CN110431232B - 用于提取和扩增核酸的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明解决的问题在于提供用于提取/扩增核酸提取对象的核酸的试剂，所述试剂的特征在于简单、快速且高效地从核酸提取对象中提取核酸并且最小化核酸扩增反应的抑制，以及解决的问题在于提供使用所述试剂提取和扩增核酸的方法。通过使用用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的试剂盒来解决所述问题，所述试剂盒包括(i)至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂，(ii)具有碳数为1‑4的羟烷基的γ‑环糊精，和(iii)核酸扩增试剂。

Description

用于提取和扩增核酸的试剂
技术领域
本发明涉及用于简单、快速且高效地提取和扩增核酸的试剂，以及使用该试剂提取和扩增核酸的方法。
背景技术
在传染病的临床检查领域，简单、快速且高灵敏度地检测病原体是非常重要的，并且快速检测试剂盒已广泛普及。使用核酸扩增技术的检测方法已知是用于高灵敏度检测病原体的方法。当通过使用核酸扩增技术的这类检测方法检测病原体时，通常预先进行从含有病原体的样品中提取核酸的操作。在这样的情况下采用的方法已知涉及使用表面活性剂从病原体提取核酸、使用环糊精中和表面活性剂对核酸扩增反应的抑制作用、以及使核酸进行扩增核酸的步骤。
在专利文献1中，将通过用官能团修饰来制备的α、β、γ-环糊精列为用于核酸扩增反应的试剂的组分，并且例示碳数为1-4的羟烷基等作为官能团。专利文献1进一步描述了在文中添加的2-羟丙基-β-环糊精和例如脱氧胆酸钠等表面活性剂共存的情况下进行PCR，然后通过添加环糊精改善DNA聚合酶对抑制作用的抗性。然而，专利文献1并没有具体记载作为环糊精的具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-198029号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供用于提取和扩增核酸的试剂，因此从例如微生物等核酸提取对象中简单、快速且高效地提取核酸，并且最小化核酸扩增反应的抑制。
用于解决问题的方案
作为实现上述目的的深入研究的结果，本发明人完成了本发明。具体地，本发明包括以下实施方案。
<1>一种用于从含有核酸提取对象的样品提取和扩增核酸提取对象的核酸的试剂盒，其包括以下(i)、(ii)和(iii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡(extracellular vesicle)：
(i)至少含有具有甾体类(steroid)骨架的表面活性剂的核酸提取试剂；
(ii)具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精；和
(iii)核酸扩增试剂。
<2>根据<1>所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精。
<3>根据<1>或<2>所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精包含在核酸扩增试剂中。
<4>根据<1>至<3>任一项所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上。
<5>根据<1>至<4>任一项所述的试剂盒，其中核酸提取对象为微生物。
<6>一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的方法，其包括以下步骤(i)、(ii)和(iii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：
(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；
(ii)将(i)中得到的核酸提取物与具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精接触的步骤；和
(iii)核酸扩增步骤，其将(ii)中得到的溶液与核酸扩增试剂接触。
<7>一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：
(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；和
(ii)核酸扩增步骤，其将(i)中得到的核酸提取物与含有具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的核酸扩增试剂接触。
<8>根据<6>或<7>所述的方法，其中核酸提取对象为微生物。
以下将更具体地描述本发明。
在本发明中，术语“具有甾体类骨架的表面活性剂”是指具有甾环(cyclopentanoperhydrophenanthrene)结构以及表面活性作用的化合物。天然存在的具有甾体类骨架的表面活性剂的实例为胆汁酸。胆汁酸是具有胆烷酸骨架的甾体类衍生物，并且通常与甘氨酸或牛磺酸结合以形成缀合的胆汁酸。天然存在的胆汁酸和胆汁酸衍生物的实例可包括胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛黄胆酸、甘氨胆酸及其盐。这样的盐的实例可包括但不特别限于钠盐。此外，本发明中的表面活性剂的实例不仅可包括天然存在的甾体类衍生物和胆汁酸衍生物，还可包括人工合成的具有甾体类骨架或胆烷酸骨架的表面活性剂。本发明中的表面活性剂的特别合适的实例包括胆酸、牛黄胆酸、甘氨胆酸、牛磺熊去氧胆酸及其盐，并且更优选胆酸及其盐，特别是胆酸钠。应注意的是，具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度没有特别限制。当核酸提取自例如微生物等核酸提取对象时，浓度优选0.4(w/w)％以上，更优选1.0(w/w)％以上，并且进一步优选1.5(w/w)％以上。其上限没有特别限制，并且浓度优选10.0(w/w)％以下，更优选5.0(w/w)％以下，并且进一步优选3.0(w/w)％以下。
本发明的核酸提取对象的实例包括微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡，但不限于生物体并且广泛地包括在膜中包封核酸的那些。其特别优选的实例包括使用具有甾体类骨架的表面活性剂提取的那些。此外，在提取过程中，可以使用细胞壁溶解酶、蛋白酶、或磷脂降解酶等促进提取。再者，还优选通过使用氧化锆粉末、加热、pH变化、或渗透压等物理作用来促进提取。
在此，核酸可以是DNA或RNA。除衣壳和细胞壁以外，膜的实例包括被膜和例如细胞膜等的脂质双层膜。此外，微生物的实例包括病毒、支原体、细菌、和真菌。提取对象的实例优选包括病毒和支原体。病毒具有称为衣壳的包封核酸的蛋白壳的结构。由于所述结构，用常规提取方法难以提取核酸。通过应用本发明的提取方法，可以简单快速地提取核酸。待提取的病毒的种类是没有限制的。优选的提取对象病毒的实例包括具有被膜的病毒和具有单链RNA的病毒。术语“具有被膜的病毒”是指其中病毒衣壳被主要由脂质构成的被膜覆盖的病毒，并且其实例包括单纯疱疹病毒、流感病毒、RS病毒、和AIDS病毒(HIV)。术语“具有单链RNA的病毒”是指属于基于巴尔的摩分类法的第4组(单链RNA +链)、第5组(单链RNA–链)、或第6组(单链RNA 逆转录)的病毒。其实例包括冠状病毒、RS病毒、人偏肺病毒、流感病毒、和AIDS病毒(HIV)。具有单链RNA的病毒是优选的，这是由于这些病毒适用于使用RNA作为起始材料的例如TRC法等核酸扩增技术。在这些实例中，特别优选流感病毒作为用于本发明的提取试剂的提取对象病毒。
本发明中的术语“支原体”是指属于支原体属(Mycoplasma)的那些并且其实例可包括猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、莱氏无胆甾原体(Acheloplasma laidlawii)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、口腔支原体(Mycoplasma orale)、柑橘僵化螺原体(Spiroplasma citri)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、和精氨酸支原体(Mycoplasma arginine)。
本发明中的术语“支原体核酸”是指支原体的核酸，其实例可包括基因组、质粒、mRNA、和rRNA。由于每个细胞的拷贝数和序列特异性，rRNA为特别优选的并且23S rRNA为最优选的。
本发明中含有核酸提取对象的样品的实例包括通过在水、生理盐水或缓冲液中简单溶解核酸提取对象制备的溶液、含有核酸提取对象的生物样品本身、和含有生物样品的滤纸或拭子(swab)等。生物样品的实例包括血、粪便、尿、痰、淋巴液、血浆、射精液、肺抽出物(lung aspirate)、脑脊髓液、咽头拭子(pharyngeal swab)、鼻腔拭子(nasopharyngealswab)、漱口液、唾液、和泪液。
除具有甾体类骨架的表面活性剂外，本发明的核酸提取试剂可进一步包含各种组分。所述试剂含有之后待进行的核酸扩增反应所需的组分，例如，酶、盐类如镁盐和钾盐、糖类如海藻糖、糖醇类如甘油、核酸组分、和有机溶剂是优选的，这是因为可简化从核酸提取步骤至核酸扩增步骤的操作。其中，特别优选有机溶剂，这是因为其具有促进核酸提取的效果。进一步包含在本发明的提取试剂中的有机溶剂的实例为二甲基亚砜(DMSO)。此外，除具有甾体类骨架的表面活性剂外，还可以在不干扰核酸扩增反应的范围内添加一种或多种表面活性剂或蛋白质变性剂。待添加的表面活性剂的实例包括阴离子表面活性剂如SDS、两性表面活性剂如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)、和非离子表面活性剂如Span 20(Sigma Aldrich)、MEGA-8(Sigma Aldrich)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween 20(Sigma Aldrich)、Tween 40(Sigma Aldrich)、Tween 60(Sigma Aldrich)、和Tween 80(Sigma Aldrich)等)。其中，优选非离子表面活性剂，因为其具有促进核酸提取的效果并且对核酸扩增反应的影响减少。待添加的表面活性剂的实例可包括Tween 20(SigmaAldrich)，其为聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯表面活性剂。
为了使用本发明的核酸提取试剂从含有核酸提取对象的样品中提取核酸提取对象的核酸，可简单地将本发明的核酸提取试剂与含有核酸提取对象的样品接触。可根据含有核酸提取对象的样品的性质、样品中核酸提取对象的浓度、和包含在核酸提取试剂中的组分等来适当确定接触时间。在许多情况下，核酸提取对象的核酸可在接触后4分钟内充分提取，并且还可在接触后即刻进行后续步骤，例如与环糊精衍生物接触的步骤。
在本发明的用于提取和扩增核酸的方法中，可使用含有核酸提取对象的样品和核酸提取试剂得到核酸提取对象的核酸提取物。其后，使核酸提取物与具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精接触，核酸提取物中具有甾体类骨架的表面活性剂包封在具有碳数为1-4羟烷基的γ-环糊精中，因此减轻对核酸扩增反应的抑制作用。因此，根据本发明的用于提取和扩增核酸的方法，可容易地对核酸提取步骤中得到的核酸提取物进行扩增步骤。
具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的实例包括但不特别限于具有以下的γ-环糊精：
1-羟甲基
1-羟乙基
2-羟乙基
1-羟丙基
2-羟丙基
3-羟丙基
2-羟基-1-甲基-乙基
1-羟丁基
2-羟丁基
3-羟丁基
4-羟丁基
1-羟基-2-甲基-丙基
2-羟基-1-甲基-丙基
3-羟基-1-甲基-丙基
1-羟基-2-甲基-乙基
2-羟基-1,2-二甲基-乙基
1,2-二羟基-乙基
1,2-二羟基-丙基
2,3-二羟基-丙基
1,2-二羟基-丁基
2,3-二羟基-丁基
3,4-二羟基-丁基
1,2,3-三羟基-丁基
或2,3-二羟基-1-甲基-丙基等。
在这些实例中，优选1-羟丙基、2-羟丙基、和3-羟丙基，并且特别优选2-羟丙基-γ-环糊精。
此外，具有碳数为1-4羟烷基的γ-环糊精可以为溶液、和固体等任何形式。再者，当本发明的核酸提取物与具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精接触时，提取物可同时与其他各种组分接触。
将用于提取微生物核酸的试剂与含有核酸提取对象的样品接触之后，将具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精与如此得到的核酸提取物接触。这可在与核酸扩增试剂接触前或接触的同时实现，并且接触的方式可根据所需的提取效率在上述范围内适当选择。本发明的实施方案的一个特别合适的实例可以是涉及将具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精与核酸提取物接触、同时与核酸扩增试剂接触的方法。再者，从更加简单的操作的观点来看，进一步优选同时添加具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精和核酸扩增试剂，因此在此还可使用含有具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的核酸扩增试剂。
应注意的是，核酸扩增试剂含有核酸扩增反应所需的组分，并且可含有，例如，酶、盐类如镁盐和钾盐、糖类如海藻糖、糖醇类如甘油、核酸组分、有机溶剂、核酸如引物和探针、以及缓冲液的组分。本发明的合适实施方案的实例是用于当使用含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂提取核酸提取对象的核酸、然后将由此得到的核酸提取物添加至含有具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的核酸扩增试剂中时进行的核酸扩增反应的试剂。另外，具有碳数为1-4羟烷基的γ-环糊精的浓度没有特别限制，并且其优选是具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上且更优选5倍以上。其上限没有特别限制，并且优选是具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的13倍以下且更优选8倍以下。
本发明中的核酸扩增技术可以是任何核酸扩增技术(例如，PCR法、TMA法、TRC法、和NASBA法)。优选涉及进行等温核酸扩增的方法，这是因为其不需要用于增加或降低温度的相对复杂的设备。这样的核酸扩增技术的一个实例是使用具有与核酸提取对象的核酸的一部分同源的序列的第一引物、具有与核酸提取对象的核酸的一部分互补的序列的第二引物、具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶、具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶、具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶、和具有RNA聚合酶活性的酶来扩增靶核酸的方法，其中将对应于具有RNA聚合酶活性的酶的启动子序列添加至第一引物或第二引物的5'端侧(例如，TMA法、TRC法、或NASBA法)。这是使用单链RNA作为靶标来扩增核酸的方法。还可使用例如特开2015-11636号公报中公开的方法来扩增双链DNA等。
本发明中的核酸扩增试剂可以为干燥状态。核酸扩增试剂含有酶，因此干燥的试剂与液态的试剂相比可以延长贮存期，并且可以实现接近室温的适宜储存温度。干燥的试剂具有可在运输或使用中易于操作的优点。
只要不失去酶活性，用于制造干燥状态的试剂的方法可以是任何方法，并且其实例可包括冻干法和蒸发干燥法。
发明的效果
根据本发明，具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精与表面活性剂的接触，与同其他环糊精衍生物接触的情况相比，可以显著高效降低表面活性剂对酶反应的抑制作用。因此，根据本发明的提取和扩增核酸的方法，可以容易地对核酸提取步骤中得到的核酸提取物进行扩增步骤。
具体实施方式
实施例
将参考以下使用流感病毒或肺炎支原体作为核酸提取对象的实施例和参考例详细描述本发明，但本发明不受这些例子的限制。
实施例1标准RNA的制备
通过特开2016-131498号公报中记载的方法制备在以下实施例中使用的引物、流感病毒RNA(以下，称为“标准RNA”)和插入性荧光染料标准核酸探针。
实施例2环糊精衍生物的包合效果
通过以下方法检测环糊精衍生物对表面活性剂的包合效果。
(1)用注射用水稀释在实施例1中制备的A型(H1N1亚型)流感病毒标准RNA使其浓度为103拷贝/2.5μL，然后将其用作RNA样品。
(2)将在(1)中制备的RNA样品(2.5μL)添加至12.5μL的预先加热至46℃的由以下成分组成的含表面活性剂的溶液(以下，称为“病毒提取物”)。搅拌溶液并且在46℃下保持4分钟，从而制备15μL的病毒RNA提取物。
病毒提取物的组成：浓度是添加病毒样品后的最终浓度(15μL中)
44.4mM氯化镁
110mM氯化钾
2.4％甘油
22.0％DMSO
0.1％(v/v)Tween20
1.5％(w/w)胆酸钠。
(3)将由以下成分组成的含环糊精衍生物的反应溶液(15μL)分配至0.5mL PCR管(Individual Dome Cap PCR Tube，SSI)中，然后在46℃下保持4分钟。在46℃下保持温度4分钟后即刻，添加15μL的(2)中得到的病毒RNA提取物。另外，作为第一引物和第二引物，组合使用具有表1中列出的序列和浓度的寡核苷酸。此外，对于各个第一引物，将T7启动子序列(SEQ ID NO:3)添加至表1中列出的各个SEQ ID NO中描述的核苷酸序列的5'端侧。
[表1]
反应溶液的组成：浓度是添加病毒RNA提取物后的最终浓度(30μL中)
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
各0.25mM：dATP、dCTP、dGTP和dTTP
各2.7mM：ATP、CTP、UTP和GTP
3.06mM ITP
70mM海藻糖
9.1U AMV逆转录酶
142U T7 RNA聚合酶
各20nM INAF探针(实施例1中制备的)
具有表1中记载的浓度的第一引物(A型(H1N1亚型)用)
具有表1中记载的浓度的第二引物(A型(H1N1亚型)用)
具有表2至表11中各自记载的浓度的环糊精衍生物
(4)其后，使用可以直接测定PCR管并且具有温度控制功能的荧光分光光度计(TRCRapid-160，TOSOH CORPORATION)，在46℃下反应的同时随时间测定30分钟反应溶液的荧光强度(激发波长：470nm，和荧光波长：520nm)。将反应溶液的荧光强度比(通过将在预定时间处的荧光强度的值除以背景的荧光强度的值而得的值)高于1.2的情况判定为阳性。将与试剂混合时的时间指定为0分钟，并且将得到阳性判定时间指定为检测时间。
结果在表2至表11中描述。
[表2]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
2-羟丙基-γ-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
6.8 4.50
8 3.56
γ-环糊精 6.8 4.13
无添加 0 N.D.
[表3]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
2-羟丙基-γ-环糊精 8 4.21
10 3.67
12 3.70
14 4.09
γ-环糊精 6.8 5.67
无添加 0 N.D.
[表4]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
2-羟乙基-β-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D.
12 8.96
14 5.08
16 5.38
γ-环糊精 6.8 5.00
无添加 0 N.D.
[表5]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
2-羟丙基-β-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 11.10
12 7.48
14 6.02
16 6.39
γ-环糊精 6.8 5.00
无添加 0 N.D.
[表6]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
甲基-β-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D.
12 N.D.
14 N.D.
16 N.D.
γ-环糊精 6.8 5.02
无添加 0 N.D.
[表7]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
2-羟丙基-α-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D.
12 N.D.
14 N.D.
16 N.D.
γ-环糊精 6.8 5.29
无添加 0 N.D.
[表8]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
单乙酰-β-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D.
12 N.D.
14 N.D.
16 N.D.
γ-环糊精 6.8 5.80
无添加 0 N.D.
[表9]
[表10]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
单-2-O-(对甲苯磺酰)-γ-环糊精 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D.
12 N.D.
14 N.D.
16 N.D.
γ-环糊精 6.8 5.28
无添加 0 N.D.
[表11]
环糊精衍生物 最终浓度(30μL中) 检测时间(分钟)
γ-环糊精磷酸盐 2 N.D.
4 N.D.
6 N.D.
8 N.D.
10 N.D,
12 N.D.
14 N.D.
16 N.D.
γ-环糊精 6.8 5.14
无添加 0 N.D.
确认到表2和表3中的2-羟丙基-γ-环糊精在6.8％(w/w)以上表现包合效果，其在10％(w/w)处表现最短的阳性判定时间，表明在10％(w/w)处的效果高，并且在8％(w/w)处表现的效果高于6.8％(w/w)γ-环糊精的效果。
确认到表4的2-羟乙基-β-环糊精在12％(w/w)以上表现包合效果，并且在14％(w/w)处表现最短的阳性判定时间，表明在14％(w/w)处的效果高，但从不表现比6.8％(w/w)γ-环糊精的阳性判定时间短的阳性判定时间。
确认到表5的2-羟丙基-β-环糊精在10％(w/w)以上表现包合效果，并且在14％(w/w)处表现最短的阳性判定时间，表明在14％(w/w)处的效果高，但从不表现比6.8％(w/w)γ-环糊精的阳性判定时间短的阳性判定时间。
确认到表6的甲基-β-环糊精、表7的2-羟丙基-α-环糊精、表8的单乙酰-β-环糊精、表9的3A-氨基-3A-脱氧-(2AS，3AS)-γ-环糊精、表10的单-2-O-(对甲苯磺酰)-γ-环糊精、和表11的γ-环糊精磷酸盐在各表中记载的任何浓度下都不表现包合效果。
实施例3蒸发干燥扩增试剂的制备方法
将由以下成分组成的含2-羟丙基-γ-环糊精的试剂溶液(18.5μL)分配至0.5mLPCR管(Individual Dome Cap PCR Tube，SSI)，然后在Virtis advantage Plus中在25℃、100托下蒸发干燥16小时，然后在50℃下1.5小时直至冷冻干燥器内的温度稳定在25℃。另外，作为第一引物和第二引物，适当地组合使用具有表1中列出的序列和浓度的寡核苷酸。具体地，在用于检测A型(H1N1亚型)的试剂的制备中，组合使用包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的引物和包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列的引物。在用于检测A型(H3N2亚型)的试剂的制备中，组合使用包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列的引物和包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列的引物。在用于检测B型的试剂的制备中，组合使用包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列的引物和包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列的引物。此外，对于各第一引物，将T7启动子序列(SEQ IDNO:3)添加至表1中列出的各SEQ ID NO中描述的核苷酸序列的5'端侧。密封干燥后的扩增试剂并且在4℃下与干燥剂一同保存。
试剂溶液的组成：浓度为TRC反应的最终浓度(30μL中)
6mM Tris-HCl(pH 8.65)
各0.25mM：dATP、dCTP、dGTP和dTTP
各2.7mM：ATP、CTP、UTP和GTP
3.06mM ITP
198.9mM海藻糖
9.1U AMV逆转录酶
142U T7 RNA聚合酶
各20nM INAF探针(实施例1中制备的)
具有表1中记载的浓度的第一引物
具有表1中记载的浓度的第二引物
在5.2％(w/w)、6.7％(w/w)、8.2％(w/w)、9.7％(w/w)、11.2％(w/w)、和12.7％(w/w)的各个浓度下的2-羟丙基-γ-环糊精。
实施例4蒸发干燥扩增试剂的评价
通过以下方法评价本发明中的含环糊精衍生物的蒸发干燥扩增试剂。
(1)用注射用水稀释实施例1中制备的A型(H1N1亚型)流感病毒标准RNA使其浓度为103拷贝/2.5μL，然后将所得物用作RNA样品。
(2)将(1)中制备的RNA样品(2.5μL)添加至27.5μL的由以下成分组成的病毒提取物。搅拌溶液并且在46℃下保持4分钟。
病毒提取物(液体)的组成：浓度为添加2.5μL RNA样品时的最终浓度(30μL中)
22.2mM氯化镁
55.0mM氯化钾
1.2％甘油
11.0％DMSO
0.05％(v/v)Tween20
1.5％(w/w)胆酸钠
54mM Tris-HCl(pH 8.65)
4mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐
3mM KOH
(3)添加(2)的病毒提取物(30μL)并与实施例3中制备的蒸发干燥扩增试剂混合(A型(H1N1亚型)用)。
(4)以与实施例2(4)中类似的方法进行测定。结果在表12中描述。
[表12]
2-羟丙基-γ-环糊精浓度 检测时间(分钟)
5.2％ 10.5
6.7％ 5.5
8.2％ 4.4
9.7％ 4.6
11.2％ 5.1
12.7％ 7.2
TRC反应已确认蒸发干燥扩增试剂含有5.2％以上浓度的2-羟丙基-γ-环糊精，并且含有8.2％的2-羟丙基-γ-环糊精的试剂表现最短的检测时间。
实施例5蒸发干燥扩增试剂对流感病毒的检测敏感度
通过以下方法使用本发明的提取/扩增核酸的试剂来检测各种流感病毒。
(1)用注射用水以表14中列出的浓度稀释表13中列出的流感病毒，从而制备病毒样品。
(2)将(1)中制备的各个病毒样品(50μL)添加至1000μL的由以下成分组成的病毒提取物。搅拌所得物然后在46℃下保持4分钟。
病毒提取物的组成：
22.2mM氯化镁
75.0mM氯化钾
1.2％甘油
11.0％DMSO
0.05％(v/v)Tween20
1.5％(w/w)胆酸钠
54mM Tris-HCl(pH 8.65)
4mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐
3mM KOH
(3)将(2)的病毒提取物(30μL)添加至实施例3中制备的各含8.2％的2-羟丙基-γ-环糊精的蒸发干燥试剂(用于检测A型(H1N1亚型)的试剂、用于检测A型(H3N2亚型)的试剂、和用于检测B型的试剂)并与之混合。
(4)以与实施例2(4)中类似的方式进行测定。结果在表14中描述。
[表13]
型 株
A型(H1N1亚型) A/California/07/2009
A型(H3N2亚型) A/Texas/50/2012
B型 B/Massachusetts/2/2012
[表14]
检测对象病毒 病毒浓度[TCID50/ml] 检测时间[分钟]
A型H1N1亚型 1.0×100 4.2
1.0×10-1 6.3
A型H3N2亚型 1.0×100 3.3
1.0×10-1 N.D.
B型 1.0×101 4.8
1.0×100 6.7
1.0×10-1 N.D.
N.D.：未检出
结果表明，可以使用本发明的提取/扩增核酸的试剂检测各种流感病毒。
实施例6环糊精衍生物的性能比较
通过以下方法比较本发明中的环糊精衍生物的性能。
(1)通过实施例3中所述方法制备含8.2％的2-羟丙基-γ-环糊精的蒸发干燥试剂。此外，分别制备了代替2-羟丙基-γ-环糊精的含8.2％的2-羟丙基-β-环糊精的蒸发干燥试剂、和代替2-羟丙基-γ-环糊精的含8.2％的2-羟乙基-β-环糊精的蒸发干燥试剂。
(2)通过实施例5的(1)和(2)中所述方法制备H1N1病毒提取物。
(3)将30μL的各个上述病毒提取物添加至(1)中3种蒸发干燥试剂并与之混合。
(4)以与实施例2(4)类似的方式进行测定。
结果示于表15。
[表15]
数值：TRC上升时间(rise time)，-：未进行，N.D.：未检出
结果，无法确认2-羟乙基-β-环糊精表现任何包合效果并且无法进行检测。在2-羟丙基-γ-环糊精和2-羟丙基-β-环糊精的情况下确认到检测。可在3分钟内检测到的病毒浓度在2-羟丙基-β-环糊精的情况中为1000TCID50/mL，而在2-羟丙基-γ-环糊精的情况中为100TCID50/mL。具体地，2-羟丙基-β-环糊精情况下的病毒浓度比另一者高10倍。
实施例7标准RNA的制备
通过以下方法制备用于以下实施例的肺炎支原体标准样品。
肺炎支原体培养液
根据“肺炎支原体检查手册”(日本国立感染症研究所(National Institute ofInfectious Diseases,NIID)，2011年9月)使用补充有葡萄糖的改良的Hayflick液体培养基培养肺炎支原体。无菌地分配培养液然后在-80℃下保存。使用补充有葡萄糖的改良的Hayflick液体培养基计算如此制备的培养液的CFU(集落形成单位)/mL。
实施例8插入性荧光染料标记的寡核苷酸的制备
基于特开2000-316587号公报中公开的方法制备如以下(A)中描述的插入性荧光染料标记的寡核苷酸探针(以下，称为“INAF探针”)。
(A)通过由SEQ ID NO:8中描述的核苷酸序列(GenBank No.NR_077056.1的核苷酸序列的第2193位核苷酸至第2208位核苷酸)表示的寡核苷酸的自5'端的第4位鸟嘌呤和第5位胞嘧啶之间的接头用噻唑橙标记探针。
实施例9肺炎支原体的检测
使用表16中列出的第一引物、第二引物和INAF探针的组合，并且通过以下方法评价。应注意的是，表16中所描述的INAF探针为实施例8中制备的探针。
(1)用生理盐水稀释实施例7中制备的各个标准样品使得浓度为表17中列出的终浓度(CFU/试验)，然后将其用作检测样品。
(2)将由以下成分组成的反应溶液分配至蒸发干燥用管，然后蒸发干燥。
扩增试剂的组成：浓度为添加RNA样品和起始溶液后的最终浓度(30μL中)
60mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.35)
150mM海藻糖
各0.48mM：dATP、dCTP、dGTP和dTTP
各2.1mM：ATP、CTP、UTP和GTP
3.2mM ITP
0.2μM第一引物(SEQ ID NO:9)
0.2μM第二引物(SEQ ID NO:10)
100nM INAF引物(实施例2中制备的)
0.025mg/mL牛血清白蛋白
142U T7 RNA聚合酶
6.4U AMV逆转录酶
8.2％(w/v)2-羟丙基-γ-环糊精
(3)将(1)中制备的各个检测样品(1μL)添加至29μL的由以下成分组成的支原体提取物中，搅拌，然后在46℃下保持1分钟。
支原体提取物的组成：浓度为添加1μL检测样品时的最终浓度(30μL中)
21.0mM氯化镁
50.0mM氯化钾
10.07％DMSO
0.05％(v/v)Tween20
1.5％(w/w)胆酸钠
(4)将30μL的(3)的支原体提取物添加至(2)中制备的蒸发干燥扩增试剂(肺炎支原体用)并与之混合。
(5)其后，使用可直接测定蒸发干燥用管并且具有温度控制功能的荧光分光光度计，在46℃下在反应的同时随时间测定反应溶液的荧光强度20分钟。
将支原体提取物的添加和混合物的搅拌完成时的时间指定为0分钟。将反应溶液的荧光强度比(通过将预定时间处的荧光强度的值除以背景的荧光强度的值而得的值)高于1.2的情况判定为阳性，将该阳性判定的时间指定为检测时间。结果示于表17。表17中的“N.D.”是指在反应起始后20分钟处的荧光强度比为1.5以下(阴性判定)。
结果表明，可以通过使用该方法高灵敏度地快速检测肺炎支原体的23S rRNA。
[表16]
[表17]
比较例1肺炎支原体的检测中的环糊精衍生物的研究
除使用表18中列出的环糊精衍生物代替2-羟丙基-γ-环糊精以外，以与实施例9中类似的方式使用表16中列出的第一引物、第二引物和INAF探针的组合，然后通过以下方法进行评价。应注意的是，表16中所描述的INAF探针是实施例8中制备的探针。
(1)用生理盐水稀释实施例7中制备的各个标准样品使其浓度为表17中列出的终浓度(CFU/试验)，然后将其用作检测样品。
(2)将由以下成分组成的反应溶液分配至蒸发干燥用管，然后蒸发干燥。
扩增试剂的组成：浓度为添加RNA样品、起始溶液后的最终浓度(30μL中)
60mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.35)
150mM海藻糖
各0.48mM：dATP、dCTP、dGTP和dTTP
各2.1mM：ATP、CTP、UTP和GTP
3.2mM ITP
0.2μM第一引物(SEQ ID NO:9)
0.2μM第二引物(SEQ ID NO:10)
100nM INAF探针(实施例2中制备的)
0.025mg/mL牛血清白蛋白
142U T7 RNA聚合酶
6.4U AMV逆转录酶
表18中列出的环糊精衍生物(3)将(1)中制备的1μL(1000CFU/试验)的检测样品添加至29μL的由以下成分组成的支原体提取物中，搅拌，然后在46℃下保持1分钟。
支原体提取物的组成：浓度为添加1μL检测样品时的最终浓度(30μL中)
21.0mM氯化镁
50.0mM氯化钾
10.07％DMSO
0.05％(v/v)Tween20
1.5％(w/w)胆酸钠
(4)将30μL的(3)的支原体提取物添加至(2)中制备的蒸发干燥扩增试剂(肺炎支原体用)并与之混合。
(5)其后，使用可直接测定蒸发干燥用管并且具有温度控制功能的荧光分光光度计，在46℃下反应的同时随时间测定反应溶液的荧光强度20分钟。
将支原体提取物的添加和搅拌完成时的时间指定为0分钟。将反应溶液的荧光强度比(通过将预定时间处的荧光强度的值除以背景的荧光强度的值而得的值)高于1.2的情况判定为阳性，将该阳性判定的时间指定为检测时间。结果示于表18。表18中的“N.D.”是指在反应起始后20分钟处的荧光强度比为1.5以下(阴性判定)。
结果，γ-环糊精以外的其他衍生物的使用导致阴性判定并且无法进行测定。在γ-环糊精的情况下的检测时间为8.89分钟，表明其效果低于2-羟丙基-γ-环糊精的效果。
[表18]
浓度(％(w/v)) 环糊精衍生物名称 检测时间(分钟)
8.2 2-羟丙基-β-环糊精 N.D.
8.2 甲基-β-环糊精 N.D.
8.2 单乙酰-β-环糊精 N.D.
8.2 2-羟乙基-β-环糊精 N.D.
8.2 γ-环糊精 8.89
8.2 2-羟丙基-α-环糊精 N.D.
8.2 3A-氨基-3A-脱氧-(2AS,3As)-γ-环糊精 N.D.
8.2 单-2-O-(对甲苯磺酰)-γ-环糊精 N.D.
8.2 2-羟丙基-α-环糊精 N.D.
实施例10实时PCR
通过以下方法评价了在实时PCR中从胆酸钠的反应抑制和从2-羟丙基-γ-环糊精的反应抑制中的恢复。
(1)在96孔PCR板(Applied biosystems)上制备了具有表19中所述反应组成的试剂，然后用8联排管盖(8cap strip)(Applied biosystems)密封。
(2)然后，使用Quant Studio 5(Applied biosystems)，在95℃下加热30秒后，进行40个循环(95℃10秒，60℃34秒)的扩增反应，从而计算Ct值。结果示于表20。
结果，含有的至少0.5％的胆酸钠完全抑制实时PCR。另一方面，已表明即使在添加1.5％胆酸钠的情况下，8.2％的2-羟丙基-γ-环糊精的添加减轻反应抑制并且可进行实时PCR。
通过上述结果确认到，本发明中的核酸扩增还可适用于实时PCR。
[表19]
试剂 试剂使用量(μL) 购自·SEQ ID NO：
SYBR Prernix Ex Taq II 10 Takara Bio Inc.
ROX参比染料II 0.4 Takara Bio Inc.
10μM F引物 0.8 SEQ ID NO:11
10μM R引物 0.8 SEQ ID NO:12
靶核酸(54.98pg/μL) 0.5 SEQ ID NO:13
胆酸钠 表20中记载的量 DOJINDO LABORATORIES
2-羟丙基-γ-环糊精 表20中记载的量 Wako Pure Chemical Industries,Ltd.
最终，用灭菌水将溶液的体积调节至20μL。
最终，用灭菌水将各个溶液的体积调节至20μL。
[表20]
胆酸钠浓度(％) 2-羟丙基-γ-环糊精浓度(％) Ct值
0 0 21.4
0 8.2 21.4
0.5 0 N.D.
1.0 0 N.D.
1.5 0 N.D.
1.5 8.2 29.9
实施例11使用病毒的实时PCR
通过以下方法使用病毒评价了在实时PCR中从胆酸钠的反应抑制和从2-羟丙基-γ-环糊精的反应抑制中的恢复。
(1)在表13中列出的流感病毒中，将10μL的H3N2型(浓度为105·39TCID50/mL)与1000μL的胆酸钠水溶液(浓度为30.6％(w/w))混合，从而制备病毒提取物。
(2)其后，在96孔PCR板(Applied biosystems)中调节具有表21中所述的反应组成的试剂，然后用8联排管盖(applied biosystems)密封。
(3)然后，使用Quant Studio 5(Applied biosystems)，在42℃下加热5分钟、然后在95℃下加热10秒后，进行40个循环(95℃10秒，60℃34秒)的扩增反应，从而计算Ct值。结果示于表22。
结果表明，当用胆酸钠从病毒中提取核酸时，抑制了一步法实时PCR，但2-羟丙基-γ-环糊精的添加导致了从反应抑制中恢复。
上述结果确认到，本发明的核酸扩增还可适用于实时PCR。
[表21]
最终，用灭菌水将溶液的体积调节至20μL。胆酸钠的最终浓度为1.5％。
最终，用灭菌水将各个溶液的体积调节至20μL。胆酸钠的终浓度为1.5％。
[表22]
胆酸钠浓度(％) 2-羟丙基-γ-环糊精浓度(％) Ct值
1.5 0 N.D.
1.5 8.2 21.7
以上参考特定实施方案来详细描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的技术理念和范围的情况下，可对本发明进行各种修改和变化。
应注意的是，2017年3月13日提交的日本专利申请No.2017-047428、2017年5月16日提交的日本专利申请No.2017-097209、和2017年11月8日提交的日本专利申请No.2017-215697的包括说明书、序列表、权利要求和摘要的全部内容通过参考引入于此作为本发明的说明书的公开内容。
序列表
<110> 东曹株式会社(TOSOH Corporation)
<120> 用于提取和扩增核酸的试剂
<130> 216-0276WO
<150> JP2017-047428
<151> 2017-03-13
<150> JP2017-097209
<151> 2017-05-16
<150> JP2017-215697
<151> 2017-11-08
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 1
<400> 1
ttctggaggg gtgaaaatgg 20
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 2
<400> 2
gggtttcgac tttctcttac ttgatcc 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7 启动子
<400> 3
aattctaata cgactcacta tagggaga 28
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 4
<400> 4
tttggagagg tgagaatggg 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5
<400> 5
gggtttcgac tttctcttac ttgatcc 27
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 6
<400> 6
aaactaggaa cgctctgtgc t 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 7
<400> 7
tttgctgtgt tcatagctga gac 23
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 8
<400> 8
aattctaata cgactcacta tagggagacc cttacaccat tacactctac 50
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 9
<400> 9
ttaatattga tcaggacatt atcatgtaga 30
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 10
<400> 10
tgtgctgttc taattg 16
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F 引物
<400> 11
caggctgcaa taagagatat tttaagct 18
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R 引物
<400> 12
gaagtcacac tggtatggtt tctca 15
<210> 13
<211> 5735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶DNA
<400> 13
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg
acatttaggt gacactatag aatacaaagc tggggtaagg agttcaaggc agcgcccaca
cccgggggct ctccgcaacc cgaccgcctg tccgctcccc cacttcccgc cctccctccc
acctactcat tcacccaccc acccacccac ccagagccgg gacggcagcc caggcgcccg
ggccccgccg tctcctcgcc gcgatcctgg acttcctctt gctgcaggac ccggcttcca
cgtgtgtccc ggagccggcg tctcagcaca cgctccgctc cgggcctggg tgcctacagc
agccagagca gcagggagtc cgggacccgg gcggcatctg ggccaagtta ggcgccgccg
aggccagcgc tgaacgtctc cagggccgga ggagccgcgg ggcgtccggg tctgagccgc
agcaaatggg ctccgacgtg cgggacctga acgcgctgct gcccgccgtc ccctccctgg
gtggcggcgg cggctgtgcc ctgcctgtga gcggcgcggc gcagtgggcg ccggtgctgg
actttgcgcc cccgggcgct tcggcttacg ggtcgttggg cggccccgcg ccgccaccgg
ctccgccgcc acccccgccg ccgccgcctc actccttcat caaacaggag ccgagctggg
gcggcgcgga gccgcacgag gagcagtgcc tgagcgcctt cactgtccac ttttccggcc
agttcactgg cacagccgga gcctgtcgct acgggccctt cggtcctcct ccgcccagcc
aggcgtcatc cggccaggcc aggatgtttc ctaacgcgcc ctacctgccc agctgcctcg
agagccagcc cgctattcgc aatcagggtt acagcacggt caccttcgac gggacgccca
gctacggtca cacgccctcg caccatgcgg cgcagttccc caaccactca ttcaagcatg
aggatcccat gggccagcag ggctcgctgg gtgagcagca gtactcggtg ccgcccccgg
tctatggctg ccacaccccc accgacagct gcaccggcag ccaggctttg ctgctgagga
cgccctacag cagtgacaat ttataccaaa tgacatccca gcttgaatgc atgacctgga
atcagatgaa cttaggagcc accttaaagg gagttgctgc tgggagctcc agctcagtga
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cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc
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tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 5735

Claims (6)

1.一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增所述核酸提取对象的核酸的试剂盒，其包括以下(i)、(ii)和(iii)，其中所述核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：
(i)核酸提取试剂，其至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂；
(ii)具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精；和
(iii)核酸扩增试剂，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是所述具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上，
所述具有甾体类骨架的表面活性剂选自胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸及它们的盐。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精包含在所述核酸扩增试剂中。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述核酸提取对象是微生物。
4.一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增所述核酸提取对象的核酸的方法，其包括步骤(i)、(ii)和(iii)，其中所述核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：
(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；
(ii)将(i)中得到的核酸提取物与具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精接触的步骤；和
(iii)核酸扩增步骤，其将(ii)中得到的溶液与核酸扩增试剂接触，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是所述具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上，
所述具有甾体类骨架的表面活性剂选自胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸及它们的盐。
5.一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增所述核酸提取对象的核酸的方法，其包括步骤(i)和(ii)，其中所述核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：
(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；和
(ii)核酸扩增步骤，其将(i)中得到的核酸提取物与含有具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的核酸扩增试剂接触，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精，
所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是所述具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上，
所述具有甾体类骨架的表面活性剂选自胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸及它们的盐。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述核酸提取对象是微生物。
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