CN106566893B

CN106566893B - 一种检测猪肉中病毒的方法和试剂盒

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Publication number: CN106566893B
Application number: CN201610860451.1A
Authority: CN
Inventors: 王传辉
Original assignee: Blue Dream Times Beijing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Lingfu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2036-09-29
Also published as: CN106566893A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种检测猪肉中的病毒的方法和相关试剂盒。本发明的方法无须进行核酸提取，仅通过简单的样本处理即可对猪肉中的病毒DNA或RNA进行检测。操作方便，节省时间和成本。

Description

一种检测猪肉中病毒的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒的检测。

背景技术

现有的组织核酸提取方法，主要为离心柱提取方法和磁珠提取方法。两种方法提取组织核酸时，第一步使用组织裂解液对组织进行消化，组织裂解液成分包括终浓度不低于4M的尿素以及20mg/mL的蛋白酶K；第二步使用高浓度的异硫氰酸胍(不低于2M)变性蛋白；第三步使用高浓度的酒精(70～80％)洗涤；第四步使用低盐的溶液(如双蒸水)对核酸进行洗脱。

蛋白酶K被认为是组织裂解液(基因组DNA提取)的首选。这是一种从腐生菌枯草杆菌(Tritirachium album)中提取的高活性蛋白酶。该酶有两个Ca²⁺结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca²⁺，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80％左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA以抑制依赖于Mg²⁺的核酸酶的作用。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mMCa²⁺而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT(pH8.0)至终浓度为2mM，以鳌合Ca²⁺。

蛋白酶K活力>30U/mg。在37℃，以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。

蛋白酶K能在很大的温度和pH值范围内(有效pH范围4.0～12.5，最佳pH范围7.5～8.0)可保持稳定，催化水解多种多肽键。

蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度，蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50～55℃。

在0.2～1％SDS或1～4M的尿素不会抑制蛋白酶K存在的情况下，蛋白酶K裂解效果更好。蛋白酶K的常用工作浓度为0.05-1mg/ml，根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。

Taq酶和MMLV酶均对一定浓度的尿素、去污剂有耐受性，在低浓度的尿素、去污剂存在下，Taq酶不仅不会受到抑制，反而会有一定的性能提升。

现有技术对猪肉进行检测，必须先对猪肉进行核酸提取，再将提取的核酸加入PCR反应体系进行扩增。程序复杂、费时费工。

发明内容

本发明的目的是提供一种免提取核酸、快速、方便地检测猪肉中的病毒的方法，以解决现有技术中存在的所述问题。

在本发明的第一个方面，本发明的检测猪肉中病毒的方法包括以下步骤：

1)向待检猪肉样品中加入处理液1和蛋白酶K，56～65℃处理待检猪肉，其中，所述处理液1包括1～8M的尿素、1％～10％(V/V)的去污剂，1.6～3M的硫酸铵，以及缓冲液，所述缓冲液为Tris-盐酸(10～200mM)、Tris-硫酸(10～200mM)或Tris-醋酸(10～200mM)，pH 9中的一种；优选地，所述处理液1还包括50～400mM的EDTA、10～50mM的NaCl；

2)向步骤1)的产物混合物中加入处理液2，以终止处理液1中蛋白酶K的作用；其中，步骤1)的产物混合物与处理液2的比例为1:15～1:25(v/v)，优选为1:18～1:20(v/v)；所述处理液2包括0.1～2M的甘氨酸以及缓冲液，所述缓冲液为Tris-盐酸(10～200mM)、Tris-硫酸(10～200mM)或Tris-醋酸(10～200mM)，pH 9中的一种；

3)对步骤2)获得的产物进行PCR扩增，其中，所使用的PCR缓冲液包括进行PCR反应时终浓度为40～70mM的Tris-甘氨酸pH 9.0，终浓度为2.5～5mM的MgCl₂，终浓度为25～80mM的KCl。

优选地，步骤1)中，处理液1和猪肉的比例为1mg猪肉加3～6μL处理液1；优选地，1mg猪肉加4～5μL处理液1；所述蛋白酶K的量为每50mg猪肉样品加入5～80μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，优选地，加入10～20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K。

优选地，所述去污剂为吐温-20或TritonX-100或两者的组合。

优选地，所述猪肉为淋巴结、心、肝、肾等。

优选地，所述猪肉样品至少50mg。

优选地，所述病毒为猪易感RNA病毒；进一步优选地，所述病毒为CSFV、PRRSV或FMDV。

在第二个方面，本发明提供一种检测猪肉中病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的处理液1、蛋白酶K、处理液2和PCR缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，如dNTP、Taq酶、MMLV酶。

本发明中的技术，第一步，使用蛋白酶K对蛋白进行消化，利用尿素变性样本中的蛋白，蛋白酶K和尿素同时还对RNAse有变性作用，对猪肉组织样品进行裂解；硫酸铵沉淀掉一部分样品中的蛋白，同时硫酸铵又作为后续PCR的缓冲液成分；去污剂去除一部分样品中的抑制剂，同时也作为后续PCR的缓冲液成分；第二步，使用甘氨酸终止蛋白酶K作用，同时稀释尿素、去污剂浓度，使得到的产物(即，核酸样本)可以直接进行之后的PCR反应；第三步，使用优化的PCR缓冲液对上述样本进行扩增。本发明的方法无须进行核酸提取，仅通过简单的样本处理即可对猪肉中的病毒DNA或RNA进行检测。操作方便，节省时间和成本。

附图说明

图1为实施例1实验结果图，其中，1-1为使用本发明方法得到的扩增曲线，1-2为对照实验的扩增曲线；

图2为实施例2实验结果图，其中，2-1为使用本发明方法得到的扩增曲线，2-2为对照实验的扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式和实施例说明本发明，但本发明的内容不限于此。如无特殊说明，以下实施方式和实施例中使用的试剂和仪器为本领域常规试剂和仪器，可以通过一般的商购途径获得；所使用的方法为本领域常规使用的方法，本领域技术人员根据现有技术可以毫无疑义地实现所述方法。

以下实施例中使用的部分试剂购自以下厂商：

尿素：购自上海生工，货号A600148；

蛋白酶K：购自武汉华美生物，货号CSB-DP437A，配制为20mg/mL的浓度；

dNTP：购自上海生工，货号D0056-0.5mL。

实施例1：

1.取1例猪瘟病毒阳性的猪淋巴结组织样本(样本收集自北京畜牧兽医研究所)，从三个不同的位置剪取共1g，用手术剪剪碎混匀；

2.称取50mg淋巴结组织样本，加入200μL处理液1(200 mMTris-盐酸，pH 9，4M尿素，1.6M硫酸铵，10体积％Triton X-100)以及10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，56℃消化至澄清；另称取50mg淋巴结组织样本，使用天根生物的病毒RNA提取试剂盒(离心柱法，货号SD101)，按说明书步骤进行提取，作为对照；

3.取30μL经处理液1处理的产物混合物，加入570μL处理液2(200 mM Tris-盐酸，pH 9，1M甘氨酸)混匀；

4.从上述反应的产物混合液中取10μL，加入40μL PCR缓冲液(使得最终PCR反应体系包含40mM的Tris-甘氨酸，pH 9，KCl 30mM，MgCl₂ 3mM，200μM dNTP)，1μL CSFV引物探针混合液(引物探针序列使用GB/T 27540-2011的序列，上游引物：

TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA，10μM，下游引物：

CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT，10μM，探针:5’-FAM-

CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA-TAMRA-3’，5μM)，MMLV

100U(购自Life technology，货号AM2049)，热启动Taq酶2.5U(购自lifetechnology，货号N8080246)，在ABI 7500 Fast机器上进行上机实验，反应程序为：45℃10min，95℃15min；95℃15s，58℃31s，40个循环。

对照组，将天根病毒RNA试剂盒提取得到的RNA，取5μL，按如下配方配制体系(25μL体系)：

在ABI 7500 Fast机器上进行上机实验，反应程序为：45℃10min，95℃15min；95℃15s，58℃31s，40个循环。

图1是实验结果。由图可见，采用本发明的方法检测效率和检测结果明显好于对照组，且本发明的方法无须提取RNA，省时省力。

实施例2

1.取1例口蹄疫病毒阳性的猪淋巴结组织样本(样本收集自北京畜牧兽医研究所)；从三个不同的位置剪取共1g，用手术剪剪碎混匀；

2.称取50mg淋巴结组织样本，加入200μL处理液1(200 mM Tris-盐酸，pH 9，4M尿素，1.6M硫酸铵，10％吐温-20)以及10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，56℃消化至澄清；另称取50mg，使用天根生物的病毒RNA提取试剂盒(离心柱法，货号SD101)，按说明书步骤进行提取，作为对照；

3.取30μL加入处理液1的样本，加入570μL处理液2(200 mM Tris-盐酸，pH 9，1M甘氨酸)混匀，终止蛋白酶K的作用；

4.从上述混合液中取10μL，加入40μL PCR缓冲液(使得PCR最终反应体系包含40mM的Tris-甘氨酸，pH 9，KCl 30mM，MgCl₂ 3mM，200μM dNTP)，1μL FMDV引物探针混合液(引物探针序列使用GB/T 22915-2008的序列，上游引物：TTACAAACCTGTGATGGCCTC，10μM，下游引物：CGGAGATCAACTTCTCCTGTATG，10μM，探针:5’-FAM-CCTCTCCTTTGCACGCCGTGG-TAMRA-3’，5μM)，MMLV 100U(购自Life technology，货号AM2049)，热启动Taq酶2.5U(购自lifetechnology，货号N8080246)，在ABI 7500 Fast机器上进行上机实验，反应程序为：45℃10min，95℃15min；95℃15s，58℃31s，40个循环。

对照组，将天根病毒RNA试剂盒提取得到的RNA，取5μL，按如下配方配制体系(25μL体系):

图2是实验结果，可见利用本发明的方法可以有效扩增口蹄疫病毒，效果比传统方法(扩增提取的RNA)更显著，且方法简单，操作方便，无须提取病毒核酸。

Claims

1.一种检测猪肉中病毒的方法，包括以下步骤：

1）向待检猪肉样品中加入处理液1和蛋白酶K，56~65℃处理待检猪肉，其中，所述处理液1包括1~8M的尿素、1%~10 %（V/V）的去污剂，1.6~3M的硫酸铵，以及缓冲液，所述缓冲液为10~200mM的 Tris-盐酸、10~200mM的 Tris-硫酸或10~200mM的 Tris-醋酸中的一种，缓冲液pH值为pH 9；1mg猪肉加4~5μL处理液1；加入10~20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K；所述去污剂为吐温-20或TritonX-100或两者的组合；所述处理液1还包括50~400mM的EDTA、10~50mM的NaCl；

2）向步骤1）的产物混合物中加入处理液2，步骤1）的产物混合物与处理液2的比例为1:18~1:20（v/v）；所述处理液2包括0.1~2M的甘氨酸以及缓冲液，所述缓冲液为10~200mM 的Tris-盐酸、10~200mM的 Tris-硫酸或10~200mM的 Tris-醋酸中的一种，缓冲液pH值为pH9；

3）对步骤2）获得的产物进行PCR扩增，其中，所使用的PCR缓冲液包括进行PCR反应时终浓度为40~70mM 的Tris-甘氨酸 pH 9.0，终浓度为2.5~5mM 的MgCl₂，终浓度为25~80mM 的KCl；所述猪肉为淋巴结、心、肝、肾；所述猪肉样品至少50mg；所述病毒为CSFV、PRRSV或FMDV。

2.一种检测猪肉中病毒的试剂盒，所述试剂盒包括处理液1、蛋白酶K、处理液2和PCR缓冲液；其特征在于，

所述处理液1包括1~8M的尿素、1%~10 %（V/V）的去污剂，1.6~3M的硫酸铵，以及缓冲液，所述缓冲液为10~200mM的 Tris-盐酸、10~200mM的 Tris-硫酸或10~200mM的 Tris-醋酸中的一种，缓冲液pH值为pH 9；

所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；

所述处理液2包括0.1~2M的甘氨酸以及缓冲液，所述缓冲液为10~200mM的 Tris-盐酸、10~200mM的 Tris-硫酸或10~200mM的 Tris-醋酸中的一种，缓冲液pH值为pH 9；所述处理液1还包括50~400mM的EDTA、10~50mM的NaCl；

所述PCR缓冲液包括进行PCR反应时终浓度为40~70mM 的Tris-甘氨酸 pH 9.0，终浓度为2.5~5mM 的MgCl₂，终浓度为25~80mM 的KCl。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述去污剂为吐温-20或TritonX-100或两者的组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、Taq酶、MMLV酶。