JPH099967A - 核酸合成法 - Google Patents
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- JPH099967A JPH099967A JP7161701A JP16170195A JPH099967A JP H099967 A JPH099967 A JP H099967A JP 7161701 A JP7161701 A JP 7161701A JP 16170195 A JP16170195 A JP 16170195A JP H099967 A JPH099967 A JP H099967A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、不純物の存在下でも核酸増幅が阻
害されないポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を提供す
ることにより、ＰＣＲに付す核酸含有試料の前処理を簡
便、迅速なものとすることを目的とする。 【構成】 ＰＣＲ反応液の２５℃温度条件下でのｐＨ値
を 8.9以上にしたことを特徴とする。
害されないポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を提供す
ることにより、ＰＣＲに付す核酸含有試料の前処理を簡
便、迅速なものとすることを目的とする。 【構成】 ＰＣＲ反応液の２５℃温度条件下でのｐＨ値
を 8.9以上にしたことを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸合成法、特に、ポリ
メラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下
ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
メラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下
ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
【０００３】ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、微生
物に起因する伝染病や遺伝病やガンの診断等に利用され
る。さらに、ＰＣＲは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイ
ピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢
血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、微生
物に起因する伝染病や遺伝病やガンの診断等に利用され
る。さらに、ＰＣＲは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイ
ピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢
血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００４】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。従って、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立つて被験
物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と
称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体からのＤ
ＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するために、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物からＤ
ＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。最近で
はＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフィル
ターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用され
ている。
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。従って、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立つて被験
物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と
称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体からのＤ
ＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するために、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物からＤ
ＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。最近で
はＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフィル
ターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用され
ている。
【０００５】かような精製試薬キットの１つは「ＣＯＬ
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。
ＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販され
ている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前
処理される。
【０００６】１．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全
血を試験管中で「マグネティクパーティクル」とよく混
合し、これにより白血球と「マグネティクパーティク
ル」を結合させる。
血を試験管中で「マグネティクパーティクル」とよく混
合し、これにより白血球と「マグネティクパーティク
ル」を結合させる。
【０００７】２．「マグネティクパーティクル」に結合
した白血球をリン酸緩衝液で洗浄する。
した白血球をリン酸緩衝液で洗浄する。
【０００８】３．「マグネティクパーティクル」に結合
した白血球は、結合状態のままでプロテアーゼで分解
し、これによりたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡ
が遊離される。
した白血球は、結合状態のままでプロテアーゼで分解
し、これによりたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡ
が遊離される。
【０００９】４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を
不活性化するため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮ
Ａを含む溶液を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに
使用される。
不活性化するため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮ
Ａを含む溶液を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに
使用される。
【００１０】一方、ＲＮＡ−ＰＣＲは、目的ＲＮＡを検
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診
断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用され
る。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因
となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
【００１１】ＲＮＡ−ＰＣＲ法では、まず逆転写酵素の
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで
増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ
−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必
須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方
法により精製される。
【００１２】しかし、試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製に
おいて不純物の完全な除去は困難であり、このため引き
続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含
量が少ない場合には、うまくできない場合が多い。ま
た、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作
中のコンタミネーションの機会が高い。
おいて不純物の完全な除去は困難であり、このため引き
続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含
量が少ない場合には、うまくできない場合が多い。ま
た、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作
中のコンタミネーションの機会が高い。
【００１３】上述の“ＣＯＬＬＥＣＴＡＧＥＮＥ”のよ
うな、改良された核酸精製法は、伝統的な手法に比較し
て精製時間が短く、簡単になりつつあるが、それでも精
製に１時間程度は必要であり、また不純物の完全な除去
は困難であり、かつ多段階の操作手順中にＤＮＡがコン
タミネーションする機会は依然として高い。ＰＣＲ法
は、試料中の１分子のＤＮＡでも増幅できるほど鋭敏な
手法なので、コンタミネーションが原因で予期せぬ結果
が得られ重大な問題を引き起しかねない。従って、コン
タミネーションの可能性の低い、より簡便な試料前処理
法が望まれている。
うな、改良された核酸精製法は、伝統的な手法に比較し
て精製時間が短く、簡単になりつつあるが、それでも精
製に１時間程度は必要であり、また不純物の完全な除去
は困難であり、かつ多段階の操作手順中にＤＮＡがコン
タミネーションする機会は依然として高い。ＰＣＲ法
は、試料中の１分子のＤＮＡでも増幅できるほど鋭敏な
手法なので、コンタミネーションが原因で予期せぬ結果
が得られ重大な問題を引き起しかねない。従って、コン
タミネーションの可能性の低い、より簡便な試料前処理
法が望まれている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、不純物の存在下でもＰＣＲが可能な反応法および反
応試薬を提供することにある。
は、不純物の存在下でもＰＣＲが可能な反応法および反
応試薬を提供することにある。
【００１５】本発明の他の目的は、試料中の目的とする
遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供することにあ
る。言い換えれば、試料、特に動物体液由来試料もしく
は試料中に含まれる遺伝子包含体の反応系への直接添加
によってもＰＣＲが可能な反応法および反応試薬を提供
することにある。
遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供することにあ
る。言い換えれば、試料、特に動物体液由来試料もしく
は試料中に含まれる遺伝子包含体の反応系への直接添加
によってもＰＣＲが可能な反応法および反応試薬を提供
することにある。
【００１６】さらに本発明の他の目的は、不純物の存在
下でもＰＣＲが可能な反応法に適した試薬キットを提供
することにある。
下でもＰＣＲが可能な反応法に適した試薬キットを提供
することにある。
【００１７】要約すれば本発明の目的は、動植物組織、
体液および排泄物あるいは環境試料中に存在する遺伝
子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良法および
ＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
体液および排泄物あるいは環境試料中に存在する遺伝
子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良法および
ＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は試料中の目的と
する遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子包含
体または遺伝子包含体を含む試料とＰＣＲ反応液を混合
し反応させることを特徴とする。また、本発明は試料中
の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、反
応液のｐＨ値を 8.9以上（２５℃での値）にしたことを
特徴とする。さらに、ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デ
オキシリボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを
含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に
用いる試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、当該キ
ットを使用するＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温度条件
下で 8.9以上となるｐＨ緩衝能力を有するｐＨ緩衝液と
したことを特徴とする。
する遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子包含
体または遺伝子包含体を含む試料とＰＣＲ反応液を混合
し反応させることを特徴とする。また、本発明は試料中
の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、反
応液のｐＨ値を 8.9以上（２５℃での値）にしたことを
特徴とする。さらに、ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デ
オキシリボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを
含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に
用いる試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、当該キ
ットを使用するＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温度条件
下で 8.9以上となるｐＨ緩衝能力を有するｐＨ緩衝液と
したことを特徴とする。
【００１９】本発明において、遺伝子を含む試料とは、
動植物組織、体液、排泄物あるいは環境試料等をいい、
遺伝子包含体とは細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液
には血液やダ液が含まれ、細胞には血液から分離した白
血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
動植物組織、体液、排泄物あるいは環境試料等をいい、
遺伝子包含体とは細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液
には血液やダ液が含まれ、細胞には血液から分離した白
血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】反応液のｐＨ値は、例えば血液から分離し
た白血球で直接ＰＣＲを行う場合には当該反応液中のｐ
Ｈ値は9.1 （２５℃での値）以上とすることが好まし
い。また、本発明により赤血球の溶血等の前処理を施す
ことなく、血液試料でＰＣＲを行う場合には当該反応液
中のｐＨ値は9.1 （２５℃での値）付近とすることが好
ましい。さらに、ダ液試料より直接ＰＣＲを行う場合に
は当該反応液中のｐＨ値は8.9 （２５℃での値）付近と
することが好ましい。
た白血球で直接ＰＣＲを行う場合には当該反応液中のｐ
Ｈ値は9.1 （２５℃での値）以上とすることが好まし
い。また、本発明により赤血球の溶血等の前処理を施す
ことなく、血液試料でＰＣＲを行う場合には当該反応液
中のｐＨ値は9.1 （２５℃での値）付近とすることが好
ましい。さらに、ダ液試料より直接ＰＣＲを行う場合に
は当該反応液中のｐＨ値は8.9 （２５℃での値）付近と
することが好ましい。
【００２１】試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法に用いる反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇ
Ｃｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌ
クレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ノニデットＰ−４０、ポリオキシエチ
レンソルビタン類等の界面活性剤、ゼラチン、アルブミ
ン等の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加
される場合がある。本発明はＰＣＲ実施者が自身で反応
液を調整して実施することもできるし、またこれらの反
応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提
供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
合成法に用いる反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇ
Ｃｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌ
クレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ノニデットＰ−４０、ポリオキシエチ
レンソルビタン類等の界面活性剤、ゼラチン、アルブミ
ン等の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加
される場合がある。本発明はＰＣＲ実施者が自身で反応
液を調整して実施することもできるし、またこれらの反
応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提
供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
【００２２】
【作用】本発明はＰＣＲの改良法を提供するものであ
り、本発明によれば、従来多用されているｐＨよりも高
いｐＨ条件下でＰＣＲが行われる。つまり、ＰＣＲ法の
一連の加熱サイクルは、２５℃温度条件下でのｐＨ値が
8.9以上の反応液中で行われる。
り、本発明によれば、従来多用されているｐＨよりも高
いｐＨ条件下でＰＣＲが行われる。つまり、ＰＣＲ法の
一連の加熱サイクルは、２５℃温度条件下でのｐＨ値が
8.9以上の反応液中で行われる。
【００２３】本発明によれば、比較的簡単な前処理を行
った試料を用いてＤＮＡ増幅が進行する。例えば、全血
は低張液と混合され、赤血球が破壊される。続いて残っ
た遺伝子包含体が集められる。集められた遺伝子包含体
は、そのまま増幅反応用の試薬類、プライマー及びＤＮ
Ａポリメラーゼ等と混合されＰＣＲサイクルが行われ
る。
った試料を用いてＤＮＡ増幅が進行する。例えば、全血
は低張液と混合され、赤血球が破壊される。続いて残っ
た遺伝子包含体が集められる。集められた遺伝子包含体
は、そのまま増幅反応用の試薬類、プライマー及びＤＮ
Ａポリメラーゼ等と混合されＰＣＲサイクルが行われ
る。
【００２４】一方、本発明によれば、試料、特に動物体
液由来の試料の反応系への直接添加によってもＤＮＡ増
幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等と混合さ
れＰＣＲサイクルが行われる。
液由来の試料の反応系への直接添加によってもＤＮＡ増
幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例え
ば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の
試薬類、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等と混合さ
れＰＣＲサイクルが行われる。
【００２５】上述のいずれの試料を用いた場合も、ＰＣ
Ｒの一工程としてＰＣＲ反応液がＤＮＡの変性の目的で
高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊され
ＤＮＡが遊離される結果、プライマー等のＰＣＲに必要
な試薬がＤＮＡに接触可能となる。この際、ＰＣＲ反応
液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもか
かわらず、この改良されたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅
が生ずる。さらに、ＰＣＲによる増幅産物は、直接制限
酵素等による切断が可能であるため、増幅産物の制限酵
素切断後のフラグメントの長さの比較（ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ）が容易となる。
Ｒの一工程としてＰＣＲ反応液がＤＮＡの変性の目的で
高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊され
ＤＮＡが遊離される結果、プライマー等のＰＣＲに必要
な試薬がＤＮＡに接触可能となる。この際、ＰＣＲ反応
液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもか
かわらず、この改良されたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅
が生ずる。さらに、ＰＣＲによる増幅産物は、直接制限
酵素等による切断が可能であるため、増幅産物の制限酵
素切断後のフラグメントの長さの比較（ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ）が容易となる。
【００２６】本発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclo
hexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいは
ＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と
苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等
種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclo
hexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいは
ＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と
苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等
種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。
【００２７】ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の
中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００２８】本明細書中でプライマーは、核酸と重合用
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。
試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレ
オチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望まし
いが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖
の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが
望ましい。
【００２９】プライマーは、公知の方法により合成する
ことができるし、また、生物界から単離することもでき
る。
ことができるし、また、生物界から単離することもでき
る。
【００３０】本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一
本鎖、二本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意
味する。
本鎖、二本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意
味する。
【００３１】核酸は種々の遺伝子包含体より入手でき
る。両端の一定個数以上のプライマーが準備できれば、
核酸は本発明により増幅することができる。
る。両端の一定個数以上のプライマーが準備できれば、
核酸は本発明により増幅することができる。
【００３２】また、“合成酵素”は、プライマー付加に
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。
よる核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系
を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのク
レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定
されるものではない。
【００３３】さらに、本明細書中で使用している“熱安
定性”は、高温下好ましくは、６５−９５℃でもその活
性を保持する化合物の性質を意味する。
定性”は、高温下好ましくは、６５−９５℃でもその活
性を保持する化合物の性質を意味する。
【００３４】
【実施例】以下の実施例は本発明を説明するものである
が、いかなる意味においても本発明を限定的に解釈する
ための意味を有するものではない。
が、いかなる意味においても本発明を限定的に解釈する
ための意味を有するものではない。
【００３５】実験例１ 本例は血液に簡略な前処理を施した後ＰＣＲを行った実
験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの各段階等で反応液の
ｐＨを一定の値に保つため、反応液に加えるトリス緩衝
液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行った。
験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの各段階等で反応液の
ｐＨを一定の値に保つため、反応液に加えるトリス緩衝
液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行った。
【００３６】ＰＣＲによる増幅を行ったのは、マウスの
β−グロビン遺伝子領域内に位置する１７４塩基のＤＮ
Ａ鎖である。従来技術を用いて以下の２種類のプライマ
ーを作成した。
β−グロビン遺伝子領域内に位置する１７４塩基のＤＮ
Ａ鎖である。従来技術を用いて以下の２種類のプライマ
ーを作成した。
【００３７】Ｐ１：５′ＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴ
ＡＣＴＡＧＣ３′ Ｐ２：５′ＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧ
３′ このＰ１プライマー（Ｐ１、配列番号：１）は、当該Ｄ
ＮＡ鎖のプラス鎖と相同性を有し、Ｐ２プライマー（Ｐ
２、配列番号：２）は、当該ＤＮＡ鎖のマイナス鎖と相
同性を有する。
ＡＣＴＡＧＣ３′ Ｐ２：５′ＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧ
３′ このＰ１プライマー（Ｐ１、配列番号：１）は、当該Ｄ
ＮＡ鎖のプラス鎖と相同性を有し、Ｐ２プライマー（Ｐ
２、配列番号：２）は、当該ＤＮＡ鎖のマイナス鎖と相
同性を有する。
【００３８】本実験には、ヒト白血球の一部にインテグ
レート（integrate)されたＤＮＡのモデルとして、霊長
類の血液に微量のげっ歯類の血液を混合して用いた。ヒ
ト白血球の一部にインテグレートされたＤＮＡとは例え
ば、ウィルスにより生体内に持ち込まれたＤＮＡであ
る。
レート（integrate)されたＤＮＡのモデルとして、霊長
類の血液に微量のげっ歯類の血液を混合して用いた。ヒ
ト白血球の一部にインテグレートされたＤＮＡとは例え
ば、ウィルスにより生体内に持ち込まれたＤＮＡであ
る。
【００３９】まず、Ｂａｌｂ／ｃマウスの全血をリン酸
緩衝液（2.68ｍＭ ＫＣｌ、1.47ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、
8.1ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で
段階希釈し、２μｌ中に白血球が１０4 、１０3 、１０
2 、１０、０個含まれる希釈溶液を得た。
緩衝液（2.68ｍＭ ＫＣｌ、1.47ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、
8.1ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で
段階希釈し、２μｌ中に白血球が１０4 、１０3 、１０
2 、１０、０個含まれる希釈溶液を得た。
【００４０】くえん酸ナトリウム処理をした健常人由来
血液２７μｌ（１μｌ中に5,100 個の白血球を含む）を
0.6ｍｌのディスポーザブルチューブに入れ、上述の段
階希釈したＢａｌｂ／ｃマウス全血希釈液を２μｌずつ
混合した。
血液２７μｌ（１μｌ中に5,100 個の白血球を含む）を
0.6ｍｌのディスポーザブルチューブに入れ、上述の段
階希釈したＢａｌｂ／ｃマウス全血希釈液を２μｌずつ
混合した。
【００４１】これらチューブに１５０μｌの低張液（３
４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え攪拌し
た。チューブを氷中に１分間放置し、浸透圧の低下によ
り赤血球を溶血した後、４℃下10,000回転／分、１分間
遠心分離した。上澄液をマイクロピペットで取り除き、
残査の白血球ペレットをそのままＤＮＡ増幅反応に使用
した。
４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え攪拌し
た。チューブを氷中に１分間放置し、浸透圧の低下によ
り赤血球を溶血した後、４℃下10,000回転／分、１分間
遠心分離した。上澄液をマイクロピペットで取り除き、
残査の白血球ペレットをそのままＤＮＡ増幅反応に使用
した。
【００４２】反応液のｐＨとＤＮＡ増幅の度合いの関係
を調べるためにｐＨを種々に調整したトリス緩衝液を作
成した。
を調べるためにｐＨを種々に調整したトリス緩衝液を作
成した。
【００４３】すなわち、まずトリスを蒸留水に溶かして
１モルの水溶液を作成した。その後、当該溶液を６部に
分割し、各々に塩酸溶液を滴下して、各々ｐＨを２５℃
の温度条件下で8.3 、9.1 、9.5 、10.0、10.5、11.0に
調整した。これらトリス緩衝液は、以下の表１に記載し
た反応液の構成成分として使用した。
１モルの水溶液を作成した。その後、当該溶液を６部に
分割し、各々に塩酸溶液を滴下して、各々ｐＨを２５℃
の温度条件下で8.3 、9.1 、9.5 、10.0、10.5、11.0に
調整した。これらトリス緩衝液は、以下の表１に記載し
た反応液の構成成分として使用した。
【００４４】表１ ＰＣＲのための反応液 １０ｍＭトリス緩衝液：上記６種の１Ｍトリス緩衝液を
反応液中の最終のトリス濃度が１０ｍＭになるように加
えた。
反応液中の最終のトリス濃度が１０ｍＭになるように加
えた。
【００４５】プライマーＰ１とＰ２が各々１μＭ ＭｇＣｌ2 1.5ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ４種のデオキシリボヌクレオチド各々２００μＭ すな
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 2.5単位（パーキンエルマー
シータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の白血球ペレットに、この反応液１００μｌを加え
たチューブに７５μｌの鉱物油を加えた。
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 2.5単位（パーキンエルマー
シータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の白血球ペレットに、この反応液１００μｌを加え
たチューブに７５μｌの鉱物油を加えた。
【００４６】以下にＰＣＲ法の反応過程を説明する。ま
ず、反応液の入ったチューブは、９４℃の温度条件下に
１分半置かれた。これにより、ＤＮＡの遊離と変性が行
われる。 その後に、以下の表２の温度サイクルを使っ
て、ＰＣＲが４０回行われた。
ず、反応液の入ったチューブは、９４℃の温度条件下に
１分半置かれた。これにより、ＤＮＡの遊離と変性が行
われる。 その後に、以下の表２の温度サイクルを使っ
て、ＰＣＲが４０回行われた。
【００４７】表２ ＰＣＲの温度サイクル 変性 ９４℃ １分間 プライマーの付着 ５５℃ １分間 （アニーリング） プライマー伸長 ７２℃ １分間 最後に７２℃で伸長反応を７分間行なって反応を終了さ
せた。
せた。
【００４８】増幅されたＤＮＡを検出するために、アガ
ロースゲル電気泳動法を使用した。３％のアガロースゲ
ルに、ＰＣＲ終了後の反応液１０μｌを添加し、ＴＡＥ
緩衝液中（４０ｍＭ トリス酢酸と１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ8.0 ）で、３〜４Ｖ／ｃｍの電圧下に４０分間電気
泳動した。その後、発けい光試薬として 0.5μｇ／ｍｌ
のエチジウムブロマイド溶液を使用し、ＤＮＡバンドを
検出した。
ロースゲル電気泳動法を使用した。３％のアガロースゲ
ルに、ＰＣＲ終了後の反応液１０μｌを添加し、ＴＡＥ
緩衝液中（４０ｍＭ トリス酢酸と１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ8.0 ）で、３〜４Ｖ／ｃｍの電圧下に４０分間電気
泳動した。その後、発けい光試薬として 0.5μｇ／ｍｌ
のエチジウムブロマイド溶液を使用し、ＤＮＡバンドを
検出した。
【００４９】すでに知られているところによれば、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタンは双極子形のイオン性
緩衝液であり、２０℃でのｐＫａは8.3 、そのΔｐＫａ
は−0.021 である。従って、ＰＣＲ中の反応液のｐＨ値
は、２５℃での測定値より低くなっているであろうこと
が予測される。
スヒドロキシメチルアミノメタンは双極子形のイオン性
緩衝液であり、２０℃でのｐＫａは8.3 、そのΔｐＫａ
は−0.021 である。従って、ＰＣＲ中の反応液のｐＨ値
は、２５℃での測定値より低くなっているであろうこと
が予測される。
【００５０】ＰＣＲの加熱周期の間での実際のｐＨを知
るために、種々の温度下で反応液のｐＨを測定した。す
なわち、上述のＰＣＲ反応溶液を２５℃、５５℃、７０
℃のインキュベータ内に置き、そのｐＨをｐＨメーター
で測定した。以下の表３はその測定結果である。
るために、種々の温度下で反応液のｐＨを測定した。す
なわち、上述のＰＣＲ反応溶液を２５℃、５５℃、７０
℃のインキュベータ内に置き、そのｐＨをｐＨメーター
で測定した。以下の表３はその測定結果である。
【００５１】 表３ 一定温度下での反応液のｐＨ １Ｍ Tris 温 度 緩衝液のｐＨ ２５℃ ５５℃ ７０℃ 8.3 8.2 7.4 7.1 9.1 8.9 8.1 7.8 9.5 9.1 8.3 8.0 10.0 9.3 8.5 8.1 10.5 9.4 8.6 8.3 11.0 9.4 8.6 8.3 実験例１のＰＣＲ後の反応液のＤＮＡゲル電気泳動図を
図１に示した。図１中でＡ〜Ｆは、ＰＣＲ反応液の作成
に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違いを示す。すな
わち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄは10.0、Ｅは
10.5、Ｆは11.0のｐＨを各々示している。さらに、図１
中の１〜５の数字は、各々ターゲットＤＮＡが含まれて
いるマウス白血球の濃度を示している。すなわち、１は
１０4 個、２は１０3 個、３は１０2 個、４は１０個、
５は０個のマウス白血球がＰＣＲ反応液中に含まれてい
ることを示している。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩで
切断した２５０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、分
子量マーカーとして用いている。図中Ｔは増幅目的とし
たＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示している。
図１に示した。図１中でＡ〜Ｆは、ＰＣＲ反応液の作成
に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違いを示す。すな
わち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄは10.0、Ｅは
10.5、Ｆは11.0のｐＨを各々示している。さらに、図１
中の１〜５の数字は、各々ターゲットＤＮＡが含まれて
いるマウス白血球の濃度を示している。すなわち、１は
１０4 個、２は１０3 個、３は１０2 個、４は１０個、
５は０個のマウス白血球がＰＣＲ反応液中に含まれてい
ることを示している。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩで
切断した２５０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、分
子量マーカーとして用いている。図中Ｔは増幅目的とし
たＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示している。
【００５２】レーンＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５で
は、ＤＮＡバンドは検出されていない。すなわち、通常
のＰＣＲで用いられているｐＨ8.3 のトリス緩衝液を用
いて作成したＰＣＲ反応液を使用した場合には、反応液
が１０4 個のマウス白血球を含んでいてもＤＮＡ鎖の増
幅が生じなかった。
は、ＤＮＡバンドは検出されていない。すなわち、通常
のＰＣＲで用いられているｐＨ8.3 のトリス緩衝液を用
いて作成したＰＣＲ反応液を使用した場合には、反応液
が１０4 個のマウス白血球を含んでいてもＤＮＡ鎖の増
幅が生じなかった。
【００５３】これに反して、ｐＨ9.1 のトリス緩衝液を
用いて作成したＰＣＲ反応液を使用した場合には、Ｂ１
とＢ２のレーンで増幅されたＤＮＡが検出された。つま
り、マウス白血球濃度が比較的高い１０4 、１０3 個の
白血球を含む反応系において、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
が観察された。
用いて作成したＰＣＲ反応液を使用した場合には、Ｂ１
とＢ２のレーンで増幅されたＤＮＡが検出された。つま
り、マウス白血球濃度が比較的高い１０4 、１０3 個の
白血球を含む反応系において、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
が観察された。
【００５４】増幅されたＤＮＡバンドはさらに、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆの１、２レーンのみならず、各々の３レーン
でも検出された。これは、ｐＨが9.5 、10.0、10.5、1
1.0の緩衝液を使用して作成した反応液を用いてＰＣＲ
を行った場合には、１０4 個、１０3 個のマウス白血球
という比較的白血球濃度が高い状態のみならず、マウス
白血球１０2 個を含んだ反応系でもＤＮＡ増幅が生じた
ことを現わしている。
Ｄ、Ｅ、Ｆの１、２レーンのみならず、各々の３レーン
でも検出された。これは、ｐＨが9.5 、10.0、10.5、1
1.0の緩衝液を使用して作成した反応液を用いてＰＣＲ
を行った場合には、１０4 個、１０3 個のマウス白血球
という比較的白血球濃度が高い状態のみならず、マウス
白血球１０2 個を含んだ反応系でもＤＮＡ増幅が生じた
ことを現わしている。
【００５５】実験例２ 本例は実験例１と同じく血液に簡略な前処理を行った後
ＰＣＲを行った実験である。本実験例においては、ＰＣ
Ｒ反応液のｐＨ緩衝液として、ＣＨＥＳ緩衝液(2-(Cycl
ohexylamino)ethanesulfonic acid)とＣＡＰＳＯ緩衝液
(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic aci
d) を使用した。
ＰＣＲを行った実験である。本実験例においては、ＰＣ
Ｒ反応液のｐＨ緩衝液として、ＣＨＥＳ緩衝液(2-(Cycl
ohexylamino)ethanesulfonic acid)とＣＡＰＳＯ緩衝液
(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic aci
d) を使用した。
【００５６】増幅の目的としたＤＮＡは、実験例１で使
用したマウス遺伝子の一部分と同一である。ウィルスに
感染した人間の血液のモデルである実験血液系も実験例
１とほぼ同一であり、以下に述べるように作成された。
用したマウス遺伝子の一部分と同一である。ウィルスに
感染した人間の血液のモデルである実験血液系も実験例
１とほぼ同一であり、以下に述べるように作成された。
【００５７】くえん酸ナトリウム処理をした健常人由来
血液26.5μｌ（１μｌ中に 5,200個の白血球を含む）を
ディスポーザブルチューブに入れた。段階希釈したＢａ
ｌｂ／ｃマウス全血希釈液２μｌをチューブに入れ混合
して、目的ＤＮＡ濃度の異なる実験血液系を作成した。
この実験血液系は、各々マウス白血球を１０4 、１
０3 、１０2 、１０、０個ずつ含んでいる。
血液26.5μｌ（１μｌ中に 5,200個の白血球を含む）を
ディスポーザブルチューブに入れた。段階希釈したＢａ
ｌｂ／ｃマウス全血希釈液２μｌをチューブに入れ混合
して、目的ＤＮＡ濃度の異なる実験血液系を作成した。
この実験血液系は、各々マウス白血球を１０4 、１
０3 、１０2 、１０、０個ずつ含んでいる。
【００５８】全血の前処理は、実験例１と同様に行っ
た。すなわち、１５０μｌの低張液（３４ｍＭ ＮａＣ
ｌと１ｍＭ ＥＤＴＡ）をそれぞれのチューブに加え、
よく混合した。チューブを氷中に５分間放置し、浸透圧
の低下により赤血球を溶血した後、４℃で10,000回転／
分、１分間遠心分離した。上澄液をマイクロピペットで
取り除き、残査の白血球ペレットをそのままＤＮＡ増幅
反応に使用した。
た。すなわち、１５０μｌの低張液（３４ｍＭ ＮａＣ
ｌと１ｍＭ ＥＤＴＡ）をそれぞれのチューブに加え、
よく混合した。チューブを氷中に５分間放置し、浸透圧
の低下により赤血球を溶血した後、４℃で10,000回転／
分、１分間遠心分離した。上澄液をマイクロピペットで
取り除き、残査の白血球ペレットをそのままＤＮＡ増幅
反応に使用した。
【００５９】反応溶液作成には、トリス緩衝液の代り
に、ＣＨＥＳあるいはＣＡＰＳＯ緩衝液を使用した以外
は、実験例１と同一である。
に、ＣＨＥＳあるいはＣＡＰＳＯ緩衝液を使用した以外
は、実験例１と同一である。
【００６０】ＣＨＥＳ緩衝液は、以下のように作成し
た。ＣＨＥＳを蒸留水に溶解して２００ｍＭのＣＨＥＳ
水溶液を作り、２つに分割する。各々の溶液に水酸化ナ
トリウム水溶液を滴下し、そのｐＨを２５℃温度条件下
で8.3 と9.0 に各々調整した。
た。ＣＨＥＳを蒸留水に溶解して２００ｍＭのＣＨＥＳ
水溶液を作り、２つに分割する。各々の溶液に水酸化ナ
トリウム水溶液を滴下し、そのｐＨを２５℃温度条件下
で8.3 と9.0 に各々調整した。
【００６１】ＣＡＰＳＯ緩衝液は、以下のように作成し
た。ＣＡＰＳＯを蒸留水に溶解して２００ｍＭのＣＡＰ
ＳＯ水溶液を作り、水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、
そのｐＨを２５℃温度条件下で9.5 に調整した。これら
緩衝液は、以下の表４に記載したＰＣＲの反応液の構成
成分として使用した。
た。ＣＡＰＳＯを蒸留水に溶解して２００ｍＭのＣＡＰ
ＳＯ水溶液を作り、水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、
そのｐＨを２５℃温度条件下で9.5 に調整した。これら
緩衝液は、以下の表４に記載したＰＣＲの反応液の構成
成分として使用した。
【００６２】表４ ＰＣＲのための反応液 １０ｍＭＣＨＥＳ緩衝液：上述の２００ｍＭＣＨＥＳ緩
衝液のいずれかをＣＨＥＳの最終濃度が１０ｍＭになる
ように加える。
衝液のいずれかをＣＨＥＳの最終濃度が１０ｍＭになる
ように加える。
【００６３】あるいは、 １０ｍＭＣＡＰＳＯ緩衝液：上述の２００ｍＭＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液をＣＡＰＳＯの最終濃度が１０ｍＭになるよう
に加える。
Ｏ緩衝液をＣＡＰＳＯの最終濃度が１０ｍＭになるよう
に加える。
【００６４】プライマーＰ１とＰ２が各々１μＭ ＭｇＣｌ2 1.5ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ４種のデオキシリボヌクレオチド各々２００μＭ すな
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 2.5単位（パーキンエルマー
シータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の白血球ペレットに、この反応液１００μｌを加え
たチューブに７５μｌの鉱物油を加えた。加熱サイクル
の条件及びゲル電気泳動による増幅ＤＮＡの検出方法も
実験例１と同様である。
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 2.5単位（パーキンエルマー
シータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の白血球ペレットに、この反応液１００μｌを加え
たチューブに７５μｌの鉱物油を加えた。加熱サイクル
の条件及びゲル電気泳動による増幅ＤＮＡの検出方法も
実験例１と同様である。
【００６５】文献によれば、ＣＨＥＳのｐＫａは9.3 で
あり、ＣＡＰＳＯのｐＫａは10.0と報告されている。異
なった温度条件下で反応液のｐＨを測定した結果は、以
下の表５の通りであった。
あり、ＣＡＰＳＯのｐＫａは10.0と報告されている。異
なった温度条件下で反応液のｐＨを測定した結果は、以
下の表５の通りであった。
【００６６】 表５ 一定温度下での反応液のｐＨ ２５℃ ５５℃ ７０℃ ２００ｍＭＣＨＥＳ ｐＨ 8.3 8.1 7.5 7.2 ２００ｍＭＣＨＥＳ ｐＨ 9.0 8.9 8.2 7.8 ２００ｍＭＣＡＰＳＯ ｐＨ 9.5 9.4 8.6 8.2 実験例２のＰＣＲ後の反応液中のＤＮＡのゲル電気泳動
図を図２に示した。図２の各レーンに付した記号のう
ち、Ａは２００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ8.3 、Ｂは２０
０ｍＭＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ9.0 、Ｃは２００ｍＭＣＡＰ
ＳＯ緩衝液ｐＨ 9.5を用いたことを示している。さら
に、図２中のレーンに付した１〜５の数字は、ターゲッ
トＤＮＡが含まれているマウス白血球の濃度を示してい
る。すなわち、１は１０4 個、２は１０3 個、３は１０
2 個、４は１０個、５は０個のマウス白血球が含まれて
いたことを示している。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩ
で切断した２５０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、
分子量マーカーとして用いている。図中Ｔは増幅目的と
したＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示している。
図を図２に示した。図２の各レーンに付した記号のう
ち、Ａは２００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ8.3 、Ｂは２０
０ｍＭＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ9.0 、Ｃは２００ｍＭＣＡＰ
ＳＯ緩衝液ｐＨ 9.5を用いたことを示している。さら
に、図２中のレーンに付した１〜５の数字は、ターゲッ
トＤＮＡが含まれているマウス白血球の濃度を示してい
る。すなわち、１は１０4 個、２は１０3 個、３は１０
2 個、４は１０個、５は０個のマウス白血球が含まれて
いたことを示している。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩ
で切断した２５０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、
分子量マーカーとして用いている。図中Ｔは増幅目的と
したＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示している。
【００６７】ｐＨ8.3 のＣＨＥＳ緩衝液を用いて作成し
たＰＣＲ反応液でＰＣＲを行った場合には、Ａ１とＡ２
レーンで増幅された弱いＤＮＡバンドが検出された。ｐ
Ｈ9.0 のＣＨＥＳ緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液
でＰＣＲを行った場合には、Ｂ１、Ｂ２のレーンで強
い、Ｂ３のレーンで弱い増幅されたＤＮＡバンドが検出
された。ＣＡＰＳＯ緩衝液ｐＨ9.5 を用いて作成したＰ
ＣＲ反応液を使用した場合には、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３のレ
ーンで増幅されたＤＮＡが観察された。
たＰＣＲ反応液でＰＣＲを行った場合には、Ａ１とＡ２
レーンで増幅された弱いＤＮＡバンドが検出された。ｐ
Ｈ9.0 のＣＨＥＳ緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液
でＰＣＲを行った場合には、Ｂ１、Ｂ２のレーンで強
い、Ｂ３のレーンで弱い増幅されたＤＮＡバンドが検出
された。ＣＡＰＳＯ緩衝液ｐＨ9.5 を用いて作成したＰ
ＣＲ反応液を使用した場合には、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３のレ
ーンで増幅されたＤＮＡが観察された。
【００６８】従って、ｐＨが高く保たれることがＤＮＡ
の増幅に正の効果を及ぼすことが観察された。
の増幅に正の効果を及ぼすことが観察された。
【００６９】実験例３ 本例は血液を試料とし、実験例１、２とは異なる前処理
を行った後ＰＣＲ反応を行った実験である。
を行った後ＰＣＲ反応を行った実験である。
【００７０】この実験では、カニクイザル血液にリン酸
緩衝液で段階希釈したマウス血液を添加した血液を試料
とした。実験例１、２と同様に、マウス血液中のＤＮＡ
は、カニクイザルに持ち込まれた外来性ＤＮＡのモデル
である。
緩衝液で段階希釈したマウス血液を添加した血液を試料
とした。実験例１、２と同様に、マウス血液中のＤＮＡ
は、カニクイザルに持ち込まれた外来性ＤＮＡのモデル
である。
【００７１】Balb/cマウスの全血をリン酸緩衝液（2.68
ｍＭ ＫＣｌ、1.47ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、 8.1ｍＭ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で段階希釈し、
２μｌに白血球が１０4 、１０3 、１０2 、１０、０個
含む溶液を作成した。
ｍＭ ＫＣｌ、1.47ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 、 8.1ｍＭ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で段階希釈し、
２μｌに白血球が１０4 、１０3 、１０2 、１０、０個
含む溶液を作成した。
【００７２】くえん酸ナトリウム処理をしたカニクイザ
ル血液９μｌ（１μｌ中に白血球15,000個を含む）をデ
ィスポーザブルチューブに入れた。このチューブに上記
マウス全血希釈液を２μｌずつ加えた。
ル血液９μｌ（１μｌ中に白血球15,000個を含む）をデ
ィスポーザブルチューブに入れた。このチューブに上記
マウス全血希釈液を２μｌずつ加えた。
【００７３】ＡＭＲＡＤ Operations Pty Ltd.からＣ
ＯＬＬＥＣＴＡＧＥＮＥの名称で販売されているマグネ
ティクパーティクル溶液をその取扱い説明に従い、リン
酸緩衝液で５１倍に希釈した。そのリン酸緩衝液２５２
μｌを上記血液が含まれているチューブに加え、室温条
件下に１０分間放置したのち、白血球が付着したマグネ
ティクパーティクルを磁石で一端に集め、溶液はピペッ
トで取り除いた。
ＯＬＬＥＣＴＡＧＥＮＥの名称で販売されているマグネ
ティクパーティクル溶液をその取扱い説明に従い、リン
酸緩衝液で５１倍に希釈した。そのリン酸緩衝液２５２
μｌを上記血液が含まれているチューブに加え、室温条
件下に１０分間放置したのち、白血球が付着したマグネ
ティクパーティクルを磁石で一端に集め、溶液はピペッ
トで取り除いた。
【００７４】白血球が付着したマグネティクパーティク
ルは、これ以降の洗浄、精製等の処理を行うことなく、
次のＰＣＲ反応行程に使用した。ＰＣＲのプライマーと
反応条件等は、実験例１と同様である。ここでも、反応
液のｐＨとＤＮＡ増幅との関係を知るために、トリス緩
衝液のｐＨのみが異なる２つの反応液でＰＣＲを行っ
た。すなわち、実験例１で述べたと同一の方法により、
ｐＨ8.3 とｐＨ9.5 の１Ｍトリス緩衝液を作成した。
ルは、これ以降の洗浄、精製等の処理を行うことなく、
次のＰＣＲ反応行程に使用した。ＰＣＲのプライマーと
反応条件等は、実験例１と同様である。ここでも、反応
液のｐＨとＤＮＡ増幅との関係を知るために、トリス緩
衝液のｐＨのみが異なる２つの反応液でＰＣＲを行っ
た。すなわち、実験例１で述べたと同一の方法により、
ｐＨ8.3 とｐＨ9.5 の１Ｍトリス緩衝液を作成した。
【００７５】この２種類のｐＨ緩衝液を使用して、表１
に記載したプライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ
等を含むＰＣＲ反応液を作成しチューブ中の白血球付着
粒子に１００μｌづつ加え、更に７５μｌの鉱物油を加
えた。ＰＣＲの温度サイクル（表２に記載した）とゲル
電気泳動による検出条件もまた実験例１と同一である。
に記載したプライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ
等を含むＰＣＲ反応液を作成しチューブ中の白血球付着
粒子に１００μｌづつ加え、更に７５μｌの鉱物油を加
えた。ＰＣＲの温度サイクル（表２に記載した）とゲル
電気泳動による検出条件もまた実験例１と同一である。
【００７６】実験例３のＰＣＲ終了後の反応液のＤＮＡ
ゲル電気泳動図を図３に示した。図３中ＡはＰＣＲがｐ
Ｈ8.3 のトリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を
使用して行われたことを示し、ＢはＰＣＲがｐＨ9.5 の
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用して
行われたことを示している。また数字の１〜５は、目的
ＤＮＡを含むマウス白血球の異なる濃度を示すものであ
り、１は１０4 個、２は１０3 個、３は１０2 個、４は
１０個、５は０個を示す。文字Ｍは分子量マーカーを示
し、制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５０ｎｇのφＸ
１７４ＲＦＤＮＡである。図中Ｔは増幅目的としたＤＮ
Ａ鎖バンドの泳動位置を示している。
ゲル電気泳動図を図３に示した。図３中ＡはＰＣＲがｐ
Ｈ8.3 のトリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を
使用して行われたことを示し、ＢはＰＣＲがｐＨ9.5 の
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用して
行われたことを示している。また数字の１〜５は、目的
ＤＮＡを含むマウス白血球の異なる濃度を示すものであ
り、１は１０4 個、２は１０3 個、３は１０2 個、４は
１０個、５は０個を示す。文字Ｍは分子量マーカーを示
し、制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５０ｎｇのφＸ
１７４ＲＦＤＮＡである。図中Ｔは増幅目的としたＤＮ
Ａ鎖バンドの泳動位置を示している。
【００７７】図３のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４あるいはＡ
５レーンには、目的ＤＮＡのバンドが検出されていな
い。つまり、通常のＰＣＲで用いられているｐＨ8.3 の
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用した
場合には、１０4 個のマウス白血球を含んでいてもＤＮ
Ａの増幅が生じなかった。
５レーンには、目的ＤＮＡのバンドが検出されていな
い。つまり、通常のＰＣＲで用いられているｐＨ8.3 の
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用した
場合には、１０4 個のマウス白血球を含んでいてもＤＮ
Ａの増幅が生じなかった。
【００７８】これに対して、図３のＢ１、Ｂ２レーンに
は、目的ＤＮＡのバンドが検出された。すなわち、ｐＨ
9.5 のトリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使
用した場合には、マウス白血球を１０3 、１０4 個含む
反応系で目的ＤＮＡの増幅が生じた。
は、目的ＤＮＡのバンドが検出された。すなわち、ｐＨ
9.5 のトリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使
用した場合には、マウス白血球を１０3 、１０4 個含む
反応系で目的ＤＮＡの増幅が生じた。
【００７９】以上述べたように本実験例３は、実験例
１、２と異なる前処理を施した試料を使用してＰＣＲを
行った。本実験例３においてもＰＣＲ反応が、高ｐＨ条
件で夾雑物の阻害が少なく行なわれることが確認され
た。
１、２と異なる前処理を施した試料を使用してＰＣＲを
行った。本実験例３においてもＰＣＲ反応が、高ｐＨ条
件で夾雑物の阻害が少なく行なわれることが確認され
た。
【００８０】実験例４ 本例は前処理を行わずに血液に直接ＰＣＲ反応液を加え
てＰＣＲを行った実験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの
各段階等で反応液のｐＨを一定の値に保つため、反応液
に加えるトリス緩衝液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行っ
た。
てＰＣＲを行った実験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの
各段階等で反応液のｐＨを一定の値に保つため、反応液
に加えるトリス緩衝液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行っ
た。
【００８１】ＰＣＲによる増幅を行ったのは、ヒトのβ
−グロビン遺伝子領域内に位置する４０８塩基のＤＮＡ
鎖である。従来技術を用いて以下の２種類のプライマー
を作成した。
−グロビン遺伝子領域内に位置する４０８塩基のＤＮＡ
鎖である。従来技術を用いて以下の２種類のプライマー
を作成した。
【００８２】ＧＨ２０：５´ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧ
ＡＣＡＧＧＴＡＣ３´ ＧＨ２１：５´ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧ
ＣＡＧ３´ (Saiki,R.K. et al., Science 239 487-491(1988) このＧＨ２０プライマー（配列番号：３）は当該ＤＮＡ
鎖のプラス鎖と相同性を有し、ＧＨ２１プライマー（配
列番号：４）は当該ＤＮＡ鎖のマイナス鎖と相同性を有
する。
ＡＣＡＧＧＴＡＣ３´ ＧＨ２１：５´ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧ
ＣＡＧ３´ (Saiki,R.K. et al., Science 239 487-491(1988) このＧＨ２０プライマー（配列番号：３）は当該ＤＮＡ
鎖のプラス鎖と相同性を有し、ＧＨ２１プライマー（配
列番号：４）は当該ＤＮＡ鎖のマイナス鎖と相同性を有
する。
【００８３】くえん酸ナトリウム処理をした健常人血液
２、１、または０．１μｌ（１μｌ中に３７００個の白
血球を含む）を直接、ＤＮＡ増幅反応に使用した。
２、１、または０．１μｌ（１μｌ中に３７００個の白
血球を含む）を直接、ＤＮＡ増幅反応に使用した。
【００８４】反応液のｐＨとＤＮＡ増幅の度合いの関係
を調べるために実験例１で作成したｐＨを種々に調整し
たトリス緩衝液を使用した。
を調べるために実験例１で作成したｐＨを種々に調整し
たトリス緩衝液を使用した。
【００８５】すなわち、まずトリスを蒸留水に溶かして
１モルの水溶液を作成した。その後、当該溶液を４部に
分割し、各々に塩酸溶液を滴下して、各々ｐＨを２５℃
の温度条件下で8.3 、9.1 、9.5 、10.0に調整した。こ
れらトリス緩衝液は、以下の表６に記載した反応液の構
成成分として使用した。
１モルの水溶液を作成した。その後、当該溶液を４部に
分割し、各々に塩酸溶液を滴下して、各々ｐＨを２５℃
の温度条件下で8.3 、9.1 、9.5 、10.0に調整した。こ
れらトリス緩衝液は、以下の表６に記載した反応液の構
成成分として使用した。
【００８６】表６ ＰＣＲのための反応液 １０ｍＭトリス緩衝液：上記４種の１Ｍトリス緩衝液を
反応液中の最終のトリス濃度が１０ｍＭになるように加
えた。
反応液中の最終のトリス濃度が１０ｍＭになるように加
えた。
【００８７】プライマーＧＨ２０とＧＨ２１が各々０．
６μＭ ＭｇＣｌ2 1.5ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ４種のデオキシリボヌクレオチド各々２００μＭ すな
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 1.25 単位（パーキンエルマ
ーシータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の血液に、この反応液５０μｌを加えたチューブに
５０μｌの鉱物油を加えた。
６μＭ ＭｇＣｌ2 1.5ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ４種のデオキシリボヌクレオチド各々２００μＭ すな
わち、 デオキシ−アデノシン−三リン酸（ｄＡＴＰ） デオキシ−グアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ） デオキシ−チミジン−三リン酸（ｄＴＴＰ） デオキシ−シチジン−三リン酸（ｄＣＴＰ） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 1.25 単位（パーキンエルマ
ーシータス社の市販品「Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ」を使用） 前記の血液に、この反応液５０μｌを加えたチューブに
５０μｌの鉱物油を加えた。
【００８８】以下にＰＣＲ法の反応過程を説明する。ま
ず、反応液の入ったチューブは、９４℃の温度条件下に
４分置かれた。これにより、ＤＮＡの遊離と変性が行わ
れる。 その後に、以下の表７の温度サイクルを使っ
て、ＰＣＲが５０回行われた。
ず、反応液の入ったチューブは、９４℃の温度条件下に
４分置かれた。これにより、ＤＮＡの遊離と変性が行わ
れる。 その後に、以下の表７の温度サイクルを使っ
て、ＰＣＲが５０回行われた。
【００８９】表７ ＰＣＲの温度サイクル 変性 ９４℃ １分間 プライマーの付着 ５５℃ １分間 （アニーリング） プライマー伸長 ７２℃ １分間 最後に７２℃で伸長反応を７分間行なった。
【００９０】増幅されたＤＮＡを検出するために、アガ
ロースゲル電気泳動法を使用した。３％のアガロースゲ
ルに、ＰＣＲ終了後の反応液１０μｌを添加し、ＴＡＥ
緩衝液中（４０ｍＭ トリス酢酸と１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ8.0 ）で、３〜４Ｖ／ｃｍの電圧下に６０分間電気
泳動した。その後、発けい光試薬として 0.5μｇ／ｍｌ
のエチジウムブロマイド溶液を使用し、ＤＮＡバンドを
検出した。
ロースゲル電気泳動法を使用した。３％のアガロースゲ
ルに、ＰＣＲ終了後の反応液１０μｌを添加し、ＴＡＥ
緩衝液中（４０ｍＭ トリス酢酸と１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ8.0 ）で、３〜４Ｖ／ｃｍの電圧下に６０分間電気
泳動した。その後、発けい光試薬として 0.5μｇ／ｍｌ
のエチジウムブロマイド溶液を使用し、ＤＮＡバンドを
検出した。
【００９１】次に、ＰＣＲ増幅産物の制限酵素による切
断を行った。即ち、血液０．１μｌにｐＨ９．５の１Ｍ
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を加え、Ｐ
ＣＲを行った後の反応液１μｌに、５０ｍＭトリス・塩
酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ
ジチオトレイトール、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび
１５ユニットの制限酵素、ＨｉｎｆＩ溶液または１０ｍ
Ｍトリス・塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび１２ユニットの制限酵素、ＨａｅＩＩＩ溶液
９μｌを混合し、３７℃１時間反応後、全反応液を用い
てアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡバンドを検出
した。
断を行った。即ち、血液０．１μｌにｐＨ９．５の１Ｍ
トリス緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を加え、Ｐ
ＣＲを行った後の反応液１μｌに、５０ｍＭトリス・塩
酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ
ジチオトレイトール、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび
１５ユニットの制限酵素、ＨｉｎｆＩ溶液または１０ｍ
Ｍトリス・塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび１２ユニットの制限酵素、ＨａｅＩＩＩ溶液
９μｌを混合し、３７℃１時間反応後、全反応液を用い
てアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡバンドを検出
した。
【００９２】実験例４のＰＣＲ後の反応液のＤＮＡゲル
電気泳動図を図４に示した。図４中でＡ〜Ｄは、ＰＣＲ
反応液の作成に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違い
を示す。すなわち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄ
は10.0のｐＨを各々示している。さらに、図４中の１〜
３の数字は、各々，ＰＣＲ反応を行った血液量を示して
いる。すなわち、１は２μｌ、２は１μｌ、３は０．１
μｌの血液がＰＣＲ反応液中に含まれていることを示し
ている。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５
０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、分子量マーカー
として用いている。図中Ｔは増幅目的としたＤＮＡ鎖バ
ンドの泳動位置を示している。
電気泳動図を図４に示した。図４中でＡ〜Ｄは、ＰＣＲ
反応液の作成に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違い
を示す。すなわち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄ
は10.0のｐＨを各々示している。さらに、図４中の１〜
３の数字は、各々，ＰＣＲ反応を行った血液量を示して
いる。すなわち、１は２μｌ、２は１μｌ、３は０．１
μｌの血液がＰＣＲ反応液中に含まれていることを示し
ている。文字Ｍは制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５
０ｎｇのφＸ１７４ＲＦＤＮＡであり、分子量マーカー
として用いている。図中Ｔは増幅目的としたＤＮＡ鎖バ
ンドの泳動位置を示している。
【００９３】レーンＡ１、Ａ２、Ａ３では、ＤＮＡバン
ドは検出されていない。すなわち、通常のＰＣＲで用い
られているｐＨ8.3 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反
応液を使用した場合には、反応液中に微量の血液が存在
してもＤＮＡ鎖の増幅が生じなかった。
ドは検出されていない。すなわち、通常のＰＣＲで用い
られているｐＨ8.3 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反
応液を使用した場合には、反応液中に微量の血液が存在
してもＤＮＡ鎖の増幅が生じなかった。
【００９４】これに反して、ｐＨ9.1 またはｐＨ9.5 の
緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用したＢ、Ｃ
の場合には、２と３のレーンで増幅されたＤＮＡが検出
された。つまり、１μｌ以下の血液を含む反応系におい
て、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が観察された。さらに、ｐ
Ｈ１０．０の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使
用した場合には、Ｄ３のレーンでは増幅されたＤＮＡの
バンドが検出された。つまり、０．１μｌの血液を含む
反応系において、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が観察され
た。
緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用したＢ、Ｃ
の場合には、２と３のレーンで増幅されたＤＮＡが検出
された。つまり、１μｌ以下の血液を含む反応系におい
て、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が観察された。さらに、ｐ
Ｈ１０．０の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使
用した場合には、Ｄ３のレーンでは増幅されたＤＮＡの
バンドが検出された。つまり、０．１μｌの血液を含む
反応系において、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が観察され
た。
【００９５】続いて、図５を参照しながら、ＰＣＲ増幅
産物の制限酵素による切断の結果を考察する。図５は、
ｐＨ9.5 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用
した０．１μｌの血液のＰＣＲ増幅産物（本反応液中の
ＤＮＡバンドは図４中のＣ３レーンにあらわされてい
る）の制限酵素による切断後のゲル電気泳動図である。
図５の中で、Ｘは制限酵素ＨｉｎｆＩ、Ｙは制限酵素Ｈ
ａｅＩＩＩを用いて切断したＰＣＲ増幅産物の泳動レー
ンを示している。また、文字Ｍは図１と同じ分子量マー
カーの泳動レーンを示し、ＴｘはＰＣＲ増幅産物がＨｉ
ｎｆＩで切断された場合の、ＴｙはＰＣＲ増幅産物がＨ
ａｅＩＩＩで切断された場合の予想されるＤＮＡバンド
の泳動位置を示している。図５から、どちらの制限酵素
を用いた場合もＰＣＲ増幅産物が完全に切断されている
ことが明らかである。
産物の制限酵素による切断の結果を考察する。図５は、
ｐＨ9.5 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用
した０．１μｌの血液のＰＣＲ増幅産物（本反応液中の
ＤＮＡバンドは図４中のＣ３レーンにあらわされてい
る）の制限酵素による切断後のゲル電気泳動図である。
図５の中で、Ｘは制限酵素ＨｉｎｆＩ、Ｙは制限酵素Ｈ
ａｅＩＩＩを用いて切断したＰＣＲ増幅産物の泳動レー
ンを示している。また、文字Ｍは図１と同じ分子量マー
カーの泳動レーンを示し、ＴｘはＰＣＲ増幅産物がＨｉ
ｎｆＩで切断された場合の、ＴｙはＰＣＲ増幅産物がＨ
ａｅＩＩＩで切断された場合の予想されるＤＮＡバンド
の泳動位置を示している。図５から、どちらの制限酵素
を用いた場合もＰＣＲ増幅産物が完全に切断されている
ことが明らかである。
【００９６】実験例５ 本例は前処理を行わずにだ液に直接ＰＣＲ反応液を加え
てＰＣＲを行った実験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの
各段階等で反応液のｐＨを一定の値に保つため、反応液
に加えるトリス緩衝液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行っ
た。
てＰＣＲを行った実験である。ＰＣＲ中の熱サイクルの
各段階等で反応液のｐＨを一定の値に保つため、反応液
に加えるトリス緩衝液のｐＨを種々変えてＰＣＲを行っ
た。
【００９７】試料として、健常人のだ液２または１μｌ
を何らの前処理なしに直接ＰＣＲ反応液に加え、ＰＣＲ
を行った。
を何らの前処理なしに直接ＰＣＲ反応液に加え、ＰＣＲ
を行った。
【００９８】使用したＰＣＲ反応液は実験例４と同じで
ある。また、ＰＣＲの条件は加熱サイクルを４０回とし
た以外は実験例４と同じである。増幅されたＤＮＡの検
出も、実験例４と同じくアガロースゲル電気泳動法で行
った。
ある。また、ＰＣＲの条件は加熱サイクルを４０回とし
た以外は実験例４と同じである。増幅されたＤＮＡの検
出も、実験例４と同じくアガロースゲル電気泳動法で行
った。
【００９９】実験例５のＰＣＲ後の反応液のＤＮＡゲル
電気泳動図を図６に示した。図６中でＡ〜Ｄは、ＰＣＲ
反応液の作成に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違い
を示す。すなわち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄ
は10.0のｐＨを各々示している。さらに、図６中の１、
２の数字は、各々，ＰＣＲを行っただ液量を示してい
る。すなわち、１は２μｌ、２は１μｌのだ液がＰＣＲ
反応液中に含まれていることを示している。文字Ｍは制
限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５０ｎｇのφＸ１７４
ＲＦＤＮＡであり、分子量マーカーとして用いている。
図中Ｔは増幅目的としたＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示
している。
電気泳動図を図６に示した。図６中でＡ〜Ｄは、ＰＣＲ
反応液の作成に使用した１Ｍトリス緩衝液のｐＨの違い
を示す。すなわち、Ａは8.3 、Ｂは9.1 、Ｃは9.5 、Ｄ
は10.0のｐＨを各々示している。さらに、図６中の１、
２の数字は、各々，ＰＣＲを行っただ液量を示してい
る。すなわち、１は２μｌ、２は１μｌのだ液がＰＣＲ
反応液中に含まれていることを示している。文字Ｍは制
限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した２５０ｎｇのφＸ１７４
ＲＦＤＮＡであり、分子量マーカーとして用いている。
図中Ｔは増幅目的としたＤＮＡ鎖バンドの泳動位置を示
している。
【０１００】レーンＡ１，Ａ２では、目的ＤＮＡバンド
は検出されていない。すなわち、通常のＰＣＲで用いら
れているｐＨ8.3 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応
液を使用し、だ液を反応液中に直接添加した場合には、
だ液中の細胞のＤＮＡ増幅が生じなかった。
は検出されていない。すなわち、通常のＰＣＲで用いら
れているｐＨ8.3 の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応
液を使用し、だ液を反応液中に直接添加した場合には、
だ液中の細胞のＤＮＡ増幅が生じなかった。
【０１０１】これに反して、ｐＨ9.1 、ｐＨ9.5 または
ｐＨ10.0の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用
したＢ、Ｃ、Ｄの１及び２のレーンでは増幅されたβ−
グロビン特異的ＤＮＡ断片のバンドが検出された。つま
り、ＰＣＲに使用する反応液のｐＨを従来法のＰＣＲで
用いられているｐＨ以上に設定することにより初めて、
だ液中のＤＮＡが何ら前処理をすることなしに直接増幅
されることが示された。
ｐＨ10.0の緩衝液を用いて作成したＰＣＲ反応液を使用
したＢ、Ｃ、Ｄの１及び２のレーンでは増幅されたβ−
グロビン特異的ＤＮＡ断片のバンドが検出された。つま
り、ＰＣＲに使用する反応液のｐＨを従来法のＰＣＲで
用いられているｐＨ以上に設定することにより初めて、
だ液中のＤＮＡが何ら前処理をすることなしに直接増幅
されることが示された。
【０１０２】以上の実験例からも明らかなように本発明
を適切に実施するためには、ＰＣＲ反応液自体のｐＨを
一定値以上に保つことが必要である。反応液自体のｐＨ
は、反応液の構成成分及び反応液に加えるｐＨ緩衝液の
種類、濃度、ｐＨ等に左右されることは周知の事実であ
り、以上の実験例に使用したｐＨ緩衝液の種類、濃度、
ｐＨ等は本発明を適切に実施するために使用可能なｐＨ
緩衝液の例示にすぎない。
を適切に実施するためには、ＰＣＲ反応液自体のｐＨを
一定値以上に保つことが必要である。反応液自体のｐＨ
は、反応液の構成成分及び反応液に加えるｐＨ緩衝液の
種類、濃度、ｐＨ等に左右されることは周知の事実であ
り、以上の実験例に使用したｐＨ緩衝液の種類、濃度、
ｐＨ等は本発明を適切に実施するために使用可能なｐＨ
緩衝液の例示にすぎない。
【０１０３】本発明の適切な実施のために、適切なｐＨ
緩衝液を含む試薬類を一組として提供することができ
る。すなわち、ＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温度条件
下で 8.9以上、ＰＣＲのアニーリング温度である５５℃
で 8.1以上、ＰＣＲのプライマー伸長反応温度である７
０℃で 7.8以上となるように設計されたｐＨ緩衝液を含
み、それ以外の構成成分として適切な量、濃度のＭｇＣ
ｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、デオキシリボヌクレオチド類、
プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、その他の添加剤の
全て、あるいは任意の組み合せを含むＰＣＲキットの提
供である。
緩衝液を含む試薬類を一組として提供することができ
る。すなわち、ＰＣＲ反応液のｐＨが２５℃の温度条件
下で 8.9以上、ＰＣＲのアニーリング温度である５５℃
で 8.1以上、ＰＣＲのプライマー伸長反応温度である７
０℃で 7.8以上となるように設計されたｐＨ緩衝液を含
み、それ以外の構成成分として適切な量、濃度のＭｇＣ
ｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、デオキシリボヌクレオチド類、
プライマー、熱安定性ポリメラーゼ、その他の添加剤の
全て、あるいは任意の組み合せを含むＰＣＲキットの提
供である。
【０１０４】
【発明の効果】本発明により、不純物を含む試料から粗
分離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加
しても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能
となる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処
理が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料
の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
分離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加
しても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能
となる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処
理が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料
の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
【０１０５】また、本発明により、遺伝子包含体を含有
する試料を直接核酸合成用反応液系に添加して、目的の
遺伝子を効率良く合成することが可能となる。
する試料を直接核酸合成用反応液系に添加して、目的の
遺伝子を効率良く合成することが可能となる。
【０１０６】更に、上述の試薬キットを使用すれば、本
発明にかかる改良ＰＣＲ法が容易に実施される結果、本
発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、ＰＣＲ
法が簡便に行なえるようになる。
発明にかかる改良ＰＣＲ法が容易に実施される結果、本
発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、ＰＣＲ
法が簡便に行なえるようになる。
【０１０７】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GCA CAG CTG TGT TTA CTA GC
【０１０８】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CAC ATA CCT CCT TCC ACT CG
【０１０９】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC
【０１１０】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GGA AAA TAG ACC AAT AGG CAG
【図１】図１は、実験例１で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
【図２】図２は、実験例２で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
【図３】図３は、実験例３で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
【図４】図４は、実験例４で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
【図５】図５は、実験例４で行ったＰＣＲの増幅産物の
制限酵素による切断により生じたＤＮＡ断片を検出する
ために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図５の中
で、Ｘは制限酵素ＨｉｎｆＩ、Ｙは制限酵素ＨａｅＩＩ
Ｉを用いて切断したＰＣＲ増幅産物の泳動レーンを示し
ている。また、ＴｘはＰＣＲ増幅産物がＨｉｎｆＩで切
断された場合の、ＴｙはＰＣＲ増幅産物がＨａｅＩＩＩ
で切断された場合の予想されるＤＮＡバンドの泳動位置
を示している。
制限酵素による切断により生じたＤＮＡ断片を検出する
ために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図５の中
で、Ｘは制限酵素ＨｉｎｆＩ、Ｙは制限酵素ＨａｅＩＩ
Ｉを用いて切断したＰＣＲ増幅産物の泳動レーンを示し
ている。また、ＴｘはＰＣＲ増幅産物がＨｉｎｆＩで切
断された場合の、ＴｙはＰＣＲ増幅産物がＨａｅＩＩＩ
で切断された場合の予想されるＤＮＡバンドの泳動位置
を示している。
【図６】図６は、実験例５で増幅されたＤＮＡを検出す
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
るために用いたゲル電気泳動の泳動図である。図中Ｔは
増幅目的としたＤＮＡ鎖の泳動バンドを示している。
Claims (3)
- 【請求項１】 試料中の目的とする遺伝子を増幅する核
酸合成法において、試料中の遺伝子包含体もしくは試料
そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応させることを
特徴とする核酸合成法。 - 【請求項２】 試料中の目的とする遺伝子を増幅する核
酸合成法において、反応液のｐＨ値を 8.9以上（２５℃
での値）にしたことを特徴とする核酸合成法。 - 【請求項３】 ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び熱安定性ポリメラーゼを含み試
料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用いる
試薬キットにおいて、当該ｐＨ緩衝液が、当該キットを
使用する遺伝子増幅反応液のｐＨが２５℃の温度条件下
で 8.9以上となるｐＨ緩衝能力を有するｐＨ緩衝液とし
たことを特徴とする核酸合成法に用いる試薬キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16170195A JP3494509B2 (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 核酸合成法 |
| EP19960108791 EP0751226B1 (en) | 1995-06-28 | 1996-05-31 | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE69637516T DE69637516D1 (de) | 1995-06-28 | 1996-05-31 | Verfahren für die Amplifizierung von Nukleinsäure-Sequenzen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16170195A JP3494509B2 (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 核酸合成法 |
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH099967A true JPH099967A (ja) | 1997-01-14 |
| JP3494509B2 JP3494509B2 (ja) | 2004-02-09 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16170195A Expired - Lifetime JP3494509B2 (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 核酸合成法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0751226B1 (ja) |
| JP (1) | JP3494509B2 (ja) |
| DE (1) | DE69637516D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09238687A (ja) * | 1996-03-08 | 1997-09-16 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
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| ES2194843T3 (es) * | 1992-09-11 | 2003-12-01 | Hoffmann La Roche | Deteccion de acidos nucleicos en sangre. |
-
1995
- 1995-06-28 JP JP16170195A patent/JP3494509B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-31 EP EP19960108791 patent/EP0751226B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-31 DE DE69637516T patent/DE69637516D1/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09238687A (ja) * | 1996-03-08 | 1997-09-16 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3494509B2 (ja) | 2004-02-09 |
| EP0751226B1 (en) | 2008-05-07 |
| DE69637516D1 (de) | 2008-06-19 |
| EP0751226A2 (en) | 1997-01-02 |
| EP0751226A3 (en) | 2000-11-02 |
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