KR101935367B1 - 이온성 액체를 사용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭의 증폭 효율 및 감도를 증가시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

핵산 증폭 방법, 핵산 증폭 저해제를 억제하는 핵산 증폭용 조성물 및 키트,핵산 증폭 저해제의 억제제에 관한 것이다. 생물학적 시료 중의 표적 미생물, 세포 또는 유전자를 높은 증폭 효율 또는 고감도로 신속하게 검출할 수 있고 정확한 분자 진단에 이용할 수 있다.

Description

이온성 액체를 사용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭의 증폭 효율 및 감도를 증가시키는 방법{Method for enhancing efficiency and sensitivity in nucleic acid amplification from biological materials using ionic liquids}
핵산 증폭 방법, 핵산 증폭 저해제를 억제하는 핵산 증폭용 조성물 및 키트, 핵산 증폭 저해제의 억제제에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술은 다양한 생물학적 시료로부터 빠르고 정확한 감염성 질환의 진단을 위해 이용되고 있으며, 그 중요성이 점점 커지고 있는 추세이다. 하지만 진단용 핵산 증폭 기술은 복잡한 생물학적 시료에 존재하는 다양한 핵산 증폭 저해 물질에 의해 세포 용해의 방해, 폴리머라제 및 DNA의 안정성 등에 영향을 받는다. 따라서 다양하고 복잡한 생물학적 시료에 존재하는 핵산 증폭 저해제 제거 기술은, 핵산 증폭 관련 분자진단 방법에 응용되어 더 정확하고 정밀한 진단을 하는 것에 도움을 줄 것으로 예상된다.
분자 진단에는 콧물, 혈액, 대변(분변), 고기 등의 다양한 생물학적 시료가 이용된다. 특히 대변의 경우에는 시료의 변이가 클 뿐만 아니라, 헴(heme), 빌리루빈, 담즙산 염과 복잡하고 다양한 폴리사카라이드 등이 존재하여 정확한 분자 진단을 방해하고 있다. 현재까지 대변 시료 속에 존재하는 다양한 핵산 증폭 저해제를 제거하기 위한 연구들이 진행되어 왔다.
대변 시료의 핵산 증폭 저해제를 제거하는 방법은 처리 순서에 따라 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫번째 방법은 시료 준비의 전처리 과정에서 핵산 증폭 저해제를 제거하는 방법이다. 하지만 이 방법은 과정이 복잡할 뿐만 아니라 반응 및 결합과 용출 완충액에 의한 영향을 많이 받고, 대부분의 핵산 증폭 저해제 전처리 단계에 나타나는 표적 세포의 손실을 막을 수 없다는 단점이 있다. 처리 순서에 따른 또 다른 핵산 증폭 저해제 제거 방법이 후처리 단계, 예를 들어 PCR 마스터 혼합물에 함께 핵산 증폭 저해제 제거 물질을 넣어 주는 방법이다. 이 방법은 전처리 단계에서 나타나는 치명적인 약점인 표적 세포 또는 DNA 손실이 발생하지 않는다는 장점이 있다. 그러나, 후처리 단계에 첨가될 수 있는 핵산 증폭 저해제 제거 물질도 상당수 연구되어 왔고 상업화된 제품들이 있지만 그 효과가 미미한 상태이다. 다양한 화학 물질(아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO, 포름아미드, 글리세롤, PGE, PVP-10 등), 계면활성제(트윈, SDS 등), 생체 분자(gp32 단일 가닥 결합 단백질, 프로티나제 저해제) 등이 연구되었으나 그 효과는 미미하였다. 다만 후처리 단계에 BSA를 넣어준 경우 약간의 핵산 증폭 저해제를 제거하는 효과를 확인할 수 있었다. 하지만 앞서 살펴본 바와 같이 대변 시료의 경우, 시료 간의 변이가 커서 BSA가 핵산 증폭 저해제 제거 효과가 있는 경우도 있었지만, 몇몇 시료에서는 그 효과가 미미하였다.
따라서, 보다 신속하고 정확하게 대변 시료를 포함한 생물학적 시료에서 중의 미량의 표적 물질을 검출할 수 있는 핵산 증폭 방법이 여전히 요구되고 있다.
이온성 액체를 사용하는 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다.
이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공하는 것이다.
이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭용 키트를 제공하는 것이다.
이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭 저해제의 억제제를 제공하는 것이다.
생물학적 시료 및 핵산 증폭용 혼합물을 준비하고, 이들 중 하나 이상에 이온성 액체를 첨가하는 단계,
상기 생물학적 시료와 상기 핵산 증폭용 혼합물을 혼합하여 핵산 증폭용 반응액을 제조하는 단계, 및
핵산을 증폭하는 단계를 포함하고, 상기 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제를 억제하는 것인 핵산 증폭 방법이 제공된다.
용어 "증폭 효율(reaction efficiency)"는 주어진 조건에서 PCR의 각 사이클당 표적 핵산의 평균 증폭 횟수(average number of doublings/cycle)를 의미한다. PCR 반응의 효율은 시료의 순도, 표적 물질의 양, 반응 조건, 반응 저해제의 존재 여부 등에 의해 영향을 받는다. PCR 반응은 일반적으로 주형을 단일가닥으로 분리시키는 변성(denaturation), 프라이머와 주형을 결합시키는 어닐링(anneling) 및 중합효소에 의한 신장(extension)의 단계로 구성된 사이클을 산물의 검출에 적합한 횟수만큼 반복하는 것에 의해 수행된다. 증폭 효율이 높을수록, 검출 가능한 수준까지의 증폭이 단시간 내에 이루어질 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭의 효율은 전체 사이클, 즉, 표적 핵산을 검출 가능한 수준까지 증폭시키기 위해 필요한 사이클을 반복 수행하여 반응을 완료하는데 걸리는 시간으로 해석될 수 있다.
용어 "반응 감도(reaction sensitivity)" 또는 "검출 한계(limit of detection, LOD)는 주어진 핵산 증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR) 조건 하에서 PCR에 의해 신뢰성 있게 검출되고 정량될 수 있는 최소 표적 핵산의 양 또는 카피 수를 의미한다. RT-PCR(real time-PCR)에서는 최대 Rn(Maximum response unit; Max Rn) 또는 임계 사이클(threshold cycle, Ct) 값에 의해 검출 한계를 표현한다. 또한, Ct 값은 PCR의 각 사이클에서 나오는 형광시그널을 분석하여 각 시료에 대해 시료 중의 표적 핵산의 카피 수와 Ct(threshold cycle) 값 간의 그래프를 작성하고 베이스라인(배경 신호)을 측정하여 이보다 현저히 형광시그널이 증가하기 시작하는 지점의 사이클 수를 의미한다.
상기 방법은 생물학적 시료 및 핵산 증폭용 혼합물을 준비하고, 이들 중 하나 이상에 이온성 액체를 첨가하는 단계를 포함한다.
용어 "생물학적 시료(biological materials)"는 생물로부터 수득될 수 있는 모든 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 인간을 포함한 포유동물이나 미생물 등으로부터 유래된 세포, 체액, 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 대변(stool), 분변(feces), 소변, 혈액, 콧물, 침, 점액, 땀, 체액, 세포, 조직, 고기 또는 핵산 중 어느 하나 이상일 수 있고, 또는 이들 중 어느 하나를 희석, 세척, 용해 또는 동결건조시킨 시료일 수 있다. 생물학적 시료는 수계나 인체로부터 채취된 시료를 별도의 핵산 분리 과정 없이 그대로 사용할 수 있다. 세포를 포함하는 유체나 혈액과 같은 체액에 수산화나트륨과 같은 알칼리 용액을 처리하면 세포가 용해되어 내부의 핵산이 방출되며, 그 상태에서 핵산 증폭용 혼합액을 첨가하고 핵산 증폭을 수행할 수 있다. 특히, 시료의 양이 적은 경우, 핵산을 분리하는 과정에서 시료의 상당량이 소실될 수 있고, 시간 및 비용도 소요되므로 시료 자체를 직접 핵산 증폭에 이용하는 것이 유리하다.
용어 "핵산 증폭용 혼합물" 또는 "핵산 증폭용 조성물"은 주형 이외의 핵산 증폭을 수행하기 위해 필요한 성분들을 모두 포함하는 혼합물을 의미하며, "마스터 믹스(master mix)" 또는 "프리 믹스(pre mix)"로 지칭되기도 한다. 상기 조성물은 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 완충액, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭용 혼합물은 각각 1μM 내지 50 mM의 정방향 및 역방향 프라이머, 10 mM Tris HCl pH 8.0 내지 9.0과 같은 중합효소 반응용 완충 용액, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 및 0.5 내지 1U의 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 핵산 증폭용 혼합물은 원하는 반응 용량 및 속도에 따라 x2 내지 x10과 같이 고배수의 농도로 이용될 수 있다.
용어 "이온성 액체(ionic liquid)"는 상온에서 이온들의 결합으로 구성되었음에도 액체 상태로 존재하는 물성을 갖는 물질을 의미한다. 화학적으로는 소금과 유사하지만 소금과 달리 상온에서 액체 상태이고, 물질을 잘 녹이는 성질을 갖는다. 또한, 상온에서 쉽게 증발되지 않아 휘발성 유해물질이 배출되지 않을 뿐만 아니라, 유기 용매에 비해 회수가 용이하기 때문에 재사용이 가능해서 환경친화적 용매로 평가되고 있다. 특히, 촉매나 전지 산업에서 전해질로 응용되고 있다. 예를 들어, 이온성 액체의 양이온은
Figure 112012060017304-pat00001
일 수 있다. 상기 식에서, R1은 H, 페닐기, C1 내지 C20 알킬기, C1 내지 C20 알케닐기 또는 C1 내지 C20 아릴기이고, R2는 H, 페닐기, C1 내지 C20 알킬기, C1 내지 C20 알케닐기 또는 C1 내지 C20 아릴기이고, R3은 H, 페닐기, C1 내지 C20 알킬기, C1 내지 C20 알케닐기 또는 C1 내지 C20 아릴기이고, 또는 R4는 H, 페닐기, C1 내지 C20 알킬기, C1 내지 C20 알케닐기 또는 C1 내지 C20 아릴기일 수 있다. 예를 들어, 이온성 액체의 음이온은 할로젠화물(halide), SCN-, BH4 -, PF6 -, CF3COO-, C6H5COO-, (CF3SO2)2N-, CH3OSO3-, (CN)2N-, NO3 -, CH3COO-, CF3SOO-, (CH3O)2PO2 -, 또는 CH3OSO3 -일 수 있다. 또한, 예를 들어, 이온성 액체는 하기 구조를 갖는 물질일 수 있다;
Figure 112012060017304-pat00002
생물학적 시료 및 핵산 증폭용 혼합물을 준비하고, 이들 중 하나 이상에 이온성 액체를 첨가하는 것은 예를 들면 생물학적 시료, 핵산 증폭용 혼합물, 또는 생물학적 시료 및 핵산 증폭용 혼합물을 혼합한 핵산 증폭용 반응액에 이온성 액체를 첨가하는 것을 포함한다.
상기 방법은 생물학적 시료와 핵산 증폭용 혼합물을 혼합하여 핵산 증폭용 반응액을 제조하는 단계를 포함한다.
용어 "핵산 증폭용 반응액"은 주형까지 첨가되어 핵산 증폭을 수행하기 위해 필요한 모든 성분들이 포함된 반응액을 의미한다.
상기 핵산 증폭용 반응액 중의 이온성 액체의 농도는 0.001%(v/v) 내지 50%(v/v)일 수 있다. 예를 들면 0.001% 내지 30%일 수 있고, 0.001% 내지 10%일 수 있으며, 0.001% 내지 5%일 수 있다.
상기 핵산 증폭용 반응액은 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 이들은 생물학적 시료에 첨가되거나, 또는 핵산 증폭용 혼합물 예를 들면 PCR 마스터 혼합물(master mix.)에 첨가될 수 있다.
상기 방법은 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함한다.
용어 "핵산 증폭(nucleic acid amplification)"은 특정 핵산 서열을 짧은 시간 안에 수만 내지 수십만 배로 증폭할 수 있는 기법을 말한다. 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(thermal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭은 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 신장(elongation)의 단계를 반복한다. 상기 용어 "어닐링(annealing)"은 용어 "혼성화(hybridization)"와 혼용될 수 있다. 또한, 증폭 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 핵산 증폭은 예를 들면 실시간 핵산 증폭일 수 있다. 상기 용어 "실시간 핵산 증폭(Real-Time PCR, RT-PCR)"은 PCR 산물의 증가를 PCR의 매 사이클마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 산물과 반응하는 형광물질의 검출 및 정량에 의해 시료를 분석하는 방법이다.
상기 방법에서 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제(nucleic acid amplification inhibitor)를 억제하는 것이다. 용어 "핵산 증폭 저해제(nucleic acid amplification inhibitor)"는 핵산 증폭 신호가 나타나지 않거나 감소하는 현상을 일으키는 물질을 의미한다. 핵산 증폭 저해제는 다양한 생물학적 시료 또는 식품에 존재하는 물질일 수 있다. 예를 들면, 담즘산(bile acid), 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FeCl3일 수 있다.
상기 용어 '억제(suppress)'는 핵산 증폭 저해제의 기능을 막거나 감소시키는 것을 말하고, 용어 '제거(remove)'와 혼용될 수 있다.
핵산 증폭 저해제를 억제하는 것인 이온성 액체를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 증폭용 조성물이 제공된다.
상기 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 생물학적 시료 또는 식품에 존재할 수 있다. 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 FeCl3일 수 있다.
상기 이온성 액체는 전술한 이온성 액체일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전술한 생물학적 시료일 수 있다.
예를 들면 핵산 증폭용 조성물 중 이온성 액체의 농도는 0.001%(v/v) 내지 50%(v/v)일 수 있다. 예를 들면 0.001% 내지 30%일 수 있고, 0.001% 내지 10%일 수 있으며, 0.001% 내지 5%일 수 있다.
상기 핵산 증폭용 조성물은 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 완충액, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 이들은 핵산 증폭용 혼합물 예를 들어 PCR 마스터 혼합물(master mix.)에 첨가될 수 있다.
핵산 증폭 저해제를 억제하는 것인 이온성 액체를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 증폭용 키트가 제공된다.
상기 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 생물학적 시료 또는 식품에 존재할 수 있다. 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 FeCl3일 수 있다.
상기 이온성 액체는 전술한 이온성 액체일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전술한 생물학적 시료일 수 있다.
상기 키트는 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 완충액, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성 (exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 키트는 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 이들은 핵산 증폭용 혼합물 예를 들어 PCR 마스터 혼합물(master mix.)에 첨가될 수 있다.
이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭 저해제의 억제제가 제공된다.
상기 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 생물학적 시료 또는 식품에 존재할 수 있다. 핵산 증폭 저해제는 예를 들면 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 FeCl3일 수 있다.
상기 이온성 액체는 전술한 이온성 액체일 수 있다.
이온성 액체를 사용하는 핵산 증폭 방법에 의하면, 생물학적 시료 중의 표적 미생물, 세포 또는 유전자를 높은 효율 또는 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
또한, 이온성 액체를 포함하는 조성물 또는 키트에 의하면, 생물학적 시료 중의 표적 미생물, 세포 또는 유전자를 높은 효율 또는 고감도로 신속하게 검출할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료에 존재하는 다양한 핵산 증폭 저해제를 제거 또는 억제함으로써 PCR 효율 또는 민감도가 향상될 수 있고, 정확한 분자 진단에 이용할 수 있다.
아울러, 이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭 저해제의 억제제에 의하면, 생물학적 시료 중의 표적 미생물, 세포 또는 유전자를 높은 효율 또는 고감도로 신속하게 검출할 수 있다.
도 1는 이온성 액체 자체가 PCR 저해를 하지 않는 것을 보여준다.
도 2a는 대변 시료에서 PCR에 대한 이온성 액체의 효과로서, 증폭 프로파일 곡선을 나타낸다.
도 2b는 대변 시료에서 PCR에 대한 이온성 액체의 효과로서, 증폭 프로파일 곡선으로부터 산출된 최대 Rn 값을 나타낸다.
도 2c는 대변 시료에서 PCR에 대한 이온성 액체의 효과로서, 증폭된 PCR 산물을 전기영동한 결과를 나타내고, 도 3d는 상기 전기영동한 결과로부터 산출된 증폭 산물의 양을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 대변 시료에서 PCR에 대한 이온성 액체의 효과로서, 도 3a는 102 카피의 게놈 DNA에 대한 증폭 프로파일 곡선, 도 3b는 101 카피의 게놈 DNA에 대한 증폭 프로파일 곡선, 및 도 3c는 도 3a 및 도 3b로부터 산출된 최대 Rn 값을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4b는 대변 시료에서 PCR에 대한 이온성 액체 또는 BSA(bovine serum albumin)의 효과로서, 도 4a는 103 카피의 게놈 DNA에 대한 증폭 프로파일 곡선을 나타내고, 도 4b는 도 4a로부터 산출된 최대 Rn 값을 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이온성 액체의 PCR 저해 시험
정제된 핵산을 시료로 하는 핵산 증폭에서 이온성 액체에 의하여 PCR이 저해되는지 여부를 조사하였다.
이온성 액체는 1-부틸-3-메틸이미다졸리움 테트라플루오로보레이트 (1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate, BMITF)를 사용하였고, 사용된 중합효소 연쇄 반응용 반응액의 최종 반응 농도는 하기와 같다;
103 카피의 게놈 DNA,
1X PCR 마스터 혼합물, 및
0.5%(v/v) 이온성 액체 또는 정제수.
상기 PCR 마스터 혼합물은 프라이머/프로브, z-taq 폴리머라제(TaKaRa), dNTP, z-taq 완충액을 포함하였다.
정방향 프라이머 : 5'-CGGGTTGTGTTAATTGAAC-3' (서열 번호 1),
역방향 프라이머 : 5'-GAAGCGGCTGAAAAAACCGCA-3' (서열 번호 2),
프로브 : 5'-agaGcaTttAagAttAtgcg-3' (서열 번호 3).
중합효소 연쇄 반응은 TMC1000(삼성)를 사용하여 온도 증감 감도 95℃에서 1초, 60℃에서 5초를 일 사이클로 하여 총 45회 사이클의 핵산 증폭을 수행하였다.
PCR 사이클 횟수에 대한 반응 단위(Response Unit; Rn)로 표시되는 증폭 프로파일 곡선을 도 1에 나타내었다(굵은 실선; 0.5%(v/v)의 이온성 액체 포함함, 점선; 이온성 액체를 포함하지 않음).
도 1에서 나타난 바와 같이, 이온성 액체 자체는 PCR 저해 효과가 없음을 확인할 수 있었다.
대변 시료에서 이온성 액체의 PCR 에 대한 효과
대변 시료에서 이온성 액체의 유무에 따라 PCR의 증폭 효율 및 민감도가 증가하는지 여부를 조사하였다.
사용된 핵산 증폭용 반응액의 최종 반응 농도는 하기와 같다;
대변 용출(elution) 시료,
103 카피의 게놈 DNA,
1X PCR 마스터 혼합물, 및
0.5%(v/v) 이온성 액체 또는 정제수.
상기 PCR 마스터 혼합물의 조성과 핵산 증폭 조건은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
PCR 사이클 횟수에 대한 반응 단위(Response Unit; Rn)로 표시되는 증폭 프로파일 곡선을 획득하고 및 이로부터 산출된 최대 Rn 값을 각각 도 2a 및 2b에 나타내었다(굵은 실선; 0.5%(v/v)의 이온성 액체 포함함, 점선; 이온성 액체를 포함하지 않음).
아울러, 상기 핵산 증폭에 의한 증폭 산물을 아가로즈 젤을 이용한 전기영동 방법으로 크기를 분리시키고 타겟 증폭 산물의 양을 비교하였다(Bioanalyzer 2100, Agilent). 도 2c는 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내고, 이로부터 산출된 증폭 산물의 양을 도 2d에 나타내었다(A; 이온성 액체 + 대변 시료, B; 이온성 액체 무첨가 + 대변 시료, C; 이온성 액체 + 완충액 중 게놈 DNA, D; 이온성 액체 무첨가 + 완충액 중 게놈 DNA).
도 2a 내지 도 2d에서 나타난 바와 같이, 이온성 액체를 사용한 실험의 경우 PCR 증폭 프로파일 곡선의 최대 Rn 값이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. PCR 증폭 산물의 농도를 전기영동 실험을 통해, Rn 값의 증가는 단순한 신호의 증가가 아니라 핵산 증폭 저해제의 제거 또는 억제에 의한 PCR 증폭 효율의 증가로서, 이온성 액체를 사용한 경우 PCR 증폭 산물의 농도가 높아짐을 확인할 수 있었다.
적은 카피 수의 표적 DNA 및 대변 시료에서 이온성 액체의 PCR 에 대한 효과
적은 카피수의 표적을 함유하는 대변 시료에서 이온성 액체의 유무에 따라 PCR의 증폭 효율 및 민감도가 증가하는지 여부를 조사하였다.
사용된 핵산 증폭용 반응액의 최종 반응 농도는 하기와 같다;
대변 용출(elution) 시료,
102 또는 101 카피의 게놈 DNA,
1X PCR 마스터 혼합물, 및
0.5%(v/v) 이온성 액체 또는 정제수.
상기 PCR 마스터 혼합물의 조성과 핵산 증폭 조건은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
PCR 사이클 횟수에 대한 반응 단위(Response Unit; Rn)로 표시되는 증폭 프로파일 곡선을 획득하여 도 3a(102 카피의 게놈 DNA에 대한 증폭 프로파일 곡선) 및 도 3b(101 카피의 게놈 DNA에 대한 증폭 프로파일 곡선)에 나타내었다(굵은 실선; 0.5%(v/v)의 이온성 액체 포함함, 점선; 이온성 액체를 포함하지 않음). 그리고, 도 3a 및 도 3b로부터 산출된 최대 Rn 값을 도 3c에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3c에서 나타난 바와 같이, 저농도 표적 DNA 실험의 경우 이온성 액체를 사용하지 않은 실험에서는 제대로 된 Ct 값을 검출할 수 없는 반면, 이온성 액체를 사용한 실험의 경우에는 Ct 값을 측정할 수 있었다. 이는 대변 시료 중 핵산 증폭 저해제의 영향에 의해 PCR의 증폭 효율 및 민감도가 낮으나, 이온성 액체의 사용에 의하여 PCR의 증폭 효율 및 민감도가 우수해져 검출 한계(Limit of Detection; LOD) 향상을 나타낸다.
대변 시료에서 이온성 액체와 BSA 의 PCR 에 대한 효과 비교
대변 시료에서 이온성 액체와 BSA의 PCR 증폭 효율 및 민감도에 대한 효과를 비교하였다.
사용된 핵산 증폭용 반응액의 최종 반응 농도는 하기와 같다;
대변 용출(elution) 시료,
103 카피의 게놈 DNA,
1X PCR 마스터 혼합물, 및
0.5%(v/v) 이온성 액체, 0.1%(v/v) BSA 또는 정제수.
상기 PCR 마스터 혼합물의 조성과 핵산 증폭 조건은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
PCR 사이클 횟수에 대한 반응 단위(Response Unit; Rn)로 표시되는 증폭 프로파일 곡선을 획득하여 도 4a에 나타내고, 도 4a로부터 산출된 최대 Rn 값을 도 4b에 나타내었다(굵은 실선; 0.5%(v/v)의 이온성 액체 포함함, 점선; 0.1%(v/v)의 BSA를 포함함, 가는 실선; 이온성 액체 및 BSA를 포함하지 않음).
도 4a 내지 도 4b에서 나타난 바와 같이, 일반적으로 대변 시료의 핵산 증폭 저해제를 제거 또는 억제하기 위해 많이 사용되는 BSA만을 사용한 경우와 비교하여, 이온성 액체를 사용한 실험에서 Rn 값이 1 이상 증가하였다. 따라서, BSA만으로는 제거할 수 없는 핵산 증폭 저해제가 이온성 액체에 의해 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
PCR 저해제를 제거 또는 억제하는 효과가 있는 이온성 액체의 스크리닝
이온성 액체 구조식 농도%(v/v) 델타 Rn
1-에틸-3-메틸이미다졸리움 디시안아미드(EMIDC)
Figure 112012060017304-pat00003
 0.50 1.2
0.25 0.7
0.10 0.2
0.00 0.0
1-에틸-3-메틸이미다졸리움 아세테이트(EMIA)
Figure 112012060017304-pat00004
 0.50 0.3
0.25 0.0
0.10 -0.3
0.00 0.0
1-에틸-3-메틸이미다졸리움 트리플레이트(EMITF)
Figure 112012060017304-pat00005
 0.50 0.6
0.25 0.3
0.10 -0.1
0.00 0.0
1-에틸-3-메틸이미다졸리움 에틸설페이트(EMIES)
Figure 112012060017304-pat00006
 1.00 0.3
0.50 0.2
0.10 -0.1
0.00 0.0
1-부틸-3-메틸이미다졸리움 디시안아미드(BMIDC)
Figure 112012060017304-pat00007
 0.50 1.0
0.25 0.4
0.10 0.0
0.00 0.0
1-메틸-1-프로필 피롤리디니움 디시안아미드(MPPDC)
Figure 112012060017304-pat00008
 0.50 1.0
0.25 0.5
0.10 0.2
0.00 0.0
1-부틸-1-메틸 피롤리디니움 디시안아미드(BMPDC)
Figure 112012060017304-pat00009
 0.50 1.0
0.25 0.6
0.10 0.2
0.00 0.0
1-에틸암모늄 나이트레이트(EAN)
Figure 112012060017304-pat00010
 0.50 -0.3
0.25 0.8
0.10 0.2
0.00 0.0
1-부틸-3-메틸이미다졸리움 테트라플루오로보레이트(BMITF)
Figure 112012060017304-pat00011
 1.00 0.8
0.50 1.0
0.00 0.0
1-에틸-3-메틸이미다졸리움 디에틸포스페이트(EMIDP)
Figure 112012060017304-pat00012
 2.00 -0.3
1.00 0.2
0.50 0.0
0.00 0.0
트리헥실테트라데실 포스포니움 디시안아미드 (TTPDC)
Figure 112012060017304-pat00013
 수용액에서 층 분리가 발생하여 사용하지 못함
상기 표에서 델타 Rn(△Rn)은 이온성 액체를 첨가한 경우의 최대 Rn 값에서 이온성 액체를 첨가하지 않은 경우의 최대 Rn 값을 뺀 값이다.
상기 표로부터 BMITF > EMIDC > BMPDC > MPPDC > BMIDC의 순서로 핵산 증폭 저해제 제거 또는 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<110> samsung electronics <120> Method for enhancing efficiency and sensitivity in nucleic acid amplification from biological materials using ionic liquids <130> pn096968 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 cgggttgtgt taattgaac 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 gaagcggctg aaaaaaccgc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 agagcattta agattatgcg 20

Claims (21)

  1. 생물학적 시료 및 핵산 증폭용 혼합물을 준비하고, 이들 중 하나 이상에 이온성 액체를 첨가하는 단계,
    상기 생물학적 시료와 상기 핵산 증폭용 혼합물을 혼합하여 핵산 증폭용 반응액을 제조하는 단계, 및
    핵산을 증폭하는 단계를 포함하고,
    상기 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제를 억제하고,
    상기 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00028
    및
    Figure 112018058119489-pat00029
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하고, 상기 식에서 R1, R2, 및 R3은 각각 H 또는 C1 내지 C20 알킬기이고,
    상기 이온성 액체는 (CN)2N- 및 BF4 -로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음이온을 포함하는 것인 핵산 증폭 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00030
    ,
    Figure 112018058119489-pat00031
    ,
    Figure 112018058119489-pat00032
    ,
    Figure 112018058119489-pat00033
    , 또는
    Figure 112018058119489-pat00034
    인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 생물학적 시료는 대변(stool), 분변(feces), 소변, 혈액, 콧물, 침, 점액, 땀, 체액, 세포, 조직, 고기 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 또는 이를 희석, 세척, 용해 또는 동결건조시킨 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 증폭용 반응액 중의 이온성 액체의 농도는 0.001%(v/v) 내지 50%(v/v)인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 핵산 증폭 저해제는 담즘산(bile acid), 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FeCl3를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 핵산 증폭용 반응액은 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 핵산 증폭 저해제를 억제하는 것인 이온성 액체를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 증폭용 조성물로서,
    상기 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제를 억제하고,
    상기 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00035
    및
    Figure 112018058119489-pat00036
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하고, 상기 식에서 R1, R2, 및 R3은 각각 H 또는 C1 내지 C20 알킬기이고,
    상기 이온성 액체는 (CN)2N- 및 BF4 -로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음이온을 포함하는 것인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00037
    ,
    Figure 112018058119489-pat00038
    ,
    Figure 112018058119489-pat00039
    ,
    Figure 112018058119489-pat00040
    , 또는
    Figure 112018058119489-pat00041
    인 것인 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 생물학적 시료는 대변(stool), 분변(feces), 소변, 혈액, 콧물, 침, 점액, 땀, 체액, 세포, 조직, 고기 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 또는 이를 희석, 세척, 용해 또는 동결건조시킨 것인 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 핵산 증폭용 조성물 중 이온성 액체의 농도는 0.001%(v/v) 내지 50%(v/v)인 것인 조성물.
  11. 청구항 7에 있어서, 핵산 증폭 저해제는 담즘산(bile acid), 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FeCl3를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  13. 핵산 증폭 저해제를 억제하는 것인 이온성 액체를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 증폭용 키트로서,
    상기 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제를 억제하고,
    상기 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00042
    및
    Figure 112018058119489-pat00043
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하고, 상기 식에서 R1, R2, 및 R3은 각각 H 또는 C1 내지 C20 알킬기이고,
    상기 이온성 액체는 (CN)2N- 및 BF4 -로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음이온을 포함하는 것인 키트.
  14. 청구항 13에 있어서, 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00044
    ,
    Figure 112018058119489-pat00045
    ,
    Figure 112018058119489-pat00046
    ,
    Figure 112018058119489-pat00047
    , 또는
    Figure 112018058119489-pat00048
    인 것인 키트.
  15. 청구항 13에 있어서, 생물학적 시료는 대변(stool), 분변(feces), 소변, 혈액, 콧물, 침, 점액, 땀, 체액, 세포, 조직, 고기 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 또는 이를 희석, 세척, 용해 또는 동결건조시킨 것인 키트.
  16. 청구항 13에 있어서, 핵산 증폭 저해제는 담즘산(bile acid), 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FeCl3를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 키트.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 키트는 BSA(bovine serum albumin), 아세트아미드, 베타인, 덱스트란, DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아미드, 글리세롤, 프로스타글란딘 E(prostaglandin E; PGE), PVP(Polyvinylpyrrolidone)-10, 트윈(Tween)-20, 트리톤(Tirton) X, SDS(sodium dodecyl sulfate), gp32 단일 가닥 결합 단백질 및 프로티나제 저해제를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 키트.
  18. 이온성 액체를 포함하는 핵산 증폭 저해제의 억제용 조성물로서,
    상기 이온성 액체는 핵산 증폭 저해제를 억제하고,
    상기 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00049
    및
    Figure 112018058119489-pat00050
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온을 포함하고, 상기 식에서 R1, R2, 및 R3은 각각 H 또는 C1 내지 C20 알킬기이고,
    상기 이온성 액체는 (CN)2N- 및 BF4 -로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음이온을 포함하는 것인 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 이온성 액체는
    Figure 112018058119489-pat00051
    ,
    Figure 112018058119489-pat00052
    ,
    Figure 112018058119489-pat00053
    ,
    Figure 112018058119489-pat00054
    , 또는
    Figure 112018058119489-pat00055
    인 것인 조성물.
  20. 청구항 18에 있어서, 핵산 증폭 저해제는 생물학적 시료에 존재하는 것인 조성물.
  21. 청구항 18에 있어서, 핵산 증폭 저해제는 담즘산(bile acid), 담즙산 염(bile salts), 다당류(polysaccharides), 빌리루빈, 헤파린, 단백질 가수분해성 효소, 페놀 화합물, 뉴클레아제, 폴리아민, 헴(heme), 헤민(hemin), 콜라겐, 멜라닌, 유멜라닌(eumelanin), 미오글로빈, 프로티나제(proteinase), 칼슘 이온, 우레아, 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린 G, 부식산(humic acid), 글로브 파우더, 염화칼슘, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FeCl3를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.
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