CN116083462A - 一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株 - Google Patents
一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株，所述萜类化合物包括倍半萜、二萜和二倍半萜中的至少一种；所述萜类合酶包括20个基因，获得了包含萜类合酶的质粒库以及菌株库。本发明对获得的菌株库进行发酵及检测，获得包括50个萜类化合物在内的产物库。本发明筛选的萜类合酶基因能够产生倍半萜、二萜及二倍半萜化合物等，丰富了萜类天然产物的种类和库容量。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株。
背景技术
萜类化合物是自然界中存在较为广泛的一类天然产物，其数量超过120000多种，并广泛分布于细菌、真菌、植物和其他真核生物中。萜类化合物的生物合成，可由不同类型的萜类环化酶催化异戊二烯单元得到不同链长且结构多样的萜类化合物，具体可分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜和四萜等，其相应萜类骨架化合物分子式为C10H16，C15H24，C20H32，C25H40，C30H48，C35H56。在此基础上，萜类骨架化合物还可以经过后续细胞色素P450酶和一些后修饰酶的催化，得到一些结构更为丰富、活性更为多样的萜类产物。萜类化合物因其丰富的生活学功能，在日常生活中得到广泛的应用。如临床上使用且荣获2015年诺贝尔化学奖的抗疟剂药物青蒿素，抗癌明星药物紫杉醇等；用作诸如保健品等产品中具有显著抗氧化活性的番茄红素和虾青素等；具有抗菌作用且作为原料药生产兽用抗生素的萜类前体化合物截短侧耳素等。除去这些已经开发成药物或者营养品的萜类化合物，研究员还发现了许多具有良好生物学功能的萜类化合物，比如具有抗炎活性的二倍半萜化合物MangicolA；具有抗过敏作用的三萜皂苷类化合物等。同时，还有一些常用作香精香料行业的倍半萜化合物诺卡酮和薄荷醇等。由此可见，萜类化合物种类多，作用广，在日常生活中扮演着重要的作用，在医疗、化妆品、保健品和科学研究中，受到了广泛的关注。
除去那些已经发现的萜类化合物，自然界中还蕴藏着丰富的萜类化合物生物合成资源，留待科研人员去挖掘。因此，寻求高效的萜类化合物发现方法，来推进这一研究领域的进程，显得尤为重要。
发明内容
本发明目的是提供一种萜类骨架的萜类合酶基因，其表达载体和重组微生物菌株，以真菌萜类产物为研究目标，以公认的安全菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)为异源表达宿主，基于自动化高通量平台，对萜类合酶基因进行规模化异源重构及功能表征，提高了萜类合酶研究的通量，丰富了萜类产物种类，加速了天然产物生物合成领域研究进程。
在本发明的第一方面，提供了一种萜类合酶基因，所述萜类化合物包括倍半萜、二萜和二倍半萜中的至少一种；
所述萜类合酶基因包括以下20个基因中的至少一个；
基因1：FgJ01056基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
基因2：FgJ03939基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因3：FgJ03982基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
基因4：FgJ04421基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
基因5：FgJ07623基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
基因6：FgJ09080基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
基因7：FgJ09920基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
基因8：Cgl01792基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
基因9：Cgl02525基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
基因10：Cgl05727基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
基因11：Cgl05950基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
基因12：Cgl10228基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
基因13：Cgl12623基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
基因14：Cgl13742基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
基因15：AF05005基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
基因16：Tvi02670基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
基因17：Tvi03689基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
基因18：Tvi09335基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
基因19：Tvi09626基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
基因20：Tvi11551基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
在本发明的第二方面，提供了一种萜类合酶基因的表达盒，所述表达盒含有所述的萜类合酶基因。
进一步地，所述表达盒还含有启动子和终止子，所述启动子包括PhlyA、PamyB和PglaA中的一种，所述终止子包括TagdA、TamyB和TniaD中的一种。
在本发明的第三方面，提供了一种萜类合酶基因的表达载体，所述表达载体含所述的表达盒。
在本发明的第四方面，提供了一种萜类合酶基因的重组微生物菌株，所述重组微生物菌株含有所述的表达载体。
进一步地，所述微生物包括米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中的一种。
在本发明的第五方面，提供了一种萜类化合物的生物合成方法，所述方法包括：
构建异源合成倍半萜、二萜或者二倍半萜萜类合酶的微生物突变株；
将所述微生物突变株发酵，获得发酵培养物；
将所述发酵培养物萃取、进行GC-MS检测。
进一步地，所述微生物突变株为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种。
在本发明的第六方面，提供了一种香叶基香叶基二磷酸合酶，其核苷酸序列如SEQID NO.21所示。
在本发明的第七方面，提供了一种编码香叶基香叶基二磷酸合酶的核酸分子，所述核酸分子为Tvi11549基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株，以真菌萜类产物为研究目标，以公认的安全菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)为异源表达宿主，基于自动化高通量平台，对萜类合酶规模化异源重构及功能表征，提高了萜类合酶研究的通量，丰富了萜类产物种类，加速了天然产物生物合成领域研究进程；具体地：
(1)本发明中优选地以米曲霉作为优势表达宿主，通过理性设计，基于搭建的自动化高通量平台，在其体内高效地异源重构了20个萜类合酶，获得了包含20个菌株在内的菌株库；
(2)本发明通过对菌株库高通量发酵培养和检测，获得了包含50个产物在内的萜类化合物库。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的菌株AO-Y21、AO-Y34和AO-Y36的产物GC/MS检测图谱；
图2为本发明的菌株AO-Y40、AO-Y63、AO-Y71、AO-Y75和AO-Y77的产物GC/MS检测图谱；
图3为本发明的菌株AO-Y81、AO-Y85、AO-Y94、AO-Y115、AO-Y125、AO-Y146、AO-Y165和AO-Y175的产物GC/MS检测图谱；
图4为本发明的菌株AO-Y179、AO-Y185、AO-Y190和AO-Y197的产物GC/MS检测图谱。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
第一部分，本发明通过生物信息学分析，最终锁定了20个能够合成倍半萜、二萜或二倍半萜化合物的萜类合酶基因。
第二部分，本发明扩增获得所述20个萜类合酶基因、启动子、终止子、线性载体片段并采用酵母组装方法，用自动化移液工作站方法转入酿酒酵母，后提取质粒，获得质粒库。
第三部分，本发明将上述获得的质粒库，基于自动化平台，转化到微生物菌株中，获得微生物菌株库。所述微生物不局限于米曲霉，包括米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种。
第四部分，本发明将上述中获得的微生物菌株库发酵、检测，根据NIST数据库比对分析，获得萜类化合物库。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株进行详细说明。
实施例1、萜类合酶生物信息学分析
基于AntiSMASH软件，对5种不同来源的丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012(Fusariumgraminearum J1-012)、胶孢炭疽菌ES026(Colletotrichum gloeosporioides ES026)、交格链孢菌(Alternaria alternata TPF6)、绿色木霉(Trichoderma viride J1-030)和黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)中的萜类合酶基因进行生物信息学分析。通过对预测基因中的第一步催化酶萜类合酶的保守结构域(I型萜类合酶DDXXD/E，II型萜类合酶DXDD)进一步分析，去除无保守结构域及功能结构域不完整的基因，最终锁定了20个能够合成倍半萜、二萜或二倍半萜化合物的基因，所示20个基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.20所示；具体列表如表1(图1)。此外，还发现了Tvi11549基因，编码香叶基香叶基二磷酸合酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
表1
实施例2、构建过表达载体
1、重组片段高通量扩增
构建重组质粒库所需的DNA片段均通过PCR扩增获得。扩增所需的Phusion高保真DNA聚合酶购于NEB公司(New England Biolabs,NEB)，Prime STAR GXL DNA聚合酶购于TaKaRa公司(TaKaRa Bio,Inc.,Shiga,Japan)。PCR引物购于金斯瑞生物科技有限公司。扩增片段PCR纯化所用的磁珠购于诺唯赞生物科技有限公司(N411-01,Vazyme)。
所有功能基因均从5株丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012(Fusarium graminearum J1-012)、胶孢炭疽菌ES026(Colletotrichum gloeosporioides ES026)、交格链孢菌(Alternaria alternata TPF6)、绿色木霉(Trichoderma viride J1-030)和黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)基因组扩增获得，所用的启动子(PhlyA、PamyB、PglaA)和终止子(TagdA、TamyB、TniaD)分别从质粒pSC19(含PhlyA)、pTAex3-optimized(含PamyB和TamyB)、pGB98(含PglaA，参考文献doi:https://doi.org/10.1002/biot.201600697)、pYJ177(含TagdA)和pGB127(含TniaD)中扩增获得，载体片段分别从质粒pTAex3-optimized、pUSA-optimized和pAdeA-optimized中扩增获得，扩增所需的引物如表2所示。所有功能基因、启动子、终止子及载体序列的5’-端和3’-端均含有40bp碱基的重叠片段，以便后续利用酿酒酵母内在重组能力组装获得质粒库。
其中，启动子PhlyA、PamyB、PglaA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22-24所示；终止子TagdA、TamyB、TniaD的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25-27所示。pTAex3-optimized载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，pUSA-optimized载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，pAdeA-optimized载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
2、酵母组装构建重组质粒库
重组质粒构建主要采用酵母组装(Yeast assembly)方法。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D,EUROSCARF)(基因型MATaura3-52trp1-289leu2-3112his3Δ1MAL2-8C SUC2)用作同源重组的实验菌株，采用优化的醋酸锂/聚乙二醇(LiAc/PEG)化学转化法构建重组质粒。
将上述中获得的构建每个重组质粒所需的编码序列、启动子、终止子和线性载体片段各取300ng，混合备用(总体积10μL)。用自动化移液工作站中的MP20096-Tip机械臂移取上述10μLDNA混合液至含有酿酒酵母感受态细胞的96孔深孔板中(100μL/孔)，随后依次加入煮沸的鱼精DNA(20μL/孔)和LiAc/TE/40％PEG4000溶液(700μL/孔)，设置“aspirate”程序，吹吸混匀，30℃培养箱孵育30min。取出培养孔板，加入DMSO(88μL/孔)，吹吸混匀，将培养板转移到42℃培养箱热激8min，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mL YPD培养基重悬菌体，转移培养板至30℃培养箱孵育60min。取出培养板，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mLTE溶液洗一遍菌体，1500rpm离心5min，弃去部分上清，余下约100μL的TE溶液重悬菌体，吸取菌液加入到含有1mL尿嘧啶缺陷型的固体培养基(SC-Ura)的96孔深孔板，转移培养板至震荡模块，设置shake程序30s，使菌液均匀涂布于固体培养基。转移培养板至30℃培养箱培养3天。待菌体长出后，转接到SC-Ura的液体培养基培养，提取酵母质粒。
具体地，本发明实施例构建的过表达载体如下：
以下质粒构建均采用酵母组装方法，选用的酵母宿主为所述的CEN.PK2-1D。AaTgenome，FgJ genome，Cgl genome，Tvi genome和AF genome分别代表是Alternariaalternate TPF6,Fusarium graminearum J1-012,Trichoderma viride J1-030,Colletotrichum gloeosporioides ES026和Aspergillus flavipes的基因组。
pYJ337质粒构建：分别以pGB381、pYJ177、Tvi genome、pYJ177为模板，用引物对P81/P84、P82/P77、P78/P79、P80/P83分别扩增片段pYJ337-F1、pYJ337-F2、pYJ337-F3、pYJ337-F4，以上4个片段进行酵母组装得到质粒pYJ337。
pGB365质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P2/P1、P4/P3分别扩增片段pGB365-F1、pGB365-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB365。
pGB367质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P5/P6、P7/P8分别扩增片段pGB367-F1、pGB367-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB367。
pGB368质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P9/P10、P11/P12分别扩增片段pGB368-F1、pGB368-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB368。
pGB369质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P13/P14、P15/P16分别扩增片段pGB369-F1、pGB369-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB369。
pGB372质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P17/P18、P19/P20分别扩增片段pGB372-F1、pGB372-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB372。
pGB373质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P21/P22、P23/P24分别扩增片段pGB373-F1、pGB373-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB373。
pGB374质粒构建：分别以FgJ genome、pYJ152为模板，用引物对P25/P26、P27/P28分别扩增片段pGB374-F1、pGB374-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB374。
pGB375质粒构建：分别以Tvi genome、pYJ152为模板，用引物对P29/P30、P31/P32分别扩增片段pGB375-F1、pGB375-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB375。
pGB376质粒构建：分别以Tvi genome、pYJ152为模板，用引物对P33/P34、P35/P36分别扩增片段pGB376-F1、pGB376-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB376。
pGB378质粒构建：分别以Tvi genome、pYJ152为模板，用引物对P37/P38、P39/P40分别扩增片段pGB378-F1、pGB378-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB378。
pGB379质粒构建：分别以Tvi genome、pYJ152为模板，用引物对P41/P42、P43/P44分别扩增片段pGB379-F1、pGB379-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB379。
pGB382质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P45/P46、P47/P48分别扩增片段pGB382-F1、pGB382-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB382。
pGB383质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P49/P50、P51/P52分别扩增片段pGB383-F1、pGB383-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB383。
pGB384质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P53/P54、P55/P56分别扩增片段pGB384-F1、pGB384-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB384。
pGB386质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P57/P58、P59/P60分别扩增片段pGB386-F1、pGB386-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB386。
pGB391质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P61/P62、P63/P64分别扩增片段pGB391-F1、pGB391-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB391。
pGB393质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P65/P66、P67/P68分别扩增片段pGB393-F1、pGB393-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB393。
pGB395质粒构建：分别以Cgl genome、pYJ152为模板，用引物对P69/P70、P71/P72分别扩增片段pGB395-F1、pGB395-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB395。
pGB398质粒构建：分别以AF genome、pYJ152为模板，用引物对P73/P74、P75/P76分别扩增片段pGB398-F1、pGB398-F2，以上2个片段进行酵母组装得到质粒pGB398。
表2
3、大肠杆菌富集重组质粒
采用CaCl2化学法制备大肠杆菌(Escherichia coli DH10B)感受态细胞。通过自动分液仪将感受态细胞以70μL/孔的量分装到96孔深孔板中。取10μL质粒DNA溶液，加入到E.coli DH10B感受态细胞，4℃培养箱孵育30min。随后，将含有细胞的平板转移到预热的42℃培养箱，孵育3min后，向每孔中加入800μL LB培养基，37℃孵育45min以复苏细胞。随后，将平板转移到离心机，1500g离心8min，收集细胞。弃去部分上清，余下约50μL培养基重悬菌体，涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)抗性的LA固体培养基，37℃过夜培养。采用Qpix 460仪器挑取菌体到LB培养基，扩大培养，以富集质粒。获得的质粒通过限制性内切酶酶切验证。
实施例3、合成萜类化合物的米曲霉突变株构建
通过生物信息学分析，本发明确定了5株丝状真菌中的20个萜类合酶，为了充分挖掘这20个萜类合酶的生物合成潜力，本发明将相应的质粒转化到米曲霉宿主Aspergillusoryzae NSAR1，构建了米曲霉突变株筛选库。下述质粒pUSA、pAdeA和pTAex3由日本东京大学IkuroAbe教授赠予。
在菌株构建中，均是采用原生质体转化的方法，基于自动化移液工作站，将含有不同基因的质粒转化到米曲霉中，如表3所示，操作步骤如下：
一、与FgJ01056相关的重组米曲霉菌株
AO-Y21：共转化质粒pGB365/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ01056；
二、与FgJ03939相关的重组米曲霉菌株
AO-Y34：共转化质粒pGB367/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ03939；
三、与FgJ03982相关的重组米曲霉菌株
AO-Y36：共转化质粒pGB368/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ03982；
四、与FgJ04421相关的重组米曲霉菌株
AO-Y40：共转化质粒pGB369/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ04421；
五、与FgJ07623相关的重组米曲霉菌株
AO-Y63：共转化质粒pGB372/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ07623；
六、与FgJ09080相关的重组米曲霉菌株
AO-Y71：共转化质粒pGB373/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ09080；
七、与FgJ09920相关的重组米曲霉菌株
AO-Y75：共转化质粒pGB374/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶FgJ09920；
八、与Cgl01792相关的重组米曲霉菌株
AO-Y77：共转化质粒pGB382/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl01792；
九、与Cgl02525相关的重组米曲霉菌株
AO-Y81：共转化质粒pGB383/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl02525；
十、与Cgl05727相关的重组米曲霉菌株
AO-Y85：共转化质粒pGB384/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl05727；
十一、与Cgl05950相关的重组米曲霉菌株
AO-Y94：共转化质粒pGB386/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl05950；
十二、与Cgl10228相关的重组米曲霉菌株
AO-Y115：共转化质粒pGB391/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl10228；
十三、与Cgl12623相关的重组米曲霉菌株
AO-Y125：共转化质粒pGB393/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl12623；
十四、与Cgl13742相关的重组米曲霉菌株
AO-Y146：共转化质粒pGB395/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Cgl13742；
十五、与AF05005相关的重组米曲霉菌株
AO-Y165：共转化质粒pGB398/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶AF05005；
十六、与Tvi02670相关的重组米曲霉菌株
AO-Y175：共转化质粒pGB375/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Tvi02670；
十七、与Tvi03689相关的重组米曲霉菌株
AO-Y179：共转化质粒pGB376/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Tvi03689；
十八、与Tvi09335相关的重组米曲霉菌株
AO-Y185：共转化质粒pGB378/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Tvi05059；
十九、与Tvi09626相关的重组米曲霉菌株
AO-Y190：共转化质粒pGB379/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Tvi09626；
二十、与Tvi11551相关的重组米曲霉菌株
AO-Y197：共转化质粒pYJ337/pUSA/pAdeA到米曲霉中，包含萜类合酶Tvi11551和GGPPs Tvi11549；
表3
实施例4萜类化合物的合成及检测
实施例3中的突变株，都按如下所述培养条件，进行了培养。具体地将实施例3中构建的菌株，转接到含有大米固体培养基的24孔深孔板培养，每个菌株转接6个复孔(每孔含1g大米和1.5mL去离子水)，30℃，发酵培养2周。向培养好的24孔深孔板中加入丙酮(5mL/孔)，室温下浸泡2h。将上清转移到新的24孔深孔板，向菌体中再加入乙酸乙酯(5mL/孔)，室温下浸泡2h。合并丙酮和乙酸乙酯萃取相，将24孔深孔板转移到通风橱，自然挥干，获得粗提物。通过GC/MS检测分析，本发明检测到50个萜类化合物，其对应的GC/MS图谱如图1～图4所示(图1～图4)。
表4
综上可知，本发明的萜类骨架的萜类合酶能够成功表达萜类化合物，提高了萜类合酶研究的通量，丰富了萜类产物种类，加速了天然产物生物合成领域研究进程。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcttgcta caccgaccct gtccaacttc gacaaaccct ctcttccatc ctcggaggga 60
ggtgatcccg cccttgcagc tcgcttgcaa ccactgtatt cgaggtttct cacggatctt 120
gatctacagc cggaatatag acgtcacgaa agcgagaagc ttatggagga ggtgctcaaa 180
tttgcgaaga gtactggtgt acctcatgat ctcaactccc attcctatca aagtctcatg 240
gttggataca catacgccga tgtaagcttt ctttcccttg tatcgactgt ttcaagagct 300
cacaccattt tcagaactgc ctcccatatc atgacattga agtcaaggtt tatgtagcca 360
tctacacatg gctggcaact atttgcgatg acgccgaggc actaggcatc attgatgatg 420
ttcaattgtt cgaacaacgc tttattctcg gagaggaaca gcctacggta tgtttacttt 480
atggctccaa ccccaagtct caaaggcttc aatgtcaaca aaaagctaat caagatgctt 540
aggtcctcct cagggctttt gccgaccaac tcaaactcac ctataagctg taccaccccc 600
ttgttgcgaa tctgattctt tgctcctctc tgaatctgct cacttctaca tcccttgtgg 660
ctcgcaaggg tattaaagaa aagggtgatc atccatcaaa gggaggcaac tacttcgcct 720
ggtacatccg ggaacgggat ggcgtcggtg aagcctattc ctggttcact ttccccaaac 780
gacaattccc cgacctggac attcctatcg aagctattga agatatgaca cgattcattg 840
cctatctcaa tgatgtttta tcgtgagtca gcctgtccta cttggtgagc tttcctattg 900
acatatctat caggttttac aaagagtccc tggctggcga gacacacaac tacatcaacc 960
atacggctgc gtatgagggt gttgattcgg atgctgcgct tcataaaact gctcaagaca 1020
ccatagactg tgcccgccgc attgagagtg ttctcgcagg aaagggcgag tatgagaaag 1080
cgtggcgact tcatgcatcc ggatacctcc aaatgcacgt ccagagaggt cgttacaggc 1140
ttatagaggt gggcgttggt gatgcgccag atgtgcatga agtcatcaag aagatttga 1199
<210> 2
<211> 1280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcctcaca agcacgttcc tcttagacca gtcaagttga catttgatcc tgtaggatca 60
aacaccctag gtgtgccaac cttggacttt gagtctctgt tccgggaaga cagcgtctct 120
gaggatgccc ctcttgttat ctacccagag gatatgggtg tcccatggaa cacctctctt 180
ccttggacca gacaatccaa gttctgggct tacgccgagg cagctggata tgaaatggcc 240
aacggaatca gccttgacaa ggcatcagag cgtggcacac tacccatgga gttgatggat 300
gagcgtcgca agtggaagat tgatgagcta gttgaggatg ccatctcttg ctgtgcttat 360
ctttacccta catcatctcc taccagattg gcgttgttga cccagtctgt tctgcttcta 420
ttcctccacg acggtatgct gatatgaaac cgcggcgaaa gaagtcaagt actgacatgt 480
gaatacagat gttattgagc gaggagctac tcaaaacgta agaagcctgc tctgcaatct 540
atacaatttg ttcaatatac tgacagatct ttaggaaacc acagtggtag acgaatttct 600
tagcatggct cccaagaaca ggcatcttaa gaaattctgg tcagacgtat tggaatgtga 660
tcccgtcctt ggacctgatc tgctttatgc tatccatgct ttcgtccgtg atggtcgtgt 720
aaagtcaccc tttaagcagg atcactatgc cacattggct gattacatgc tttaccgtcg 780
caatgatgtt ggcaagacgt gagtactttt caaggcatct ttctatcact ttcactgaca 840
atgaactcag atttatgatt gcagctatcc gcttcggctc tggcgtgcaa caaacacgcg 900
aagaacttgc tccctttgac gagcttgctg atctttacgt cagacactca attcttatca 960
acgatctcta ctcgtatgat aaggaggtgc acgaggtcaa gactatcgac gcgtccatcg 1020
tgaacgcagt tgctgtcaca gagcagctcc tttccgtgtc gcctgacctg gccaagaact 1080
taaccagagc tattaccttt gacatggaga aggagtttta cggcatttgt gagaagttta 1140
tgcacagccc tgatatcaac gatcgccagc gcgtgttcgt tactgcgctc tttgatgcgt 1200
tgacaggcaa tatcttccat tctgctactt tgagcagata cgttcgtcac ggcgagagac 1260
cacttccttg caagtgttag 1280
<210> 3
<211> 1187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaaaact ttcccaccga gtattttctc aacactagcg tgcgccttct cgagtatatt 60
cgataccgag acagcaatta cacccgagag gagcgcatcg agaatttgca ctatgcttac 120
aacaaggctg cccaccactt tgctcagcct cgccaacagc agatgctcaa ggtagaccct 180
aagcgactac aggcttccct ccaaacaatc gttggcatgg ttgtatacag ctgggcaaag 240
gtgtccaaag agtgcatggc ggatctatct attcactaca cctatactct cgttttggat 300
gacagcagcg atgatcccca tcctgccatg ttgaactatt ttgacgacct tcaagccgga 360
cgagagcagg cccatccatg gtgggcactt gtcaacgagc actttcccaa cgtccttcgc 420
cattttggac ctttctgctc attgaacctt atccgtagca ctatggactg taagataccg 480
attctattat tcacccgtat gaagaagcta acggcggtgg aacaacagtt tttgagggat 540
gttggattga gcagtacaac tttggaggat tcccaggatc tgatgactac cctcaattcc 600
ttcgtcgtat gaatggtttg ggtcattgtg ttggggcttc tctatggccc aaggacctgt 660
ttgatgagcg gaagcatttc cttgaaatca cgtcagccgt tgctcagatg gagaactgga 720
tggtttgggt caatgatctc atgtcattct acaaggaatt cgacgatgag cgtgaccaaa 780
tcagtctggt caagaacttt gtcacctgcc atgagatcac tctggatgaa gctttggaga 840
agctcaccca ggaaacccta cactcgtcta agcagatggt tgctgtcttc tcggacaagg 900
accctcaggt gatggacacg attgagtgtt tcatgcatgg ctacgtcacg tggcacttgt 960
gcgacgctcg ataccgcctc catgagattt atgaaaaggt caaggatcag gatacagagg 1020
acgccaagaa gttctgcaag ttctttgagc aggcggccaa tgtcggcgcc gttgcaccct 1080
cggagtgggc ttatccacaa gttgcacaac tggcaaacgt tcgggccaag gacgatgtga 1140
aggaggctca gaagcccatc ctaagttcaa ttgagctagt ggagtaa 1187
<210> 4
<211> 1593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcacgtga caaccacaaa gcagaacaag actacggtca tactgccaga cctgttcaaa 60
ggtttcgttg ttcagactcc tcgtgtcaac aaagattacg aggcagtcaa accaatctcg 120
gaacaatggc tctcagagta agatgaacat gaagttgtgt tgaaattata ctgacacaaa 180
ccaggaaatg ccagttctct cctcggatga aaaaaagagt cgagttctgt gactttgctc 240
tattcatctc tatcacagct cctgatgcac ctcaagacaa actcaagact atgtgtgatt 300
ggggtaactg ggtaagaact ctcttcatca ttcacatgta caaaactaat tcaaaatctc 360
taggtctttc cttttgatga ctgtaggtga cattgatatt tgtgaaggaa atcaactgaa 420
aatccatagt gtttgatgaa gggtcattga aaagtgctca aagacaggct caacatgtcg 480
ttgacagtct catggcagat atgctcggca agacctttac caaaaagaag attcgtgttg 540
tacaggctca cgatgacatc tttcgaagag tatcagaggt aggcacaagt ccttatatga 600
atatgacaac cgctaacttg aaatcttgaa gggttcaaca gctggtatgt ttggatcttg 660
tctatcccgt ccgtgaatta actaatatga tacaggcgct cggacgagat ttgctctcgc 720
tatgagagac tacacagatg gcgtgatcca ccatgtcaag cattactcgt cgagcagtat 780
tccaagcatc gaagagatgc ttcatactcg gagattatcg tctggtgtca cacctttgta 840
tcatctagtg gaatttgctc atgatatccg actacctgat gaggtgtttg agaatcctgt 900
gatccaaacg ttggaacgtc ttggtgtgga ctttgtctta ctgtaagttc aaaaaagctg 960
tttcaatggt tatcgctgac tgacgtgact ctgcagtgcc aatgatattt tatcctacag 1020
aaaagaagag gtaagacatg attatggttg tgataggact cgtatctgac agtgtataga 1080
atgacgattc tcccttcagc atggttgcct cttgtcgagc ggctgggcaa tctcctcaag 1140
aagcctttga cacggtgggc gcacttcttg aagaacgaca tcaagaatgg cagacggtca 1200
tagctgagct gccaagctgg gggccagaaa ttgacgctca agtggcaaga tatgtcgagg 1260
gcattcagaa cgtggtccaa gccaatgtca catggaggta ccgatccttt tatttcagca 1320
atatcaagta ccgaatcgct aacatgtgat agctttcaat cggggcggta ctttgggaaa 1380
caagctcaag aaatccgaca aactcggttg gttgaggtga tggttgatcc cccgtatctg 1440
caacagcagc agcagcagcg acagcgccgt gcagccaaca tgcattcagg tcaatggtca 1500
aagagcctgt cgtcgtttgt tcagaatgta tcctggtcgt ttgttctgag tctggtgatc 1560
atttgtcact ttgccgtagt tagtcggcaa tga 1593
<210> 5
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggatccct acagtgaaac atcagatctt gttgacattt ctcgcttcga cacccacggc 60
cttggagcta attacaaact acgacgacat aagttcgaac acctagctga cactggatgt 120
cacaaagcaa ggtcagattg ggtaaaatac attggccctc ttactgaatt cggaggctgc 180
aatcacatca acgggaattt ctctgctgta gtgttgccat tgtgcagacc tgaccgcctg 240
gagcttatag catatgtact cgaatgtaag tcaaagaaag caattggtag ggttctaacg 300
ctaacaataa agtcgcattt cttcatgatt ccgttctcga gtcagaaaac acgtctccgg 360
tatgttatgg cagatctagc agcctaggtt ccggttctgc taataatggt tgcaggaatc 420
cgaagtgcaa gccgaggctg gtctacgcct cttatatgaa cgatgcataa gtcgactctt 480
gcagacagac gaagtatgcg ccaaaaagat tgcaaagacg tggaaagacg cgatcaacac 540
aactacaaag gataagaacg tggacttcca atctatagaa gactacttgg agtttcgcat 600
gattgatact ggtgcaccgt acgtttaaga tgcttctaga tggctgctaa aaatcgacta 660
atattagaaa ctaggttcgt cgaggccctc atgctttttg gattgggcat gtcgctttca 720
ccgcaagaag atgatgctct tggtcacgtt attcggccat gtttcgccgc tttggcgttg 780
acgaacgact acttttcgtt tgatcgagag atagaagaag tcgatacttc tactcttatc 840
aactcggttg ccatagtaat gcgaattcag agtctggaca ttcccaccgc caagacaatt 900
atcaatgaga ctatacagaa gtacgagcga gagttcctcc gacgcattga tgagtacaaa 960
cagcacaaag gaccaatctc taacaagatt gaacaataca tggaagctat gacttatcag 1020
atcagtggga atttagtatg gagtctgaat tgtcctagat ataatcctga ctatcggtac 1080
ggactggagg cttgtcagca cgagggttga 1110
<210> 6
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaaacaat cagctctcag tcaaagcgcg atagtcaagg ctcttcgggg ccagacacta 60
cgaattccaa atctccacaa tctattccgc tcatggcctg aacatcaacc caaactgaac 120
cgccatcatg agcacgttaa accactagtc gatcaagcgg tcgatcgcat ggcactaaaa 180
tacccgctca tcatacgtcg caagaaagac gatattgcca agttcgcctg cttatggtat 240
ccccaggccc gtaagcggga gatggaggca ctggcgctct actcgacgtg gctggtgtgc 300
tgggatgacg ctgtcgatgc taacgagggt gatctggcgg gtgatttctc aagcgcggag 360
cgttggagac ggcagacttt gggcatggtt tgtgaggctt tggccgttga cggaatgtgt 420
gcacgtggat cagacggtga tccgattaac gacgtatttc aagatttcgg ctcgaggatc 480
tgcgagacgg cgtcgaggga tcagcggcgg gtcttacatg atgagataca gctatttact 540
gctagctgtg cagctgagca ggaattgcgc ctggctggtc gcgtgccgga ctacgagtcg 600
tatatgaagc tcaggattgg caccgtcggt ggcaggatgc tttgcagtct tgtcccgtat 660
gctacgcagg agagactacc gcaagcagtc ctttcgagcc ccgaggtaca tcagctgtgg 720
acacaagtgt gtattctgct gagcttgttg aacgatgtgt tatcgttgaa gaaggagttg 780
cagacagatt gtgtcattaa tgctgttgct gcaatgatgg agccaagcac gacgttggat 840
atggcgattg ccgagttgga agtaagaatg agaacagcag tcgaggagtt taacaatgct 900
gcgagcaaat tgatcaagga tacggaagcg gaaagagaaa tacggtctct tgttgagaaa 960
tacgttgagg gatgtcgctg tattgtcact ggtactctcg agtttacgtc tgtatgcccc 1020
tag 1023
<210> 7
<211> 1657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggtccctt ccatcatcac accgccgcct agctgcgcag gtggccccat cagcccatcc 60
agcatctgct cagaccatgt tgatattcct gagctggctg atggccgatg gattaggttg 120
cccgaggctt tgttttcgtc catcatggct gtcgaaccgg atgtcaaccc catgtacaaa 180
acatcaaaag ccttgtcaga tgcttggcta aaggagtaag ataaccgtgc attggtccca 240
tatgatagct gacagaatgt cgtacagtgc actgcgaatg aacgacaaga ctgcaagcat 300
ctggagccga ctggatattg cttacatgag cgccatctgt gcccccaacg ccgatctgga 360
aacgctcaag ctaatgaacg actggaatgg atgggttttc gcattcgacg accgtaagtt 420
atagccttga ccactattgt tatgaaccaa caaacacgcc ccccataaag tcaagccacc 480
atcgggccgc gccgtccgtc catgcatgca tgcataaaaa gtggtgacaa gaatatccgc 540
taacaaccaa cagcttttga cgaagggtcc ttcgccaaca atcccatcaa ggcagccgaa 600
gaggtgattt acactctcgc tacacttgac aacatccacc ccgtcgtatc tcccgaccag 660
aaccccctgc gccataccct gcaatcatgc tggaaccgtt tcagacagcg agcgagtccc 720
gccctacagt accgatggaa gaagcacctc accatgtact gtatcggtgt tttgcagcag 780
gttggcgtcc agaacaccgc gtcgagactg agcgttgagg aatacatgga tatgagagcc 840
ggatgcgtcg gggcgtatcc ctgtatcgga cttatggagt aggttcattt catttcatcc 900
atcccctttc tttccctatc gtgattctct tcacggatac tttgaggccg caaacgtcta 960
gaagcattct gctttcgggt aagcccttcc ggcaatgcca gggctaaggg ttgtcttcac 1020
ccctttgtgg tcctagcggc ggtttgtctt ggctgatgag atttgcaccc attggctgcc 1080
acccgggaat gtttcataat taattacgag gacacgtcaa ctgactcagt aattgcaggt 1140
tcgccgaggg aattgacttg ccgcaagacg tcatggatca tccttctctt gaagccatct 1200
cacgaatcac atgcgattta gttactctgt aagacacatt ccgtgatatt gtctgattta 1260
gacttttgct aacttcgggc aggcaaaacg acctttgctc ttaccgcaaa gatctcatcc 1320
aaggcgaaga cagtaacatt atgttcatcc tcagggacca gggtatgacg gaccaggaag 1380
ccgccgacga gatcggcgag atgctgtacg actgctacag aagatggcac actgccatgg 1440
caaaccttcc gttttggggc gagggtgttg atcgagacgt gatcaagttt gtcaacggat 1500
gcaggaatat tgctcttggc aatctgcatt ggaggtgtgt attttttcta ccacgtacga 1560
tttacagttc actaacggtc gcagtctgta tacattcagg tacctgggcg acgagggtcc 1620
tcaagtcaag aagactcgaa tgatgaggct tccttga 1657
<210> 8
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtcgtcgc ccatcatgag tccattgagt ccattgagcc caacaggctc caaggcaaac 60
atcttcagga atagggttcc aactcagttg cggcgatgca ttcccttgta catcgcttgc 120
gtttgcctca tcctcctgat tctcaacgtc gacatgatcg gttcagtccc caagccggtt 180
cacctgtcga agcgcagtgg cacaaggtca acacgaggct tccccaagaa gatttggcaa 240
agttggaaag ttgcgccctt ctctttcgag ggcgagcaga ttctcacagc cagaacatgg 300
acggacaaga accccggctt ccgttatgaa gtcctcaccg acactaacga catggagtat 360
gtcgaggagc actacggccc tgaaggcttc gatcgcccag acattgtcga catgtaccgc 420
catgtcaacg cgactattat caaggcggac ttactgcggt atatgatcat gtacgcggag 480
ggtggcgtct acgccgacat tgacgtcgag gatctccgtc ctgtggccag atggatcccg 540
gagagataca aggaggagga tcttgacctg gtcatcggtg tcgagattga tcagcctcat 600
ttcaaggacc acccaattct cggcaagaag tcaatgtcgt tctgccaatg gactttcatg 660
tctcgccctc gtcatccagt catgctgaag ctggtcgaga acatcatggc atggcttact 720
gacgtcgcca agacgcaagg agtctctatc tccgagatca agctcgactt tgacgaggtc 780
atcagcggta ccgggccttc tgctttcacc aaggcagttc tggaggtcat gtcttcaaga 840
tctcgtcaag gacccattac atgggacacc ttccacgaca tcgacgagtc taaggtggtc 900
agcggcatcc tggtccggga tgtcgagtcc ttcgccgccg gccaaggcca ctccgactcc 960
ggcaaccaca actccagggg tgcgcttgtc aagcatcatt accacgcatc gaactggccc 1020
agccgccacc cgcgcttcag gcatcctatc tttggcgagg tcgaacgctg taactggaac 1080
atcgagtgcg tcatgaaatg ggatcaagac atcgccgcct tcaacgctct ctctcctgaa 1140
gaacagaagc agaaggttga ggagcacgag aacctacaaa agttccagca gaagcagagc 1200
gagcaaaagc cgatcgagca gccgctacag ttccctccgc aacaggctct tcaaccaccc 1260
gcgaagcaag aggaactgaa gttgaagtga 1290
<210> 9
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtcttcga atgcgagcga gtatggggtt tcgtcccctc ttgagcacgt tcctggatct 60
ccggatacct cgagcacgcc cccttcatca gatgacgaag ctatctctcc caacctctcc 120
ctcctgaagg ggcgtgtcaa ttcggcacgc aaatccgtgc gcattccgga tttgtgctca 180
tcgatcctct caactgaacc tgttgtcaac gccaactacg aaaaggtcaa gcttgaggca 240
gacaattgga tcaaggagtg agccaaaccc tgcctaccct ctgcagatgc ctcaaactaa 300
gatgttgtgt agggtgtttc aatttgatga gaccgcagcg aagaagaacg tcaaagctga 360
ttttgctttg atgtgcgcgc tttcggctcc ctatgccgac gaagaggccc ttcgcatgat 420
ggtcgactgg cacaactggg taagtaatag tacgatcaca atgcgcttca tgtagaactg 480
accctgactg cttaaatagg tatttatttt tgatgatcgt atgtactctt caacgtgact 540
gcctctcggc acgactgaca ccatgtagaa tttgatgagg gtcatctgaa aaacgaccca 600
gtcaaggcca aggaagagtt ggatgctcac tggtctatcc tggaggaccg aaacccgcca 660
gtgcaacttc atgagaaccc tatcagatat gtctttcaga cgacctggga ccgtgtgaag 720
aaggtaagtg gcttcccggg tcgactttac actcttattg tcactgagct aacaaattaa 780
cagagatcat cggccggtat gatgaaatga tgttgaacac agcctgtttc tttcactgat 840
acgcttccta gatttgcaag agcattggaa agtttctcac aagatgtact ttgatgggct 900
tctcggccag gtgaaggtgg cacattcgca gtccgccttc acgctcacag ttgatgaata 960
catgaacttc cgacgggcta cgattggaac agagccatca tttgccctgg tagagtaaga 1020
ggcactccga tctttccttc ataagtctac taacatgctg ttgtgaaggt acgctcatgg 1080
catcaacatc tcacaaaagt accttagcca tccgtctgtg cgagaatgtg agcgagtctc 1140
ggctgatctt gttatcttgt aagtaactta tacttgatca atacctgcaa tatcactaac 1200
caccatacag tgtcaatgac atcctgtcgt atcgcaaaga tttggtcagt tttccgtcct 1260
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acctcatctt gctgcttagg gcccaaggct ttagtgaaca agaagccatt gaccagattg 1380
gtgatatgat actggagtgc tatcgttcgt ggtatcgtgc tttggcggag ttgccagttt 1440
ggggggaaag ggtggacaag gaggtgctca gatacatcga ggcctgccgt actattgctc 1500
ttggcaacct ccatttcacg taagcggcgt acacaaaatg ctttcttttg gggcctcact 1560
aacctctctg ctaggtacac gagcgagcga tacctcggcc atgaaggagc tcaaattcgt 1620
gagactcgca tcatgtcgct tcccgcctag 1650
<210> 10
<211> 1754
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgggctcac tggtttccga agcccaggaa atcctggagg cacttcgtgg ggaggttctt 60
cacgtccctg acctgcgtga aattttcaag aattggccgg tggaagcgaa caccaactac 120
aaggaaatca tacctgttgt cgaggccgca tttgatcggt tggttgtctt tctatgaaga 180
aaagagaaaa aacaatcact aataattgtt taaacagatt ggtccggaac ccaggacttc 240
gagagaaata ccgaaaggcc aattacgcca gattcgtgag cttgttagtg tcaccaccca 300
ttccacagac tcaacaactg ctgaatgagg tgactttcga aagatattac ccacatccag 360
actggaacca aatccagact cttgcgctct atatcgtctg gctcttctgt tgggatgatg 420
ctattgacca gcagggtagt gacctgagtg ccaatctggc gagagcaaag acccatcgca 480
acgacactat ccgcgtactc aacaaagcct tgggtcttag caccacaagc aataactctt 540
acaatatcac gtgcgatcat gtgaatgctg agttgattac tattggagca gagctgtgca 600
aggcctacaa ctttggtggg agaattcatc ctccttttgg gacgctctat gctgaccaag 660
acatagaaca aaggcaaact ttcatgaacc agatgcgccg ctacattgag aactgtgata 720
aagagcagag ttttcgtctg cgcggtactc ttcctagcat ggaggcttac aaagagttgc 780
gccatggaac ggcggcagtc tggaccctct gcgccctaat tgagtacggc ctgggagaga 840
gcatccctga gcacattcgc tgcatggccg aattgcagac cctctggtta gagacaagca 900
gaggtatttg gatgtaagta ggccttcata cccatgcaga gaagaaagac ggaggagaaa 960
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ctcgatcctg cctatttata agccatcctt tccaacttac cgctccccgc cgccgtcccc 1080
ttcctttccc tccttcgaat tatccgccct tctaccccat caacggccac tagccgcctc 1140
gaagtctctg atgccatgta cttcccctcc tcctactcat ctccctacac ctgccagaag 1200
catcgagtca gccgatgaaa ccaacttcgg tatcaagtcc taagaccttg tgcgatatca 1260
cctacctctc tggcttgtgt atgcgccttt actacatcct tatataccgt cgaccctctg 1320
caccttcccg cgtctcacct cccgcacact gaagcgatca ctacttttgt gaaaagctca 1380
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catcctcatg gtggaggagg gaaaatcgcc acagcaagcg gtagacgccc tcctagccga 1500
cctcaccgtc tccgtcacca cctttgaagg cgctgcgaac actcttgcgg aggcggcggg 1560
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atagcttcga gtccacgagg tacaagctag gggcatgcat gaacgcggac ggatcgttgg 1740
acatctcgct gtaa 1754
<210> 11
<211> 2253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggatcata tttgggaata ttctgtcgac atcgacgctg aggtggcggc gtctactggt 60
tgcttcacaa cactaccaat tcgtattcat catagaaatg atcttgcaga tgacgccacc 120
aaacagtcaa ttttggactg gggtgcctat attggtgacg gttgggagca caagtctggt 180
tcatcatgga gtcccgttgg aaactggggg gctttcatct ttccagagtc tctccctgaa 240
cgtttgggag tcatcacata cttggctaac atgggaaaca tccacgacgg ttagtctgtg 300
ctacttcaag tttccgcatc gccaattctg atcagtcatt cacagatttg tgtgacgaac 360
ttccttatga ggaagctctc aaagagcaca agagccttag tcaggccatg gaaataagcg 420
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gcggctgagt cggcccttgt gctgacgaac gactattgga gttgggaccg ggagtggcgc 840
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<210> 12
<211> 4223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcagcac ccttatgcca gtcacaggac gtcgagatga attcagcctg tggcaatgcc 60
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cgctgctgcg gaggagatca gtcaaaacat agccatcatg ggcggcgatg cgcctcacta 720
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caagatcact gactgctgaa aataagattc tctgtcgatg tattgctgta tggagctaca 2580
acttatggtt tcatcctctg gcgaaatttc caggaccaac tttaggccga tgttccctgg 2640
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agctataccg gttcttccac agttctcggg gcagaattca cattgcagtt gaacaagccc 2760
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acatatttta ccaggcaata tagtccgcat ctcgccaaat gagctctcgt ttgccagtgc 2880
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acctttctat gacgtccttg ctgccggctt cagcagcaga tgcatcggaa gcgagcgtga 3000
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gagactgcct aggacgaaag taa 4223
<210> 13
<211> 1076
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgattttcg agtactcgaa agaagtcgag gaaggcacct atgacaccca tggactcgac 60
tgcggcatta ccctccgcca acataagcag cagttcagag aaattgatgg tgctcttcgt 120
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<210> 14
<211> 2381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggcttcaa caatgatgaa ctaccaagac tgcgggccga tgcgatacaa gtcctcggtt 60
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agtggaaggg catcgtgagt gttcgtggac aagatgcctt catggaacac aagacactgg 720
actcgtacat gcacgtgcgg cactacgatg ccggagccta ctcggtttgg tcgcaaatcc 780
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acttgggcat tctcactcct gtctcaagtc gtctgagcac aaaacgactc aggccattct 1320
ggaataacca gcgaactgaa tatactacca tgacgcctgc cgagaccagt tccgatgaca 1380
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aggaggaaca aggcgaagtc cagctgcaca gtattcttca aagcgcacgg gcagcgcgtt 2160
ctgcttcggc atcttcgaat aatgatggga agttgtcggt cgagacgaaa ctgctgattc 2220
gggagatgct ggaggaggca ggcagcctgg aacatacaag ggtggtaatt cgaggcttgt 2280
atgacgagac gagagccgtg ttgaccgcga tggagaacga agctgggtcg ggtggcaaga 2340
attggatgtt acatttgatt actttccagt tgaaagtata a 2381
<210> 15
<211> 1699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgcgggaca aggtcctgaa cccgtggatt gaacggttag tggaaatact caattggtgt 60
cattgattag ttcgagccct aaccaatttc aagatgggta gttaacccga gcactgcccg 120
agcactgcag gcggccgatt ttggtgtttt tgctgcggtc tgggggccag acgctccgtt 180
tgacgtcctc tgcacagcag ccaagtattt cgcttgggtt tgtctcctat aggttctctt 240
tatatactca gtttgacaac cgggatctta gtatttcgtg tacgatgata gtatgttttt 300
ctgggtttgg ctttttttag cattttggct ttgcactaag aggctttcat gtcaaccagt 360
ttttgattgt ggggctctaa agcatgatga aatcggcgct tgcaaataca gggaagcaag 420
tcttcagtat ttcaagttta ccctccttgg tgaaggtgat ggacctgatt taactacttt 480
tgatattgac cagcggaacg gattgcaatg ctgggatgag gtcggtcagc acattcgtca 540
agtctgctct agatgtatga atattttgca accatcccgt ggaattgtct cttcgatcat 600
tgtactgacc gttcgaataa agcaactcgc gaaatcttat gtgacgagat gctgcggtac 660
atcggtagcc tcaacagaat cgatagcatc ttcatgaatt gtgacattcc ctcagttgac 720
aaatactggg aaaggcgtga agctacagct gctgcttact gtgtcattgc gacactcccg 780
tatgaaggtg aacttgaatc atttttgcgg agaaatacta actgtctaag gtttatctat 840
ggggtcgaca ttgataggtc gagtgtggaa agccagttta tgaaggactt atggaggcat 900
acttcctatt ttgtgcacat gtgagtatca tgcaatcagt cccctaatta atcactttag 960
catgttttcc aactctcatc tagcacaaat gacatgctct cggtgcggaa ggaactggtt 1020
tgtgttcatt tgttatgcca aggaaaaaca agggctaata taggtcagag tgagggccag 1080
ttcgagaact tgatccctgt gttaatgctg aataaaatca ttgactgcaa cgcagcaatg 1140
tatcaaagct atcaattgct tcacaatgaa gcaatgggat tccgccagac aaaacgatac 1200
ttacttaaga accagagttc gaagatcgtc tcagagatgt tcaccgaagg gtgtctgaat 1260
gttgcaatgg gccttgctca ctggaggtaa actacattga tcattatact tccgtgaaaa 1320
ttactaaacc tttcttttga agttattctg gaaatcgata cttcaactcc tgggagatga 1380
acaacgaaaa ggagataagc ttcactgtta agctgccctc gccaaatcca aagcctatcg 1440
gccaagccaa acgattcgaa acgctaaaat actacgctct attattgcac tctcgctctc 1500
cgcacgcgct gctaagtgtt cttcggttta gtcctttgat agcgttgatt gttatttcta 1560
tggctcctcg agtgggaacg ttatttcctt cgttccgggg caccgctcga gtagtcaaag 1620
ggttctacag tacggcaatc gacaattaat ctcatttttt catgcttatc taacctgcac 1680
aggctttatc ttccagtaa 1699
<210> 16
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgtcctccc aagccgccat catcgccgct ctcaagggcc aaaccctccg cattcccaac 60
ctcacagctt tcttccaagc ctggcccccc caaaccctca acgagcacta ccaagactcc 120
gtcactctca ccacaaacac catcctcaag atcgccgcta gagcgcccca tctgcaaatt 180
gagcgccgtc tgcgtgatga tattgcctta ctagcatgcc tatggtacac cgatacgccc 240
aaattgcgtc tcgaggccct ggtgttgtac gtggtatggg tcgtatgttg ggatgacact 300
gtcgacacag tcgaaggcga cctggcggca gatttcgacc gtgccgagca gtggcgcgag 360
agaacgttgg caattgcaaa ggctgcgttg aatctgcccg gaacagctcc agacggcgag 420
gtcgacgcca tcaacgccgt gctggtcgac tttgggcggc ggtacgcaga ggaggcaccg 480
ctccatgagc gccagcgcat gtacgatgag cttgccacct acattcacgc ctgctcaacg 540
gaacagaaga tgcgcctcag cgagactgtg cctggctttg acgagtacat ggcgctccgg 600
gagggcacaa tcgccggcgg cacgttcctc gccctggttc cttatgccat gaaccaagac 660
gtgccgccgg agatgatcaa ctcaccacac atccccgtcc ttcagaagca gatcagcgtg 720
ctggcaagct tcgtcaacga cctgctatca ctcaagaagg agcttcattc cggctgcgcc 780
atcaacgtcg tgtgtacgct tcttactctg gacacgacgt tggacgaggt tatggcgcag 840
ttgctccaga agttcaagga cgcagtccgg cagttcgacg aggcagcagg ggaattcatc 900
ggccagtacg cgcacgacga caatcttcaa agtgtagcac aagagctagt caacgggtac 960
agacgtatag tcactggtat actggaattc tcttaagtat ctcacaattc cctgaaccgt 1020
gggacctttt gatattaccc tagcagtact acctagtaga tatcttggat tcgtagtagt 1080
acgcggtata agctaacctc tctggaaaac aggctcaaat cccctcgcta taaactcgcg 1140
cagctcctgc gcgaagatgg atcactagaa atagtcctct ga 1182
<210> 17
<211> 1090
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggagtatc gttactcaga gatcatcgac ccaagtgtct atgaaacaca tgggttggcc 60
aacggcatcg ctcttcgcgg gcacaaagag cctatgaagg agatccgtgg agcacgtcga 120
gcccaaatcg attggtctac tcacgtaaaa cctctcgccg attataaggg tggactcggc 180
caacggttca gcttcatgca ggtaactgtc ccagaatgtc tgccggagag gcttgagatc 240
atctcgtatg caaacgaata tgcgttcatc tatgatggtg aaaccccatc catacacaat 300
ttggtagacc cttaatgatc taactctttg ttcagacgag atggaaactc tggatcttga 360
gaatgtctca gccacatcgc ccgggatgct cgaggcattc ggaaaaggcg ctttagacag 420
caagacagat agcaaatcac gtcccgaaaa gcgactgcag gcacagatat tgaaagagat 480
gattgccatc gaccctcaac gggccatcac gtctatgaaa gcctgggcca ggtttgtcca 540
gttggcatct cagacaagag aatcgccatt ccggacattg gcagagtacg tccccgcaag 600
ggtgattgat gctggcgagc tgtgagtatt tatcagtctt aaaggcatct ttgactatta 660
cagcagcgct aacgtagtgt tgaggatctg gttcggtacg ttgacgtttg gcatggccct 720
cactattccg gacgaagagt acgagctctg catggaattg gcccgccctg gatacgctgt 780
cttgggactc accaatgacc tatactcgtg ggagaaggag aggcaagcgg ctgagaaagc 840
aggccaggac tatgtcttca acgccatctg ggtcattatg aacgagcagc aggtgagcga 900
ggatgaagct aaagccatct gcgcagaaga gatccagcga tatgccacca tcttctgtcg 960
caacgtcgat gagacaaaga ggaacctggc gctctccagg gatcttcggg cgtacatcga 1020
ggctgtcatg tacagttgca gcggcaatct cgtttggagc atttactgcc cccgatacca 1080
tgaattttag 1090
<210> 18
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggcgccca gcagatacga ccttggagct aacgagctcg cctctatgtt gagtggtagc 60
actcttccca ttcccaactt gaaagtcccc ctagcgaatt ttcccaaagg tgtcaacaag 120
tatatgcatg agattcgaca atgggtggat agacttatcg acgagttagt agattatttt 180
catcctgggc aatcatcaat gctgaccagt gtaggaatat tcttgataga agaaaacgtg 240
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cgttccttga attcaactaa ccaccctcgg gtagttgcta cccttattca gaatgggaag 360
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atggagaaga cgatactggc gtcatctcaa atgcagacct agcacgggta ttttgcgaac 480
aatcactgga tcacatcaaa ctcaaattgg aactggatga ttctcagcaa agaacagccc 540
caacccagcc tctatccagc atggccatgt ttgaccatgt ggctaaaccg ttaacggcgg 600
catggaacca cagttcgtat tcactcttac atcgcaatct accaggattt tggctttaat 660
gaatactaat gagagactta tagcacggaa acaacgttta tataatgaaa ttgaacatta 720
tgtgaattgc tgcttggttg agcatattca gcaagaggat gattctatcc ctacccaaga 780
agaatttacc ataatgcggt tcggtacatc aggcatcacc cccggaatcg ctatatgcga 840
gtaagtactg gtcttttgtt gggctgttga ggcagtcagt attaatgtat atcaggttca 900
ctaggaatgt gtcattacca gatgaaattg tcgaatcagc ccccatgaag gtgatttgga 960
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acagtcaccc aagaattcat gcacatattt cagacttcag taaacacctt tgaagaggct 1260
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gaaaatccgc agagtcagaa attggctgca gttgaggctt ag 1482
<210> 19
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggatcaac tcaggagtct cgtctttttt ttacgtgatg ttgctttgaa gcacacactt 60
ggcactagcc ataccaagaa tgataccacc gagatatttg atgaacgtaa agaagtcata 120
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catttactat cctcactgca agaaggacaa gatgctggtg ctttcacagt ttctttactg 420
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cgagatcttc gaaagggtct tggacctgtt tcaactgaac gtctcaggaa ggagctgcat 780
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ccttgggatc acttccagat gcgagcggac gacgtcggtc tgtattcaaa attcgcatgc 900
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<210> 20
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgacccttg cctacagtcc cacttacatg acaactcgca gtgaggctgg atactaccag 60
cccggtgagc ttgttgacag caaccacaaa actgcgagtg actcggggac aagtttgagc 120
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acttgccatc aatatctggt ttcaagtcaa cgaagaagat ttgctccaga tcagacatat 480
aattagcctg ttacacaatg catctcttat tctggatgat gtagaggatg gatcaacctc 540
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tgggtatcaa atcaataaag caataatgga ggttttgaaa cttgggagct cagaatgtct 660
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aatatgcttg ttcgactgat ggctgctaaa acccaaacaa ctccaccggt tactcccgat 960
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<210> 21
<211> 1483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgtcactct acgggctcgt ttcttttgct tataactcac ttggtcttgg aggcccacag 60
ctatccaagg caaggtcgat ttatgttccc gatcttttcg ccggtatatt gtcgggagag 120
cctgagagaa acccgtacga ggcagaagtc agcgctaagt ctgaagcatg gacgaaagag 180
tcagtgatac ccatattgtc taccacacta atacttactt tgggaaagat tggtgaagat 240
ggacgcgcga acagccaaaa tattgaccaa ggcaaatttt gcatacctga taagcttgtc 300
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tgacgaccgt aagtttcatc ttaaaaaaac actgaaaaaa aagcactgga tatcaatact 480
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atccactaca atacattttc caaaccactt ggcatcggtt acaagaagtg agcggtattc 660
ggatatccaa attacttggc acagtataga gggctaacta tttcatgaaa gagaaaccct 720
tcacaaggtc ttcagcagcg gtggaagtat actcacaaaa ggtgcctata tgctattctc 780
aagcaagttg atgtcacgca aagaaatctt ttagttgata tcgaccttga tgaatacata 840
gaaacaagac ggcattctat cggtagttat tgtttattta ccgtcgtgga gtaagtgcct 900
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gaattaaagc accgcaagaa gccatggaac acccgtctgt acttacgtgc gaacgcgcag 1020
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agggaagaag atgcgtgaaa cgcgtatcat ggacattaat tag 1483
<210> 22
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgagtgaagt tccggtcgga gcaatcaggg tcggttggag tatatcagaa atgtatatct 60
ttggaaaggg tagttataat atgtcgaata tgaatttagg taagagtatt tgaaacaaca 120
agtatgagga tggttcactg gatggcttgc cctaacatcc acaccatcgc atccggccac 180
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agtatgagat acttgcagaa cgccgagtgg cgttatcaac cgcgtgacct attcagtacc 300
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tcgcgtgtcc agagtgttgc tacagcatgg tctggattcc aatccacgca gcagatatct 540
cttttacgca gtaactattc gatagccatt tccgttcaga tcagccgtcg gatccgagga 600
gcgacgacat caatgcgtgt tattagtcaa attttggagg ggttgcgtgc ccactgcagg 660
cagatgtagc cgtggcacca caacaccggc cagccctgga ttgggtggtg gaaccaagat 720
atgagaacca gtatctattg gcacggaggc gtttccggag cctgccgcgt gtgatacgtg 780
cagagtcaat tcctacggac tgtctggggt aggatcacaa ctaatcagtt gcagcgatgg 840
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cagtgcatga cgtcttccat caatccatca ccccagactg aatcctcaca ttaatttaac 1320
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cagttgattg ttcactcatc gactttatca atcttccatt gaccattcca ggcttgtcgc 1440
ccactcatat aatcttcttt ccccggtctc acatcaatca cccttcacac cacaacacc 1499
<210> 23
<211> 604
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcatggtgtt ttgatcattt taaattttta tatggcgggt ggtgggcaac tcgcttgcgc 60
gggcaactcg cttaccgatt acgttagggc tgatatttac gtaaaaatcg tcaagggatg 120
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acgctgatca cgggcagcga tccaaccaac accctccaga gtgactaggg gcggaaattt 360
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tgcaatttaa actcttctgc gaatcgcttg gattccccgc ccctggccgt agagcttaaa 480
gtatgtccct tgtcgatgcg atgtatcaca acatataaat actagcaagg gatgccatgc 540
ttggaggata gcaaccgaca acatcacatc aagctctccc ttctctgaac aataaacccc 600
acag 604
<210> 24
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggatccgaac tccaaccggg gggagtatat tgagtggccg cagtggaagg aatcgcggca 60
gttgatgaat ttcggagcga acgacgccag tctccttacg gatgatttcc gcaacgggac 120
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tccggacggt caggaactta gccttatgag attaatgatg gacgtgtctg gcctcggaaa 240
aggatatatg gggatcataa tagtactagc catattaatg aagggtatat accacgcgtt 300
ggacctgcgt tatagcttcc cgttagttat agtaccatcg ttataccagc caatcaagtc 360
accacgcacg accggggacg gcgaatcccc gggaattgaa agaaattgca tcccaggcca 420
gtgaggccag cgattggcca catctccaag gcacagggcc attctgcagc gctggtggat 480
tcatcgcaat ttcccccggc ccggcccgac accgctatag gctggttctc ccacaccatc 540
ggagattcgt cgcctaatgt ctcgtccgtt cacaagctga agagcttgaa gtggcgagat 600
gcctctgcag gaattcaagc tagatgctaa gcgatattgc atggcaattt gtgttgatgc 660
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<210> 25
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgtattggt attaccagaa cgtcacgaga ccgcctgccg caatgttctc atcctttctt 60
tgctactagc aagttttttc gcaatttctc gaagctttag atggtctttt cttttccagt 120
cgaaagctac tagccggtct tttctgtcct attcagctta ggcagttata ggatatcttc 180
aagattcagg tactctttga ctacacacaa tgccctatga tatgaagggt aaatgtgtgg 240
gtatcattca ttggatctta agtaaggcac agcccgcgga gcagaaatga agctccttgt 300
atgacatcac caaatggtca cttaatgcaa tttcgaaccc tttccatccg agctcaagtt 360
cgagagctca gttcccattt tactcatctt ttttacttag aagagggata taatctaata 420
acaaactgat ttaaatgaac acagagctat tactttcaaa tttggcttaa tgtccacttc 480
tcgccaccca acggtcctat ggggtagtgg ttatcccacc ggattttgat gaacaatata 540
catgtcctgt atatgtgtag gaagatc 567
<210> 26
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatctgtagt agctcgtgaa gggtggagag tatatgatgg tactgctatt caatctggca 60
ttggacagtg agtttgagtt tgatgtacag ttggagtcgt tactgctgtc atccccttat 120
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cc 182
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
actagacggg ttcgcatagg tttggggttg tatcttggcg ttgggacgga ctgggtatgg 60
tgtttctttt ggatatatga catgatatgt acacggccgt gaatctttaa ctttatatca 120
ttatagaaat gcacttgcac atttcaacac gctgcgagca gaatctcgaa gattgttccg 180
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gaaaacaagg cggccactgt agactagag 269
<210> 28
<211> 8546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tggggatcct ctagactgat gatgcagtgg ttcgttcaca ttctgctctt gaagattgga 60
gtcgctaaaa tgaataggag ttgagctctt gcttcgggtg tggtggcggg cgcgtgagcc 120
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gtaggaagtt ctagtggggt tgtcaatagc ctcatttcgc ggggtgaaat aatcctgtgg 240
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tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 1080
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 1140
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1200
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 1260
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 1320
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 1380
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 1440
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 1500
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 1560
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 1620
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 1680
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 1740
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 1800
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 1860
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 1920
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 1980
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 2040
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 2100
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg ttcaattcat catttttttt 2160
ttattctttt ttttgatttc ggtttccttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca 2220
gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt 2280
tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag 2340
gaaacgaaga taaatcatgt cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag 2400
tcctgttgct gccaagctat ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc 2460
attggatgtt cgtaccacca aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat 2520
ttgtttacta aaaacacatg tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa 2580
gccgctaaag gcattatccg ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc 2640
tgacattggt aatacagtca aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg 2700
ggcagacatt acgaatgcac acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca 2760
ggcggcagaa gaagtaacaa aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg 2820
caagggctcc ctatctactg gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga 2880
caaagatttt gttatcggct ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta 2940
cgattggttg attatgacac ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca 3000
acagtataga accgtggatg atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag 3060
aggactattt gcaaagggaa gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg 3120
ctgggaagca tatttgagaa gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa 3180
tgcatgtata ctaaactcac aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccgt 3240
aacttacacg cgcctcgtat cttttaatga tggaataatt tgggaattta ctctgtgttt 3300
atttattttt atgttttgta tttggatttt agaaagtaaa taaagaaggt agaagagtta 3360
cggaatgaag aaaaaaaaat aaacaaaggt ttaaaaaatt tcaacaaaaa gcgtacttta 3420
catatatatt tattagacaa gaaaagcaga ttaaatagat atacattcga ttaacgataa 3480
gtaaaatgta aaatcacagg attttcgtgt gtggtcttct acacagacaa gatgaaacaa 3540
ttcggcatta atacctgaga gcaggaagag caagataaaa ggtagtattt gttggcgatc 3600
cccctagagt cttttacatc ttcggaaaac aaaaactatt ttttctttaa tttctttttt 3660
tactttctat ttttaattta tatatttata ttaaaaaatt taaattataa ttatttttat 3720
agcacgtgat gaattcgtaa tcatgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 3780
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 3840
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 3900
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 3960
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 4020
accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 4080
gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc 4140
ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 4200
actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 4260
cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 4320
ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 4380
agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 4440
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt tgctttgacg 4500
tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc 4560
gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg 4620
ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 4680
ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aactagtccg 4740
tcatgtccag gaagataggt cagttgattg gggatctagt gcaacaagga tcgttgaagg 4800
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actctaaagg attggagacg attaaacaca tcgaagcagg gccgcatgcg gaagattatc 4920
atcgtctacc tcgtggtacc aagattcgca caatcgatcc tgatctgctc ctcccgggtg 4980
ctgggcaacc ctccccactg tcttttgtga aacctgaatg ggctaaggag agacaagact 5040
tcattcaggc tcgccaggcc ttgtttatag actagcatct tttactgtct acatcaacgg 5100
cggcgtgagc tgggaacaag atagtattca gccacaattc gagaacaatg tatcacttta 5160
agcttaattt ataaatagac catattcact tctcacaaaa aatgcctctt ttcaccagta 5220
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ctttcctctt catactccca attctacaga atcccatcat gtctgaagct ctgacaaaca 5400
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atccccgagt cgttgcgtcc cgtcctccag aacagaagca tgcaggtgcg caagctgaag 5760
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aagaaatccg gcaccgtgca cgggatcaag gtcgccgagg gtctgaggga gagcgaggcc 5880
ttccctgatg gtcctattta cactcccagt accaaggcgg agcagggcga gcatgatgag 5940
aacattcatc cggatcaggg tatgttctat ctatatctcc gtttcttccc gggttccgat 6000
ttcggaggca gtggttgatt tgccttgttt aattctcttt tctcttctct ctttttttta 6060
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tggtgaacgt tatgcctcta agatcgcctc tcttgcggtt cagctttaca aggtcgctca 6180
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tcctgagact gacgaggttg tgctggccga cgaggtcctc acccccgatt catcgcgttt 6300
ctggcctaag gactcgtacg agatcggtcg tggacagcag agcttcgata agcagttctt 6360
gcgtgactgg ttgacgagcg agggactgaa gggcaagcct ggtgtgcgga tgaccgatga 6420
gattgcgcag aagaccagcg ctaagtaccg ggaggcatat gagcggatca ctggtgagac 6480
taaggttcct gcggtctagt cagggaggtg gtgtatgtca aaatgaaatt gtcgtatata 6540
taacgctcaa ttgtccaatg tctataaatc cgtcttaccc aagtcattgg tcaagatgaa 6600
aactggtata gagacctaaa aatataaatt actatacaaa ttgaacctgg tatccattta 6660
ctgatcccac tcggaacgca acgccttcaa tcccttcttc gctttcggcg cctcctgtgg 6720
actcgtatgc tgttgcgc 6738
Claims (10)
1.一种萜类合酶基因，其特征在于，所述萜类合酶基因包括以下20个基因中的至少一个；
基因1：FgJ01056基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
基因2：FgJ03939基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因3：FgJ03982基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
基因4：FgJ04421基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
基因5：FgJ07623基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
基因6：FgJ09080基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
基因7：FgJ09920基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
基因8：Cgl01792基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
基因9：Cgl02525基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
基因10：Cgl05727基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
基因11：Cgl05950基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
基因12：Cgl10228基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
基因13：Cgl12623基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
基因14：Cgl13742基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
基因15：AF05005基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
基因16：Tvi02670基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
基因17：Tvi03689基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
基因18：Tvi09335基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
基因19：Tvi09626基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
基因20：Tvi11551基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
2.一种含有权利要求1所述萜类合酶基因的表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求1所述的萜类合酶中的一种或多种、启动子和终止子。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述启动子包括PhlyA、PamyB和PglaA中的一种，所述终止子包括TagdA、TamyB和TniaD中的一种。
4.一种萜类合酶基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2和权利要求3任一项所述的表达盒。
5.一种萜类合酶的表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将扩增获得启动子、终止子、线性化载体和权利要求1所述的萜类合酶混匀转入酿酒酵母感受态细胞获得。
6.一种萜类合酶基因的重组微生物菌株，其特征在于，所述重组微生物菌株含有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的一种萜类合酶基因的重组微生物菌株，其特征在于，所述微生物包括米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中的一种。
8.一种萜类化合物的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括：
构建异源合成倍半萜、二萜或者二倍半萜化合物萜类合酶的微生物突变株；
将所述微生物突变株发酵，获得发酵培养物；
将所述发酵培养物萃取、并进行GC-MS检测。
9.一种香叶基香叶基二磷酸合酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
10.一种编码香叶基香叶基二磷酸合酶的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为Tvi11549基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
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