CN105143449A

CN105143449A - Rna制备方法

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Publication number: CN105143449A
Application number: CN201380055893.3A
Authority: CN
Inventors: 佐野创太郎; 宫本重彦; 友野润; 平塚哉
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: US20150376600A1; US9695413B2; JP6301260B2; JPWO2014065395A1; EP2913399B1; WO2014065395A1; EP2913399A1; EP2913399A4; CN105143449B

Abstract

本发明的课题在于，提供一种比现有方法更简便地制备可供试于酶反应的RNA的方法。提供一种用于提取生物试样中的RNA的试剂，其含有碱金属盐及表面活性剂。

Description

RNA制备方法

技术领域

本发明涉及一种以未分解的方式提取生物试样中的RNA的方法，其使用含有碱金属盐及表面活性剂的RNA提取试剂。

背景技术

随着基因工程的发展，在病毒的检测、细胞动态分析、体质检查、医药品的奏效检查等中利用基因检查。作为这些基因检查中的分析对象之一的RNA与DNA相比不稳定，容易因生物试样中所含的内源性核糖核酸酶及高温·碱处理而分解。因此，在RNA的制备中需要用于防止其分解的先进技能、多阶段的实验工序、昂贵的专用设备·试剂。

例如，作为从生物试样中回收RNA的一般方法，已知通过组合使用蛋白质改性剂和有机溶剂来溶解被分析物，使内源性核糖核酸酶失活而回收未分解的RNA的异硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)法(非专利文献1)及热酚法(非专利文献2)。但是，这些方法均含有抑制核酸扩增反应等酶反应的有机溶剂及高浓度的改性剂，因此，不仅危险性较高，而且需要用于除去这些物质的多阶段的工序和较长的处理时间，从成本及简便性的方面考虑，存在问题。

另一方面，出于使RNA的制备简便的目的，也开发了一种在不使用有机溶剂的情况下，使用强离液物质和表面活性剂作为蛋白质改性剂提取RNA，将提取液直接供与酶反应的方法。例如，已知使用硫氰酸胍和肌氨酰作为改性剂溶解生物试样，一边保护RNA不受内源性核糖核酸酶的影响而分解，一边进行提取的方法(专利文献1)。该提取液可以直接供与酶反应。根据该方法，在将提取液供与酶反应之前，不需要除去改性剂的工序，能够比现有方法更简便地提取RNA。但是，硫氰酸胍等强离液物质及肌氨酰为蛋白质的强改性剂，从有效的酶反应这样的观点考虑，不优选酶反应体系中存在这些强改性剂。

相对于此，作为不抑制之后的酶反应的核酸提取法，已知使用了胆酸、乙醇酸的方法(专利文献2)。根据本方法，从生物试样中所提取的核酸可以不需要纯化工序及稀释工序直接供与核酸扩增法等酶反应。但是，本方法无法防止内源性核糖核酸酶导致的RNA的分解，无法提取未分解的RNA。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4836795号公报

专利文献2：国际公开第2007/116450号

非专利文献

非专利文献1：Chomczynski&Sacchi(1987)AnalyticalBiochemistry，162：156-159.

非专利文献2：水野贵之(2003)生物实验说明(7)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供一种比现有方法更简便地制备可供试于酶反应的RNA的方法。

用于解决课题的技术方案

本发明涉及一种用于提取生物试样中的RNA的试剂，其含有碱金属盐及表面活性剂。

优选碱金属盐为碱金属卤化物。

优选碱金属盐为氯化锂。

优选表面活性剂含有乙醇酸类。

优选表面活性剂还含有脱氧胆酸类。

另外，本发明涉及一种RNA提取试剂盒，其具有所述用于提取生物试样中的RNA的试剂。

另外，本发明涉及一种提取生物试样中的RNA的方法，该方法包括：使用所述用于提取生物试样中的RNA的试剂或RNA提取试剂盒。

发明的效果

根据本发明，可在未分解状态下比现有方法更简便地制备可供与酶·化学反应等试验的RNA。

附图说明

图1为示出了以细胞为被分析物提取RNA并供与RT-PCR的结果的图。

具体实施方式

下面，对本发明详细地进行记载。

在本发明中，为了从生物试样制备未分解性RNA，使用碱金属盐和表面活性剂，在防止RNA因被分析物内存在的核糖核酸酶导致的分解的同时，制备可供试于之后的酶反应的RNA。

在本发明中，所谓生物试样，可例示：动物或植物的细胞、组织、全血、血清、淋巴液、组织液、尿、精液、阴道液、羊水、眼泪、唾液、汗等体液、源自于外来体等细胞的卵泡、粪便、痰、细菌、病毒等，但只要为含有核酸的物质即可，不限定于此。

在本发明中，所谓RNA，可例示：信使RNA及转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、核仁小分子RNA、微RNA等不可翻译RNA等，但只要为含有核糖核苷酸的聚合物的物质即可，不限定于此。

就RNA的一般制备方法、即利用RNA对固相载体的吸附的方法及利用有机溶剂及水溶性高分子、表面活性剂的添加导致的RNA的不溶化的方法而言，不仅需要用于纯化处理液的复杂操作，而且根据RNA的分子量在回收效率上有差别，有时无法得到目标RNA。另一方面，本发明中的RNA制备方法可将RNA提取液直接供试于之后的分析，处理液具有无损失地含有被分析物中所含的所有分子量的RNA这样的优点。

在本发明中，用于提取RNA的RNA提取试剂含有碱金属盐作为RNA保护剂。

所谓本发明中的碱金属盐，可例示：锂盐、钠盐、钾盐、铷盐、铯盐。可优选例示：氯化锂、溴化锂、碘化锂、醋酸锂、氢氧化锂、氟化钠、氯化钠、溴化钠、碘化钠、醋酸钠、焦磷酸钠、硫氰酸钠、硫酸钠、亚硫酸钠、二亚硫酸钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、酒石酸钠、硝酸钠、氟化钾、氯化钾、溴化钾、碘化钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、硫酸钾、氟化铷、氯化铷、溴化铷、碘化铷、醋酸铷、氯化铯、溴化铯、碘化铯、醋酸铯，但不限定于此。可更优选例示碱金属卤化物。可进一步优选卤化物中的离液效果较小的氯化锂。这些碱金属盐可以单独使用，也可以组合使用。

碱金属盐具有RNA保护效果，另一方面，不会成为核酸相关酶的辅因子，与其它产生可成为辅因子的多价阳离子的金属盐相比，具有对酶活性造成的影响较小这样的优点。

RNA提取试剂中所含的碱金属盐的浓度可以由本领域技术人员容易地确定最佳值，但作为一个例子，优选0.2M以上且饱和浓度以下，更优选0.3M以上且5.0M以下，进一步优选0.3M以上且2.5M以下。若碱金属盐的浓度过低，则无法保护RNA免受内源性核糖核酸酶导致的分解，若浓度过高，则可以保护RNA，但存在抑制之后的酶反应的倾向。

在本发明中，RNA提取试剂含有表面活性剂作为被分析物溶解剂。所谓本发明中的表面活性剂，可例示离子型、非离子型、双离子型表面活性剂。可优选例示：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等Tween类、TritonX-100、TritonX-114、TritonXL-80N等Triton类、Nonidet类、NP-40等非离子型表面活性剂、胆酸类、脱氧胆酸类、乙醇酸类等阴离子型表面活性剂，可更优选例示：Tween20、TritonX-100、脱氧胆酸、乙醇酸，但只要为不抑制酶反应的表面活性剂即可，不限定于此。这些表面活性剂可以单独使用，也可以组合使用。

RNA提取试剂中所含的表面活性剂的浓度可以由本领域技术人员容易地确定最佳值，但在使用胆酸类、脱氧胆酸类、乙醇酸类的情况下，其浓度优选为1mM以上。若表面活性剂的浓度过低，则存在无法使生物试样溶解的倾向。

在本发明中，RNA提取试剂可以含有缓冲剂。作为本发明中的缓冲剂，可优选使用磷酸缓冲液及两性离子缓冲液等缓冲剂。其中，优选MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS等两性离子缓冲液，特别优选TAPS。这些缓冲剂可以单独使用，也可以组合使用。

在本发明中，RNA提取试剂可以含有具有源自于生物试样的异物导致的酶反应抑制降低效果的白蛋白等蛋白质成分、多胺、环糊精、海藻糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇等水溶性高分子。

在本发明中，RNA提取试剂可以含有用于防止在冰点下的冻结的甘油、甜菜碱、蔗糖等防冻剂。

在本发明中，RNA提取试剂可以含有用于确保核酸酶活性失活的螯合剂及核酸酶抑制剂、DTT(二硫苏糖醇)等还原剂、用于之后的酶反应的DMSO及甲酰胺这样的有机溶剂。

生物试样和RNA提取试剂的混合比优选为9:1～1:999，更优选为4:1～1:499，进一步优选为1:1～1:99。

在本发明中，将生物试样和RNA提取试剂混合后，在RNA提取处理时，可以物理破碎生物试样，也可以与例如利用冻结融化的破碎及利用均质器的物理破碎法等组合。另外，根据本发明，在将生物试样和RNA提取试剂混合之前，即使不进行破碎操作也可提取RNA。

将生物试样和RNA提取试剂混合后，为了从生物试样中提取RNA，可以实施热处理。热处理温度优选为0℃以上且100℃以下，更优选为30℃以上且90℃以下，进一步优选为50℃以上且80℃以下。若温度过低，则存在提取效率降低的倾向，若过高，则存在RNA分解的倾向。热处理时间优选为30分钟以下，更优选为15分钟以下。若处理时间过短，则存在提取效率降低的倾向，若过长，则存在RNA分解的倾向。

在本发明中，对于RNA提取液，不需要进一步的纯化工序及稀释工序等，可将RNA提取液混入酶反应溶液直接作为底物，引发核酸扩增反应等酶反应。作为使其反应的酶，例如可以举出：脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶等核酸酶、蛋白酶、肽酶等蛋白酶、DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、耐热性聚合酶、链置换聚合酶、末端转移酶等聚合酶、连接酶、重组酶、溶解酶、纤维素酶等。RNA提取液和酶反应溶液的混合比优选为1:999～999:1，更优选为1:99～99:1，进一步优选为1:49～49:1。

在本发明中，RNA提取液可以与溴化乙锭、SYBR(R)Green、PicoGreen(R)等核酸荧光标记试剂及荧光标记探针混合，对含有的RNA进行检测。另外，也可在荧光标记试剂存在下将RNA提取液供与核酸扩增反应，实时监控扩增反应。另外，也可将RNA提取液供与测序反应。

在本发明中，所谓核酸扩增反应，为PCR法所代表的使核酸序列扩增的方法，例如除PCR法以外，可例示：LCR(连接酶链反应)法、SDA(链置换扩增反应)法、RCA(滚环扩增反应)法、CPT(循环探针技术)法、Q-β复制扩增技术法、ICAN(恒温和嵌合引物引发的核酸扩增反应)法、LAMP(DNA的环介导等温扩增)法、NASBA(基于核酸序列的扩增方法)法及TMA(转录介导扩增技术)法等公知的方法，但并不限定于这些方法。

在本发明中，可将具有与RNA提取液中所含的部分目标核酸互补的核酸的分子、抗体或者单链核酸结合蛋白质等具有特异性结合能力的分子及目标核酸混合，使其特异性结合。简言之，可使用RNA提取液进行Southern印迹、Northern印迹、实时PCR、利用标记核酸探针等的特异性核酸的标记、检测、纯化、分离等。

在本发明中，也可将RNA提取液供与离子交换柱、凝胶过滤柱等各种色谱及离心、过滤、透析、在固相载体上的吸附处理，分离异物，纯化RNA提取液中所含的RNA。另外，也可适宜组合这些技术方案用作RNA纯化试剂盒。

本发明的试剂盒具有上述RNA提取试剂。此外，例如可以具有被分析物清洗液、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、逆转录酶、DNA聚合酶及其底物、寡核苷酸。

也可将本发明的试剂及试剂盒装入核酸制备装置、核酸扩增装置、核酸自动分析装置等中。

实施例

下面，通过实施例对本发明具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。

[实施例1]

按以下的步骤从小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA为模板进行RT-PCR，通过琼脂糖凝胶电泳确认源自于RNA的扩增片段。

(RNA提取试剂的制备)

制备以下组成的RNA提取试剂。

氯化锂、75mMTAPS(pH8.0)、2.25mMCaCl₂、15mMMgCl₂、175mM乙醇酸、5mM脱氧胆酸、50mMEDTA、0.05％TritonX-100

以氯化锂为0M、0.1M、0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M、4.0M、5.0M、6.0M、7.0M的浓度制备RNA提取试剂。

(RNA的提取)

从小鼠采集血液。使用肝素作为抗凝剂。在该小鼠血液2μl中添加RNA提取试剂18μl，在75℃下孵化5分钟。将孵化后的溶液冷却至室温后，添加2μl的DNaseI(相当于10Units的量)，以42℃/5分钟→75℃/10分钟孵化。

(RT-PCR)

将上述制备的RNA试样冷却至室温，以其为模板进行RT-PCR，得到源自于被分析物的核酸的扩增片段。RT-PCR以H3F3AmRNA为靶向，将正向引物F1(5’-GGCCTCACTTGCCTCCTGCAA-3；’序列号1)、反向引物R1(5’-GCAAGAGTGCGCCCTCTACTG-3；’序列号2)用作引物组。RT-PCR使用PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒Ver.2(Takarabio公司制)相对于反应溶液添加上述制备的RNA试样2％容量进行。反应在50℃/30分钟的逆转录反应、94℃/1分钟的逆转录酶的失活处理后，进行94℃/15秒钟→62℃/15秒钟→72℃/15秒钟的PCR循环30个循环。另外，为了确认扩增片段不是源自于DNA，作为阴性对照，在不进行逆转录反应的情况下，进行94℃/15秒钟→60℃/15秒钟→72℃/15秒钟的PCR循环30循环。接着，基于常规方法将RT-PCR产物供与琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段进行可视化。

将通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化的扩增片段的结果示于表1。在使用氯化锂浓度为0.5～5.0M的RNA提取试剂的情况下，仅确认到RT-PCR时的扩增片段，可知可适当地提取RNA。

[表1]

LiCl浓度(M)	0	0.1	0.2	0.5	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0
												RT-PCR	-	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-

+：有扩增

-：无扩增

[实施例2]

(RNA提取试剂的制备)

制备以下组成的含有碱金属盐的RNA提取试剂。

0.7M碱金属盐、75mMTAPS(pH8.0)、2.25mMCaCl₂、15mMMgCl₂、175mM乙醇酸、5mM脱氧胆酸、50mMEDTA、0.05％TritonX-100

作为碱金属盐，使用氯化锂、溴化锂、碘化锂、氯化钠、碘化钠、氯化钾、碘化钾、氯化铷、氯化铯、醋酸锂、磷酸二氢钠、酒石酸钠、硝酸钠、醋酸钾、磷酸氢二钾、硫酸钾。

另外，使用氯化锂作为碱金属盐，制备省略了作为表面活性剂的脱氧胆酸的RNA提取试剂。

(RNA的提取)

使用制备的RNA提取试剂，通过与实施例1同样的方法从小鼠采集血液，提取RNA。

(RT-PCR)

通过与实施例1同样的方法，以上述提取的RNA试样为模板进行RT-PCR，得到源自于各被分析物的核酸的扩增片段。

将通过琼脂糖凝胶电泳进行了可视化的有无扩增的研究结果示于表2。在使用含有碱金属盐的RNA提取试剂的情况下，仅确认到RT-PCR时的扩增片段，可知可适当地提取RNA。另外，在使用含有碱金属盐中的碱金属卤化物的RNA提取试剂的情况下，RT-PCR中的扩增效率较高。另外，可知这些RNA提取试剂不抑制DNaseI处理及RT反应、PCR。

[表2]

+：有扩增-：无扩增

[比较例1]

按以下步骤从小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA为模板进行RT-PCR，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段。

(RNA提取试剂的制备)

制备以下组成的含有强离液物质或者多价金属盐或者铵盐的RNA提取试剂。

0.7M强离液物质或者多价金属盐或者铵盐、75mMTAPS(pH8.0)、2.25mMCaCl₂、15mMMgCl₂、175mM乙醇酸、5mM脱氧胆酸、50mMEDTA、0.05％TritonX-100

作为强离液物质，使用硫氰酸胍、盐酸胍、尿素。作为多价金属盐，使用氯化镁、氯化钙、氯化镍、氯化锰。作为铵盐，使用磷酸氢二铵。另外，制备不含作为RNA保护剂的盐而仅含表面活性剂的RNA提取试剂。

(RNA的提取)

(RT-PCR)

通过与实施例1同样的方法，以上述提取的RNA试样为模板进行RT-PCR。

将通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化了的扩增片段的结果示于表2。在使用多价金属盐的情况下，在RT-PCR、PCR中均未确认到扩增片段。由此可知多价金属离子不以RNA保护剂起作用或者抑制酶反应。简言之，在本体系中，多价阳离子不优选作为RNA提取试剂的添加剂。在使用强离液物质、铵盐的情况下，在RT-PCR、PCR中可确认到扩增片段。由此可知可通过强离液物质及铵盐抑制DNaseI处理。简言之，在本体系中，强离液物质及铵盐不优选作为RNA提取试剂的添加剂。在不含作为RNA保护剂的盐的情况下，RNA分解，在RT-PCR、PCR中均未确认到扩增片段。

[比较例2]

(RNA提取试剂的制备)

制备以下组成的不含表面活性剂的RNA提取试剂。

0.7M氯化锂、75mMTAPS(pH8.0)、2.25mMCaCl₂、15mMMgCl₂、50mMEDTA

(RNA的提取)

使用制备的RNA提取试剂，通过与实施例1同样的方法从小鼠采集血液，从被分析物中提取RNA。

(RT-PCR)

将通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化的扩增片段的结果示于表2。在使用不含表面活性剂的RNA提取试剂的情况下，在RT-PCR、PCR中确认到扩增片段。这是因为不含表面活性剂，由此被分析物未完全溶解，无法通过DNaseI除尽DNA。

[实施例3]从培养细胞中提取RNA

按以下步骤从人培养细胞即HEK293T细胞及Jurkat细胞中提取RNA，通过琼脂糖凝胶电泳确认其存在。

(RNA提取试剂的制备)

制备以下组成的含有氯化锂的RNA提取试剂。

0.7M氯化锂、75mMTAPS(pH8.0)、2.25mMCaCl₂、15mMMgCl₂、175mM乙醇酸、5mM脱氧胆酸、50mMEDTA、0.05％TritonX-100

(RNA的提取)

离心分离10³～10⁵个培养细胞，以颗粒的形式回收。在该细胞颗粒中添加RNA提取试剂18μl，在75℃下孵化5分钟。将孵化后的溶液冷却至室温后，添加2μl的DNaseI(10Units分)，以42℃/5分钟→75℃/10分钟孵化。

(RT-PCR)

将上述提取的RNA试样冷却至室温，以各自为模板进行RT-PCR，得到源自于细胞的核酸的扩增片段。RT-PCR以ACTBmRNA为靶向，将正向引物F2(5’-AGATGGCCACGGCTGCT-3’；序列号3)、反向引物R2(5’-AACCGCTCATTGCCAATGG-3’；序列号4)用作引物组。RT-PCR使用PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒Ver.2(Takarabio公司制)相对于反应溶液添加上述制备的RNA试样2％容量进行。反应在50℃/30分钟的逆转录反应、94℃/1分钟的逆转录酶的失活处理后，进行94℃/15秒钟→60℃/15秒钟→72℃/15秒钟的PCR循环30循环。另外，作为阴性对照，在不进行逆转录反应的情况下，进行94℃/15秒钟→60℃/15秒钟→72℃/15秒钟的PCR循环30循环。接着，基于常规方法将RT-PCR产物供与琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段进行可视化。

将通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化的扩增片段示于图1。在将HEK293T细胞、Jurkat细胞设为被分析物的情况下，均确认到特异性扩增片段，可知可适当地提取RNA。

Claims

1.一种用于提取生物试样中的RNA的试剂，其包含碱金属盐及表面活性剂。

2.如权利要求1所述的试剂，其中，碱金属盐为碱金属卤化物。

3.如权利要求1或2所述的试剂，其中，碱金属盐为氯化锂。

4.如权利要求1～3中任一项所述的试剂，其中，表面活性剂含有乙醇酸类。

5.如权利要求4所述的试剂，其中，表面活性剂还含有脱氧胆酸类。

6.一种RNA提取试剂盒，其具有权利要求1～5中任一项所述的试剂。

7.一种提取生物试样中的RNA的方法，该方法包括：使用权利要求1～5中任一项所述的试剂或权利要求6所述的RNA提取试剂盒。