WO2012108471A1 - 核酸抽出液の製造方法 - Google Patents

核酸抽出液の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012108471A1
WO2012108471A1 PCT/JP2012/052873 JP2012052873W WO2012108471A1 WO 2012108471 A1 WO2012108471 A1 WO 2012108471A1 JP 2012052873 W JP2012052873 W JP 2012052873W WO 2012108471 A1 WO2012108471 A1 WO 2012108471A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
nucleic acid
extract
reagent
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/052873
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
哉 平塚
Original Assignee
Ｂｉｏｃｏｓｍ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ｂｉｏｃｏｓｍ株式会社 filed Critical Ｂｉｏｃｏｓｍ株式会社
Priority to JP2012556913A priority Critical patent/JP6128371B2/ja
Publication of WO2012108471A1 publication Critical patent/WO2012108471A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid extract. More specifically, the present invention relates to a method for producing a nucleic acid extract capable of easily and efficiently extracting a nucleic acid from a test sample and further allowing the nucleic acid amplification reaction to proceed efficiently. Furthermore, the present invention relates to a kit for producing a nucleic acid extract used in the above method for producing a nucleic acid extract.
  • nucleic acid extraction techniques have used reagents that require careful handling, such as sodium hydroxide and phenol.
  • Patent Document 1 a method of concentrating nucleic acid by providing a ultrafiltration step without performing a nucleic acid concentration step using phenol and ethanol
  • Patent Document 2 a method of extracting a nucleic acid from a hard tissue-derived biological sample by reacting proteinase K in the presence of potassium chloride, cholic acid, or a thiol compound
  • nucleic acid extraction methods since substances that inhibit the nucleic acid amplification reaction inevitably remain in the obtained nucleic acid extract, the obtained nucleic acid extract is not subjected to steps such as purification and dilution. Thus, there is a problem in that it cannot be used for a series of reaction systems subsequent to nucleic acid amplification and subsequent analysis.
  • An object of the present invention is to provide a technique for obtaining a nucleic acid extract that can be applied to a nucleic acid amplification reaction as it is, simply and efficiently, even for a test sample with many impurities.
  • the present inventor conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. After the nucleic acid was extracted by contacting cholic acids, glycolic acids, and divalent cation chelating agents with the test sample, albumin was further added. It has been found that a nucleic acid extract that can be applied to a nucleic acid amplification reaction as it is can be obtained simply and efficiently even if it is added to a test sample with many impurities. The present invention has been completed by further studies based on this finding.
  • this invention provides the manufacturing method of the nucleic acid extract of the following aspect, and the kit for nucleic acid extract manufacturing.
  • Item 1 A method for producing a nucleic acid extract comprising the following steps: Selected from the group consisting of at least one cholic acid selected from the group consisting of lithocholic acid, deoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid and salts thereof, glycolic acid and salts thereof, glycolic acid and salts thereof, glycolic acid and salts thereof
  • the manufacturing method of the nucleic acid extract of claim item 1 which makes a test sample contact a proteolytic enzyme in a 1st process.
  • item 3 which makes a test sample contact a proteolytic enzyme in a 1st process.
  • Item 3. Item 3. The method for producing a nucleic acid extract according to Item 1 or 2, wherein a surfactant is brought into contact with the test sample in the first step.
  • Item 4. Item 4.
  • Item 5. The method for producing a nucleic acid extract according to any one of Items 1 to 4, wherein a buffer is added in the second step.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. Selected from the group consisting of at least one cholic acid selected from the group consisting of lithocholic acid, deoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid and salts thereof, glycolic acid and salts thereof.
  • a first reagent comprising at least one glycolic acid and a divalent cation chelating agent;
  • a second reagent comprising albumin;
  • Item 8. A kit for producing a nucleic acid extract according to Item 7. Item 9.
  • a 1-1 reagent comprising at least one glycolic acid, a divalent cation chelating agent, and a surfactant;
  • a second reagent comprising albumin, a divalent metal salt captured by a chelating agent of a divalent cation contained in the first reagent, and a buffer;
  • Item 9 A kit for producing a nucleic acid extract according to Item 7 or 8, which comprises
  • a nucleic acid extract that can be applied to a nucleic acid amplification reaction as it is can be obtained simply and efficiently even for a test sample containing a large amount of contaminants such as whole blood, plants, and processed foods.
  • the present invention can efficiently prepare a nucleic acid extract regardless of the species of organisms contained in a test sample, diagnosis of diseases, inspection of environmental pollution, identification of plant varieties, brands, etc. It can be used for inspection of microbial contamination of cosmetics and the like, and investigation of biological materials contained in foods and cosmetics. Furthermore, the present invention can be applied to rapid DNA inspection for criminal investigations, biological contamination inspections such as customs, and the like.
  • the method for producing a nucleic acid extract of the present invention comprises a first step of extracting nucleic acid by bringing a test sample into contact with a chelating agent of cholic acid, glycolic acid, and divalent cation, and It includes a second step of adding albumin to the extract obtained in the first step.
  • a chelating agent of cholic acid, glycolic acid, and divalent cation includes a second step of adding albumin to the extract obtained in the first step.
  • nucleic acid is used as a concept including DNA, RNA, and derivatives thereof.
  • test sample used in the method for producing a nucleic acid extract of the present invention is not limited as long as nucleic acid separation or detection is required, regardless of whether it is a microorganism, an animal, or a plant, Samples that can contain all organisms or their debris are included.
  • test sample examples include whole blood, blood components including blood cells, animal tissue tissue pieces, feces, urine, hair, nails, body fluids, animal extracts, and other animal-derived samples; whole grass, seeds, Examples include plant-derived samples such as fruits, seed coats, stems, leaves, roots, sap, pollen, plant tissue fragments, plant extracts; environmental samples such as soil, seawater, river water, airborne particles, and tap water.
  • plant-derived samples such as fruits, seed coats, stems, leaves, roots, sap, pollen, plant tissue fragments, plant extracts
  • environmental samples such as soil, seawater, river water, airborne particles, and tap water
  • the said test sample may mix
  • environment-derived samples can be used to inspect environmental pollution by microorganisms, and in the field of bioremediation, they can also be used to check for the presence of contaminant-utilizing bacteria in environment-derived samples to be purified.
  • an animal-derived sample can be used for diagnosis of infectious diseases.
  • a plant-derived sample can be used for determination of the presence or absence of a genetically modified plant, identification of cultivar / brand, and the like.
  • One feature of the present invention is that a nucleic acid extract that can be applied to a nucleic acid amplification reaction as it is can be obtained simply and efficiently even for a test sample with a large amount of contaminants.
  • a problem that could not be overcome by the conventional nucleic acid extraction technique of directly preparing a nucleic acid extract that can be directly applied to a nucleic acid amplification reaction from a test sample having a large amount of impurities has been solved.
  • the sample to be manually applied to the present invention is preferably a sample having a large amount of impurities, specifically, whole blood, body fluid, plant-derived sample, and processed food.
  • nucleic acid is extracted from a test sample by bringing the test sample into contact with a chelating agent of cholic acid, glycolic acid, and a divalent cation to perform extraction treatment (first step).
  • the concentration of the test sample when contacting with the chelating agent of cholic acid, glycolic acid, and divalent cation can be appropriately set according to the amount of nucleic acid contained in the test sample. Good.
  • cholic acids used in the first step include lithocholic acid, deoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid, and salts thereof.
  • the salt contained in cholic acids include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
  • the cholic acid may be selected from one of lithocholic acid, deoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid, and salts thereof. You may use combining a seed
  • the cholic acids preferably include deoxycholic acid and salts thereof, and more preferably sodium deoxycholate.
  • the concentration of cholic acids when contacting the test sample is, for example, 0.01 to 10 mM, preferably 0.05 to 5 mM, and more preferably 0.05 to 3 mM.
  • glycolic acids used in the first step include glycolic acid and salts thereof.
  • the salt of glycolic acid include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
  • glycolic acids may be used by selecting one from glycolic acid and salts thereof, or may be used in combination of two or more.
  • glycolic acids are preferably glycolic acid salts, more preferably sodium glycolate.
  • the concentration of glycolic acid when contacting the test sample is, for example, 0.1 to 100 mM, preferably 0.5 to 100 mM, and more preferably 1 to 50 mM.
  • the divalent cation chelating agent used in the first step is not limited as long as it can form a complex salt by coordination with a divalent metal ion in the sample, particularly magnesium ion.
  • a chelating agent citric acid, phytic acid, phosphoric acid and the like can be applied, and a preferable example thereof is a sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter sometimes referred to as EDTA).
  • the concentration of the divalent cation chelating agent in contact with the test sample is, for example, 0.01 to 200 mM, preferably 0.01 to 100 mM, more preferably 0.1 to 50 mM. Is mentioned.
  • a proteolytic enzyme may be brought into contact with the test sample in addition to the chelating agents of cholic acids, glycolic acids, and divalent cations.
  • Proteolytic enzyme can act on the test sample in this way, so that the protein mixed in the test sample can be decomposed, which promotes the destruction of the cell membrane structure and enables more efficient nucleic acid extraction.
  • the type of proteolytic enzyme used in the first step is not limited as long as the protein in the test sample can be degraded, and examples thereof include proteinase K.
  • the concentration of the proteolytic enzyme at the time of contacting with the test sample may be appropriately set according to the type and activity of the decomposing enzyme. Is, for example, 0.01 to 50 g / L, preferably 0.05 to 10 g / L, and more preferably 0.1 to 5 g / L.
  • a surfactant may be brought into contact with the test sample.
  • the surfactant used in the first step is not particularly limited, but is preferably a nonionic surfactant, more preferably Tween 20, Triton X-100, NP-40, or the like.
  • the concentration of the surfactant when contacting the test sample may be appropriately set according to the type of the surfactant. For example, 0.01 to 100 g / L, preferably 0.05 to 10 g / L, and more preferably 0.1 to 5 g / L.
  • the nucleic acid extraction in the first step is performed in an aqueous solution, but may be performed under conditions to which a buffer, a pH adjuster, a stabilizer and the like are added as long as the effect of the present invention is not hindered. .
  • the temperature and processing time of the extraction process in the first step are, for example, 10 to 75 ° C., preferably 20 to 50 ° C., more preferably 25 to 45 ° C., and 0. -60 minutes, preferably 1-30 minutes, more preferably 1-10 minutes.
  • the first step it is desirable to subject to heat treatment in order to inactivate the protein contained in the nucleic acid extract after the extraction treatment.
  • heat treatment may be performed under conditions that can inactivate the protein without degrading the extracted nucleic acid. Specifically, it is 75 to 100 ° C., preferably 80 to 98 ° C., more preferably 85. Examples are 0.1 to 30 minutes, preferably 1 to 20 minutes, more preferably 2 to 10 minutes under a temperature condition of ⁇ 95 ° C.
  • the nucleic acid can be extracted efficiently and the extracted nucleic acid can be protected.
  • cell membranes and the like are dissolved using the surface-active action of deoxycholic acid and glycolic acid, whereby nucleic acids inside the cells are released into the solution.
  • the released nucleic acid is protected from a nucleolytic enzyme such as a DNA degrading enzyme by the action of a chelating agent of glycolic acid and a divalent cation.
  • a nucleic acid extract is produced by adding albumin to the extract obtained in the first step (second step).
  • the albumin used in the second step is not limited in its origin or production method, but is derived from various animals, extracted from animal serum, or genetically modified techniques. Any of those manufactured may be used. Preferred examples include albumin derived from bovine serum (BSA), plant albumin, various animal albumins, and glycated albumin. Among these, bovine serum-derived albumin is preferably exemplified.
  • the final concentration of albumin is 0.01 to 100 g / L, preferably 0.1 to 100 g / L, more preferably 0.5 to What is necessary is just to set so that it may be 50 g / L.
  • the nucleic acid amplification reaction is not hindered by the contaminants even if the extract obtained from the test sample containing a large amount of contaminants is subjected to the nucleic acid amplification reaction as it is. It becomes possible to make it.
  • this second step in addition to albumin, it is desirable to add a divalent metal salt captured by the divalent cation chelating agent used in the first step.
  • DNA polymerases such as Taq DNA polymerase used for nucleic acid amplification reaction are required to have a divalent metal salt (especially magnesium salt)
  • by adding a divalent metal salt, in the first step Eliminate the influence of the chelating agent of the divalent cation used and use the nucleic acid extract as it is without changing the magnesium ion concentration, etc., under conditions optimized for use in nucleic acid amplification reactions. Can be used.
  • the divalent metal salt used in the second step include a magnesium salt, an iron salt, a manganese salt, and the like, and a magnesium salt is preferable.
  • the divalent metal salt is not limited as long as it can liberate divalent metal ions in the extract obtained in the first step and does not inhibit the stability of nucleic acid and subsequent analysis. If a magnesium salt is used as the metal salt, magnesium chloride and magnesium sulfate are preferred examples.
  • the addition amount of the divalent metal salt into the extract may be an amount corresponding to the binding amount of the chelating agent of the divalent cation added in the first step. It is desirable to set the final salt concentration to be 0.1 to 50 mM, preferably 1 to 25 mM, more preferably 1 to 10 mM.
  • a buffering agent may be added in addition to the above components.
  • the addition of a buffer facilitates the pH adjustment in the subsequent analysis.
  • the adjustment of the DNA polymerase to be used to the optimum pH is facilitated, and after the reagent group added in the first step, The influence on the reaction system can also be eliminated.
  • the buffer used in the second step is not limited as long as it does not inhibit the stability of nucleic acid and subsequent analysis.
  • a buffer having a buffering ability in the range of pH 6 to 10 preferably TAPS (N- [ Tris (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropanesulfonic acid) and tris (trishydroxymethylaminomethane) buffer.
  • the amount of the buffer added to the extract may be any amount that can impart a buffering action to the extract.
  • the final concentration of the buffer is 0.01 to 200 mM, preferably 0. It is desirable to set it to 1 to 100 mM, more preferably 10 to 100 mM.
  • the nucleic acid in the test sample is extracted, and the influence of the substance that inhibits the nucleic acid amplification reaction is removed.
  • the nucleic acid extract obtained in the present invention does not need to be provided with a step of removing the reaction inhibitory substance including dilution of the nucleic acid extract required in the conventional method.
  • labor saving of operation and loss of the nucleic acid sample can be reduced to the minimum, and a decrease in detection sensitivity due to an increase in the amount of recoverable nucleic acid extract can be reduced. Therefore, it is possible to meet market demands for reliably detecting a small amount of various detection objects without taking time and effort.
  • nucleic acid extract obtained by the method for producing a nucleic acid extract of the present invention is applied, but examples include nucleic acid amplification and detection by a nucleic acid amplification reaction.
  • examples of the nucleic acid amplification reaction include PCR, LCR (ligase chain reaction), etc., PCR using Taq DNA polymerase, which is a general-purpose technique, is particularly suitable, and its application range is wide.
  • Kit for producing nucleic acid extract Furthermore, the present invention also provides a kit for producing a nucleic acid extract used in the method for producing a nucleic acid extract.
  • the kit of the present invention comprises cholic acids, glycolic acids, a divalent cation chelating agent, and albumin.
  • the kit of the present invention individually includes a first reagent used in the first step of the method for producing the nucleic acid extract and a second reagent used in the second step of the method for producing the nucleic acid extract. Designed to.
  • the first reagent contained in the kit of the present invention may contain cholic acids, glycolic acids, and divalent cation chelating agents in one solution, and contain them separately in two or more solutions. It may be a thing. From the viewpoint of ease of operation, the first reagent is desirably an embodiment containing cholic acid, glycolic acid, and a divalent cation chelating agent in one solution.
  • the proteolytic enzyme when used in the first step of the method for producing a nucleic acid extract, contains at least one of cholic acid, glycolic acid, and a divalent cation chelating agent in the first reagent. It may be included in a form coexisting with one type, or separately from these, an embodiment in which a proteolytic enzyme is included alone may be used.
  • the surfactant when a surfactant is used in the first step of the method for producing a nucleic acid extract, the surfactant is at least one of cholic acids, glycolic acids, and divalent cation chelating agents in the first reagent. It may be contained in a form coexisting with the seed, and separately from these, an embodiment in which the surfactant is contained alone may be used.
  • these added components may be contained in the first reagent.
  • the second reagent contained in the kit of the present invention contains albumin.
  • the divalent metal salt in the second step of the method for producing a nucleic acid extract, in the case of adding a divalent metal salt captured by a chelating agent of a divalent cation contained in the first reagent, is:
  • the second reagent may be included in a form coexisting with albumin, or may be an embodiment in which a divalent metal salt is included separately from albumin.
  • the buffering agent when adding a buffering agent in the second step of the method for producing a nucleic acid extract, the buffering agent may be included in the second reagent in a form that coexists with albumin.
  • the aspect in which a buffering agent is contained independently may be sufficient.
  • the first reagent comprises a reagent containing cholic acids, glycolic acids, and a divalent cation chelating agent
  • the second reagent comprises a reagent containing albumin
  • the first reagent comprises a first reagent containing cholic acid, glycolic acid, a divalent cation chelating agent, and optionally a surfactant, and a first reagent containing proteolytic enzyme.
  • the second reagent comprises albumin and, if necessary, a reagent containing a divalent metal salt and / or a buffer.
  • the concentration of each component contained in the kit of the present invention is appropriately set within a range in which the concentration at the time of use of the nucleic acid extract production method can be satisfied.
  • kit of the present invention may contain other necessary reagents, an experimental procedure manual for carrying out the above-described method for producing a nucleic acid extract, and the like as necessary.
  • Example 1 Production of nucleic acid extract from whole blood A DNA extract was prepared from EDTA-treated whole blood, and ⁇ -globin gene contained in the obtained DNA extract was detected.
  • aqueous solution containing 10 mM sodium deoxycholate, 0.35 M glycolic acid, 100 mM EDTA ⁇ 2Na, 0.5 g / L Tween 20, and 0.5 g / L Triton X-100 as the first reagent was prepared.
  • An aqueous solution containing 0.1 mAU proteinase K (manufactured by Roche) was prepared as the 1-2 reagent.
  • an aqueous solution (pH 9.5) containing 1.0 g / L bovine serum albumin (BSA), 25 mM MgCl 2 and 0.5 mM TASP buffer was prepared.
  • a nucleic acid extract was prepared in the same manner as described above.
  • PCR reaction solution was 5 ⁇ L of ⁇ 10 Reaction Buffer (Ex Taq Buffer (+ Mg 2+ ), manufactured by Takara Bio Inc.), 5 ⁇ L of 2.5 mM dNTPs, 1 ⁇ L each of 10 pmol / ⁇ L primer, 5 U / ⁇ L Ex Taq.
  • nucleic acid extraction is performed using deoxycholic acid, glycolic acid, and EDTA
  • the DNA amplification reaction by PCR is inhibited by contaminants contained in the nucleic acid extract.
  • inhibition of DNA amplification reaction can be suppressed by adding albumin. That is, from this experimental result, after extracting nucleic acid by contacting a chelating agent of deoxycholic acid, glycolic acid, and a divalent cation with a test sample, albumin is added to the test sample, and so on. It was revealed that a nucleic acid extract that can be directly applied to a nucleic acid amplification reaction can be prepared even for a test sample with a large amount of impurities.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、夾雑物の多い被検試料であっても、簡便且つ効率的に、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を得る技術を提供することである。　被検試料に、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出した後に、更にアルブミンを添加することにより、夾雑物の多い被検試料であっても、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液が簡便且つ効率的に得られる。

Description

核酸抽出液の製造方法
　本発明は、核酸抽出液の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、簡便且つ効率的に被検試料から核酸を抽出でき、更には核酸の増幅反応を効率的に進行させることが可能な核酸抽出液を製造する方法に関する。更に、本発明は、上記核酸抽出液の製造方法に使用される核酸抽出液製造用キットに関する。
　核酸が含まれる各種試料から核酸を抽出するには、細胞壁や細胞膜を破壊した後に、核酸を分離すると共に、タンパク質を変性させることが必要とされる。従来、核酸の抽出手法では、水酸化ナトリウムやフェノール等の慎重な取り扱いを要する試薬が使用されていた。また、従来、このような慎重な取り扱いを要する試薬を使用しない核酸抽出手法として、フェノールとエタノールを使用した核酸濃縮工程を行わずに、限界濾過工程を設けることにより核酸を濃縮する方法（例えば、特許文献１参照）や、プロテイナーゼＫを、塩化カリウム、コール酸、チオール化合物の存在下で反応させて、硬組織由来の生体試料から核酸を抽出する手法（例えば、特許文献２参照）も提案されている。
　しかしながら、これらの核酸抽出手法では、得られた核酸抽出液中に核酸増幅反応を阻害する物質が不可避的に残存するため、得られた核酸抽出液は、精製、希釈等の工程を経ずして、核酸増幅、及びその後の分析へと続く一連の反応系に供することはできないという問題点があった。当該技術分野では、被検試料から抽出した核酸を直接分析するのではなく、ＰＣＲ等の核酸増幅技術を利用して増幅させた後に分析を行うことが一般的となっている。そのため、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を簡便に取得できる核酸抽出技術の開発が切望されていた。
　そこで、近年、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を得る手法として、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を被検試料に接触させて核酸を抽出する方法が報告されている（例えば、特許文献３参照）。特許文献３の技術では、デオキシコール酸とグリコール酸の持つ界面活性作用を利用して細胞膜等を溶解して細胞内部の核酸を遊離させ、それと同時にグリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤の作用により遊離された核酸を核酸分解酵素から保護し、更にはデオキシコール酸とグリコール酸を併用していることによりＤＮＡポリメラーゼ等の酵素による核酸増幅反応が阻害されるのを抑制している。
　しかしながら、特許文献３の技術では、夾雑物の少ない被検試料では、抽出処理された抽出液をそのまま核酸増幅反応に供することができても、全血、植物、加工食品等の夾雑物の多い被検試料では、以前として、抽出処理された抽出液を核酸増幅反応に供すると、反応阻害が生じるため、更なる希釈、精製等の工程が必要であった。
　このような従来技術を背景として、夾雑物の多い被検試料であっても、簡便且つ効率的に、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を得る技術の開発が望まれている。
特開平５－２３６９６３号公報 特開２００４－２０１５５８号公報 国際公開第２００７／１１６４５０号パンフレット
　本発明は、夾雑物の多い被検試料であっても、簡便且つ効率的に、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を得る技術を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、被検試料に、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出した後に、更にアルブミンを添加することにより、夾雑物の多い被検試料であっても、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液が簡便且つ効率的に得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成した。
　即ち、本発明は、下記態様の核酸抽出液の製造方法、及び核酸抽出液製造用キットを提供する。
項１．　下記工程を含む核酸抽出液の製造方法：
リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を、被検試料に接触させて核酸を抽出処理する第１工程、並びに
第１工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第２工程。
項２．　更に、第１工程において、被検試料にタンパク質分解酵素を接触させる、項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
項３．　更に、第１工程において、被検試料に界面活性剤を接触させる、項１又は２に記載の核酸抽出液の製造方法。
項４．　更に、第２工程において、第１工程で使用した二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩を添加する、項１乃至３のいずれかに記載の核酸抽出液の製造方法。
項５．　更に、第２工程において、緩衝剤を添加する、項１乃至４のいずれかに記載の核酸抽出液の製造方法。
項６．　被検試料が全血である、項１乃至５に記載の核酸抽出液の製造方法。
項７．　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びにアルブミンを含む、核酸抽出液製造用のキット。
項８．　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を含む第１試薬と、
アルブミンを含む第２試薬と、
を含む、項７に記載の核酸抽出液製造用のキット。
項９．　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びに界面活性剤を含む第1-1試薬と、
タンパク質分解酵素を含む第1-2試薬と、
アルブミン、上記第1-1試薬に含まれる二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩、及び緩衝剤を含む第２試薬と、
を含む、項７又は８に記載の核酸抽出液製造用のキット。
　本発明によれば、全血、植物、加工食品等の夾雑物が多い被検試料であっても、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液が簡便且つ効率的に得ることができる。
　本発明は、被検試料に含まれる生物の種を問わず効率的な核酸抽出液の調製が可能であるので、病気の診断、環境汚染等の検査、植物品種、銘柄等の特定、食品や化粧料等の微生物汚染の検査、食品や化粧料等に含まれる生物由来原料の調査等に利用することができる。更に、本発明は、犯罪捜査の迅速ＤＮＡ鑑定、税関等の生物混入検査等にも応用することができる。
全血（ＥＤＴＡ処理後）を被検試料として、本発明の核酸抽出液の製造方法により核酸抽出液を得て、ＰＣＲによりβグロブリン遺伝子を増幅させた結果を示す図である。
１．核酸抽出液の製造方法
　本発明の核酸抽出液の製造方法は、被検試料に、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出処理する第１工程、及び第１工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の核酸抽出液の製造方法について詳述する。
　本発明において、核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの誘導体を含む概念として用いられる。
　本発明の核酸抽出液の製造方法に供される被検試料は、核酸の分離又は検出が求められているものである限り制限されるものではなく、微生物、動物、植物の別を問わず、全ての生物又はその生物片を含みうる試料が包含される。当該被検試料として、具体的には、全血、血球細胞を含む血液成分、動物組織の組織片、糞便、尿、毛髪、爪、体液、動物エキス等の動物由来試料；全草、種子、果実、種皮、茎、葉、根、樹液、花粉、植物組織片、植物エキス等の植物由来試料；土壌、海水、河川水、空気中の浮遊粒子、水道水等の環境由来試料等が例示される。また、当該被検試料は、核酸が含まれ得る限り、食品、生物製薬剤、飲料、化粧料、肥料、堆肥等の、前述の試料を配合又は加工したものであってもよい。例えば、環境由来試料は、微生物による環境汚染を検査するために利用可能であり、また、バイオレメデーションの分野において、浄化対象となる環境由来試料の汚染物質資化菌の存在の検査にも利用可能である。また、例えば、動物由来試料は、感染症の診断に使用することができる。また、例えば、植物由来試料は、遺伝子組み換え植物の有無の判定や、品種・銘柄の特定等に利用することができる。更に、食品、飲料、化粧料等の加工製品を被検試料とする場合には、当該加工製品の微生物汚染の有無の確認、配合されている生物由来原料の有無の確認やその由来の特定、遺伝子組み換え動植物由来原料の有無の確認を行うことができる。
　本発明の一つの特徴として、夾雑物の多い被検試料であっても、簡便且つ効率的に、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液が得られることが挙げられる。本発明では、夾雑物の多い被検試料から、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を直接調製するという従来の核酸抽出技術では克服できなかった問題点が解消されており、かかる本発明の効果に鑑みれば、本発明に手適用される被検試料として、夾雑物が多いもの、具体的には、全血、体液、植物由来試料、加工食品が好適である。
　本発明では、先ず、被検試料に、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて抽出処理することにより、被検試料から核酸を抽出する（第１工程）。
　本第１工程において、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤に接触させる際の被検試料の濃度については、被検試料に含まれる核酸の量等に応じて適宜設定すればよい。
　本第１工程において使用されるコール酸類としては、具体的には、リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩が挙げられる。コール酸類に含まれる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。本発明において、コール酸類は、リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩の中から１種を選択して使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明において、コール酸類として、好ましくはデオキシコール酸及びその塩、更に好ましくはデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。
　本第１工程において、被検試料に接触させる際のコール酸類の濃度としては、例えば、０．０１～１０ｍＭ、好ましくは０．０５～５ｍＭ、更に好ましくは０．０５～３ｍＭが挙げられる。
　本第１工程において使用されるグリコール酸類としては、具体的には、グリコール酸及びその塩が挙げられる。グリコール酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。本発明において、グリコール酸類は、グリコール酸及びその塩の中から１種を選択して使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明において、グリコール酸類として、好ましくはグリコール酸の塩、更に好ましくはグリコール酸ナトリウムが挙げられる。
　本第１工程において、被検試料に接触させる際のグリコール酸類の濃度としては、例えば、０．１～１００ｍＭ、好ましくは０．５～１００ｍＭ、更に好ましくは１～５０ｍＭが挙げられる。
　本第１工程において使用される二価陽イオンのキレート剤としては、試料中の２価の金属イオン、特にはマグネシウムイオンと配位して錯塩を形成し得るものである限り制限されない。このようなキレート剤には、クエン酸、フィチン酸、リン酸なども適用可能であるが、好適な例として、エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと表記することもある）のナトリウム塩が挙げられる。
　本第１工程において、被検試料に接触させる際の二価陽イオンのキレート剤の濃度としては、例えば、０．０１～２００ｍＭ、好ましくは０．０１～１００ｍＭ、更に好ましくは０．１～５０ｍＭが挙げられる。
　更に、本第１工程では、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤に加えて、タンパク質分解酵素を被検試料に接触させてもよい。このようにタンパク質分解酵素を被検試料に作用させることにより、被検試料中に混在するタンパク質を分解でき、これによって細胞の膜構造の破壊が促進され、一層効率的な核酸の抽出が可能になる。本第１工程に使用されるタンパク質分解酵素としては、被検試料中のタンパク質を分解し得る限り、その種類については制限されないが、例えば、プロテイナーゼＫ等が例示される。
　本第１工程において、タンパク質分解酵素を被検試料に接触させる場合、被検試料に接触させる際のタンパク質分解酵素の濃度については、当該分解酵素の種類や活性等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．０１～５０ｇ/Ｌ、好ましくは０．０５～１０ｇ/Ｌ、更に好ましくは０．１～５ｇ/Ｌが挙げられる。
　また、本第１工程では、上記成分に加えて、界面活性剤を被検試料に接触させてもよい。このように、面活性剤を使用することによって、被検試料から核酸を一層効率的に抽出することが可能になる。本第１工程に使用される界面活性剤としては、特に制限されるものではないが、好ましくは非イオン性界面活性剤、更に好ましくはＴｗｅｅｎ　２０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、ＮＰ－４０等が例示される。
　本第１工程において、界面活性剤を被検試料に接触させる場合、被検試料に接触させる際の界面活性剤の濃度については、当該界面活性剤の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．０１～１００ｇ/Ｌ、好ましくは０．０５～１０ｇ/Ｌ、更に好ましくは０．１～５ｇ/Ｌが挙げられる。
　本第１工程における核酸抽出は、水溶液中で行われるが、本発明の効果が妨げられないことを限度として、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等が添加された条件で行ってもよい。
　本第１工程における抽出処理の温度及び処理時間としては、例えば、１０～７５℃、好ましくは２０～５０℃、更に好ましくは２５～４５℃の温度条件で、０．～６０分間、好ましくは１～３０分間、更に好ましくは１～１０分間が挙げられる。
　また、本第１工程において、上記抽出処理後に、核酸抽出液に含まれるタンパク質を失活させるために、加熱処理に供することが望ましい。このような加熱処理は、抽出された核酸を分解することなく、タンパク質を失活し得る条件で行えばよく、具体的には、７５～１００℃、好ましくは８０～９８℃、更に好ましくは８５～９５℃の温度条件で、０．１～３０分間、好ましくは１～２０分間、更に好ましくは２～１０分間が例示される。
　斯くして本第１工程によって被検試料を処理することにより、核酸を効率的に抽出できると共に、抽出された核酸の保護が可能になる。具体的には、デオキシコール酸とグリコール酸の界面活性作用を利用して細胞膜等を溶解し、それにより細胞内部の核酸が溶液中に遊離する。それと同時に、グリコール酸及び二価陽イオンのキレート剤の作用により、遊離された核酸はＤＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素から保護される。
　次いで、上記第１工程で得られた抽出液にアルブミンを添加することにより、核酸抽出液を製造する（第２工程）。
　本第２工程で使用されるアルブミンについては、その由来や製法等について制限されるものでなく、様々な動物由来のもの、動物の血清から抽出して得られたもの、遺伝子組み換え技術を用いて製造されたもの等のいずれであってもよい。好適には、牛血清由来のアルブミン（ＢＳＡ）、植物アルブミン、各種動物アルブミン、糖化アルブミンが挙げられる。これらの中でも、好ましくは牛血清由来のアルブミンが例示される。
　第１工程で得られた抽出液に対するアルブミンの添加量については、例えば、アルブミンの終濃度が、０．０１～１００ｇ/Ｌ、好ましくは０．１～１００ｇ/Ｌ、更に好ましくは０．５～５０ｇ/Ｌとなるように設定すればよい。
　このように、アルブミンを添加することにより、夾雑物が多い被検試料から得られた抽出液をそのまま核酸増幅反応に供しても、核酸増幅反応が夾雑物により阻害されることなく、核酸を増幅させることが可能になる。
　更に、本第２工程では、アルブミンに加えて、第１工程で使用した二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩を添加することが望ましい。核酸増幅反応に使用されるＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼをはじめとするＤＮＡポリメラーゼは、二価の金属塩（特に、マグネシウム塩）要求性であるため、二価の金属塩を添加することにより、第１工程で使用した二価陽イオンのキレート剤の影響を消去して、核酸増幅反応に供する際に好適化された条件で、特にはマグネシウムイオン濃度等を変更することなく、そのまま核酸抽出液を核酸増幅反応に供することができる。
　本第２工程で使用される二価の金属塩としては、具体的には、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩である。また、二価の金属塩は、第１工程で得られた抽出液中で、二価の金属イオンを遊離でき、核酸の安定性、その後の分析を阻害しない限り制限されないが、例えば、二価の金属塩としてマグネシウム塩を使用する場合であれば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムが好適な例として挙げられる。
　二価の金属塩の抽出液中への添加量については、第１工程で添加した二価陽イオンのキレート剤の結合量に相当する量であればよく、具体的には、二価の金属塩の終濃度が、０．１～５０ｍＭ、好ましくは１～２５ｍＭ、更に好ましくは１～１０ｍＭとなるように設定することが望ましい。
　更に、本第２工程では、上記成分以外に、緩衝剤を添加してもよい。緩衝剤の添加により、その後の分析におけるｐＨ調整を容易にし、とりわけ核酸増幅反応においては、用いるＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨへの調整が容易になると共に、第１工程で添加した試薬群の後の反応系への影響を消失させることもできる。
　本第２工程で使用される緩衝剤としては、核酸の安定性及びその後の分析を阻害しない限り制限されないが、例えば、ｐＨ６～１０の範囲で緩衝能を有するもの、好ましくはＴＡＰＳ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸）、トリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)緩衝剤が挙げられる。
　緩衝剤の抽出液中への添加量については、当該抽出液に緩衝作用を付与できる量であればよく、具体的には、緩衝剤の終濃度が、０．０１～２００ｍＭ、好ましくは０．１～１００ｍＭ、更に好ましくは１０～１００ｍＭとなるように設定することが望ましい。
　斯くして本第２工程により得られた核酸抽出液は、被検試料中の核酸が抽出されており、しかもの核酸増幅反応を阻害する物質の影響が除去されているので、そのまま核酸増幅反応に供することができる。即ち、本発明で得られる核酸抽出液は、従来法において必要であった核酸抽出液の希釈等を含めた該反応阻害物質を除去する工程を設ける必要がない。これにより、操作の省力化、並びに核酸試料の損失を最小限に低減できる共に、回収できる核酸抽出液量の増加による検出感度の低下を低減できる。それ故、手間を掛けずに微量の各種検出対象を確実に検出したいとの市場の要求に応えることができる。
　本発明の核酸抽出液の製造方法によって得られた核酸抽出液が適用される好適な分析反応系としては特に制限はないが、核酸増幅反応による核酸の増幅及び検出が例示される。核酸増幅反応としてはＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等が例示され、汎用技術であるＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによるPCRが特に好適であり、その応用範囲は広範に亘る。
２．核酸抽出液製造用キット
　更に、本発明は、上記核酸抽出液の製造方法に使用される核酸抽出液の製造用キットをも提供する。
　本発明のキットは、コール酸類、グリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、及びアルブミンを含むことを特徴とする。
　本発明のキットは、上記核酸抽出液の製造方法の第１工程で使用される第１試薬と、上記核酸抽出液の製造方法の第２工程で使用される第２試薬とを個別に含むように設計される。
　本発明のキットに含まれる第１試薬は、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を１つの溶液に含むものであってもよく、またこれらを２以上の溶液に別けて含むものであってもよい。操作簡便性の観点から当該第１試薬は、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を１つの溶液に含む態様であることが望ましい。
　また、上記核酸抽出液の製造方法の第１工程において、タンパク質分解酵素を使用する場合、当該タンパク質分解酵素は、第１試薬において、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤の少なくとも１種と共存する形態で含まれていてもよく、またこれらとは別に、タンパク質分解酵素が単独で含まれる態様であってもよい。
　また、上記核酸抽出液の製造方法の第１工程において界面活性剤を使用する場合、当該界面活性剤は、第１試薬において、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤の少なくとも１種と共存する形態で含まれていてもよく、またこれらとは別に、界面活性剤が単独で含まれる態様であってもよい。
　更に、上記核酸抽出液の製造方法の第１工程において、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を添加する場合には、これらの添加成分が上記第１試薬に含まれていてもよい。
　本発明のキットに含まれる第２試薬は、アルブミンを含有する。
　また、上記核酸抽出液の製造方法の第２工程において、第１試薬に含まれる二価陽イオンのキレート剤に捕捉される二価の金属塩を添加する場合、当該二価の金属塩は、第２試薬において、アルブミンと共存する形態で含まれていてもよく、またアルブミンとは別に、二価の金属塩が単独で含まれる態様であってもよい。
　更に、上記核酸抽出液の製造方法の第２工程において、緩衝剤を添加する場合、当該緩衝剤は、第２試薬において、アルブミンと共存する形態で含まれていてもよく、またアルブミンとは別に緩衝剤が単独で含まれる態様であってもよい。
　本発明のキットの好適な一態様として、第１試薬が、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を含む試薬からなり、第２試薬が、アルブミンを含む試薬からなるキット；好ましくは、第１試薬が、コール酸類、グリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む第1-1試薬、並びにタンパク質分解酵素を含む第1-2試薬からなり、第２試薬が、アルブミン、及び必要に応じて二価の金属塩及び／又は緩衝剤を含む試薬からなるキットが例示される。
　本発明のキットに含まれる各成分の濃度については、上記核酸抽出液の製造方法の使用時の濃度を充足できる範囲で適宜設定される。
　また、本発明のキットには、必要に応じて、その他に必要になる試薬や、上記核酸抽出液の製造方法を実施するための実験手順書等が含まれていてもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１：全血から核酸抽出液の製造
　ＥＤＴＡ処理した全血からＤＮＡ抽出液を調製し、得られたＤＮＡ抽出液に含まれるβグロビン遺伝子の検出を行った。
＜試薬の調製＞
　第1-1試薬として、１０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム、０．３５Ｍのグリコール酸、１００ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ　２０、及び０．５ｇ／ＬのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む水溶液を調製した。
　第1-2試薬として、０．１ｍＡＵのプロテイナーゼＫ（ロッシュ社製）を含む水溶液を調製した。
　第２試薬として、１．０ｇ／Ｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＡＳＰ緩衝剤を含む水溶液（ｐＨ９．５）を調製した。
＜全血から核酸抽出液の調製＞
　第1-1試薬１０μｌと第1-2試薬１０μｌを混合し、２０μｌの混合液（第１試薬）を得た。次いで、ＥＤＴＡで処理した全血１μｌを０．２ｍｌのマイクロチューブに入れ、更に上記で得られた第１試薬２０μｌを添加して撹拌した後に、７２℃で６分間インキュベートし、続いて９４℃で３分間インキュベートした。
　次いで、上記処理を行ったマイクロチューブに、第２試薬１０μｌを添加し、撹拌することにより、核酸抽出液を調製した。
　また、比較のために、第1-1試薬と第1-2試薬の代わりに同量の滅菌水、第２試薬の代わりに同量の滅菌水、又は第1-1試薬、第1-2試薬及び第２試薬の代わりに同量の滅菌水を使用して、上記と同様に処理して核酸抽出液を調製した。
＜ＤＮＡの増幅＞
　上記で調製した核酸抽出液を室温まで冷却し、ＰＣＲによりβグロビン遺伝子を増幅させた。PCR反応は、フォワードプライマーＧＨ２０（5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'；配列番号１）、リバースプライマーＧＨ２１（5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-3'；配列番号２）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer（+Mg2+）、タカラバイオ社製）を５μL、２．５mMのdNTPsを５μL、１０pmol/μLのプライマー各１μL、５U/μLのEx Taq（タカラバイオ社製）を０．５μL、上記で調製した核酸試料を５μLに、滅菌水を加えて、全量５０μLとして調製した。反応は、９４℃で６０秒での変性の後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の伸長を１サイクルとし、３５サイクル行った後、７２℃で２４０秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。次に、ＰＣＲ反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。
＜結果＞
　得られた結果を図１に示す。上記第１試薬（第1-1試薬と第1-2試薬の混合液）と上記第２試薬を使用した条件では、βグロビン遺伝子を明確に検出できた。これに対して、上記第１試薬及び第２試薬の一方又は双方を滅菌水に置き換えた場合には、βグロビン遺伝子を検出することはできなかった。具体的には、上記第１試薬のみを使用した場合には、夾雑物が多く、極めて薄いバンドしか検出されなかった。また、上記第２試薬のみを使用した場合には、即ち、滅菌水での熱処理により核酸を抽出して第２試薬を添加しても、極めて薄いバンドしか検出されなかった。
　この結果から、デオキシコール酸、グリコール酸、及びＥＤＴＡを用いて、核酸抽出を行うだけでは、核酸抽出液に含まれる夾雑物によってＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応が阻害されるが、更に核酸の抽出処理後にアルブミンを添加することにより、ＤＮＡ増幅反応の阻害を抑制できることが確認された。即ち、本実験結果から、被検試料に、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出した後に、更にアルブミンを添加することにより、全血のような夾雑物の多い被検試料であっても、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を調製できることが明らかとなった。

Claims (9)

  1. 　下記工程を含む核酸抽出液の製造方法：
    リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を、被検試料に接触させて核酸を抽出処理する第１工程、並びに
    第１工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第２工程。
  2. 　更に、第１工程において、被検試料にタンパク質分解酵素を接触させる、請求項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
  3. 　更に、第１工程において、被検試料に界面活性剤を接触させる、請求項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
  4. 　更に、第２工程において、第１工程で使用した二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩を添加する、請求項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
  5. 　更に、第２工程において、緩衝剤を添加する、請求項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
  6. 　被検試料が全血及び植物組織である、請求項１に記載の核酸抽出液の製造方法。
  7. 　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びにアルブミンを含む、核酸抽出液製造用のキット。
  8. 　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を含む第１試薬と、
    アルブミンを含む第２試薬と、
    を含む、請求項７に記載の核酸抽出液製造用のキット。
  9. 　リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びに界面活性剤を含む第1-1試薬と、
    タンパク質分解酵素を含む第1-2試薬と、
    アルブミン、上記第1-1試薬に含まれる二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩、及び緩衝剤を含む第２試薬と、
    を含む、請求項７に記載の核酸抽出液製造用のキット。

     
PCT/JP2012/052873 2011-02-10 2012-02-08 核酸抽出液の製造方法 WO2012108471A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012556913A JP6128371B2 (ja) 2011-02-10 2012-02-08 核酸抽出液の製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-026923 2011-02-10
JP2011026923 2011-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012108471A1 true WO2012108471A1 (ja) 2012-08-16

Family

ID=46638684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/052873 WO2012108471A1 (ja) 2011-02-10 2012-02-08 核酸抽出液の製造方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6128371B2 (ja)
WO (1) WO2012108471A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014065395A1 (ja) * 2012-10-26 2014-05-01 株式会社カネカ Ｒｎａ調製法
JP2018500033A (ja) * 2014-12-23 2018-01-11 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 核酸増幅の阻害を低減するための組成物
WO2018168600A1 (ja) * 2017-03-13 2018-09-20 東ソー株式会社 核酸抽出および増幅試薬

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007116450A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-18 Biocosm Inc. 核酸抽出方法及び核酸抽出キット
JP2008289376A (ja) * 2007-05-22 2008-12-04 Eiken Chem Co Ltd 核酸回収試薬およびそれを用いた核酸増幅試薬キット、ならびに核酸回収方法およびそれを用いた核酸増幅方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007116450A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-18 Biocosm Inc. 核酸抽出方法及び核酸抽出キット
JP2008289376A (ja) * 2007-05-22 2008-12-04 Eiken Chem Co Ltd 核酸回収試薬およびそれを用いた核酸増幅試薬キット、ならびに核酸回収方法およびそれを用いた核酸増幅方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FORBES BA. ET AL.: "Substances interfering with direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by PCR: effects of bovine serum albumin.", J CLIN MICROBIOL., vol. 34, no. 9, 1996, pages 2125 - 2128 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014065395A1 (ja) * 2012-10-26 2014-05-01 株式会社カネカ Ｒｎａ調製法
CN105143449A (zh) * 2012-10-26 2015-12-09 株式会社钟化 Rna制备方法
JPWO2014065395A1 (ja) * 2012-10-26 2016-09-08 株式会社カネカ Ｒｎａ調製法
US9695413B2 (en) 2012-10-26 2017-07-04 Kaneka Corporation RNA preparation method
CN105143449B (zh) * 2012-10-26 2018-11-13 株式会社钟化 Rna制备方法
JP2018500033A (ja) * 2014-12-23 2018-01-11 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 核酸増幅の阻害を低減するための組成物
US10604787B2 (en) 2014-12-23 2020-03-31 3M Innovative Properties Company Composition for reducing inhibition of nucleic acid amplification
WO2018168600A1 (ja) * 2017-03-13 2018-09-20 東ソー株式会社 核酸抽出および増幅試薬
US11208686B2 (en) 2017-03-13 2021-12-28 Tosoh Corporation Reagent for extracting and amplifying nucleic acid

Also Published As

Publication number Publication date
JP6128371B2 (ja) 2017-05-17
JPWO2012108471A1 (ja) 2014-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200239871A1 (en) Method, lysis solution and kit for selectively depleting animal nucleic acids in a sample
US10731146B2 (en) Purification of nucleic acid from environmental or biological samples
Eggert et al. Nucleic acid isolation from ecological samples—animal scat and other associated materials
ES2971094T3 (es) Detección de uno o más patógenos
JP6128371B2 (ja) 核酸抽出液の製造方法
JP5924888B2 (ja) 核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬
WO2009016652A1 (en) A buffer system and a method for direct pcr amplification
KR101777168B1 (ko) 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도
JP6979409B2 (ja) 細胞溶解及び核酸増幅のためのプロセス
JP6979269B2 (ja) 微生物の死細胞及び／又は不活化ウイルスの測定方法
CN103443294A (zh) 用于修饰核酸的方法
JP7369115B2 (ja) 微生物の細胞の測定方法
US20240341302A1 (en) Method to preserve nucleic acids in water samples
KR20200071450A (ko) 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법
WO2007116450A1 (ja) 核酸抽出方法及び核酸抽出キット
EP2625271B1 (en) Method for extracting dna from nematodes and plant cells
AU2020244838B2 (en) Methods of detecting microbial content in cannabis
Juvonen et al. Amplification facilitators and pre‐processing methods for PCR detection of strictly anaerobic beer‐spoilage bacteria of the class clostridia in brewery samples
JP7350716B2 (ja) 微生物の細胞及び／又はウイルスの測定方法
JP2015119656A (ja) 核酸増幅法
TWI542699B (zh) 檢測奇異果過敏原之方法
WO2012088412A2 (en) Capture and enrichment of organisms and cells from liquids
JP2018042472A (ja) 生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法
SI23734A (sl) Postopek za ekstrakcijo DNK mikroorganizmov iz živil
JP2008092835A (ja) 核酸抽出方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12744816

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012556913

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12744816

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1