JP3943597B2 - 核酸物質の単離及び増幅 - Google Patents
核酸物質の単離及び増幅 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3943597B2 JP3943597B2 JP52922197A JP52922197A JP3943597B2 JP 3943597 B2 JP3943597 B2 JP 3943597B2 JP 52922197 A JP52922197 A JP 52922197A JP 52922197 A JP52922197 A JP 52922197A JP 3943597 B2 JP3943597 B2 JP 3943597B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- stranded nucleic
- acid material
- solid phase
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
最近まで、上記した複合混合物から核酸を単離及び/または精製する方法は複数の工程を含む労力を要する方法であった。EP 0389063(参考文献として本明細書に援用する)には、複合混合物から核酸物質を簡単に且つ迅速に精製する方法が開示されている。この方法は、全血のような複合混合物を核酸結合シリカ固相材料の存在下、すべての核酸物質が前記固相に結合し得る条件下でカオトロピック剤で処理し、前記混合物から前記固相を分離することからなる。この文献は、混合物中に一本鎖核酸と二本鎖核酸の両方が存在するならば、その両方が固相に結合することを示している。前記文献は、混合物中に存在すると疑われる公知配列を有するある種の核酸の増幅(PCR)をも開示している。
従って、前記文献から、サンプル中に存在すると疑われる公知核酸を簡単に且つ迅速に検出する方法が教示される。
標的核酸(一本鎖または二本鎖)の種類が前もって明らかで、なかったり、分析しなければならない標的が多種類であることはしばしばである。これらの場合、上記した迅速であるがむしろおおざっぱな方法では十分に洗練され得ず、粗な物質を更に精製することが望まれ得る。二本鎖(ds)及び一本鎖(ss)核酸(NA)の混合物を一本鎖及び二本鎖形態に分画することは、例えばds−ハイブリッドから標識ss−NAプローブを分離する際に、ds−DNA鋳型からインビトロ転写物を分離する際に、またmRNAからゲノムDNAを分離する際にしばしば必要とされている。現在、各種核酸の分離は、幾つかの方法で行われている。サイズ及び形に違いがあることから、電気泳動が各種形態の核酸を分画するために使用され得る(1−3)。遠心は密度の違いを利用している(4)。より最近では、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が一本鎖及び二本鎖DNA及びRNA分子を分離、精製するために使用されてきた(5−8)。
現在最も広く使用されている方法(9)により真核細胞から精製したRNAは有意な量のゲノムDNAを含んでいると考えられ、ss−RNA分画のゲノムDNA汚染を減らす改変方法が最近発表された(10)。
EP 0389063の方法により一本鎖及び/または二本鎖物質を別々に調べることは不可能である。なぜならば、該方法は両者を区別しないからである。
よって、本発明は、一本鎖核酸物質を二本鎖核酸物質から分離する方法を提供する。この方法は、一本鎖核酸物質及び二本鎖核酸物質を含む混合物を、カオトロピック剤及び核酸結合固相を含み、二本鎖核酸物質は固相に結合するが実質量の一本鎖核酸物質は結合しないような組成を有する液体と接触させ、前記固相を前記液体から分離することからなる。前記分離を達成するための適当な条件は当業者により決定され得る。
二本鎖核酸物質は固相に結合するが一本鎖核酸物質は結合しない条件はさまざまであるが、上記した特異的な結合を得るための重要なパラメーターはカオトロピック剤の濃度[おおよそ1〜10Mでなければならず、好ましくは3〜6M、特に約5Mである]、キレート剤の濃度[キレート剤がEDTAの場合、10mM以上でなければならず、好ましくは1M以下である]、分離が行われる水溶液のpH[カオトロピック剤としてチオシアネートを使用する場合には、2以上、10以下でなければならなず、そうでなければds物質がssになる危険性があるからである]である。方法を実施する際の温度はあまり重要でないようであるが、好ましくは4〜60℃の温度に維持するのが最良である。本発明では、分離中ds物質が二本鎖を保つことが重要であることは勿論である。ds核酸が40%GC塩基対で少なくとも50bpである場合、ds物質は通常上記した条件下で二本鎖を保つ。前記した長さがGC含量の増減によりどのように変化するか当業者は知っている。Van Nessら(26)及び/またはThompsonら(27)に、全方法が上記したa.o.因子間の複雑な相互作用に依存することが示されている。こうした開示内容及び上記引用文献から、当業者ならば特定の方法に対する条件を調節することができる。
カオトロピック剤は本発明の非常に重要な要素である。カオトロピック剤は、核酸の二次、三次及び/または四次構造を変更し得る物質と定義される。カオトロピック剤は核酸の一次構造に対して実質的な影響を持つものであってはならない。核酸がタンパク質のような他の分子に結合して存在する場合、同じまたは別のカオトロピック剤によりその結合を変化させることもできる。多くのカオトロピック剤、例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、(イソ)チオシアン酸ナトリウム、尿素またはグアニジニウム塩、またはその組み合わせが本発明での使用に適している。本発明で使用するのに好ましいカオトロピック剤はグアニジニウム塩であり、チオシアン酸グアニジニウムが最も好ましい。
偶然にも、本発明者らは、ss−核酸は緩衝液L11の存在下でシリカ粒子またはケイソウ土に結合せず(実施例参照)、ds核酸は結合することを知見した。異なる条件下での実験から、非結合分画にMg2+または他の二価陽イオンを添加することが非常に要であることが判明した。キレート剤(EDTA)の濃度とほぼ同等の濃度の二価イオン(Mg2+)で最良の結果が得られた。
使用される固相はあまり重要でない。固相が可逆的に核酸を結合することが重要である。
固相材料は公知であり、その多くはシリカを主成分とするもの、例えばアルミニウムシリケート等であり、好ましくはシリカである。シリカには、SiO2結晶及び他の形態の酸化ケイ素(例えば、ケイソウ土スケルトン、ガラス粉末及び/または粒子、無定形酸化ケイ素)が包含される。固相は任意の形態で、存在し得、核酸混合物を収容する容器またはその容器の一部であってもよい。また、固相はフィルターーまたは他の適当な構造であり得る。ケイ素を主成分とする物質以外に、他の材料、例えばニトロセルロース(フィルター)、ラテックス粒子及び他のポリマー物質も適当である。固相の好ましい形態は、結合物質と遊離物質を例えば遠心により容易に分離し得る粒状である。固相の粒度は臨界的でない。適当な平均粒度は約0.05〜500μmである。好ましくは、粒度は、粒子の少なくとも、80%、好ましくは90%が上記した範囲のサイズを有するように選択される。このことは、0.1〜200μm、好ましくは1〜200μmの好ましい平均粒度に対しても当てはまる。所与の重量の粒子の結合性は粒度が小さくなるほど優れているが、粒子はその粒度が小さすぎると例えば遠心により分離後容易に再分散され得なくなる。こうした現象は、出発物質が高分子量の核酸を多く含む核酸に富む場合に生ずるであろう。このような場合、粒子及び核酸は凝集物を形成する。当業者は、予想される特定用途に適した粒度を選択することができる。凝集物の形成は、多くの用途で分別されたシリカまたはケイソウ土を使用することにより避けることができる。
本発明の別の態様は、一本鎖核酸物質を核酸物質混合物から単離する方法であり、該方法は前記混合物を上記した方法にかけるステップ及び一本鎖核酸物質を含む上清を、カオトロピック剤及び第2の核酸結合固相を含む第2液体で処理するステップを含み、第2液体は上清と第2液体の混合物により一本鎖核酸物質が第2固相に結合し得るような組成を有する。
この方法で、二本鎖核酸物質は粗製混合物から除去され、一本鎖核酸は残りの依然として粗製の混合物から別の1ステップで精製される。二本鎖物質及び一本鎖物質は可逆的に各固相に結合し、それにより固相から容易に溶出されて更に分析または他の処理を受ける。非常に有用な別の処理は(二本鎖または一本鎖)核酸物質の増幅である。
両方の物質を増幅することも、または両方の物質を増幅するために他方の物質に変換させることもできる。本発明は更に、一本鎖核酸物質を増幅させる方法を提供し、該方法は、一本鎖核酸物質をプライマーとハイブリダイズするステップ及びハイブリダイズされた一本鎖物質を鋳型として用い、プライマー配列にヌクレオチドを付加する酵素を用いてプローブを伸長させるステップからなり、少なくとも1つのプライマーはランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含む。
本発明により精製された一本鎖核酸を、第1及び第2鎖合成のためのランダム3’末端を有するプライマー(タグプライマー)を用いるcDNA合成反応用インプットとして使用した(図7に示す概略を参照されたい)。
次いで、上記したタグ付きcDNAを、両タグプライマー中に存在するPCRモチーフと相同のPCRプライマーを1つだけ用いることにより増幅させる。第1鎖合成に使用されるタグプライマー(TAG20)は、生じたPCR産物のその後の直接配列決定を容易にすべく特に設計されたものである。
多くの他のプロトコル(16−22)とは対照的に、上記した方法は配列データを全く必要とせず、増幅された産物の大部分は、臭化エチジウム染色アガロースゲル上に別個のバンドとして可視化され得、増幅されたcDNAの単離及び直接配列決定が容易となる。増幅基準は当業界で公知である。適当なプライマーの長さ、適当な緩衝液、鎖を分離するための適当な融解温度、適当なハイブリダイズ条件はすべて、当分野の一般的なハンドブックを用いて決定され得る。
勿論、例示した配列は本発明を逸脱せずに変更可能である。ハイブリダイゼーション及び伸長の目的に適している限り、増幅モチーフとしていずれの配列を使用するかは殆ど重要でない。適当な制限は、当業者により変更し得る条件に依存する。通常、プライマーは少なくとも10塩基長を有し、100塩基を大きく越えない長さを有する。
本発明の増幅の態様を、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用いて例示する。勿論、他の増幅方法も同等に適当である。
プライマーに対する標識(即ち、タグ)の例がDIG(ジゴキシゲニン)である。しかしながら、他の標識も使用可能であり、当業界で公知である。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
分離/単離
材料及び方法
核酸ソース
ファージMS−2 ss−RNA(3569nt)、大腸菌rRNA(16及び23S、それぞれ1.7kb及び3.5kb)、ファージM13 ss−DNA(7599nt)及びHindIII消化λファージds−DNAは、Boehringer(ドイツのマンハイムに所在)から購入した。ロタウイルスds−RNAは、感染者の便からプロトコルY/SC(11)により精製した。プラスミドDNAは、Ish−Horowicz及びBurke(13)に記載されている大腸菌HB101から、セファロースCL2B(スウェーデンのウプサラに所在のPharmacia,Inc.)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。総NAは大腸菌からプロトコルY/D(11)により精製した。
化学薬品
チオシアン酸グアニジニウム(GuSCN)は、Fluka(スイスのBuchsに所在)から入手した。
EDTA(Titriplex)及びMgCl2・6H2Oは、Merck(ドイツのダルムシュタットに所在)から入手した。TRISは、Boehringer(ドイツのマンハイムに所在)から入手した。粒度分別したシリカ粒子(粗シリカ、SC)及びケイソウ土(diatom)懸濁液の調製は(11)に記載されている。Triton X−100は、Packard(イリノイ州ダウナーズグローブに所在のPackard Instrument Co.,Inc.)から入手した。
緩衝液の組成
溶解/結合緩衝液L6、洗浄緩衝液L2及びTE(10mMトリスHCl、1mM EDTA;pH=8.0)は(11)に記載されている。0.2M EDTA(pH8.0)は、EDTA(Merck、ドイツ)37.2g及びNaOH(Merck、ドイツ)4.4gを全容量が500mlになるように水に溶解して調製した。溶解/結合緩衝液L11は、0.2M EDTA(pH=8.0)100ml中にGuSCN120gを溶解して調製した。結合緩衝液L10は、0.35MトリスHCl(pH6.4)100ml中にGuSCN 120gを溶解し、続いて0.2M EDTA(pH8.0)22ml及びTriton X−100 9.1gを添加し、溶液を均質化し、最後に固体MgCl2・6H2O 11gを添加して調製した。L10中のMgCl2の最終濃度は約0.25Mである。L10は、暗所で室温で保存したとき少なくとも1ヶ月間安定である。
プロトコルRによるds−NA及びss−NAの分画
手順の概略を図1に示す。サンプル(TE緩衝液中に種々のNAの混合物を含む)50μlをエッペンドルフ(Eppendorf)チユーブ中のL11 900μl及びSC 40μlの混合物に添加後、渦状に混合して均質化した。室温で10分結合後、チユーブを遠心すると(2分間、約10,000×g)、シリカ/ds−NAペレット(「初期シリカペレット」)及びss−NA含有上清が生じた。
ss−NA形態(プロトコルR−上清)を回収するために、上清900μlをL10 400μl及びSC 40μlの混合物に添加し、ss−NAを室温で10分間のインキュベーションして結合させた。その後チューブを遠心し(15秒間、約10,000×g)、上清を(吸引により)除去した。生じたペレットをその後1mlのL2で2回、1mlのエタノール70%(容量/容量)で2回、1mlのアセトンで1回洗浄した。シリカペレットを乾燥し(エツペンドルフ加熱ブロックにおいて蓋を開いて、56℃で10分間)、TE緩衝液50μlに溶出させた(蓋を閉じて、56℃で10分間)。遠心(2分間、約10,000×g)後の上清はss−NA分画を含む。
初期シリカペレットからds−NA形態(プロトコルR−ペレット)を回収するために、残りの上清を捨て、シリカペレットをL11で2回洗浄して非結合ss−NAを除去した。その後、生じたシリカペレットをL2で2回、エタノール70%で2回、アセトンで1回洗浄し、上記したように乾燥し、溶出させた。遠心(2分間、約10,000×g)後の上清はds−NA分画を含む。
プロトコルRによりNAを分画するための完全手順(約1時間を要する)では、2つのエッペンドルフチューブを使用するのみである。
ゲノムDNA及びss−NAの分画
ss−NAが高分子量ゲノムDNAに捕捉されるために、上記したプロトコルRではss−NAは低収率でしか得られない。この問題は、ss−NAの捕捉を防止するに十分なだけ高分子量ゲノムDNAを剪断させるプロトコルY/D(11)により総NAをまず単離することにより避けられ得る。こうして精製した総NAはその後プロトコルR用インプットとして使用され得る。
ゲル電気泳動
すべての実験で、NAを、Aaij及びBorst(14)に記載されている緩衝液系中に臭化エチジウム(1μg/ml)を含む中性アガローススラブゲル(酢酸を用いてpH7.7に調節した40mM トリス−20mM 酢酸ナトリウム−2mM EDTA;臭化エチジウムを緩衝液1mlあたり1μgの濃度に添加した。)を用いる電気泳動にかけた(8〜10V/cm)。
ハイブリダイゼーション
DNA断片を、Southern(15)の方法によりニトロセルロースフィルターに移し、ランダム標識化(Boehringer、ドイツ)により作成した[α−32p]dCTP標識pHC624(16)とハイブリダイズした。ハイブリダイズ条件は(12)に既に記載されている通りである。
結果
各種NAのシリカ粒子に対する結合について各種GuSCN含有溶解緩衝液を比較したところ、結合緩衝液としてL11(EDTAにつき約100mM)を用いたときに二本鎖形態のみが結合した。一方、一本鎖形態及び二本鎖形態の両方が結合緩衝液L6(EDTAにつき約20mM)において結合した(表1)。これらの所見に基づいて、一本鎖核酸及び二本鎖核酸を分画するためのプロトコル(プロトコルR)を開発した(図1)。
二本鎖核酸をL11中のシリカ粒子により結合させたら、簡単に遠心してシリカ/ds−NAペレットを一本鎖形態を含有する上清から分離させる。この上清をシリカ粒子及び結合緩衝液L10(Mg2+につき約250mM)の混合物に添加し、一本鎖核酸のシリカ粒子への結合を回復させる。続いて、シリカ−NA複合体を洗浄及び溶出させて二本鎖形態及び一本鎖形態は精製され得る(プロトコルR)。二本鎖核酸は初期シリカ−ペレット(プロトコルR−ペレット)から回収される。一方、一本鎖形態は初期上清(プロトコルR−上清)から回収される。
プロトコルRを最適化するために、予め精製または市販されている核酸を混合し、次いでプロトコルRにより分画する再構築実験を実施した。
二本鎖DNA及び一本鎖DNAの混合物の分画
ds/DNA/ss−DNA混合物の二本鎖形態及び一本鎖形態への分画を図2に示す。臭化エチジウム染色ゲルのバンド強度から推定したss−DNAの回収率は約50%であった。500bp〜4.6kbの範囲のds−DNAの回収率は80〜90%であった[同程度の回収率が100〜500bpの範囲のds−DNA断片でも得られた(示さず)]。より大きな断片は(11)に記載されているようにかなり剪断された。UV照射による検出レベルで、ds−形態及びss−形態への分画は完全であった。
二本鎖RNA及び一本鎖RNAの混合物の分画
図3に、ds−RNA(ヒトロタウィルスゲノムセグメント1−11、詳細は14参照)及びss−RNA(ファージMS2RNA)の混合物の二本鎖形態及び一本鎖形態への分画を示す。ds−RNA及びss−RNAの推定回収率は少なくとも80%であった。UV照射による検出レベルで、ds−形態及びss−形態への分画は完全であった。
二本鎖DNA及び一本鎖RNAの混合物の分画
図4に、ds−DNAがss−RNAから効率的に分離され得ることを示す。
上記両分画の回収率は少なくとも80%である。大腸菌rRNA(23S及び16S)をss−RNAインプットとして使用したときにも同様の結果が得られた(示さず)。
上記した実験で、ds−形態及びss−形態の分画は(臭化エチジニウ染色及びUV照射後のバンド強度の肉眼検査で判断して)完全であると考えられる。ds−DNA及びss−RNAの混合物のss−形態及びds−形態への分画方法の遂行を確認するために、前記混合物からプロトコルR−上清により精製したNAを、サザンプロッティング及び分画用インプットとして使用したds−DNAと相同の32P−標識DNAプローブとハイブリダイズすることにより調べた。この実験で、ss−NA分画に含まれるds−DNAインプットの量は0.1%未満であることが判明した(図5)。
ゲノムDNA及び一本鎖RNAの混合物の分画
大腸菌をプロトコルR用インプットとして用い、直接分画による高分子量(ゲノム)ds−DNA及びss−RNAの分離を調べると、ds−DNA分画はrRNAでかなり汚染され(図6、レーン6及び7)、ss−RNA回収率は低かった(図6、レーン8及び9)。これは、シリカ/NA複合体が形成されたときRNAが高分子量(ゲノム)ds−DNAに捕捉されるためであろう。一方、ss−RNA分画にはゲノムDNAは観察されなかった。まず標準プロトコルY/D(11)を用いて単離し、その後プロトコルRにおいてインプット材料として使用した総核酸から、ss−RNA分画の回収率が優位に高いことが判明した(図6、レーン2及び5)。
増幅
材料及び方法
核酸ソース
HIV−1 RNAはウイルス培養物から単離した(23)。ファージMS−2 RNAは、Boehringer(ドイツのマンハイムに所在)から購入した。マーカーとして使用した7.5Kb ボリ(A)テイルRNA及び100bp ラダーは、Life Technologies(米国メリーランド州Gaithersburgに所在)から購入した。PCR TA3クローニングベクターは、Promega(米国マディソンに所在)から入手した。プラスミドの5’NOT Hxb2ENN(24)(ヌクレオチド638−4647由来のHIV−1のGAG遺伝子及びPOL遺伝子含有)及び168.1 RTN(24)(ヌクレオチド5674−8474由来のHIV−1のENV遺伝子含有)は、Ish−Horowicz及びBurke(13)に記載されているように精製し、その後実施例に記載されているプロトコルR−ペレットにより精製した。PCR実験でポジティブコントロールとして使用したプラスミドpHCrecは、PCRプライマーRB 8(下記する)を用い、λDNA(Boehringer)に対する低アニーリングPCRにより作成した。別個のPCR産物をプロトコルY/D(11)を用いて精製し、次いでPCR IIIベクター(Invitrogen)にクローン化した。その後、約600bPインサートを有する露出(revealing)プラスミドpHCrecを、Ish−Horowicz及びBurke(13)に記載されている大腸菌HB101から、セファロースCL2B(スウェーデンのウプサラに所在のPharmacia,Inc.)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。
化学薬品及び酵素
EDTA、KCl、MgC12・6H2O、NaCl及びクエン酸トリナトリウム2水和物は、Merck(ドイツのダルムシュタットに所在)から入手した。TRIS及びBSAは、Boehringer(ドイツのマンハイムに所在)から入手した。Triton X−100は、Packard(米国イリノイ州ダウナーズに所在のPackard Instruments Co.,Inc.)から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は、Serva(ドイツのハイデルベルグに所在)から入手した。
dNTP類及び硫酸デキストランは、Pharmacia(スウェーデンのウプサラに所在)から入手した。
プロトコルRで使用した化学物質は本明細書に記載した通りである。
逆転写酵素SuperScript IIは、Life Technologies(米国メリーランド州Gaithersburgに所在)から購入した。DNAポリメラーゼSequenase 2は、Amersham(英国に所在)から入手した。Ampli−Taq DNAポリメラーゼは、Perkin Elmer(米国ノーウォークに所在)から入手した。RNase Hは、Boehringer(ドイツのマンハイムに所在)から入手した。サケ精子DNAは、Sigma(米国セントルイスに所在)から入手した。
緩衝液及び溶液の組成
プロトコルRで使用した緩衝液の調製は本明細書に記載した通りである。ただし、核酸の単離のためのプロトコルRで使用した溶解緩衝液及び洗浄緩衝液(L10、L11及びL2)は、該溶解緩衝液及び洗浄緩衝液中の内在性核酸を除去するためにケイソウ土(11)を充填したカラムを通して濾過した。
10×逆転写緩衝液(CMB1)は、100mM トリスHCl(pH8.5)、500mM KCl及び1%Triton X−100からなる。
10×PCR緩衝液は、500mM トリスHCl(pH8.3)、200mM KCl及び1mg/ml BSAからなる。
溶出緩衝液トリス/EDTA(TE、pH8.0)は、10mM トリスHCl(pH8.0)及び1mM EDTA(pH8.0)からなる。
オリゴヌクレオチド
第1鎖プライマーTAG 20は次の通り
第2鎖プライマーTAG 7は次の通り
PCRプライマーRB8は次の通り
下線はPCRモチーフである。
太字は直接配列決定のためのモチーフである。
N=A、T、CまたはG。
第1鎖合成のプロトコール
市販されている逆転写酵素中に存在するss−RNAは、第1鎖合成に使用したときに望ましくない副生成物を生ずると考えられた。この問題を解決するために、逆転写酵素を、外部から添加されるプライマーを欠いているcDNA合成用混合物中で予め処理した。
1μl SuperScript II(200U/μl)
1μl CMB1(10×)
0.5μl MgCl2(100mM)
0.4μl dNTP類(各25μM)
7.1μl H2O
37℃で15分間インキュベートした。
プロトコルR−上清により精製した核酸(20μl)を60℃で5分間インキュベートした後、氷で急冷した。続いて、以下の混合物を添加した。
3μl CMB1(10×)
1μL TAG20(100ng/μl)
1.5μl MgCl2(100mM)
1.2μl dNTP類(各25mM)
3.3μl H2O
最後に、プレインキュベートしたSuperScriptII(SS II)10μlを添加し、生じた混合物を42℃で30分間インキュベートした。
逆転写反応後、混合物を80℃で5分間インキュベートすることによりSS IIを不活化し、その後混合物を室温まで冷却した。RNA/DNAハイブリッドを一本鎖cDNAに変換するために、混合物にRNAse Hを20単位添加し、37℃で60分間インキュベートした。次いで、一本鎖cDNAをプロトコルR−上清を用いて単離した。一本鎖cDNAをTE40μl中に溶出させ、20μlを第2鎖合成用インプットとして使用した。
第2鎖合成のプロトコル
一本鎖cDNA 20μlに、以下の混合物を添加した(氷上)。
4μl CMB1(10×)
1μL TAG 7−DIG*(100ng/μl)
2μ1 MgCl2(100mM)
1.6μl dNTP類(各25mM)
0.2μl Sequenase 2(13U/μl)
11.2μl H2O
混合物を氷上で10分間インキュベートし、その後37℃で60分間インキュベートした。第2鎖合成後、二本鎖cDNAをプロトコールR−ペレットを用いて単離した。二本鎖cDNAをTE 40μl中に溶出させた。20μlを採取し、2μlをPCR用インプットとして使用した。残りの18μlは−20℃で保存した。
ポリメラーゼ連鎖反応のためのプロトコル
二本鎖cDNA 2μlを、以下の組成のPCR混合物48μlに添加した。
18μl TE(pH8.0)
1μl RB 8(100ng/μl)
5μl PCR緩衝液(10×)
0.9μl MgCl2(100mM)
0.2μl dNTP類(100μM)
0.1μl dUTP*(25μM)
0.3μl Ampli Taq(5U/μl)
22.5μl H2O
95℃で5分間インキュベート後、DNA熱サイクラー(タイプ480:Perkin Elmer Cetus)を用いてサンプルに45回の増幅サイクルを加えた。1サイクルは、95℃で1分間の変性、63℃で1分間のアニーリング及び72℃で2分間の伸長とした。増幅サイクル後、サンプルを72℃で8分間インキュベートし、その後温度を4℃に下げた。PCR産物25μlについて、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により調べた。各実験において、TEをネガティブ抽出コントロールとして及びネガティブPCRコントロールとして使用した。
*dTTPをdUTPで部分的に置換することにより、従来のPCR反応により生じた産物は再増幅され得ないことを確認するための方法が得られる。PCR増幅の産物は、ウラシル含有デオキシリボ核酸である。従来のPCR増幅による汚染物を含む可能性のあるPCR産物は、PCR前に酵素ウラシルN−グリコシラーゼ(UNG)を用いてウラシル塩基を切除することにより除去される。
ゲル電気泳動
すべての実験で、核酸を、Aaij及びBorst(14)に記載されている緩衝液系中に臭化エチジウムを含有する中性アガローススラブゲルを用いて電気泳動した(8〜10V/cm)。
ハイブリダイゼーション
サザンブロッティング(15)後、HIV−1の全GAG遺伝子、POL遺伝子及びENV遺伝子を表す32P−標識プローブ[プラスミド5’NOT Hxb2ENN及びプラスミド168 1RTN](10)とハイブリダイズしてDNA断片を検出した。
結果
同時に、105分子のHIV−1 RNA(23)及びネガティブコントロール(TE)を、プロトコルR−上清を用いて抽出した。生じた一本鎖核酸を上記した非選択的RT−PCRにより増幅させ、HIV−1 RNAについて別個の結合パターンを得た。TEコントロール中には増幅産物はなかった(図8)。2回の変動は、方法の非選択性を反映する。方法のPCR部分の効率のためのコントロールとして、0、6、60及び600分子のプラスミドpHCrecのインプットを使用した。
図8Aにおいて目に見えるバンドがHIV−起源であることを確認するために、高緊縮条件下でHIV−1ゲノムのほぼ全体を包含する32P−標識プローブとのサザンブロットハイブリダイゼーションを実施した(図8B)。この実験から、UV照射により目に見えるバンドの多くはHIV−1プローブとハイブリダイズした。前記プローブとハイブリダイズしなかったバンドは、プローブ中に存在する部分以外のHIV−1ゲノムの部分と相同であるか、HIV−1 RNA調製物(例えば、細胞mRNA)中に存在する一本鎖RNAまたはSuperscript−II中に存在するss−RNA(Superscript IIのプレインキュベーション中にds−ハイブリッドに変換されなかった)に由来するであろう。
C型肝炎RNA、ファージMS2 RNAおよび7.5kbボリ−(A)テイルRNAのような他の一本鎖RNAでも同様の結果が得られた(結果示さず)。
結論として、上記した方法は(例えば血清中に存在する)一本鎖RNA標的をアガロースゲルにおいて一連の別個のバンドに増幅するために使用し得る。別個のバンドはアガロースゲルから精製され、例えば細菌ベクター中でクローン化され得、その後クローンは配列決定され得る。タグプライマー(TAG 20)の1つが配列モチーフを有しているという事実から、バンドをゲルから精製後、クローニングなしに別個のバンドの配列を決定することが可能である。本明細書に記載の方法は、臨床サンプル中に存在する未知の配列(例えば、ウイルス配列)を単離しキャラクタイゼーションする際に、また配列データを持たない転写物からcDNAを増幅するために有用である。
シリカ粒子ではなくケイソウ土を使用して類似の結果が得られた(データ示さず)。
Claims (16)
- 二本鎖核酸物質から一本鎖核酸物質を分離して、一本鎖核酸物質を単離する方法であって、該方法は、
上記両方の混合物を、1〜10Mの濃度のカオトロピック剤及びキレート剤を含み且つ2〜10のpHを有する第1液体並びに核酸に可逆的に結合できる核酸結合第1固相と接触させ、ここで、該第1液体は、二本鎖核酸物質は前記第1固相に結合するが実質量の一本鎖核酸物質は結合しないような組成を有しており、及び
前記第1固相を前記第1液体から分離することを包含し、
該方法は、更に、前記の一本鎖核酸物質を含む上清を、カオトロピック剤を含む第2液体及び核酸に可逆的に結合できる核酸結合第2固相で処理することを含み、ここで、該第2液体は、前記上清と第2液体による混合物が、一本鎖核酸物質を第2固相に結合させ得るような組成を有し、それにより一本鎖核酸物質を単離することを特徴とする、前記方法。 - キレート剤が10mM〜1Mの濃度で存在するEDTAである請求項1に記載の方法。
- 第1液体がカオトロピック剤、キレート剤、及び適切な濃度の2価陽イオンを含む請求項1に記載の方法。
- 2価陽イオンの濃度がキレート剤の濃度と同等である請求項3に記載の方法。
- キレート剤がEDTAであり、イオンがMg 2+ である請求項3に記載の方法。
- 第1液体が、120gのGuSCNを0.2MのEDTA(pH=8)100mlに溶解させることによって調製された緩衝液で構成される請求項1に記載の方法。
- 第2液体が、120gのGuSCNを0.35MのトリスHCl(pH6.4)100mlに溶解し、0.2M EDTA(pH8.0)22ml及びTriton X−100 9.1gを加え、溶液を均質化し、最終濃度が約0.25MとなるようにMgCl 2 を加えることによって調製された緩衝液で構成される請求項1に記載の方法。
- 第1及び第2固相がケイ素を主成分とする請求項1に記載の方法。
- 固相を遠心により上清から分離することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 核酸の混合物に元々存在する一本鎖核酸物質を単離して増幅する方法であって、該方法は、
前記混合物を請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法に供した後の単離物質を、
一本鎖核酸をプライマーとハイブリダイズするステップ、及びハイブリダイズされた一本鎖物質を鋳型として用いてプライマー配列にヌクレオチドを付加する酵素でプライマーを伸長させるステップを含み、少なくとも1つの前記プライマーがランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含むことを特徴とする一本鎖核酸物質を増幅する工程に供することを含む、前記一本鎖核酸物質を単離して増幅する方法。 - ランダムハイブリダイズ配列及び増幅配列を含む少なくとも一つのプライマーが、更に標識を含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- ランダムハイブリダイズ配列及び増幅モチーフを含む少なくとも一つのプライマーが、更に直接配列決定モチーフを含むことを特徴とする請求項10または11に記載の方法。
- 一本鎖核酸物質がmRNAからなることを特徴とする請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法。
- mRNAをcDNAに変換させることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- ゲル電気泳動ステップを含むことを特徴とする請求項1乃至14のいずれか1項に記載の方法。
- その後配列決定ステップを含むことを特徴とする請求項1乃至15のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96200354 | 1996-02-14 | ||
EP96200354.7 | 1996-02-14 | ||
PCT/NL1997/000063 WO1997030062A1 (en) | 1996-02-14 | 1997-02-14 | Isolation and amplification of nucleic acid materials |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000505295A JP2000505295A (ja) | 2000-05-09 |
JP3943597B2 true JP3943597B2 (ja) | 2007-07-11 |
Family
ID=8223661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52922197A Expired - Lifetime JP3943597B2 (ja) | 1996-02-14 | 1997-02-14 | 核酸物質の単離及び増幅 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7238530B2 (ja) |
EP (1) | EP0880537B1 (ja) |
JP (1) | JP3943597B2 (ja) |
KR (1) | KR100483498B1 (ja) |
AT (1) | ATE284891T1 (ja) |
AU (1) | AU723900B2 (ja) |
CA (1) | CA2245888C (ja) |
DE (1) | DE69731939T2 (ja) |
ES (1) | ES2235225T3 (ja) |
WO (1) | WO1997030062A1 (ja) |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2965131B2 (ja) | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
US6423536B1 (en) * | 1999-08-02 | 2002-07-23 | Molecular Dynamics, Inc. | Low volume chemical and biochemical reaction system |
AU2001232485A1 (en) | 2000-01-13 | 2001-07-24 | Amsterdam Support Diagnostics B.V. | A universal nucleic acid amplification system for nucleic acids in a sample |
WO2002059353A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Bio S & T | Two-step amplification using a program primer followed by specific primers |
EP1448799B2 (en) | 2001-11-28 | 2018-05-16 | Life Technologies Corporation | Methods of selective nucleic acid isolation |
WO2004042058A2 (de) † | 2002-11-08 | 2004-05-21 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren |
EP1418241A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | PrimaGen Holding B.V. | Method for quantifying a ratio between at least two nucleic acid sequences |
US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
DK2374900T3 (en) * | 2003-03-07 | 2016-10-17 | Rubicon Genomics Inc | Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization |
JP4241183B2 (ja) | 2003-05-19 | 2009-03-18 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸回収方法及び核酸回収キット |
DE10358137A1 (de) * | 2003-12-12 | 2005-07-07 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und Kit zur Isolierung von RNA |
JP2005218385A (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Dnaform:Kk | 1本鎖dnaを調製するための方法 |
JP4690656B2 (ja) * | 2004-02-12 | 2011-06-01 | ジーエルサイエンス株式会社 | 核酸の分離精製方法及び分離吸着体 |
AU2005200670B2 (en) * | 2004-02-20 | 2007-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Adsorption of nucleic acids to a solid phase |
CA2902980A1 (en) | 2004-03-08 | 2005-09-29 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods and compositions for generating and amplifying dna libraries for sensitive detection and analysis of dna methylation |
EP1747296A2 (en) * | 2004-04-19 | 2007-01-31 | Academisch Medisch Centrum | Detection of viral nucleic acid and method for reverse transcribing rna |
EP1589119A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-26 | Academisch Medisch Centrum | Detection of enterovirus RNA and method for reverse transcribing RNA |
AU2005277527A1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-02 | Preanalytix Gmbh | Additive, method, and article for DNA collection, stabilization, and purification |
AU2011253981B2 (en) * | 2004-09-02 | 2015-03-26 | Lifeind Ehf. | Two-dimensional strandness- and length-dependent separation of nucleic acid fragments |
CA2614580A1 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Lifeind Ehf. | Two-dimensional strandness- and length-dependent separation of nucleic acid fragments |
DE102004045332B3 (de) * | 2004-09-16 | 2006-03-09 | Macherey, Nagel Gmbh & Co. Handelsgesellschaft | Verfahren zur Isolierung und Trennung von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren aus einer diese Nucleinsäuren enthaltenden Probe sowie Trennsäule zur Durchführung dieses Verfahrens |
US20060166223A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-07-27 | Reed Michael W | DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces |
DK1924704T3 (da) | 2005-08-02 | 2011-09-05 | Rubicon Genomics Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion |
EP1924705A1 (en) | 2005-08-02 | 2008-05-28 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
JP4699868B2 (ja) | 2005-11-04 | 2011-06-15 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸精製方法及び核酸精製器具 |
US8163535B2 (en) * | 2006-06-26 | 2012-04-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
US7608399B2 (en) * | 2006-06-26 | 2009-10-27 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
EP2247753B1 (en) * | 2008-02-01 | 2014-06-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Urine transport medium |
US20110046361A1 (en) * | 2008-04-30 | 2011-02-24 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids |
DE102008026058A1 (de) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Qiagen Gmbh | Lyse, Binde- und/oder Waschreagenz verwendbar zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren |
CA2742598A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Nucleic acid extraction on curved glass surfaces |
EP2345719A1 (en) | 2010-01-18 | 2011-07-20 | Qiagen GmbH | Method for isolating small RNA |
EP2407540A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-01-18 | Qiagen GmbH | Method for purifying a target nucleic acid |
US11542494B2 (en) | 2010-09-02 | 2023-01-03 | Qiagen Gmbh | Method for isolating a target nucleic acid including small target nucleic acids with high yield |
WO2012159063A2 (en) | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Blood Cell Strorage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
EP3789500A1 (en) | 2011-08-12 | 2021-03-10 | QIAGEN GmbH | Method for isolating nucleic acids |
EP2756079A1 (en) | 2011-09-13 | 2014-07-23 | Qiagen GmbH | Method for isolating nucleic acids from a veterinary whole blood sample |
US11021733B2 (en) | 2011-09-26 | 2021-06-01 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
ES2937410T3 (es) | 2011-09-26 | 2023-03-28 | Qiagen Gmbh | Método rápido para aislar ácidos nucleicos extracelulares |
AU2012314515B2 (en) | 2011-09-26 | 2018-03-15 | Preanalytix Gmbh | Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids |
WO2014029792A1 (en) | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Qiagen Gmbh | Virus particle stabilisation and method for isolating viral nucleic acids |
US20150225712A1 (en) | 2012-08-21 | 2015-08-13 | Qiagen Gmbh | Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample |
AU2013310861B2 (en) | 2012-09-03 | 2019-02-14 | Qiagen Gmbh | Method for isolating RNA including small RNA with high yield |
US20150275267A1 (en) | 2012-09-18 | 2015-10-01 | Qiagen Gmbh | Method and kit for preparing a target rna depleted sample |
WO2014049022A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
JP6255034B2 (ja) | 2012-12-11 | 2017-12-27 | キアゲン ゲーエムベーハー | シリカ粒子の調製 |
JP6407248B2 (ja) | 2013-03-18 | 2018-10-17 | キアゲン ゲーエムベーハー | 細胞外核酸の安定化および単離 |
US11525155B2 (en) | 2013-03-18 | 2022-12-13 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
CN106132200B (zh) | 2014-03-18 | 2020-10-30 | 凯杰有限公司 | 胞外核酸的固定和分离 |
EP2940136A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | QIAGEN GmbH | Method for isolating poly(A) nucleic acids |
ZA201608812B (en) | 2014-06-26 | 2019-08-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
CA2952745A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
WO2016058173A1 (zh) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | 深圳华大基因研究院 | 一种用于核酸随机片段化的引物及核酸随机片段化方法 |
EP3307886B1 (en) | 2015-06-10 | 2021-03-24 | Qiagen GmbH | Method for isolating extracellular nucleic acids using anion exchange particles |
US10214739B2 (en) * | 2015-10-30 | 2019-02-26 | Axagarius Gmbh & Co. Kg | RNA binding solution |
CN108291250B (zh) | 2015-11-20 | 2022-05-27 | 凯杰有限公司 | 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法 |
US11725200B2 (en) | 2017-09-27 | 2023-08-15 | Qiagen Gmbh | Method for isolating RNA with high yield |
US20220090998A1 (en) | 2019-01-04 | 2022-03-24 | Qiagen Gmbh | Urine stabilization |
WO2021211849A1 (en) * | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Chhalliyil Pradheep | Rapid extraction and purification of rna |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LU82089A1 (fr) | 1980-01-16 | 1981-09-10 | Sipac | Procede de preparation d'un echangeur de cations et procede d'utilisation de cet echangeur pour l'extraction de metaux de liquides |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US5075430A (en) * | 1988-12-12 | 1991-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Process for the purification of DNA on diatomaceous earth |
NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
US5043272A (en) | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
CA2063855C (en) * | 1991-04-03 | 1997-08-26 | Will Bloch | Precision and accuracy of anion-exchange separation of nucleic acids |
US5155018A (en) * | 1991-07-10 | 1992-10-13 | Hahnemann University | Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources |
WO1995004140A1 (en) * | 1993-07-28 | 1995-02-09 | Akzo Nobel N.V. | Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms |
WO1995006652A1 (en) * | 1993-08-30 | 1995-03-09 | Promega Corporation | Nucleic acid purification compositions and methods |
ATE210671T1 (de) * | 1994-02-11 | 2001-12-15 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen |
DE69528256T2 (de) | 1994-04-14 | 2003-07-31 | Rockefeller University New Yor | Vorrichtung zur isolierung von zellularinhaltsstoffen |
US6037465A (en) | 1994-06-14 | 2000-03-14 | Invitek Gmbh | Universal process for isolating and purifying nucleic acids from extremely small amounts of highly contaminated various starting materials |
ATE184013T1 (de) * | 1994-06-14 | 1999-09-15 | Invitek Gmbh | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
-
1997
- 1997-02-14 EP EP97902751A patent/EP0880537B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 JP JP52922197A patent/JP3943597B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 AT AT97902751T patent/ATE284891T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 DE DE69731939T patent/DE69731939T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 WO PCT/NL1997/000063 patent/WO1997030062A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-14 ES ES97902751T patent/ES2235225T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 KR KR10-1998-0706258A patent/KR100483498B1/ko active IP Right Grant
- 1997-02-14 AU AU16766/97A patent/AU723900B2/en not_active Expired
- 1997-02-14 CA CA002245888A patent/CA2245888C/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-01-12 US US09/760,085 patent/US7238530B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2000505295A (ja) | 2000-05-09 |
DE69731939D1 (de) | 2005-01-20 |
AU723900B2 (en) | 2000-09-07 |
EP0880537A1 (en) | 1998-12-02 |
AU1676697A (en) | 1997-09-02 |
KR19990082522A (ko) | 1999-11-25 |
KR100483498B1 (ko) | 2005-07-18 |
US20010021518A1 (en) | 2001-09-13 |
EP0880537B1 (en) | 2004-12-15 |
CA2245888C (en) | 2008-12-23 |
ES2235225T3 (es) | 2005-07-01 |
US7238530B2 (en) | 2007-07-03 |
WO1997030062A1 (en) | 1997-08-21 |
DE69731939T2 (de) | 2005-12-22 |
ATE284891T1 (de) | 2005-01-15 |
CA2245888A1 (en) | 1997-08-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3943597B2 (ja) | 核酸物質の単離及び増幅 | |
US5935825A (en) | Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences | |
Belyavsky et al. | PCR-based cDNA library construction: general cDNA libraries at the level of a few cells | |
JP4289443B2 (ja) | Pcrの過程でdna断片の増幅を抑制する方法 | |
EP0419571B1 (en) | Dna amplification and subtraction techniques | |
JP4480622B2 (ja) | 核酸精製用組成物及び方法 | |
US9890413B2 (en) | Isolation of nucleic acid from stool samples and other biological materials which are rich in inhibitors | |
CA2354379C (en) | Method for isolating dna from biological materials | |
JPH07509371A (ja) | 核酸配列の検出及び増幅のための方法,試薬及びキット | |
JP2006528482A (ja) | 核酸の逆転写及び/または増幅方法 | |
JPH10501246A (ja) | 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法 | |
WO2003048395A1 (en) | Methods for the selection and cloning of nucleic acid molecules free of unwanted nucleotide sequence alterations | |
JP4284063B2 (ja) | 核酸塩基配列決定方法 | |
JP3082908B2 (ja) | リボ核酸の単離方法 | |
WO1998049345A1 (en) | Methods and compositions for targeted dna differential display | |
JPH1080280A (ja) | 核酸合成法 | |
JP6489017B2 (ja) | 核酸増幅法 | |
JP3416981B2 (ja) | 核酸合成法 | |
JP4186270B2 (ja) | 核酸合成法 | |
JPH0928398A (ja) | mRNAの特異的決定のための方法と試薬 | |
JPH09187277A (ja) | 鋳型として全血液を用いた核酸の直接的pcr増幅法 | |
JPH04300000A (ja) | 核酸の定量方法 | |
JP2004105009A (ja) | テトラフェニルホウ素化合物から成る核酸分離用試薬とそれを用いる核酸分離方法 | |
AU2022407332A1 (en) | A method of capturing crispr endonuclease cleavage products | |
JPH05292971A (ja) | ビオチン化cDNAライブラリの製法及びこれを用いたサブトラクション方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060808 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061101 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061218 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070320 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070406 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110413 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120413 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120413 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130413 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130413 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140413 Year of fee payment: 7 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |