b，质粒ppjo01、ppjo03和ppjo04中hmgs的RBS的TIR维持在189。对于质粒ppjo05和ppjo06，hmgs的RBS的TIR值设定在6345。

表5中给出所用引物、质粒和菌株的概述。

表5：所用引物、质粒和菌株

1.4在水-有机双相摇瓶培养物中产生檀香烯

在含有盐酸四环素-5的甲醇极限培养基中培养含有檀香烯生产质粒的扭脱甲基杆菌AM1(参见上文)。将预培养物从琼脂平板接种到具有5ml培养基的试管中并且在30℃和180转/分钟振摇48小时。将100ml带挡板的摇瓶中具有12ml培养基的主培养物用预培养物接种至OD₆₀₀0.1。在30℃培养16小时后，主培养物达到早期指数生长期(OD₆₀₀0.3-0.6)。接下来，添加cumate供诱导并添加3ml十二烷作为有机相。在48小时温育后，将15ml的总培养物体积滗析并在3220g离心10分钟。1ml十二烷上层用于分析檀香烯。

1.5檀香烯分析

通过配备Equity 5柱(Supelco，30m x 0.25mm x 0.25μM)的GC-MS(GC17A连同Q5050质谱仪,Shimadzu,Kyoto,日本)分析檀香烯。如下进行测量：载气：氦气；在250℃分流进样(8:1)；流量：2.2ml/分钟；界面温度：250℃；程序：80℃保持3分钟，16℃/分钟至240℃，保持2分钟。由于檀香烯标准品并无市售，所以代之使用檀香木油以分析样品中的檀香烯产物。在测量之前，将檀香木油在十二烷中1:500稀释。檀香木油中所含的多种物质在11分钟和12.4分钟之间洗脱。

2结果

2.1使用带组成型启动子的质粒产生檀香烯(对比实施例)

为了用扭脱甲基杆菌AM1以及来自黄色粘球菌的甲羟戊酸操纵子产生檀香烯，表达来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20和其他基因。FPP应当由来自大花澳洲檀香(SSpiSSY)或黄皮(SanSyn)的檀香烯合酶转化成檀香烯。另外，还测试来自檀香烯合酶SSpiSSY和FPP合酶ERG20的融合蛋白的檀香烯产生。总计，构建七个质粒变体(ppjo01、ppjo01_woMVA、ppjo03、ppjo04、ppjo04_woMVA、ppjo05、ppjo06)供合成檀香烯。

用檀香烯生产质粒转化扭脱甲基杆菌AM1后，菌落在30℃温育5天后出现。对于无甲羟戊酸途径的质粒(pQ2418F、ppjo01_woMVA、ppjo04_woMVA)和hmgs的RBS的TIR设定在189的那些质粒，可见到远超过3,000个转化体。与此相比，含有具有hmgs的RBS的TIR为6345(ppjo05、ppjo06)的质粒的菌落大约为100个可见，明显更少的转化体出现。在30℃温育总计8天后，具有分别含有ppjo05和ppjo06的转化体的其他的、但明显更小的菌落出现。这些观察结果显示，大概因为对扭脱甲基杆菌有毒的异戊二烯基磷酸中间体的累积，具有hmgs的RBS的较高设定TIR的檀香烯生产质粒明显地损害生物生长，并且因而形成抑制者(suppressor)。

将5天后可见到和每种情况下六个更小菌落的来自AM1的分别具有ppjo05和ppjo06的转化体铺种到新鲜的琼脂平板上并在30℃温育6天。甚至对于先前小的转化体，再铺种后，形成大菌落，即抑制者。因此，由于不可能在不形成抑制者的情况下选择性培养具有质粒ppjo05或ppjo06的转化体，仅可以测试抑制者的产物形成。为此，为了获得足够的细胞群，将新出现的抑制者铺种到又一个新鲜的琼脂平板上并且在30℃温育7天。对于其中不出现抑制者形成的其他扭脱甲基杆菌菌株，同样地在每种情况下，将3个不同克隆铺种到新琼脂平板上并且在30℃温育7天。

在上文描述的条件下进行培养，作为水-有机双相培养物，其中使用十二烷作为有机相。

含有质粒ppjo01_woMVA、ppjo03、ppjo04、ppjo04_woMVA或ppjo05的扭脱甲基杆菌AM1能够产生檀香烯，如图1中与檀香木油中的物质相比，具有相同保留时间和质谱的α-檀香烯峰所示。以举例方式，显示了来自含有质粒ppjo03的扭脱甲基杆菌AM1的样品的色谱图和质谱。与此相反，对含有空载体对照(pQ2148F)的扭脱甲基杆菌AM1不可检出檀香烯。

本领域技术人员认识到，可以轻易地改造本文在实际实施例中描述的细菌菌株和发酵条件，而不脱离本发明的范围。因此可构思简单的改造用于从甲醇或乙醇产生其他倍半萜，例如潜在生物燃料如红没药烯，或产生香精物质如檀香烯或产生二萜如香紫苏醇。本发明能够实现从碳源甲醇或乙醇生物产生萜类，不与食物竞争。

从权利要求、说明书和附图得出的全部特征和优点(包括建设性细节、空间布局和方法步骤)本身以及庞大种类的组合对于本发明可能是必不可少的。

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序列方案–无限制文本

SEQ ID No.1：黄色粘球菌羟甲基戊二酰-CoA合酶

SEQ ID No.2：黄色粘球菌羟甲基戊二酰-CoA还原酶

SEQ ID No.3：黄色粘球菌甲羟戊酸激酶

SEQ ID No.4：黄色粘球菌磷酸甲羟戊酸激酶

SEQ ID No.5：黄色粘球菌焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶

SEQ ID No.6：黄色粘球菌异戊烯基焦磷酸异构酶

SEQ ID No.7：移除EcoRI限制性位点、插入沉默突变(gaattc至gagttc)的黄色粘球菌hmgs基因

SEQ ID No.8：来自黄色粘球菌的hmgr基因

SEQ ID No.9：来自黄色粘球菌的mvaK1基因

SEQ ID No.10：来自黄色粘球菌的mvaK2基因

SEQ ID No.11：来自黄色粘球菌的mvaD基因

SEQ ID No.12：来自黄色粘球菌的fni基因

SEQ ID No.13：来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20，PRT

SEQ ID No.14：来自酿酒酵母的FPP合酶ERG20，DNA

SEQ ID No.15：来自红球姜的倍半萜合酶

SEQ ID No.16：针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的红球姜α-葎草烯合酶zssI的DNA序列

SEQ ID No.17引物HMGS-fw

SEQ ID No.18引物HMGS-rev

SEQ ID No.19引物HMGS-over-fw

SEQ ID No.20引物HMGS-over-rev

SEQ ID No.21引物MVA1_fw

SEQ ID No.22引物MVA-SacIA-rev

SEQ ID No.23引物MVA-SacIA-fw

SEQ ID No.24引物MVA-SacIB-rev

SEQ ID No.25引物MVA-SacIB_fw

SEQ ID No.26引物MVA2_rev

SEQ ID No.27引物pQF_MCS-fw

SEQ ID No.28引物pQF_MCS-rev

SEQ ID No.29引物ZSSI-fw

SEQ ID No.30引物ZSSI-RBS-fw

SEQ ID No.31引物ZSSI-rev

SEQ ID No.32引物ERG20_fw

SEQ ID No.33引物ERG20-RB S(35k)-fw

SEQ ID No.34引物ERG20-RB S(20k)-fw

SEQ ID No.35引物ERG20_rev

SEQ ID No.36引物ERG20_rev-2

SEQ ID No.37引物fni-RBSopt-fw

SEQ ID No.38引物fni-RBSopt-rev

SEQ ID No.39TIR为22,000的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.40TIR为36,800的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.41TIR为221,625的zssI的优化RBS

SEQ ID No.42：来自酿酒酵母的GGPP合酶

SEQ ID No.43：来自成团泛菌的GGPP合酶

SEQ ID No.44：来自加拿大红豆杉的GGPP合酶

SEQ ID No.45：来自檀香的倍半萜合酶

SEQ ID No.46：大花澳洲檀香倍半萜合酶

SEQ ID No.47：来自香脂冷杉的二萜合酶

SEQ ID No.48TIR为65,000的fni的优化RBS

SEQ ID No.49TIR为6,345的hmgs的优化RBS

SEQ ID No.50针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的香脂冷杉顺-冷杉醇合酶AbCAS的DNA序列。

SEQ ID No.51TIR为233,000的AbCAS的优化RBS

SEQ ID No.52来自酿酒酵母的GGPP合酶ERG20F96C的DNA序列

SEQ ID No.53质粒ppjo16中TIR为10,000的ERG20F96C的优化RBS

SEQ ID No.54针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的香脂冷杉LPP合酶NtLPPS基因的DNA序列。

SEQ ID No.55针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的香脂冷杉顺-冷杉醇合酶NtABS基因的DNA序列。

SEQ ID No.56质粒ppjo16中TIR为145,000的NtLPPS的优化RBS

SEQ ID No.57质粒ppjo16中TIR为130,000的NtABS的优化RBS

SEQ ID No.58质粒ppjo17中TIR为9,500的ERG20F96C的优化RBS

SEQ ID No.59：质粒ppjo16的启动子区，包括RBS AbCAS，紧随CymR*之后开始

SEQ ID No.60：来自克隆16s6的质粒ppjo16的启动子区，包括RBS AbCAS，紧随CymR*之后开始

SEQ ID No.61：针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的来自大花澳洲檀香的檀香烯合酶SspiSSY的DNA序列。

SEQ ID No.62：质粒ppjo01和ppjo01_woMVA中TIR为44,000的SSpiSSY的优化RBS

SEQ ID No.63：质粒ppjo01和ppjo01_woMVA中TIR为20,000的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.64：针对扭脱甲基杆菌AM1作密码子优化的来自黄皮(Clausenalansium)的檀香烯合酶SanSyn的DNA序列。

SEQ ID No.65：质粒ppjo03中TIR为233,000的SanSyn的优化RBS

SEQ ID No.66：质粒ppjo03中TIR为22,000的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.67：质粒ppjo04和ppjo04_woMVA中TIR为53,000的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.68：质粒ppjo05和ppjo06中TIR为402,000的SSpiSSY的优化RBS

SEQ ID No.69：质粒ppjo06中TIR为1,344,000的ERG20的优化RBS

SEQ ID No.70引物pj05

SEQ ID No.71引物pj10

SEQ ID No.72引物pj16

SEQ ID No.73引物pj17

SEQ ID No.74引物pj25

SEQ ID No.75引物pj26

SEQ ID No.76引物pj27

SEQ ID No.77引物pj28

SEQ ID No.78引物pj29

SEQ ID No.79引物pj30

SEQ ID No.80引物SspiSSY_RBSopt_fw

SEQ ID No.81引物SspiSSY_rev

SEQ ID No.82引物pj01

SEQ ID No.83引物pj06

SEQ ID No.84引物ERG20-fus_fw

SEQ ID No.85引物ERG20-fus_rev

SEQ ID No.86引物pj08

SEQ ID No.87引物pj09

SEQ ID No.88引物pj77

SEQ ID No.89引物pj78

SEQ ID No.90TIR为189的hmgs的优化RBS

Claims

1.含有异源萜烯合酶和重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌中表达，特征在于所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-异戊二烯基二磷酸前体合酶。

2.含有异源羟甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)和羟甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)作为异源甲羟戊酸途径的酶和重组DNA的甲基营养细菌，所述重组DNA编码至少一种具有酶活性的多肽供所述细菌中表达，特征在于所述至少一种具有酶活性的多肽选自

-异源萜烯合酶和

-异戊二烯基二磷酸前体合酶。

3.根据权利要求1或2所述的细菌，特征在于至少一种异源甲羟戊酸途径酶含有与根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的肽序列分别具有至少60％同一性的肽序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶选自倍半萜合酶和二萜合酶。

5.根据权利要求4所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶是倍半萜合酶，其中倍半萜合酶是合成环状倍半萜的酶，倍半萜尤其选自a-葎草烯和檀香烯的差向异构体，如α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯或α-外型-香柠檬烯，和红没药烯如b-红没药烯。

6.根据权利要求4所述的细菌，特征在于异源萜烯合酶是二萜合酶，尤其合成二萜的酶，二萜尤其选自香紫苏醇、顺-冷杉醇、冷杉二烯、异海松二烯、泪杉醇和落叶松醇。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是选自法呢基二磷酸合酶(FPP合酶)和香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)的酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源FPP合酶，其中异源FPP合酶是真核或原核FPP合酶。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌，特征在于异戊二烯基二磷酸前体合酶是异源GGPP合酶，其中异源GGPP合酶是来自从细菌、植物和真菌选出的生物的酶。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌，特征在于异源表达所述酶的重组DNA配有常见的诱导型启动子或几种相互独立可诱导的启动子。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的细菌，特征在于重组DNA在每种情况下相互独立地在质粒上可表达或可染色体表达。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的细菌，特征在于细菌是甲基营养变形杆菌，尤其甲基杆菌属(Methylobacterium)或甲基单胞菌属(Methylomonas)的细菌，优选地细菌扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的细菌，特征在于细菌是缺少类胡萝卜素生物合成活性、尤其缺少diapolycopene氧化酶活性的菌株。

14.由甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜的方法，包括以下步骤：

-提供含甲醇和/或乙醇的水介质，

-在生物反应器的所述培养基中培养根据权利要求1至13中任一项所述的甲基营养细菌，其中甲醇和/或乙醇由细菌转化成萜烯，

-分离生物反应器中形成的倍半萜或二萜。

15.根据权利要求14所述的方法，特征在于，所述培养基中含有甲醇和/或乙醇作为培养所述细菌的唯一碳源。

16.含有甲醇和/或乙醇的培养基培养根据权利要求1至13中任一项所述的重组甲基营养细菌的用途，用于从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜。

17.根据权利要求1至13中任一项所述的甲基营养细菌的用途，用于从甲醇和/或乙醇从头微生物合成倍半萜或二萜。