JPH1080280A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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- JPH1080280A JPH1080280A JP8238113A JP23811396A JPH1080280A JP H1080280 A JPH1080280 A JP H1080280A JP 8238113 A JP8238113 A JP 8238113A JP 23811396 A JP23811396 A JP 23811396A JP H1080280 A JPH1080280 A JP H1080280A
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- saliva
- nucleic acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、唾液試料中の目的とする遺伝子を
前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】 本発明は、唾液試料そのものと遺伝子増
幅反応液を混合し反応させる核酸合成法において、反応
前に唾液試料を加温処理或いは糖分解酵素で処理する。
例えば、唾液試料を０〜４０℃で１時間加温した後に直
接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った結果。図３の
電気泳動図に示す如く、加温の温度が上昇するにしたが
い、生成されるＰＣＲ産物の量が増大し、特に３０℃以
上において、すべての唾液添加量で、電気泳動で検出す
るのに充分な量のＰＣＲ産物が生成される。
前処理なしで直接増幅出来る核酸合成法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】 本発明は、唾液試料そのものと遺伝子増
幅反応液を混合し反応させる核酸合成法において、反応
前に唾液試料を加温処理或いは糖分解酵素で処理する。
例えば、唾液試料を０〜４０℃で１時間加温した後に直
接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った結果。図３の
電気泳動図に示す如く、加温の温度が上昇するにしたが
い、生成されるＰＣＲ産物の量が増大し、特に３０℃以
上において、すべての唾液添加量で、電気泳動で検出す
るのに充分な量のＰＣＲ産物が生成される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法で
ある。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１
−２７４６９７号に述べられている。
【０００３】ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染
症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも
適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に
選ばれる場合が多い。
分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の
核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染
症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも
適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に
選ばれる場合が多い。
【０００４】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが良く知られている。
【０００５】そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からの核酸の抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフ
ィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用
されている。
つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子
包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体
からの核酸の抽出が必要である。阻害を除去するため
に、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフ
ィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用
されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
【０００７】遺伝子検査のための検査材料としては、末
梢血液が用いられる場合が多い。しかし、口腔粘膜細胞
は、その採取の容易さ、感染性の低さにおいて、末梢血
液よりも検査材料としてすぐれている。通常、口腔粘膜
細胞からＤＮＡを抽出する方法として、ブラシ等で剥離
した口腔粘膜細胞を蛋白分解酵素で処理した後、先に示
したいずれかの精製法でＤＮＡを精製する方法が用いら
れている。しかし、この方法を用いた場合には、先に述
べたように不純物除去の不完全さ、ＤＮＡ回収のばらつ
き等の回収されたＤＮＡの質および量の問題のみなら
ず、操作の繁雑さに由来する多検体処理の困難さ、処理
に要する時間が長い事、操作中のコンタミネーションの
機会が高い事等の多くの問題点を包含している。
梢血液が用いられる場合が多い。しかし、口腔粘膜細胞
は、その採取の容易さ、感染性の低さにおいて、末梢血
液よりも検査材料としてすぐれている。通常、口腔粘膜
細胞からＤＮＡを抽出する方法として、ブラシ等で剥離
した口腔粘膜細胞を蛋白分解酵素で処理した後、先に示
したいずれかの精製法でＤＮＡを精製する方法が用いら
れている。しかし、この方法を用いた場合には、先に述
べたように不純物除去の不完全さ、ＤＮＡ回収のばらつ
き等の回収されたＤＮＡの質および量の問題のみなら
ず、操作の繁雑さに由来する多検体処理の困難さ、処理
に要する時間が長い事、操作中のコンタミネーションの
機会が高い事等の多くの問題点を包含している。
【０００８】そこで、本発明は、唾液中の目的とする遺
伝子を直接増幅できる核酸合成法を提供することを目的
とする。言い換えれば、唾液よりＤＮＡを精製すること
なしに、核酸合成反応に用いる方法を提供することにあ
る。
伝子を直接増幅できる核酸合成法を提供することを目的
とする。言い換えれば、唾液よりＤＮＡを精製すること
なしに、核酸合成反応に用いる方法を提供することにあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本件発明者は、先ずＰＣ
Ｒによる増幅効率が悪い唾液試料を長時間低温、例えば
５℃中で保存する事により増幅効率が上昇する事を見出
だし、次に唾液試料をＰＣＲ反応液に添加する前に種々
の温度で処理したところ、処理温度が上昇するに従い、
かつ処理時間が長くなるに従い、増幅効率が上昇する事
を見出だした。一方、糖の一種であるヘパリンで処理し
た血液から精製したＤＮＡは高率にＰＣＲを抑制する事
は良く知られている。我々は、これら２つの事実より、
唾液中のＰＣＲ抑制物質の主たるものは、何らかの糖で
あり、唾液保存中に唾液中の分解酵素がＰＣＲ抑制の原
因となっている糖を分解したためにＰＣＲの効率が上昇
したのではないかと推測した。
Ｒによる増幅効率が悪い唾液試料を長時間低温、例えば
５℃中で保存する事により増幅効率が上昇する事を見出
だし、次に唾液試料をＰＣＲ反応液に添加する前に種々
の温度で処理したところ、処理温度が上昇するに従い、
かつ処理時間が長くなるに従い、増幅効率が上昇する事
を見出だした。一方、糖の一種であるヘパリンで処理し
た血液から精製したＤＮＡは高率にＰＣＲを抑制する事
は良く知られている。我々は、これら２つの事実より、
唾液中のＰＣＲ抑制物質の主たるものは、何らかの糖で
あり、唾液保存中に唾液中の分解酵素がＰＣＲ抑制の原
因となっている糖を分解したためにＰＣＲの効率が上昇
したのではないかと推測した。
【００１０】そこで、更に唾液を糖分解酵素の一種であ
るアミラーゼで処理した後、ＰＣＲに用いたところ、ア
ミラーゼを添加しない場合に比べ、低温、短時間処理で
唾液由来のＰＣＲ抑制物質が分解されることを見出だ
し、本発明をなすに至った。
るアミラーゼで処理した後、ＰＣＲに用いたところ、ア
ミラーゼを添加しない場合に比べ、低温、短時間処理で
唾液由来のＰＣＲ抑制物質が分解されることを見出だ
し、本発明をなすに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、唾液よりＤＮＡを精
製することなしに、核酸合成反応に用いるものである。
そのため本発明は、唾液中のＰＣＲ抑制の原因となって
いる糖を分解する方法を提供する。唾液中のＰＣＲ抑制
の原因となっている糖を分解する方法の一つとしては、
加温処理する方法が挙げられる。したがって、第１の発
明は、唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反
応させる核酸合成法において、反応前に唾液試料を加温
処理することを特徴とする。唾液試料とは、唾液そのも
の、又は唾液希釈液をいう。また反応前とは、唾液試料
とＰＣＲ反応液を添加する前、後のいずれも指すが、Ｐ
ＣＲ反応液添加前に唾液試料のみを加温処理することが
好ましい。ＰＣＲ反応液添加後に加温処理すれば、プラ
イマーダイマー等の非特異的増幅産物が増大する可能性
があるので、適切なプライマーの選択が必要である。こ
の際、あらかじめＤＮＡ合成酵素の活性をＤＮＡ合成酵
素に対する抗体等で抑制しておけば、非特異的増幅産物
の増大が抑えられる。また、非特異的増幅産物の増大を
抑える他の方法として、ＰＣＲ反応液を構成する成分の
一部（例えば、ＤＮＡ合成酵素又はプライマー）を除い
た反応液に唾液試料を直接添加したものを加温処理した
後、除いておいた成分を混合する方法が考えられる。
製することなしに、核酸合成反応に用いるものである。
そのため本発明は、唾液中のＰＣＲ抑制の原因となって
いる糖を分解する方法を提供する。唾液中のＰＣＲ抑制
の原因となっている糖を分解する方法の一つとしては、
加温処理する方法が挙げられる。したがって、第１の発
明は、唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反
応させる核酸合成法において、反応前に唾液試料を加温
処理することを特徴とする。唾液試料とは、唾液そのも
の、又は唾液希釈液をいう。また反応前とは、唾液試料
とＰＣＲ反応液を添加する前、後のいずれも指すが、Ｐ
ＣＲ反応液添加前に唾液試料のみを加温処理することが
好ましい。ＰＣＲ反応液添加後に加温処理すれば、プラ
イマーダイマー等の非特異的増幅産物が増大する可能性
があるので、適切なプライマーの選択が必要である。こ
の際、あらかじめＤＮＡ合成酵素の活性をＤＮＡ合成酵
素に対する抗体等で抑制しておけば、非特異的増幅産物
の増大が抑えられる。また、非特異的増幅産物の増大を
抑える他の方法として、ＰＣＲ反応液を構成する成分の
一部（例えば、ＤＮＡ合成酵素又はプライマー）を除い
た反応液に唾液試料を直接添加したものを加温処理した
後、除いておいた成分を混合する方法が考えられる。
【００１２】加温処理の温度としては、３０℃以上がよ
い。また、加温処理時間としては、１０分以上、好まし
くは３０分以上、更に好ましくは６０分〜１２０分がよ
い。例えば、我々の実験では、唾液を４０℃で１０分程
度処理する事によりＰＣＲ抑制が解除されたが、５℃で
処理すると、ＰＣＲ抑制解除まで数日を要した。
い。また、加温処理時間としては、１０分以上、好まし
くは３０分以上、更に好ましくは６０分〜１２０分がよ
い。例えば、我々の実験では、唾液を４０℃で１０分程
度処理する事によりＰＣＲ抑制が解除されたが、５℃で
処理すると、ＰＣＲ抑制解除まで数日を要した。
【００１３】また、唾液中のＰＣＲ抑制の原因となって
いる糖を分解する方法の一つとしては、唾液を糖分解酵
素により処理する方法が挙げられる。したがって、第２
の発明は、唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合
し反応させる核酸合成法において、反応前に唾液試料を
糖分解酵素で処理することを特徴とする。糖分解酵素と
しては、例えばアミラーゼが挙げられるが、これに限定
されるものではない。糖分解酵素の添加量としては、唾
液試料１μｌ当たり、０．０１〜０．１ユニットが好ま
しい。例えば、我々の実験では、１％ＮａＣｌを口に含
んで採取したヒト唾液５μｌを０．５ユニットのヒト由
来アミラーゼで１０℃以上で１０分間処理することによ
り、ＰＣＲ抑制が解除された。一方、同じ唾液をアミラ
ーゼ無添加で１０分間温度処理した場合には、同程度の
効果を出すのに４０℃での処理が必要であった。
いる糖を分解する方法の一つとしては、唾液を糖分解酵
素により処理する方法が挙げられる。したがって、第２
の発明は、唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合
し反応させる核酸合成法において、反応前に唾液試料を
糖分解酵素で処理することを特徴とする。糖分解酵素と
しては、例えばアミラーゼが挙げられるが、これに限定
されるものではない。糖分解酵素の添加量としては、唾
液試料１μｌ当たり、０．０１〜０．１ユニットが好ま
しい。例えば、我々の実験では、１％ＮａＣｌを口に含
んで採取したヒト唾液５μｌを０．５ユニットのヒト由
来アミラーゼで１０℃以上で１０分間処理することによ
り、ＰＣＲ抑制が解除された。一方、同じ唾液をアミラ
ーゼ無添加で１０分間温度処理した場合には、同程度の
効果を出すのに４０℃での処理が必要であった。
【００１４】なお、本発明において、ＰＣＲ反応液は、
通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、
プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及びＤＮＡ合
成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の
塩類に変更して使用されている。また、ノニデットＰ−
４０，ポリオキシエチレンソルビタン類等の界面活性
剤、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチルスルホキ
シド等種々の物質が添加される場合がある。
通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、
プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及びＤＮＡ合
成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の
塩類に変更して使用されている。また、ノニデットＰ−
４０，ポリオキシエチレンソルビタン類等の界面活性
剤、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチルスルホキ
シド等種々の物質が添加される場合がある。
【００１５】本発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ
(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic aci
d) あるいはＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfo
nic acid)と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによる
ｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調
整された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１
００ｍＭの間の濃度で使用される。
液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩
酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望
ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ
(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic aci
d) あるいはＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfo
nic acid)と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによる
ｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調
整された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１
００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１６】本明細書中でプライマーは、ＤＮＡと重合
用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌク
レオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ま
しいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本
鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすること
が望ましい。プライマーは、公知の方法により合成する
ことができるし、また、生物界から単離することもでき
る。また、“合成酵素”は、プライマー付加による核酸
を合成する酵素あるいは、かような化学合成系を意味す
る。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなど
があるが、これらにのみ限定されるものではない。
用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌク
レオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ま
しいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本
鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすること
が望ましい。プライマーは、公知の方法により合成する
ことができるし、また、生物界から単離することもでき
る。また、“合成酵素”は、プライマー付加による核酸
を合成する酵素あるいは、かような化学合成系を意味す
る。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなど
があるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００１７】
［実験例１］本例は、直接添加によるＰＣＲの効率が悪
い唾液試料を５℃、 -20℃または -80℃で１２日間保存
した後、直接添加ＰＣＲを行った実験である。試料は10
mlの１％ＮａＣｌ液で口をゆすいで採取したヒト唾液を
用いた。種々の量の試料を直接ＰＣＲ反応液に添加し
（全50μｌ）、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、pH9.
2 に調節した10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,2
00μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5
units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq:
Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用いた。
い唾液試料を５℃、 -20℃または -80℃で１２日間保存
した後、直接添加ＰＣＲを行った実験である。試料は10
mlの１％ＮａＣｌ液で口をゆすいで採取したヒト唾液を
用いた。種々の量の試料を直接ＰＣＲ反応液に添加し
（全50μｌ）、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、pH9.
2 に調節した10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,2
00μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5
units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq:
Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用いた。
【００１８】なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbeta-glo
bin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持
つオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩基配列
を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣＲによ
り 408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,R.K.,G
elfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Hor
n,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 2
39,487-491.) 。
bin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持
つオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩基配列
を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣＲによ
り 408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,R.K.,G
elfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Hor
n,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 2
39,487-491.) 。
【００１９】 Ｐ１：５′ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３′ Ｐ２：５′ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３′ ＰＣＲは、９４℃、２分のプレヒーティングの後、９４
℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件で４
０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼーシ
ョンを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、
３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウ
ム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液
中で電気泳動を行い検出した。
℃ １分間、５５℃１分間、７２℃ １分間の条件で４
０サイクル、最後に７２℃ ７分間のポリメライゼーシ
ョンを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、
３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウ
ム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液
中で電気泳動を行い検出した。
【００２０】保存前または後の唾液試料を直接ＰＣＲ反
応液に添加し、ＰＣＲを行った時のＰＣＲ産物の電気泳
動図を図１に示す。図中Ａは保存前、Ｂ，Ｃ，Ｄはそれ
ぞれ５℃、 -20℃、 -80℃、１２日間保存後の唾液試料
を直接ＰＣＲ反応に添加し、ＰＣＲを行ったときのＰＣ
Ｒ産物の電気泳動図を示している。さらに図中、１〜５
は唾液試料の添加量を示し、それぞれ１：４μｌ、２：
２μｌ、３：１μｌ、４：０．５μｌ、５：０μｌの添
加量を示している。また、Ｍは分子量マーカー（制限酵
素 HinC IIで切断したφ×174 RF DNA）を示している。
応液に添加し、ＰＣＲを行った時のＰＣＲ産物の電気泳
動図を図１に示す。図中Ａは保存前、Ｂ，Ｃ，Ｄはそれ
ぞれ５℃、 -20℃、 -80℃、１２日間保存後の唾液試料
を直接ＰＣＲ反応に添加し、ＰＣＲを行ったときのＰＣ
Ｒ産物の電気泳動図を示している。さらに図中、１〜５
は唾液試料の添加量を示し、それぞれ１：４μｌ、２：
２μｌ、３：１μｌ、４：０．５μｌ、５：０μｌの添
加量を示している。また、Ｍは分子量マーカー（制限酵
素 HinC IIで切断したφ×174 RF DNA）を示している。
【００２１】Ａの結果からわかるように、本唾液試料を
採取直後に直接ＰＣＲに用いた場合には、レーン４で痕
跡程度のＰＣＲ産物が検出されるのみで、本唾液試料が
強いＰＣＲ抑制を持っている事が示されている。次に本
唾液試料を５℃、 -20℃、 -80℃で１２日間保存後に直
接ＰＣＲに用いた結果が、それぞれＢ、Ｃ、Ｄに示され
ている。 -20℃保存のＣにおいては、レーン３で多量の
ＰＣＲ産物が検出されるが、レーン２で痕跡程度、レー
ン１、４ではＰＣＲ産物は検出されなかった。また、 -
80℃保存のＤにおいても、レーン４で少量のＰＣＲ産物
が検出されるのみであった。それに対して、５℃保存の
Ｂにおいては、唾液試料のいずれの添加量においても、
多量のＰＣＲ産物が検出された。
採取直後に直接ＰＣＲに用いた場合には、レーン４で痕
跡程度のＰＣＲ産物が検出されるのみで、本唾液試料が
強いＰＣＲ抑制を持っている事が示されている。次に本
唾液試料を５℃、 -20℃、 -80℃で１２日間保存後に直
接ＰＣＲに用いた結果が、それぞれＢ、Ｃ、Ｄに示され
ている。 -20℃保存のＣにおいては、レーン３で多量の
ＰＣＲ産物が検出されるが、レーン２で痕跡程度、レー
ン１、４ではＰＣＲ産物は検出されなかった。また、 -
80℃保存のＤにおいても、レーン４で少量のＰＣＲ産物
が検出されるのみであった。それに対して、５℃保存の
Ｂにおいては、唾液試料のいずれの添加量においても、
多量のＰＣＲ産物が検出された。
【００２２】［実験例２］本例は、３７℃で０分〜１２
０分間加温した後の唾液試料を用いて直接添加ＰＣＲを
行った実験である。試料は実験例１と同じ方法で採取し
た唾液を用いた。また、用いたＰＣＲ反応液の組成およ
びＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１
と同様である。
０分間加温した後の唾液試料を用いて直接添加ＰＣＲを
行った実験である。試料は実験例１と同じ方法で採取し
た唾液を用いた。また、用いたＰＣＲ反応液の組成およ
びＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１
と同様である。
【００２３】加温後の唾液を直接ＰＣＲ反応液に添加
し、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図
２に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾液試料の加温時間を示し
ており、それぞれＡ：０分間、Ｂ：１５分間、Ｃ：３０
分間、Ｄ：１時間、Ｅ：２時間の処理を示している。さ
らに図中１〜４は唾液試料の添加量を示しており、１：
４μｌ、２：２μｌ、３：１μｌ、４：０μｌ添加時の
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示している。また、Ｍは
実験例１と同じものを使用した。結果、時間の経過に伴
って生成されるＰＣＲ産物の量が増大していることが示
されている。
し、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図
２に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾液試料の加温時間を示し
ており、それぞれＡ：０分間、Ｂ：１５分間、Ｃ：３０
分間、Ｄ：１時間、Ｅ：２時間の処理を示している。さ
らに図中１〜４は唾液試料の添加量を示しており、１：
４μｌ、２：２μｌ、３：１μｌ、４：０μｌ添加時の
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示している。また、Ｍは
実験例１と同じものを使用した。結果、時間の経過に伴
って生成されるＰＣＲ産物の量が増大していることが示
されている。
【００２４】［実験例３］本例は、０〜４０℃で１時間
加温した後の唾液試料を用いて直接添加ＰＣＲを行った
実験である。試料は実験例１と同じ方法で採取した唾液
を用いた。また、用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣ
Ｒの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様
である。
加温した後の唾液試料を用いて直接添加ＰＣＲを行った
実験である。試料は実験例１と同じ方法で採取した唾液
を用いた。また、用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣ
Ｒの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様
である。
【００２５】加温後の唾液を直接ＰＣＲ反応液に添加
し、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図
３に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾液試料の加温温度を示し
ており、それぞれＡ：０℃、Ｂ：１０℃、Ｃ：２０℃、
Ｄ：３０℃、Ｅ：４０℃の処理を示している。さらに図
中１〜４は唾液試料の添加量を示しており、１：４μ
ｌ、２：２μｌ、３：１μｌ、４：０μｌ添加時のＰＣ
Ｒ産物の電気泳動の結果を示している。また、Ｍは実験
例１と同じものを使用した。結果、加温の温度が上昇す
るにしたがい、生成されるＰＣＲ産物の量が増大し、特
に３０℃以上において、すべての唾液添加量で、電気泳
動で検出するのに充分な量のＰＣＲ産物が生成されてい
ることが示されている。
し、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図
３に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾液試料の加温温度を示し
ており、それぞれＡ：０℃、Ｂ：１０℃、Ｃ：２０℃、
Ｄ：３０℃、Ｅ：４０℃の処理を示している。さらに図
中１〜４は唾液試料の添加量を示しており、１：４μ
ｌ、２：２μｌ、３：１μｌ、４：０μｌ添加時のＰＣ
Ｒ産物の電気泳動の結果を示している。また、Ｍは実験
例１と同じものを使用した。結果、加温の温度が上昇す
るにしたがい、生成されるＰＣＲ産物の量が増大し、特
に３０℃以上において、すべての唾液添加量で、電気泳
動で検出するのに充分な量のＰＣＲ産物が生成されてい
ることが示されている。
【００２６】［実験例４］本例は、唾液直接添加ＰＣＲ
に用いる唾液試料をあらかじめ、アミラーゼ処理した時
のＰＣＲ効率に及ぼす影響を検討した実験である。試料
は実験例１と同じ方法で採取した唾液５μｌを用いた。
アミラーゼはヒト由来のα−アミラーゼを用い、唾液試
料５μｌ当たり０．５ units添加した。なお、用いたＰ
ＣＲ反応液の組成およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気
泳動の条件は実験例１と同様である。 処理後の唾液を
直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行ったときのＰＣ
Ｒ産物の電気泳動図を図４に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾
液試料の処理温度を示しており、それぞれＡ：０℃、
Ｂ：１０℃、Ｃ：２０℃、Ｄ：３０℃、Ｅ：４０℃で１
０分間の処理を示している。さらに図中１〜４は、実験
に使用した試料の種類を示しており、１は無添加群、２
はアミラーゼ添加群、３は唾液添加群、４は唾液および
アミラーゼ添加群を示している。また、Ｍは実験例１と
同じものを使用した。 結果、Ａ〜Ｅの３レーンで示さ
れるように、アミラーゼ無添加群では、４０℃加温した
時にはじめて、電気泳動で検出するのに充分なＰＣＲ産
物が得られたのに対し、Ａ〜Ｅの４レーンで示されるよ
うに、アミラーゼ添加群においては１０℃以上で加温し
たすべての場合において、検出するのに充分なＰＣＲ産
物が得られた。さらにＡ〜Ｅの２のレーンで示されるよ
うにアミラーゼ添加によるＰＣＲ産物の出現は、用いた
ヒト由来α−アミラーゼからのＤＮＡの持ち込みによる
ものではないことが確認された。
に用いる唾液試料をあらかじめ、アミラーゼ処理した時
のＰＣＲ効率に及ぼす影響を検討した実験である。試料
は実験例１と同じ方法で採取した唾液５μｌを用いた。
アミラーゼはヒト由来のα−アミラーゼを用い、唾液試
料５μｌ当たり０．５ units添加した。なお、用いたＰ
ＣＲ反応液の組成およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気
泳動の条件は実験例１と同様である。 処理後の唾液を
直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行ったときのＰＣ
Ｒ産物の電気泳動図を図４に示した。図中Ａ〜Ｅは、唾
液試料の処理温度を示しており、それぞれＡ：０℃、
Ｂ：１０℃、Ｃ：２０℃、Ｄ：３０℃、Ｅ：４０℃で１
０分間の処理を示している。さらに図中１〜４は、実験
に使用した試料の種類を示しており、１は無添加群、２
はアミラーゼ添加群、３は唾液添加群、４は唾液および
アミラーゼ添加群を示している。また、Ｍは実験例１と
同じものを使用した。 結果、Ａ〜Ｅの３レーンで示さ
れるように、アミラーゼ無添加群では、４０℃加温した
時にはじめて、電気泳動で検出するのに充分なＰＣＲ産
物が得られたのに対し、Ａ〜Ｅの４レーンで示されるよ
うに、アミラーゼ添加群においては１０℃以上で加温し
たすべての場合において、検出するのに充分なＰＣＲ産
物が得られた。さらにＡ〜Ｅの２のレーンで示されるよ
うにアミラーゼ添加によるＰＣＲ産物の出現は、用いた
ヒト由来α−アミラーゼからのＤＮＡの持ち込みによる
ものではないことが確認された。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、唾液試料を核酸合成用反
応液系に直接添加しても、効率良く、目的の遺伝子を合
成することが可能となる。従って、核酸合成の際の核酸
を含む試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようにな
る。
応液系に直接添加しても、効率良く、目的の遺伝子を合
成することが可能となる。従って、核酸合成の際の核酸
を含む試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようにな
る。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ
【図１】唾液試料を保存前および種々の温度で保存後
に、直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時のＰ
ＣＲ産物のゲル電気泳動の泳動図である。
に、直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時のＰ
ＣＲ産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図２】唾液試料を３７℃で０〜１２０分間加温した後
に直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣ
Ｒ産物のゲル電気泳動の泳動図である。
に直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣ
Ｒ産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図３】唾液試料を０〜４０℃で１時間加温した後に直
接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣＲ産
物のゲル電気泳動の泳動図である。
接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣＲ産
物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図４】唾液試料をヒト由来α−アミラーゼ添加もしく
は無添加の状態で、０〜４０℃で１０分間加温した後に
直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣＲ
産物のゲル電気泳動の泳動図である。
は無添加の状態で、０〜４０℃で１０分間加温した後に
直接ＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った後のＰＣＲ
産物のゲル電気泳動の泳動図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、反応前に唾液試
料を加温処理することを特徴とする核酸合成法。 - 【請求項２】 唾液試料そのものと遺伝子増幅反応液を
混合し反応させる核酸合成法において、反応前に唾液試
料を糖分解酵素で処理することを特徴とする核酸合成
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238113A JPH1080280A (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
| US08/911,735 US5912146A (en) | 1996-09-09 | 1997-08-15 | Method for synthesis of nucleic acids |
| EP97114937A EP0854195A1 (en) | 1996-09-09 | 1997-08-28 | Method for the amplification of nucleic acids in a salivary sample |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238113A JPH1080280A (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1080280A true JPH1080280A (ja) | 1998-03-31 |
Family
ID=17025376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8238113A Pending JPH1080280A (ja) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | 核酸合成法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5912146A (ja) |
| EP (1) | EP0854195A1 (ja) |
| JP (1) | JPH1080280A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015119656A (ja) * | 2013-12-24 | 2015-07-02 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6770468B1 (en) * | 1999-09-14 | 2004-08-03 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway |
| US6534300B1 (en) * | 1999-09-14 | 2003-03-18 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases |
| KR20020047693A (ko) * | 2000-12-13 | 2002-06-22 | 김성수 | 유전자 검사용 키트 |
| US6905856B2 (en) * | 2001-12-21 | 2005-06-14 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Soluble GlcNAc phosphotransferase |
| US6800472B2 (en) * | 2001-12-21 | 2004-10-05 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase |
| CN100429307C (zh) * | 2002-01-09 | 2008-10-29 | 希森美康株式会社 | 核酸检测方法及其系统 |
| US7851152B2 (en) * | 2004-09-25 | 2010-12-14 | Yaodong Chen | Fluorescent base analogues' usage in the characterization of nucleic acid molecules and their interactions |
| WO2011137445A2 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | The Uab Research Foundation | Saliva polymerase chain reaction assay for cytomegalovirus infection |
| CN113234793A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 江苏迅睿生物技术有限公司 | 一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5618665A (en) * | 1993-01-22 | 1997-04-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Enzymatic fluorometric assay for adenylate cyclase |
| JP3416981B2 (ja) * | 1993-03-30 | 2003-06-16 | 株式会社島津製作所 | 核酸合成法 |
| CA2121659C (en) * | 1993-05-11 | 2000-11-28 | Michael C. Little | Sample processing method for mycobacteria |
| US5658749A (en) * | 1994-04-05 | 1997-08-19 | Corning Clinical Laboratories, Inc. | Method for processing mycobacteria |
| US5620869A (en) * | 1995-09-28 | 1997-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions |
-
1996
- 1996-09-09 JP JP8238113A patent/JPH1080280A/ja active Pending
-
1997
- 1997-08-15 US US08/911,735 patent/US5912146A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-28 EP EP97114937A patent/EP0854195A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015119656A (ja) * | 2013-12-24 | 2015-07-02 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5912146A (en) | 1999-06-15 |
| EP0854195A1 (en) | 1998-07-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060418 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060822 |