JP4284063B2 - 核酸塩基配列決定方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、遺伝子工学分野で有用な、核酸の塩基配列決定方法に関する。
背景技術
現在、核酸の塩基配列を解析する方法としては、平板タイプまたはキャピラリータイプのゲルを用いた電気泳動方法によって解析を行うチェーンターミネータ法がその主流である。該方法は、使用するポリメラーゼあるいは電気泳動装置の改良により一度に解析できる塩基配列の長さが伸びてきている。しかしながらそれでも、通常５００塩基対前後、長くても１０００塩基対以下を解析できるにすぎない。従って、通常のプラスミド、ファージ、コスミド等のベクターにクローニングされた、数キロ塩基対より長いＤＮＡ断片の塩基配列を決定するためには、プライマーウォーキング法、サブクローニング法あるいはデリーションクローン作製法のような手法のいずれかを単独、または組み合わせて用いる必要がある。
例えば、上記の手法をそれぞれ用いて、プラスミドベクターにクローニングされた５キロ塩基対の長さのＤＮＡ断片の塩基配列を決定するケースにおいて、プライマーウォーキング法を用いるならば、クローニングされたＤＮＡ断片のどちらかの末端から、まずはベクター上の塩基配列を有するプライマーを用いて塩基配列を決定する。その後、新たに得られた塩基配列の情報に基づいて新たなプライマーを設計・合成してさらに先の領域の塩基配列を決定する。この操作を何回も繰り返すことによって、クローニングされた断片の全塩基配列を決定することができる。しかしながらプライマーウォーキング法では、各塩基配列の操作毎に、プライマーを設計・合成する必要があり、時間と費用を要する。
次に上記ＤＮＡ断片の塩基配列をサブクローニング法を用いて解析する場合には、まず、プラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、この切断されたＤＮＡ断片の長さに基づいて、クローニングされたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。次に、上記の制限酵素地図をもとに選択された制限酵素で切断されたＤＮＡ断片をファージあるいはプラスミドベクターにそれぞれサブクローニングし、ベクター上の配列を有するプライマーを用いて塩基配列を決定する。このサブクローニング法では、制限酵素地図の作成やそれに続くサブクローニング等、煩雑な操作が必要であり、手間と時間を要する。また、この方法で効率よく、元のクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列が決定されるためには、サブクローニングに適した制限酵素認識部位が該ＤＮＡ断片上に均一に散在している必要がある。
さらにジーン（Ｇｅｎｅ）、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８５）記載のＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらによって開発された塩基配列決定法、すなわちデリーションクローン作製法は、クローニングされた断片のどちらか一端を基点にして、断片長が連続的に短くなっているクローンのシリーズを調製することを特徴とする。この方法は、上記プライマーウォーキング法、あるいはサブクローニング法にみられる問題点の一部を解決したものである。このデリーションクローン作製法を用いれば、プライマーウォーキング法のように、塩基配列決定の操作毎にプライマーを設計・合成する必要はなく、また、サブクローニング法のように制限酵素地図を作成したり、制限酵素地図に基づいてサブクローニングする必要もない。しかしながら、このデリーションクローン作製法においてＤＮＡ断片長が連続的に短くなっているクローンの群を調製するには、ＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを、２種類の制限酵素、エキソ（Ｅｘｏ）ＩＩＩ ヌクレアーゼ、エキソＶＩＩ ヌクレアーゼ、クレノウフラグメント ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼという順で、各酵素に適した条件で連続的に処理していく必要がある。そのため、該方法においては、遺伝子操作に関してかなりの熟練を要する。また、クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列によってエキソＩＩＩ ヌクレアーゼに対する反応性（削られやすさ）が異なることから、上記の連続的な本操作の前に予備実験を行い、エキソＩＩＩ ヌクレアーゼに対する反応性を予め調べておく必要がある。
また、ＰＣＲ法でランダムに増幅した断片の塩基配列を解析する方法として、ＴｅｌｅｎｉｕｓらのＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）法、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第１３巻、第７１８〜７２５頁（１９９２）や、ＷｏｎｇらのＴＲＨＡ（Ｔａｇｇｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ヌクレイック アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、第１９号、第３７７８〜３７８３頁（１９９６）が挙げられる。しかしながら、いずれもの方法もランダムな配列を含む複数のプライマーの混合物を用いてＰＣＲを行い、増幅された複数のラダーを一つずつ単離、精製した後にシークエンシングする方法であり、操作が繁雑である。
このように、現在の核酸の塩基配列解析方法は、いずれも問題点をかかえており、ゲノム解析において、迅速、低コストの核酸の塩基配列解析方法が求められていた。
発明の目的
本発明の目的は、複雑な操作を経ずに、鋳型核酸のある１点を基点にして、ＤＮＡ断片長が連続的に短くなっている増幅ＤＮＡ断片の群を調製し、該ＤＮＡ断片の塩基配列を解析することを特徴とする核酸の塩基配列決定方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、特定の塩基配列を有する複数のプライマーからなるプライマープールから選択されるプライマーと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲを行うことによって、鋳型ＤＮＡの一箇所を基点にした鎖長の異なる一連のＤＮＡ増幅断片の群を調製できることを見い出した。そしてそのＤＮＡ増幅断片群中のそれぞれのＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、元のＤＮＡ断片の全塩基配列を解析できることを明らかにし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、核酸の塩基配列決定方法であって、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を増幅する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５’末端側にタグ配列を有し、３’末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有する；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片をダイレクトシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とする核酸塩基配列決定方法に関する。
本発明の第１の発明において、タグ配列を有するプライマーは、下記一般式で表される構造を有するプライマーが使用できる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただしＳａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
また、本発明の第１の発明において、タグ配列を有するプライマーが表１〜表５に記載のプライマーから選択されるプライマーが使用できる。
さらに本発明の第１の発明において、鋳型核酸の増幅工程としては、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）が例示される。該ＰＣＲの工程に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかより選択することができる。
本発明の第１の発明において、さらに実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片を生成する反応を選択する工程を含んでもよく、さらに実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片を選択する工程を含んでもよい。
本発明の第１の発明は、試料から直接あるいは試料から鋳型核酸を調製した後に、実施することができ、該鋳型核酸は、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣライブラリー、ゲノムあるいはｃＤＮＡののいずれの形でも好適に使用できる。
本発明の第２の発明は、上記本発明の第１の発明の核酸塩基配列決定方法に用いるプライマープールであって、該プライマーの５’末端側にタグ配列を有し、さらに３’末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有する少なくとも２以上のプライマーを包含することを特徴とするプライマープールに関する。
本発明の第２の発明のプライマープールにおいて、タグ配列を有するプライマーは、下記一般式で表される構造を有するプライマーが好適に使用できる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただしＳａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
本発明の第２の発明において、プライマー中のタグ配列がシークエンシング用プライマー配列を含んでもよい。
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明のプライマープールを含むことを特徴とする核酸塩基配列決定用組成物に関する。
本発明の第３の発明の核酸塩基配列決定用組成物において、さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでもよく、該ＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼが使用できる。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのいずれもが好適に使用できる。
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の核酸塩基配列決定方法に使用するためのキットであって、本発明の第２の発明のプライマープールを含むことを特徴とする核酸塩基配列決定用キットに関する。
本発明の第４の発明のキットにおいて、さらにＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼ用バッファーを含んでもよい。
また、本発明の第４の発明のキットは、パッケージされた形態において、本発明の第２の発明のプライマープールおよび上記ＤＮＡポリメラーゼの使用を指示した指示書を含んでもよく、プライマープール中のタグ配列を有するプライマーのそれぞれがあらかじめ定められた場所に分注されていてもよい。
本発明の第５の発明は、包装材と該包装材に封入された核酸塩基配列決定用試薬からなる製造品であって、該核酸増幅用試薬がプライマープール及び／又はＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に前記核酸塩基配列決定用試薬が塩基配列決定に使用できることが表示してなる核酸塩基配列決定用試薬の製造品に関する。
発明の詳細な説明
以下、本発明を、鋳型核酸を増幅するためにポリメラーゼ チェーン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を使用する場合について説明する。しかし、本発明において使用される増幅方法はＰＣＲに限定されるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、２つのプライマーによって規定される鋳型核酸の領域を特異的に増幅できるいずれもの方法を使用することができる。そのような方法としては例えば、国際公開公報第００／５６８７７号パンフレット記載のＩＣＡＮ法、日本国特許２０８７４９７号記載のＳＤＡ法、米国特許５８５４０３５号記載のＲＣＡ法などが挙げられる。
本明細書においてプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのことをいい、アデニンヌクレオチド（Ａ）、グアニンヌクレオチド（Ｇ）、シトシンヌクレオチド（Ｃ）及びチミンヌクレオチド（Ｔ）が例示される。また、該デオキシリボヌクレオチドは、ＰＣＲに使用できるものであれば非修飾あるいは修飾デオキシリボヌクレオチドのいずれを含んでいてもよい。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいて、その中央より３’末端にかけての部分を示す。同様に、５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を示す。
本明細書においてタグ配列とは、上記プライマーの５’末端側に配置された、あるいは該プライマーの中央より３’末端側に配置された、特定のプライマープールに含有される各プライマーに共通の塩基配列、あるいは各プライマーごとに異なる塩基配列のことをいい、特に限定はされないが、チェーンターミネーター法によるシークエンシング用プライマーがアニーリングするための配列やさらに制限エンドヌクレアーゼの酵素認識部位を含んでいてもよい。また、該タグ配列は、鋳型核酸にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが好ましいが、鋳型ＤＮＡの配列によっては該塩基配列を構築することが困難な場合もあるので特に限定はされない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のプライマープール
本発明のプライマープールは、５’末端にタグ配列を有し、任意の塩基配列にアニーリングしうるプライマーのライブラリーである。ＰＣＲにおけるプライマープールから選択されるプライマーからのＤＮＡ鎖の伸長には、主に当該プライマーの３’末端側の配列が重要である。また、タグ配列には、鋳型にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが、ＰＣＲでの特異的増幅に効果的である。本発明の方法に使用されるプライマープールに包含されるプライマーは、鋳型核酸中の任意の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能である。すなわち、当該プライマーの３’末端側の塩基配列と鋳型ＤＮＡとが完全に相補的でない場合でもＤＮＡ鎖を伸長することが可能である。当該プライマーは通常、プール中の各プライマーが任意の塩基配列の鋳型核酸にほぼ均等に分散してアニーリングしうるように設計されることが好ましい。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。このようなプライマーの設計は、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝酒造発行、第１３頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計することができる。また、市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用することができる。
本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定はされないが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１８ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造を持つオリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただし、Ｓａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
まずプライマーの５’末端側のタグ配列としては、例えば、好ましくは１０ヌクレオチド以上、特に好ましくは、１５ヌクレオチド以上の塩基配列が配置される。該配列には、特に限定はないが、２次構造やダイマー構造を形成しない配列が好ましく、また、鋳型中の塩基配列と相補性のないものが特に好ましい。鋳型となる核酸の塩基配列に関する情報がある場合には、これを参考にして設計することができ、例えば鋳型核酸中の最も少ない６塩基の配列を組み合わせた約５０種類から選択することができる。特に限定はされないが、具体的な塩基配列としては、例えば大腸菌、パイロコッカス属細菌あるいはバチルス属細菌等の塩基配列解析を行う場合、タグ配列として、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧ（配列番号１）を選択することができる。
次に、プライマーの３’末端側の特定の塩基配列（すなわちそれぞれの塩基が４種類の塩基から選択される１種の塩基のみからなる配列）については、鋳型核酸にアニーリングする必要があることから、少なくとも３ヌクレオチド以上、特に７ヌクレオチド以上が好ましい。さらに、該特定の塩基配列中には、その位置に特に限定はないが、例えば、特定の塩基配列の３’末端側、５’末端側あるいは内部にランダムな組み合わせ、Ｎ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃの混合）部分を含んでもよい。特該ランダムな塩基配列は、０から５ヌクレオチドであることが好ましい。また、該特定の塩基配列中の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定したプライマープールであってもよく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、３’末端側から１番目と７番目の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定した場合が挙げられる。さらに、該塩基配列中のＧＣ含量は、５０％〜７０％であることが好ましく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、４ヌクレオチドから５ヌクレオチドがＧＣになる場合が挙げられる。この場合、プライマー全体で２次構造をとらない、プライマーダイマー形成しないということを指標にすることが好ましい。
特定の塩基配列を有するプライマーの鋳型にアニーリングするための特異的配列は、３ヌクレオチド以上、さらに好ましくは７ヌクレオチド以上にすることにより、後のＰＣＲにおいて効率的にシングルバンドを生成することができる。また、該プライマー中にランダムな塩基配列の部分を含んでもよい。特に、該プライマーにタグ配列を含むことが重要である。
本発明のプライマープールは、上記一般式に示す構造及び特定の塩基配列を有することにより、後のＰＣＲにおいて実質的にシングルバンドの増幅断片を生成し、また、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。従って、該増幅断片の塩基配列を解析することにより鋳型核酸の全塩基配列を決定することができる。
本発明のプライマープールの一つの態様としては、例えば、鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドであるものが挙げられる。特に限定はされないが、例えば、実施例１に記載のプライマープールＩ〜ＩＩＩが挙げられる。さらに、該鋳型特異的塩基配列の５’側にランダムな塩基配列を含むプライマープールＩ、ＩＶもしくはＶＩ、又は３’末端側にランダムな塩基配列を含むプライマープールＩＩが例示される。また、該プライマーにランダムな塩基配列の部分を全く含まないプライマープールＩＩＩあるいはＶが例示される。
例えば、鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドである場合、鋳型核酸への特異的アニーリングには、上記プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチド中、６ヌクレオチド以上が鋳型核酸にアニーリングすることが好ましい。特に限定はされないが、例えば上記特定の塩基配列が３’末端側にある場合において、特に該特定の配列の３’末端の６ヌクレオチドの配列のバリエーションが重要であり、プライマープールの各プライマー間で６ヌクレオチド中２ヌクレオチド以上異なることが好ましい。
本発明のプライマープール中のプライマーのそれぞれと鋳型特異的なプライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、全反応の少なくとも１０％以上の割合でいろいろなサイズのシングルバンドの増幅断片を得ることができ、該増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより、目的の核酸の全塩基配列を決定する事ができる。
本発明のプライマープールは、特定の塩基配列、タグ配列そしてランダムな塩基配列の各部分を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明の塩基配列決定方法
本発明の方法は、上記（１）に示されたプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定することにより実施される。
本発明の方法において、ＰＣＲで使用するＤＮＡポリメラーゼは、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物）を用いることができる。特に限定はされないが、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ型）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（いずれもα型）等が好適に使用できる。さらに、該ＤＮＡポリメラーゼはミ混合型のＤＮＡポリメラーゼであってもよく、例えば、３’→５’エキソ活性のあるものとないものの組み合わせ、例えば、タカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラ Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。また、国際公開公報第９９／５４４５５号パンフレット記載の３’→５’エキソ活性のあるもの同士の組み合わせあるいは３’→５’エキソ活性のないものの組み合わせのいずれもが本発明の方法に好適に使用できる。
当該方法では、伸長反応となる基質となるヌクレオチド３リン酸には、ＰＣＲ法等に用いられるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰのアナログ、例えば７−デアザ−ｄＧＴＰ等を含んでもよい。
本発明の方法において、鋳型となる核酸、上記（１）のプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、鋳型特異的プライマーを起点として、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。従って、該増幅断片をシークエンスすることにより、鋳型核酸の全塩基配列を解析することができる。
本発明の方法において、鋳型となる核酸は、生物のゲノムであってもよく、該ゲノムを物理的手段で切断した断片あるいは制限酵素で消化した断片、あるいは該断片をプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ＢＡＣあるいはＹＡＣベクターに挿入したものも好適に使用できる。あるいは、逆転写反応で得られたｃＤＮＡであってもよい。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
また、本発明の方法においては、鋳型となる核酸の由来に応じて使用するプライマープールを選択する工程を含んでいてもよい。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を鋳型としたい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ等あるいは好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
本発明の方法においてＰＣＲは、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施することができる。また、本発明の方法におけるＰＣＲ条件は、国際公開パンフレット第００／１４２１８号等に記載の高速ＰＣＲ法の条件で実施してもよい。さらに、反応液中に国際公開パンプレット第９９／５４４５５号記載の酸性物質あるいは陽イオン錯体を含有させても良い。
上記のＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片を適切なＤＮＡ塩基配列決定操作、例えばチェーンターミネーター法に供することにより、当該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。さらに、同様に決定された各ＰＣＲの増幅断片の塩基配列を総合し、解析することにより、鋳型に用いた核酸の塩基配列を広い範囲にわたって決定することができる。
本発明の方法においては、ＰＣＲ産物は、適当な精製方法、例えば、マイクロコン−１００のようなＰＣＲ産物精製用の分子ふるいに供して、精製したのちにシークエンシングに供してもよい。
本発明の方法を用いた塩基配列解析の例として、例えば大腸菌ゲノムを解析した場合、タグ配列を有する９２個のプライマーを含む本発明のプライマープールを用いた９２反応中、２２反応でシングルバンドの単一なＰＣＲ増幅産物が得られ、該増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより、約４０００ｂｐ以上の塩基配列を決定することができる。また、ピロコッカス フリオサスゲノムに関しては９２反応中、１８反応でシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られ、約５０００ｂｐ以上の領域に渡って塩基配列を決定することができる。さらに、バチルス カルドテナックスゲノムに関しては、挿入方向の異なる該ゲノム由来のＤＮＡ断片のプラスミドを混合することにより、各方向計９２反応中、２０反応でシングルバンドのＰＣＲ増幅産物が得られ、約２０００ｂｐ以上の領域に渡って塩基配列を両方向から決定することができる。
上記のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片は、その末端にプライマープールから選択されたプライマー由来のタグ配列を有している。従って、タグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用することにより、当該増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。
本発明において、塩基配列の決定はダイレクトシークエンシングによって実施される。本明細書においてダイレクトシークエンシングとは、増幅された核酸断片をベクターにクローン化することなく鋳型として使用して核酸の塩基配列を決定することをいう。従って、ダイレクトシークエンシングは、ＰＣＲなどの増幅方法によって得られた断片を鋳型とし、この断片に相補的な配列を有するプライマー、例えばタグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用して、ジデオキシ法のような通常の塩基配列決定方法によって実施される。
さらに、上記のＰＣＲで得られた増幅断片を全てシークエンシング反応に供することにより、実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られた反応については、バックグラウンドとして、プライマー同士の増幅断片がある場合においてもその塩基配列が解読される。すなわち、本発明において、実質的にシングルバンドの増幅断片とは、後のシークエンス解析において、その塩基配列を解析しうる程度に単一な増幅断片のことをいう。従って、本発明の方法においては、実質的にシングルバンドの増幅断片を得ることができる核酸増幅方法、特に限定はされないが、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＲＣＡ法等のいずれもが好適に使用できる。この結果を総合的に解析することにより、元の鋳型核酸の全塩基配列を決定することができる。なお、ＰＣＲで増幅される領域の偏り等により、鋳型核酸の一部の領域で塩基配列を決定できない場合もある。その場合は、該領域について本発明の方法を再度実施するか、あるいは公知の方法を組み合わせて、例えば、得られた塩基配列情報に基づいて新たに合成したプライマー等を用いて該領域の塩基配列を決定することは当然のことである。
上記塩基配列決定は、市販のシークエンサー例えば、Ｍｅｇａ ＢＡＣＥ １１０００（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を使用することができる。また、市販のシークエンシングキット、例えばＢｃａＢＥＳＴＴＭ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ キット（宝酒造社製）等を用いてもよい。
さらに好ましい態様としては、特に限定するものではないが、上記のＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動等に供して、増幅産物を分析したうえで、実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応並びに本発明の塩基配列決定方法に適切な鎖長の反応を選択し、その反応生成物をシークエンシングに供してもよい。上記工程を加えることにより、シークエンシングに供する増幅断片の数を減らし、塩基配列決定に要するコストを低減することができる。また、実質的にシングルバンドである反応を選択することにより、目的の増幅断片の分子（モル）数が他の増幅断片に比べて十分に多い場合、タグ配列を利用してシークエンス反応を行っても、ノイズが少なく信頼できるシークエンスデータを得ることができる。このように実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応を選択するには、増幅断片の量を分子数に換算して評価することが重要である。特に限定するものではないが、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザ（宝酒造社製）の電気泳動装置等を有効に利用することができる。該装置では、増幅断片の量とその分子量を測定して、その値から各断片の量を分子数に換算して表示することができる。また、塩基配列を決定したい全領域に渡って重複が少なくできる限り均等に分散した塩基配列データが得られるよう、適切な鎖長の反応を選択することも配列決定の経済効率を上げるという観点から重要である。このような２つの選択の工程を自動化したシステムをコンピューターに組み込んで構築することにより、塩基配列決定に要する労力、および時間を飛躍的に低減させることができる。
さらに、前記の増幅産物の分析において、複数の増幅断片が認められた場合であっても、公知の方法によって１種の増幅断片、例えば最も増幅量の多い断片を単離し、これをシークエンシングに供することもできる。
また、プライマープールのプライマー全てと、既知の配列に特異的なプライマーとでＰＣＲ反応を行った場合に、全てのＰＣＲ反応に特異的なプライマー同士で増幅したサイズのバンドが現れることがある。この増幅断片はタグ配列を含まないため、目的の増幅断片にバックグラウンドとして含まれていても塩基配列を決定することができる。ただし、上記の特異的なプライマー同士での増幅は、目的とする核酸の増幅効率を低下させるため、このような増幅が生じないようなプライマー配列を設計することが好ましい。特に限定はされないが、鋳型となる配列によっても異なるが、一般にプライマーの３’末端がＡＴリッチであることが好ましい。
本発明の方法において使用するプライマープールは、上記（１）に記載されたプライマーを含むプールである。これらのプライマーの全てと鋳型核酸中の既知配列に特異的なプライマーの組み合わせを用いて個々にＰＣＲを行う。特に限定はされないが、プライマープール中のプライマーが有する特定の塩基配列が７ヌクレオチドの時、配列中の塩基の分布にまったく偏りがない場合に平均して、該配列は４７＝１６３８４に一個現れる。従って、７ヌクレオチドの特定の塩基配列を含むプライマーを１００通り用意したとすると、平均して、約１６０ヌクレオチドに一個の割合で該配列が現れる。つまり、この１００個の上記プライマーをそれぞれ別々に使ってＰＣＲする事によって、平均１６０ヌクレオチドずつ、長さの異なった増幅断片が得られることになる。このうち、実質的にシングルバンドで得られたＰＣＲ産物をタグ配列と同じ、あるいはタグ配列に含有される塩基配列を有するシークエンス用プライマーでシークエンス反応を行って得られた塩基配列データを解析する事によって、後に得られるシークエンスデータを待つことなく、一気に数Ｋｂのシークエンス解析を実施することができる。
（３）本発明のプライマープールを含むキット
本発明は、上記（１）に記載されたプライマープールを用いた上記（２）記載の核酸の塩基配列決定方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明のプライマープールの仕様及び、該プールを用いたＰＣＲ法のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、本発明のプライマープール、ＤＮＡポリメラーゼ並びに該ポリメラーゼ用バッファーを含むキットは本発明の方法に好適に使用できる。また、本発明のプライマープール、市販のＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ用試薬を指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、鋳型がＲＮＡの場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記（２）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、ＰＣＲ用試薬は、市販のＰＣＲ用試薬であってもよく、実施例記載のバッファーを使用してもよい。さらに、塩基配列決定用試薬、例えばシークエンス用プライマーあるいはシークエンス用ポリメラーゼを含んでもよい。
本発明の塩基配列決定方法を記載した指示書とは、本発明の塩基配列決定方法を、当該キットの使用方法、推奨されるプライマープールの仕様、推奨される反応条件等に関する情報を第３者に提供するものの事を言い、該内容を記載した印刷物、例えばパンフレット又はリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通じて、開示提供された情報も含まれる。
（４）本発明の組成物
本発明は、前述の核酸塩基配列決定方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（１）に記載のプライマープール並びに上記（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、ＰＣＲを行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。さらに、上記（２）記載の酸性物質あるいは陽イオン錯体を含んでいてもよい。
本発明のプライマープールを用いることにより、迅速で低コストの核酸塩基配列決定方法が提供される。また、該方法では、約１００種類のプライマーを有するプライマープールと一つの特異的プライマーの組み合わせで実施することができるため、大量、多種類のゲノム解析に有用である。さらに、本発明の方法は、従来のショットガン・シークエンス法に比べ、少ないシークエンス回数で目的の核酸の塩基配列を決定することができることからも、大量、多種類のゲノム解析に有用である。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１
（１）プライマープールＩの作製
配列表の配列番号１記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（Ｉ）で表されるプライマープールＩを合成した。
５’−タグ配列−ＮＮ−ＳＳＳＳＳＳＳ−３’ （Ｉ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表１にプライマープールＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
すなわち、表１は、一般式Ｉで表されるプライマーの３’末端７ヌクレオチドの特定の塩基配列を示したものであり、４７＝１６３８４通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して、特定の９２種類の塩基配列を有するプライマーを選定した。
（２）プライマープールＩＩの作製
配列表の配列番号２記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＩ）で表されるプライマープールＩＩを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳＳＳＳＳ−ＮＮ−３’ （ＩＩ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表２にプライマープールＩＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
すなわち、表２は、上記一般式ＩＩで表されるプライマーの３’末端の３塩基目から９塩基目までの特定の塩基配列を示したものであり、４７＝１６３８４通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して、特定の９２種類の塩基配列を有するプライマーを選定した。
（３）プライマープールＩＩＩの作製
配列表の配列番号２記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるプライマープールＩＩＩを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳＳＳＳＳ−３’ （ＩＩＩ）
（Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）さらに表３にプライマープールＩＩＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
すなわち、表３は、一般式ＩＩＩで表されるプライマーの３’末端７ヌクレオチドの特定の塩基配列を示したものであり、４７＝１６３８４通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して、特定の９２種類の塩基配列を有するプライマーを選定した。
（４）プライマープールＩＶの作製
配列表の配列番号３記載の塩基配列、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＶ）で表されるプライマープールＩＶを合成した。
５’−タグ配列−ＮＮＮ−ＳＳＳＳＳＳ−３’ （ＩＶ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表４にプライマープールＩＶの構造及びＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
すなわち、表４は、一般式ＩＶで表されるプライマーの３’末端６ヌクレオチドの特定の塩基配列を示したものであり、４６＝４０９６通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して、特定の７７種類の塩基配列を有するプライマーを選定した。
（５）プライマープールＶの作製
配列表の配列番号３記載の塩基配列、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（Ｖ）で表されるプライマープールＶを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳ−３’ （Ｖ）
（Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）さらに表５にプライマープールＶの構造及びＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
すなわち、表５は、一般式Ｖで表されるプライマーの３’末端３ヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、４３＝６４通りの塩基配列を有するプライマーを選定した。
実施例２
（１）プラスミドにクローン化された大腸菌遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）のゲノムＤＮＡを鋳型に配列表の配列番号４及び５記載の塩基配列を有するＥｃｏ−１プライマーとＥ６ｓｐｈプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られた約６．１ｋｂｐのＰＣＲ増幅断片の末端をタカラ ブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化処理し、さらに制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）のＳｍａＩ、ＳｐｈＩサイトに連結してプラスミドｐＵＣＥ６を得た。
（２）上記プラスミドｐＵＣＥ６を鋳型として、ベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭ１３−ｐｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）と実施例１で調製したプライマープールＩ〜ＩＩＩの各９２とおりのプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、１００ｐｇのプラスミドｐＵＣＥ６、０．６２５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液２５μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（パーキンエルマー社製）で、９８℃ ０秒、３８℃ ０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩでは、９２反応液のうち２２反応液で３００ｂｐから５６００ｂｐの範囲でいろいろなサイズのシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００（宝酒造社製）にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドｐＵＣＥ６に挿入されたＤＮＡ断片の４３７８塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＩでは、９２反応液のうち２１反応液で３００ｂｐから４７００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が得られた。該増幅断片についてダイレクトシークエンスを行ない、４６０１塩基の配列を決定することができた。さらに、プライマープールＩＩＩの場合は、９２反応液のうち２４反応液で１０００ｂｐから６０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズのシングルバンドのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が得られた。該増幅断片についてダイレクトシークエンスを行ない、上記プライマープールと同様に鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（パーキンエルマー社製）で、９８℃ ０秒、３８℃ ０秒、７２℃ ３分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中２２反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ（鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。該反応のうち１２反応においては、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、２２反応中１０反応では、１塩基ミスマッチでアニールしていた。そのうち５反応及び２反応は、それぞれ同一の領域を増幅していた。
本発明のプライマープールＩＩの場合、９２反応中２１反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ、鋳型核酸の塩基配列を決定できた。また、該反応のうち９反応においては、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、９２反応中１０反応では、１塩基ミスマッチでアニールしていた。そのうち２反応は２塩基ミスマッチでアニールしていた。
実施例３
（１）プラスミドにクローン化されたＧＣ含量（４３．２％）の低いピロコッカス フリオサス遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、ピロコッカス フリオサス（ＤＳＭ登録番号３６３８）のゲノムＤＮＡを鋳型に配列表の配列番号６及び７記載の塩基配列を有するＰｆｕＦＸｂａプライマーとＰｆｕＲＸｂａプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られた約８．５ｋｂｐのＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＸｂａＩサイトに連結してプラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５を得た。
（２）上記プラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５を鋳型として、配列表の配列番号８記載のベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭＲ１と実施例１で調製したプライマープールＩの各９２とおりのプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、２００ｐｇのプラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、を９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、９２反応液のうち１８反応液で１３００ｂｐから８４００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００（宝酒造社製）にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（Ｔａｇ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５に挿入されたＤＮＡ断片の５６２２塩基の配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中１９反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ，鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。また、該反応のうち４反応において、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、９２反応中９反応では１塩基ミスマッチ、１反応では２塩基ミスマッチ、１反応では３塩基ミスマッチでアニールしていた。１塩基ミスマッチでアニールしていた反応のうち、２反応は、同一配列にアニールしていた。
実施例４
（１）ＧＣクラスターとＡＴクラスターの繰り返しが多いバチルス カルドテナックス遺伝子について、プラスミドにクローン化された該遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、バチルス カルドテナックス（ＤＳＭ登録番号４０６）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結して２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７を得た。さらに、上記ＤＮＡ断片の挿入方向が逆向きのプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７を得た。
（２）上記プラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７及びプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７の混合物を鋳型として、ベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭ１３−ｐｒｉｍｅｒＲＶと実施例１で調製したプライマープールＩの各９２種類のプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、２００ｐｇのプラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７及びプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７の混合物、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液ををＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、９２反応液のうち１９反応液で６５０ｂｐから２８００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（Ｔａｇ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の２２５４塩基の配列を両方向から決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中１９反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ、鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。また、該反応のうち６反応において、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、８反応では１塩基ミスマッチ、２反応では２塩基ミスマッチでアニールしていた。
実施例５
実施例２〜４の結果について、本発明の方法におけるプライマーアニーリング様式を検討した。
本発明の方法について、特定の塩基配列７ヌクレオチドが、鋳型核酸と完全一致していないにも関わらず、シングルバンドでＰＣＲ増幅し、シークエンスができることを確認した。これらのプライマーについて、７ヌクレオチド中のどの塩基が鋳型と相補的でなかったのかを集計した。その結果、７ヌクレオチド中、３’末端がミスマッチであったが、シークエンスできたものが４３反応中５反応、３’末端から２番目がミスマッチであったがシークエンスできたもの、４３反応中３反応、以下同様に３’末端から３番目で４３反応中２反応、４番目で４３反応中６反応、５番目で４３反応中６反応、６番目で４３反応中５反応、７番目で４３反応中１６反応であった。すなわち、３’末端から７番目がミスマッチでもＰＣＲ増幅し、シークエンスできた例が多く、プライマープールの３’末端から７番目のバリエーションが必須でないことが明らかになった。一方、３’末端がミスマッチであったのにも関わらず、シングルバンドの増幅産物が得られてシークエンスできた例が５反応あった。次に、ミスマッチの種類について表６に示す。
表６に示したように一方をＴとするミスマッチが多いことから、このＴが、他の塩基よりもミスマッチを起こしやすいことが確認できた。
実施例６
（１）コスミドにクローン化されたピロコッカス フリオサス遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。コスミドクローンのは、国際公開公報ＷＯ９７／２４４４４パンフレット記載の４０ｋｂｐのピロコッカス フリオサス遺伝子が挿入されたコスミド４９１を用いた。以下のように行った。
（２）上記コスミド４９１を鋳型として、配列表の配列番号９記載のインサート内の特異的な塩基配列を有するプライマーＰｆｕ３０Ｆ１と実施例１で調製したプライマープールＩ、ＩＩの各９２種類、プライマープールＩＶの各７７種類、及びプライマープールＶの各６４種類のプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、５００ｐｇのコスミド４９１、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩを用いた場合、９２反応液のうち２２反応液で４００ｂｐから６０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の約１７４６塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＩを用いた場合、９２反応液のうち２０反応液で５００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の２０４５塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＶを用いた場合、７７反応液のうち１７反応液で１１００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、配列表の配列番号３記載のシークエンスプライマー２を用いてダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の２６１４塩基の配列を決定することができた。さらに、プライマープールＶを用いた場合、６４反応液のうち２３反応液で５００ｂｐから２９００ｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、配列表の配列番号３記載のシークエンスプライマー２を用いてダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プライマープールＶにおいても、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基の配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
実施例７
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの塩基配列決定方法について検討した。ゲノムＤＮＡは、常法により調製した。
（２）上記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号９記載の塩基配列を有するプライマーＰｆｕ３０Ｆ１と実施例１で調製したプライマープールＩの各９２種類のプライマーの内、表１の４９番〜７２番の２４種のそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、１０ｎｇのピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡ、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、５０℃ １０秒、７２℃ ４０秒を１サイクルとした４０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩを用いた場合、２４反応液のうち８反応液で４００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、ゲノムＤＮＡにおいても約１０００塩基の配列を決定することができ、本発明の核酸塩基配列決定方法が有効であることを確認した。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、５０℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした４０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
実施例８
サーモコッカス リトラリス ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子、サーモコッカス セラー ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの調製
サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ５４７３）、サーモコッカス セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ２４７６）それぞれ１１ｍｌ相当分の菌体を集め、５００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、１００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に１００μｌのＴＥに溶解してそれぞれゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｆ１（配列番号１０）とオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｒ０（配列番号１１）を合成した。
上記実施例８−（１）で調製したサーモコッカス リトラリス とサーモコッカス セラーのゲノムＤＮＡ溶液各５μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｆ１及び１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｒ０をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、マイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例８−（２）で得た約０．５ｋｂのサーモコッカス リトラリス由来の断片ＴｌｉＦ１Ｒ０のとサーモコッカス セラー由来の断片ＴｃｅＦ１Ｒ０の塩基配列を決定し、それをもとにＴｌｉＦ１Ｒ０の上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−１（配列番号１２）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−２（配列番号１３）を合成した。また、ＴｃｅＦ１Ｒ０の上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−１（配列番号１４）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−２（配列番号１５）を合成した。さらに、表７に示す４８種類のプライマーを合成した。表７中のタグ配列を配列表の配列番号１６に示す。
実施例８−（１）で調製した各ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−１または２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−２と各２０ｐｍｏｌの表１記載の４８種類のプライマーとの組み合わせで、また、２０ｐｍｏｌのＴｃｅＲＮ−１または２０ｐｍｏｌのＴｃｅＲＮ−２と各２０ｐｍｏｌの表１記載の４８種類のプライマーとの組み合わせで、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３０μＭ ｄＮＴＰ混合物、２．５単位のタカラＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲは９４℃で３分インキュベートした後、９８℃で１０秒、５０℃で１０秒、７２℃で４０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物の一部をアガロース電気泳導し、シングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークエンスをおこない、ＲＮａｓｅＨＩＩの上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、サーモコッカス リトラリスでは、約４５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＮ７にＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の上流が、約６００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＣ２５、約４００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＣ２６に下流が含まれていることがわかった。また、サーモコッカス セラーでは、約４５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｃｅＮ２４にＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の上流が、約４００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｃｅＣ２９に下流が含まれていることがわかった。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子全域のクローニング
ＴｌｉＦ１Ｒ０、上流、下流を含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１７に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１８に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｌｉＮｄｅ（配列番号１９）及びＴｌｉＢａｍ（配列番号２０）を合成した。
同様に、ＴｃｅＦ１Ｒ０、上流、下流を含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２１に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｃｅＮｄｅ（配列番号２３）及びＴｃｅＢａｍ（配列番号２４）を合成した。
実施例８−（１）で得たサーモコッカス リトラリス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｌｉＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｌｉＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＬＩ２２３ＮｄおよびｐＴＬＩ２０４を作製した。
また、サーモコッカス リトラリス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｃｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｃｅＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７を作製した。
（５）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例８−（２）で得られたｐＴＬＩ２２３Ｎｄ、ｐＴＬＩ２０４、ｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。ｐＴＬＩ２０４のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２５に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２６に示す。ｐＴＬＩ２２３Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＬＩ２０４とくらべて４８４番目のＴがＣに置きかわっていた。また、アミノ酸配列では１６２番目のフェニルアラニンがロイシンに置きかわっていた。
また、ｐＴＣＥ２０７のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２７に示す。該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２８に示す。ｐＴＣＥ２６５Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＣＥ２０７とくらべて１４番目のＡがＧに置きかわっており、６９３から６９６番目が欠失していた。また、アミノ酸配列では５番目のグルタミン酸がグリシンに置きかわっており、２３１番目のフェニルアラニンが欠失していた。
（６）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＴＬＩ２２３Ｎｄ、ｐＴＣＥ２６５Ｎｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む１０ｍｌのＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を１９６μｌのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にｐＴＬＩ２０４、ｐＴＣＥ２０７で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液の酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においてもＲＮａｓｅＨ活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。このように、本発明の方法により、ライブラリーを作製することなく、ゲノムより直接目的の遺伝子を簡便、迅速にクローニングできることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、鋳型に特異的なプライマーと特定の塩基配列を有するプライマーとでＰＣＲすることによって得られるＰＣＲ産物をシークエンシングすることにより、迅速で低コストの核酸の塩基配列決定方法が提供される。
【配列表】
本発明は、遺伝子工学分野で有用な、核酸の塩基配列決定方法に関する。
背景技術
現在、核酸の塩基配列を解析する方法としては、平板タイプまたはキャピラリータイプのゲルを用いた電気泳動方法によって解析を行うチェーンターミネータ法がその主流である。該方法は、使用するポリメラーゼあるいは電気泳動装置の改良により一度に解析できる塩基配列の長さが伸びてきている。しかしながらそれでも、通常５００塩基対前後、長くても１０００塩基対以下を解析できるにすぎない。従って、通常のプラスミド、ファージ、コスミド等のベクターにクローニングされた、数キロ塩基対より長いＤＮＡ断片の塩基配列を決定するためには、プライマーウォーキング法、サブクローニング法あるいはデリーションクローン作製法のような手法のいずれかを単独、または組み合わせて用いる必要がある。
例えば、上記の手法をそれぞれ用いて、プラスミドベクターにクローニングされた５キロ塩基対の長さのＤＮＡ断片の塩基配列を決定するケースにおいて、プライマーウォーキング法を用いるならば、クローニングされたＤＮＡ断片のどちらかの末端から、まずはベクター上の塩基配列を有するプライマーを用いて塩基配列を決定する。その後、新たに得られた塩基配列の情報に基づいて新たなプライマーを設計・合成してさらに先の領域の塩基配列を決定する。この操作を何回も繰り返すことによって、クローニングされた断片の全塩基配列を決定することができる。しかしながらプライマーウォーキング法では、各塩基配列の操作毎に、プライマーを設計・合成する必要があり、時間と費用を要する。
次に上記ＤＮＡ断片の塩基配列をサブクローニング法を用いて解析する場合には、まず、プラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、この切断されたＤＮＡ断片の長さに基づいて、クローニングされたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。次に、上記の制限酵素地図をもとに選択された制限酵素で切断されたＤＮＡ断片をファージあるいはプラスミドベクターにそれぞれサブクローニングし、ベクター上の配列を有するプライマーを用いて塩基配列を決定する。このサブクローニング法では、制限酵素地図の作成やそれに続くサブクローニング等、煩雑な操作が必要であり、手間と時間を要する。また、この方法で効率よく、元のクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列が決定されるためには、サブクローニングに適した制限酵素認識部位が該ＤＮＡ断片上に均一に散在している必要がある。
さらにジーン（Ｇｅｎｅ）、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８５）記載のＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらによって開発された塩基配列決定法、すなわちデリーションクローン作製法は、クローニングされた断片のどちらか一端を基点にして、断片長が連続的に短くなっているクローンのシリーズを調製することを特徴とする。この方法は、上記プライマーウォーキング法、あるいはサブクローニング法にみられる問題点の一部を解決したものである。このデリーションクローン作製法を用いれば、プライマーウォーキング法のように、塩基配列決定の操作毎にプライマーを設計・合成する必要はなく、また、サブクローニング法のように制限酵素地図を作成したり、制限酵素地図に基づいてサブクローニングする必要もない。しかしながら、このデリーションクローン作製法においてＤＮＡ断片長が連続的に短くなっているクローンの群を調製するには、ＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを、２種類の制限酵素、エキソ（Ｅｘｏ）ＩＩＩ ヌクレアーゼ、エキソＶＩＩ ヌクレアーゼ、クレノウフラグメント ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼという順で、各酵素に適した条件で連続的に処理していく必要がある。そのため、該方法においては、遺伝子操作に関してかなりの熟練を要する。また、クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列によってエキソＩＩＩ ヌクレアーゼに対する反応性（削られやすさ）が異なることから、上記の連続的な本操作の前に予備実験を行い、エキソＩＩＩ ヌクレアーゼに対する反応性を予め調べておく必要がある。
また、ＰＣＲ法でランダムに増幅した断片の塩基配列を解析する方法として、ＴｅｌｅｎｉｕｓらのＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）法、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第１３巻、第７１８〜７２５頁（１９９２）や、ＷｏｎｇらのＴＲＨＡ（Ｔａｇｇｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ヌクレイック アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、第１９号、第３７７８〜３７８３頁（１９９６）が挙げられる。しかしながら、いずれもの方法もランダムな配列を含む複数のプライマーの混合物を用いてＰＣＲを行い、増幅された複数のラダーを一つずつ単離、精製した後にシークエンシングする方法であり、操作が繁雑である。
このように、現在の核酸の塩基配列解析方法は、いずれも問題点をかかえており、ゲノム解析において、迅速、低コストの核酸の塩基配列解析方法が求められていた。
発明の目的
本発明の目的は、複雑な操作を経ずに、鋳型核酸のある１点を基点にして、ＤＮＡ断片長が連続的に短くなっている増幅ＤＮＡ断片の群を調製し、該ＤＮＡ断片の塩基配列を解析することを特徴とする核酸の塩基配列決定方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、特定の塩基配列を有する複数のプライマーからなるプライマープールから選択されるプライマーと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲを行うことによって、鋳型ＤＮＡの一箇所を基点にした鎖長の異なる一連のＤＮＡ増幅断片の群を調製できることを見い出した。そしてそのＤＮＡ増幅断片群中のそれぞれのＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、元のＤＮＡ断片の全塩基配列を解析できることを明らかにし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、核酸の塩基配列決定方法であって、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を増幅する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５’末端側にタグ配列を有し、３’末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有する；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片をダイレクトシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とする核酸塩基配列決定方法に関する。
本発明の第１の発明において、タグ配列を有するプライマーは、下記一般式で表される構造を有するプライマーが使用できる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただしＳａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
また、本発明の第１の発明において、タグ配列を有するプライマーが表１〜表５に記載のプライマーから選択されるプライマーが使用できる。
さらに本発明の第１の発明において、鋳型核酸の増幅工程としては、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）が例示される。該ＰＣＲの工程に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかより選択することができる。
本発明の第１の発明において、さらに実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片を生成する反応を選択する工程を含んでもよく、さらに実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片を選択する工程を含んでもよい。
本発明の第１の発明は、試料から直接あるいは試料から鋳型核酸を調製した後に、実施することができ、該鋳型核酸は、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣライブラリー、ゲノムあるいはｃＤＮＡののいずれの形でも好適に使用できる。
本発明の第２の発明は、上記本発明の第１の発明の核酸塩基配列決定方法に用いるプライマープールであって、該プライマーの５’末端側にタグ配列を有し、さらに３’末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有する少なくとも２以上のプライマーを包含することを特徴とするプライマープールに関する。
本発明の第２の発明のプライマープールにおいて、タグ配列を有するプライマーは、下記一般式で表される構造を有するプライマーが好適に使用できる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただしＳａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
本発明の第２の発明において、プライマー中のタグ配列がシークエンシング用プライマー配列を含んでもよい。
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明のプライマープールを含むことを特徴とする核酸塩基配列決定用組成物に関する。
本発明の第３の発明の核酸塩基配列決定用組成物において、さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでもよく、該ＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼが使用できる。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのいずれもが好適に使用できる。
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の核酸塩基配列決定方法に使用するためのキットであって、本発明の第２の発明のプライマープールを含むことを特徴とする核酸塩基配列決定用キットに関する。
本発明の第４の発明のキットにおいて、さらにＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼ用バッファーを含んでもよい。
また、本発明の第４の発明のキットは、パッケージされた形態において、本発明の第２の発明のプライマープールおよび上記ＤＮＡポリメラーゼの使用を指示した指示書を含んでもよく、プライマープール中のタグ配列を有するプライマーのそれぞれがあらかじめ定められた場所に分注されていてもよい。
本発明の第５の発明は、包装材と該包装材に封入された核酸塩基配列決定用試薬からなる製造品であって、該核酸増幅用試薬がプライマープール及び／又はＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に前記核酸塩基配列決定用試薬が塩基配列決定に使用できることが表示してなる核酸塩基配列決定用試薬の製造品に関する。
発明の詳細な説明
以下、本発明を、鋳型核酸を増幅するためにポリメラーゼ チェーン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を使用する場合について説明する。しかし、本発明において使用される増幅方法はＰＣＲに限定されるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、２つのプライマーによって規定される鋳型核酸の領域を特異的に増幅できるいずれもの方法を使用することができる。そのような方法としては例えば、国際公開公報第００／５６８７７号パンフレット記載のＩＣＡＮ法、日本国特許２０８７４９７号記載のＳＤＡ法、米国特許５８５４０３５号記載のＲＣＡ法などが挙げられる。
本明細書においてプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのことをいい、アデニンヌクレオチド（Ａ）、グアニンヌクレオチド（Ｇ）、シトシンヌクレオチド（Ｃ）及びチミンヌクレオチド（Ｔ）が例示される。また、該デオキシリボヌクレオチドは、ＰＣＲに使用できるものであれば非修飾あるいは修飾デオキシリボヌクレオチドのいずれを含んでいてもよい。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいて、その中央より３’末端にかけての部分を示す。同様に、５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を示す。
本明細書においてタグ配列とは、上記プライマーの５’末端側に配置された、あるいは該プライマーの中央より３’末端側に配置された、特定のプライマープールに含有される各プライマーに共通の塩基配列、あるいは各プライマーごとに異なる塩基配列のことをいい、特に限定はされないが、チェーンターミネーター法によるシークエンシング用プライマーがアニーリングするための配列やさらに制限エンドヌクレアーゼの酵素認識部位を含んでいてもよい。また、該タグ配列は、鋳型核酸にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが好ましいが、鋳型ＤＮＡの配列によっては該塩基配列を構築することが困難な場合もあるので特に限定はされない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のプライマープール
本発明のプライマープールは、５’末端にタグ配列を有し、任意の塩基配列にアニーリングしうるプライマーのライブラリーである。ＰＣＲにおけるプライマープールから選択されるプライマーからのＤＮＡ鎖の伸長には、主に当該プライマーの３’末端側の配列が重要である。また、タグ配列には、鋳型にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが、ＰＣＲでの特異的増幅に効果的である。本発明の方法に使用されるプライマープールに包含されるプライマーは、鋳型核酸中の任意の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能である。すなわち、当該プライマーの３’末端側の塩基配列と鋳型ＤＮＡとが完全に相補的でない場合でもＤＮＡ鎖を伸長することが可能である。当該プライマーは通常、プール中の各プライマーが任意の塩基配列の鋳型核酸にほぼ均等に分散してアニーリングしうるように設計されることが好ましい。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。このようなプライマーの設計は、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝酒造発行、第１３頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計することができる。また、市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用することができる。
本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定はされないが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１８ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造を持つオリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−タグ配列−Ｓａ−３’
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す、ただし、Ｓａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
まずプライマーの５’末端側のタグ配列としては、例えば、好ましくは１０ヌクレオチド以上、特に好ましくは、１５ヌクレオチド以上の塩基配列が配置される。該配列には、特に限定はないが、２次構造やダイマー構造を形成しない配列が好ましく、また、鋳型中の塩基配列と相補性のないものが特に好ましい。鋳型となる核酸の塩基配列に関する情報がある場合には、これを参考にして設計することができ、例えば鋳型核酸中の最も少ない６塩基の配列を組み合わせた約５０種類から選択することができる。特に限定はされないが、具体的な塩基配列としては、例えば大腸菌、パイロコッカス属細菌あるいはバチルス属細菌等の塩基配列解析を行う場合、タグ配列として、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧ（配列番号１）を選択することができる。
次に、プライマーの３’末端側の特定の塩基配列（すなわちそれぞれの塩基が４種類の塩基から選択される１種の塩基のみからなる配列）については、鋳型核酸にアニーリングする必要があることから、少なくとも３ヌクレオチド以上、特に７ヌクレオチド以上が好ましい。さらに、該特定の塩基配列中には、その位置に特に限定はないが、例えば、特定の塩基配列の３’末端側、５’末端側あるいは内部にランダムな組み合わせ、Ｎ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃの混合）部分を含んでもよい。特該ランダムな塩基配列は、０から５ヌクレオチドであることが好ましい。また、該特定の塩基配列中の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定したプライマープールであってもよく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、３’末端側から１番目と７番目の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定した場合が挙げられる。さらに、該塩基配列中のＧＣ含量は、５０％〜７０％であることが好ましく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、４ヌクレオチドから５ヌクレオチドがＧＣになる場合が挙げられる。この場合、プライマー全体で２次構造をとらない、プライマーダイマー形成しないということを指標にすることが好ましい。
特定の塩基配列を有するプライマーの鋳型にアニーリングするための特異的配列は、３ヌクレオチド以上、さらに好ましくは７ヌクレオチド以上にすることにより、後のＰＣＲにおいて効率的にシングルバンドを生成することができる。また、該プライマー中にランダムな塩基配列の部分を含んでもよい。特に、該プライマーにタグ配列を含むことが重要である。
本発明のプライマープールは、上記一般式に示す構造及び特定の塩基配列を有することにより、後のＰＣＲにおいて実質的にシングルバンドの増幅断片を生成し、また、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。従って、該増幅断片の塩基配列を解析することにより鋳型核酸の全塩基配列を決定することができる。
本発明のプライマープールの一つの態様としては、例えば、鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドであるものが挙げられる。特に限定はされないが、例えば、実施例１に記載のプライマープールＩ〜ＩＩＩが挙げられる。さらに、該鋳型特異的塩基配列の５’側にランダムな塩基配列を含むプライマープールＩ、ＩＶもしくはＶＩ、又は３’末端側にランダムな塩基配列を含むプライマープールＩＩが例示される。また、該プライマーにランダムな塩基配列の部分を全く含まないプライマープールＩＩＩあるいはＶが例示される。
例えば、鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドである場合、鋳型核酸への特異的アニーリングには、上記プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチド中、６ヌクレオチド以上が鋳型核酸にアニーリングすることが好ましい。特に限定はされないが、例えば上記特定の塩基配列が３’末端側にある場合において、特に該特定の配列の３’末端の６ヌクレオチドの配列のバリエーションが重要であり、プライマープールの各プライマー間で６ヌクレオチド中２ヌクレオチド以上異なることが好ましい。
本発明のプライマープール中のプライマーのそれぞれと鋳型特異的なプライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、全反応の少なくとも１０％以上の割合でいろいろなサイズのシングルバンドの増幅断片を得ることができ、該増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより、目的の核酸の全塩基配列を決定する事ができる。
本発明のプライマープールは、特定の塩基配列、タグ配列そしてランダムな塩基配列の各部分を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明の塩基配列決定方法
本発明の方法は、上記（１）に示されたプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定することにより実施される。
本発明の方法において、ＰＣＲで使用するＤＮＡポリメラーゼは、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物）を用いることができる。特に限定はされないが、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ型）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（いずれもα型）等が好適に使用できる。さらに、該ＤＮＡポリメラーゼはミ混合型のＤＮＡポリメラーゼであってもよく、例えば、３’→５’エキソ活性のあるものとないものの組み合わせ、例えば、タカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラ Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。また、国際公開公報第９９／５４４５５号パンフレット記載の３’→５’エキソ活性のあるもの同士の組み合わせあるいは３’→５’エキソ活性のないものの組み合わせのいずれもが本発明の方法に好適に使用できる。
当該方法では、伸長反応となる基質となるヌクレオチド３リン酸には、ＰＣＲ法等に用いられるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰのアナログ、例えば７−デアザ−ｄＧＴＰ等を含んでもよい。
本発明の方法において、鋳型となる核酸、上記（１）のプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、鋳型特異的プライマーを起点として、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。従って、該増幅断片をシークエンスすることにより、鋳型核酸の全塩基配列を解析することができる。
本発明の方法において、鋳型となる核酸は、生物のゲノムであってもよく、該ゲノムを物理的手段で切断した断片あるいは制限酵素で消化した断片、あるいは該断片をプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ＢＡＣあるいはＹＡＣベクターに挿入したものも好適に使用できる。あるいは、逆転写反応で得られたｃＤＮＡであってもよい。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
また、本発明の方法においては、鋳型となる核酸の由来に応じて使用するプライマープールを選択する工程を含んでいてもよい。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を鋳型としたい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ等あるいは好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
本発明の方法においてＰＣＲは、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施することができる。また、本発明の方法におけるＰＣＲ条件は、国際公開パンフレット第００／１４２１８号等に記載の高速ＰＣＲ法の条件で実施してもよい。さらに、反応液中に国際公開パンプレット第９９／５４４５５号記載の酸性物質あるいは陽イオン錯体を含有させても良い。
上記のＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片を適切なＤＮＡ塩基配列決定操作、例えばチェーンターミネーター法に供することにより、当該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。さらに、同様に決定された各ＰＣＲの増幅断片の塩基配列を総合し、解析することにより、鋳型に用いた核酸の塩基配列を広い範囲にわたって決定することができる。
本発明の方法においては、ＰＣＲ産物は、適当な精製方法、例えば、マイクロコン−１００のようなＰＣＲ産物精製用の分子ふるいに供して、精製したのちにシークエンシングに供してもよい。
本発明の方法を用いた塩基配列解析の例として、例えば大腸菌ゲノムを解析した場合、タグ配列を有する９２個のプライマーを含む本発明のプライマープールを用いた９２反応中、２２反応でシングルバンドの単一なＰＣＲ増幅産物が得られ、該増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより、約４０００ｂｐ以上の塩基配列を決定することができる。また、ピロコッカス フリオサスゲノムに関しては９２反応中、１８反応でシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られ、約５０００ｂｐ以上の領域に渡って塩基配列を決定することができる。さらに、バチルス カルドテナックスゲノムに関しては、挿入方向の異なる該ゲノム由来のＤＮＡ断片のプラスミドを混合することにより、各方向計９２反応中、２０反応でシングルバンドのＰＣＲ増幅産物が得られ、約２０００ｂｐ以上の領域に渡って塩基配列を両方向から決定することができる。
上記のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片は、その末端にプライマープールから選択されたプライマー由来のタグ配列を有している。従って、タグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用することにより、当該増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。
本発明において、塩基配列の決定はダイレクトシークエンシングによって実施される。本明細書においてダイレクトシークエンシングとは、増幅された核酸断片をベクターにクローン化することなく鋳型として使用して核酸の塩基配列を決定することをいう。従って、ダイレクトシークエンシングは、ＰＣＲなどの増幅方法によって得られた断片を鋳型とし、この断片に相補的な配列を有するプライマー、例えばタグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用して、ジデオキシ法のような通常の塩基配列決定方法によって実施される。
さらに、上記のＰＣＲで得られた増幅断片を全てシークエンシング反応に供することにより、実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られた反応については、バックグラウンドとして、プライマー同士の増幅断片がある場合においてもその塩基配列が解読される。すなわち、本発明において、実質的にシングルバンドの増幅断片とは、後のシークエンス解析において、その塩基配列を解析しうる程度に単一な増幅断片のことをいう。従って、本発明の方法においては、実質的にシングルバンドの増幅断片を得ることができる核酸増幅方法、特に限定はされないが、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＲＣＡ法等のいずれもが好適に使用できる。この結果を総合的に解析することにより、元の鋳型核酸の全塩基配列を決定することができる。なお、ＰＣＲで増幅される領域の偏り等により、鋳型核酸の一部の領域で塩基配列を決定できない場合もある。その場合は、該領域について本発明の方法を再度実施するか、あるいは公知の方法を組み合わせて、例えば、得られた塩基配列情報に基づいて新たに合成したプライマー等を用いて該領域の塩基配列を決定することは当然のことである。
上記塩基配列決定は、市販のシークエンサー例えば、Ｍｅｇａ ＢＡＣＥ １１０００（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を使用することができる。また、市販のシークエンシングキット、例えばＢｃａＢＥＳＴＴＭ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ キット（宝酒造社製）等を用いてもよい。
さらに好ましい態様としては、特に限定するものではないが、上記のＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動等に供して、増幅産物を分析したうえで、実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応並びに本発明の塩基配列決定方法に適切な鎖長の反応を選択し、その反応生成物をシークエンシングに供してもよい。上記工程を加えることにより、シークエンシングに供する増幅断片の数を減らし、塩基配列決定に要するコストを低減することができる。また、実質的にシングルバンドである反応を選択することにより、目的の増幅断片の分子（モル）数が他の増幅断片に比べて十分に多い場合、タグ配列を利用してシークエンス反応を行っても、ノイズが少なく信頼できるシークエンスデータを得ることができる。このように実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応を選択するには、増幅断片の量を分子数に換算して評価することが重要である。特に限定するものではないが、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザ（宝酒造社製）の電気泳動装置等を有効に利用することができる。該装置では、増幅断片の量とその分子量を測定して、その値から各断片の量を分子数に換算して表示することができる。また、塩基配列を決定したい全領域に渡って重複が少なくできる限り均等に分散した塩基配列データが得られるよう、適切な鎖長の反応を選択することも配列決定の経済効率を上げるという観点から重要である。このような２つの選択の工程を自動化したシステムをコンピューターに組み込んで構築することにより、塩基配列決定に要する労力、および時間を飛躍的に低減させることができる。
さらに、前記の増幅産物の分析において、複数の増幅断片が認められた場合であっても、公知の方法によって１種の増幅断片、例えば最も増幅量の多い断片を単離し、これをシークエンシングに供することもできる。
また、プライマープールのプライマー全てと、既知の配列に特異的なプライマーとでＰＣＲ反応を行った場合に、全てのＰＣＲ反応に特異的なプライマー同士で増幅したサイズのバンドが現れることがある。この増幅断片はタグ配列を含まないため、目的の増幅断片にバックグラウンドとして含まれていても塩基配列を決定することができる。ただし、上記の特異的なプライマー同士での増幅は、目的とする核酸の増幅効率を低下させるため、このような増幅が生じないようなプライマー配列を設計することが好ましい。特に限定はされないが、鋳型となる配列によっても異なるが、一般にプライマーの３’末端がＡＴリッチであることが好ましい。
本発明の方法において使用するプライマープールは、上記（１）に記載されたプライマーを含むプールである。これらのプライマーの全てと鋳型核酸中の既知配列に特異的なプライマーの組み合わせを用いて個々にＰＣＲを行う。特に限定はされないが、プライマープール中のプライマーが有する特定の塩基配列が７ヌクレオチドの時、配列中の塩基の分布にまったく偏りがない場合に平均して、該配列は４７＝１６３８４に一個現れる。従って、７ヌクレオチドの特定の塩基配列を含むプライマーを１００通り用意したとすると、平均して、約１６０ヌクレオチドに一個の割合で該配列が現れる。つまり、この１００個の上記プライマーをそれぞれ別々に使ってＰＣＲする事によって、平均１６０ヌクレオチドずつ、長さの異なった増幅断片が得られることになる。このうち、実質的にシングルバンドで得られたＰＣＲ産物をタグ配列と同じ、あるいはタグ配列に含有される塩基配列を有するシークエンス用プライマーでシークエンス反応を行って得られた塩基配列データを解析する事によって、後に得られるシークエンスデータを待つことなく、一気に数Ｋｂのシークエンス解析を実施することができる。
（３）本発明のプライマープールを含むキット
本発明は、上記（１）に記載されたプライマープールを用いた上記（２）記載の核酸の塩基配列決定方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明のプライマープールの仕様及び、該プールを用いたＰＣＲ法のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、本発明のプライマープール、ＤＮＡポリメラーゼ並びに該ポリメラーゼ用バッファーを含むキットは本発明の方法に好適に使用できる。また、本発明のプライマープール、市販のＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ用試薬を指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、鋳型がＲＮＡの場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記（２）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、ＰＣＲ用試薬は、市販のＰＣＲ用試薬であってもよく、実施例記載のバッファーを使用してもよい。さらに、塩基配列決定用試薬、例えばシークエンス用プライマーあるいはシークエンス用ポリメラーゼを含んでもよい。
本発明の塩基配列決定方法を記載した指示書とは、本発明の塩基配列決定方法を、当該キットの使用方法、推奨されるプライマープールの仕様、推奨される反応条件等に関する情報を第３者に提供するものの事を言い、該内容を記載した印刷物、例えばパンフレット又はリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通じて、開示提供された情報も含まれる。
（４）本発明の組成物
本発明は、前述の核酸塩基配列決定方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（１）に記載のプライマープール並びに上記（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、ＰＣＲを行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。さらに、上記（２）記載の酸性物質あるいは陽イオン錯体を含んでいてもよい。
本発明のプライマープールを用いることにより、迅速で低コストの核酸塩基配列決定方法が提供される。また、該方法では、約１００種類のプライマーを有するプライマープールと一つの特異的プライマーの組み合わせで実施することができるため、大量、多種類のゲノム解析に有用である。さらに、本発明の方法は、従来のショットガン・シークエンス法に比べ、少ないシークエンス回数で目的の核酸の塩基配列を決定することができることからも、大量、多種類のゲノム解析に有用である。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１
（１）プライマープールＩの作製
配列表の配列番号１記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（Ｉ）で表されるプライマープールＩを合成した。
５’−タグ配列−ＮＮ−ＳＳＳＳＳＳＳ−３’ （Ｉ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表１にプライマープールＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
（２）プライマープールＩＩの作製
配列表の配列番号２記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＩ）で表されるプライマープールＩＩを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳＳＳＳＳ−ＮＮ−３’ （ＩＩ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表２にプライマープールＩＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
（３）プライマープールＩＩＩの作製
配列表の配列番号２記載の塩基配列、ＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるプライマープールＩＩＩを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳＳＳＳＳ−３’ （ＩＩＩ）
（Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）さらに表３にプライマープールＩＩＩの構造及びＳＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
（４）プライマープールＩＶの作製
配列表の配列番号３記載の塩基配列、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（ＩＶ）で表されるプライマープールＩＶを合成した。
５’−タグ配列−ＮＮＮ−ＳＳＳＳＳＳ−３’ （ＩＶ）
（Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）
さらに表４にプライマープールＩＶの構造及びＳＳＳＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
（５）プライマープールＶの作製
配列表の配列番号３記載の塩基配列、ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣをタグ配列として含むプライマーを合成した。すなわち、下記一般式（Ｖ）で表されるプライマープールＶを合成した。
５’−タグ配列−ＳＳＳ−３’ （Ｖ）
（Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。）さらに表５にプライマープールＶの構造及びＳＳＳの特定の塩基配列について示す。
実施例２
（１）プラスミドにクローン化された大腸菌遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）のゲノムＤＮＡを鋳型に配列表の配列番号４及び５記載の塩基配列を有するＥｃｏ−１プライマーとＥ６ｓｐｈプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られた約６．１ｋｂｐのＰＣＲ増幅断片の末端をタカラ ブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化処理し、さらに制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）のＳｍａＩ、ＳｐｈＩサイトに連結してプラスミドｐＵＣＥ６を得た。
（２）上記プラスミドｐＵＣＥ６を鋳型として、ベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭ１３−ｐｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）と実施例１で調製したプライマープールＩ〜ＩＩＩの各９２とおりのプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、１００ｐｇのプラスミドｐＵＣＥ６、０．６２５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液２５μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（パーキンエルマー社製）で、９８℃ ０秒、３８℃ ０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩでは、９２反応液のうち２２反応液で３００ｂｐから５６００ｂｐの範囲でいろいろなサイズのシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００（宝酒造社製）にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドｐＵＣＥ６に挿入されたＤＮＡ断片の４３７８塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＩでは、９２反応液のうち２１反応液で３００ｂｐから４７００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が得られた。該増幅断片についてダイレクトシークエンスを行ない、４６０１塩基の配列を決定することができた。さらに、プライマープールＩＩＩの場合は、９２反応液のうち２４反応液で１０００ｂｐから６０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズのシングルバンドのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が得られた。該増幅断片についてダイレクトシークエンスを行ない、上記プライマープールと同様に鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（パーキンエルマー社製）で、９８℃ ０秒、３８℃ ０秒、７２℃ ３分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中２２反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ（鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。該反応のうち１２反応においては、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、２２反応中１０反応では、１塩基ミスマッチでアニールしていた。そのうち５反応及び２反応は、それぞれ同一の領域を増幅していた。
本発明のプライマープールＩＩの場合、９２反応中２１反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ、鋳型核酸の塩基配列を決定できた。また、該反応のうち９反応においては、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、９２反応中１０反応では、１塩基ミスマッチでアニールしていた。そのうち２反応は２塩基ミスマッチでアニールしていた。
実施例３
（１）プラスミドにクローン化されたＧＣ含量（４３．２％）の低いピロコッカス フリオサス遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、ピロコッカス フリオサス（ＤＳＭ登録番号３６３８）のゲノムＤＮＡを鋳型に配列表の配列番号６及び７記載の塩基配列を有するＰｆｕＦＸｂａプライマーとＰｆｕＲＸｂａプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られた約８．５ｋｂｐのＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＸｂａＩサイトに連結してプラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５を得た。
（２）上記プラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５を鋳型として、配列表の配列番号８記載のベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭＲ１と実施例１で調製したプライマープールＩの各９２とおりのプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、２００ｐｇのプラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、を９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、９２反応液のうち１８反応液で１３００ｂｐから８４００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００（宝酒造社製）にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（Ｔａｇ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドｐＴＶＰｆｕ８．５に挿入されたＤＮＡ断片の５６２２塩基の配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中１９反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ，鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。また、該反応のうち４反応において、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、９２反応中９反応では１塩基ミスマッチ、１反応では２塩基ミスマッチ、１反応では３塩基ミスマッチでアニールしていた。１塩基ミスマッチでアニールしていた反応のうち、２反応は、同一配列にアニールしていた。
実施例４
（１）ＧＣクラスターとＡＴクラスターの繰り返しが多いバチルス カルドテナックス遺伝子について、プラスミドにクローン化された該遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。プラスミドクローンの調製は、以下のように行った。すなわち、バチルス カルドテナックス（ＤＳＭ登録番号４０６）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化後、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結して２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７を得た。さらに、上記ＤＮＡ断片の挿入方向が逆向きのプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７を得た。
（２）上記プラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７及びプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７の混合物を鋳型として、ベクター上の特異的な塩基配列を有するプライマーＭ１３−ｐｒｉｍｅｒＲＶと実施例１で調製したプライマープールＩの各９２種類のプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、２００ｐｇのプラスミドｐＵＣＢｃａＦ２．７及びプラスミドｐＵＣＢｃａＲ２．７の混合物、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液ををＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、９２反応液のうち１９反応液で６５０ｂｐから２８００ｂｐの範囲で異なるサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（Ｔａｇ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の２２５４塩基の配列を両方向から決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
（４）本発明の方法においてプライマーのアニーリング様式について検討した。本発明のプライマープールＩの場合、９２反応中１９反応でシングルバンドのＰＣＲ産物が得られ、鋳型核酸の塩基配列を決定することができた。また、該反応のうち６反応において、プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチドが鋳型核酸と完全一致していた。また、８反応では１塩基ミスマッチ、２反応では２塩基ミスマッチでアニールしていた。
実施例５
実施例２〜４の結果について、本発明の方法におけるプライマーアニーリング様式を検討した。
本発明の方法について、特定の塩基配列７ヌクレオチドが、鋳型核酸と完全一致していないにも関わらず、シングルバンドでＰＣＲ増幅し、シークエンスができることを確認した。これらのプライマーについて、７ヌクレオチド中のどの塩基が鋳型と相補的でなかったのかを集計した。その結果、７ヌクレオチド中、３’末端がミスマッチであったが、シークエンスできたものが４３反応中５反応、３’末端から２番目がミスマッチであったがシークエンスできたもの、４３反応中３反応、以下同様に３’末端から３番目で４３反応中２反応、４番目で４３反応中６反応、５番目で４３反応中６反応、６番目で４３反応中５反応、７番目で４３反応中１６反応であった。すなわち、３’末端から７番目がミスマッチでもＰＣＲ増幅し、シークエンスできた例が多く、プライマープールの３’末端から７番目のバリエーションが必須でないことが明らかになった。一方、３’末端がミスマッチであったのにも関わらず、シングルバンドの増幅産物が得られてシークエンスできた例が５反応あった。次に、ミスマッチの種類について表６に示す。
実施例６
（１）コスミドにクローン化されたピロコッカス フリオサス遺伝子の塩基配列決定方法について検討した。コスミドクローンのは、国際公開公報ＷＯ９７／２４４４４パンフレット記載の４０ｋｂｐのピロコッカス フリオサス遺伝子が挿入されたコスミド４９１を用いた。以下のように行った。
（２）上記コスミド４９１を鋳型として、配列表の配列番号９記載のインサート内の特異的な塩基配列を有するプライマーＰｆｕ３０Ｆ１と実施例１で調製したプライマープールＩ、ＩＩの各９２種類、プライマープールＩＶの各７７種類、及びプライマープールＶの各６４種類のプライマーのそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、５００ｐｇのコスミド４９１、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ４０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩを用いた場合、９２反応液のうち２２反応液で４００ｂｐから６０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の約１７４６塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＩを用いた場合、９２反応液のうち２０反応液で５００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の２０４５塩基の配列を決定することができた。また、プライマープールＩＶを用いた場合、７７反応液のうち１７反応液で１１００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、配列表の配列番号３記載のシークエンスプライマー２を用いてダイレクトシークエンスを行なった。その結果、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の２６１４塩基の配列を決定することができた。さらに、プライマープールＶを用いた場合、６４反応液のうち２３反応液で５００ｂｐから２９００ｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、上記と同じ方法で精製後、配列表の配列番号３記載のシークエンスプライマー２を用いてダイレクトシークエンスを行なった。その結果、プライマープールＶにおいても、コスミド４９１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基の配列を決定することができた。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９８℃ １０秒、３８℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
実施例７
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの塩基配列決定方法について検討した。ゲノムＤＮＡは、常法により調製した。
（２）上記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号９記載の塩基配列を有するプライマーＰｆｕ３０Ｆ１と実施例１で調製したプライマープールＩの各９２種類のプライマーの内、表１の４９番〜７２番の２４種のそれぞれとでＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液組成は、２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ 酢酸カリウム、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ ｄＮＴＰ混合物、１０ｎｇのピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡ、２．５単位のタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液１００μｌを調製した。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、５０℃ １０秒、７２℃ ４０秒を１サイクルとした４０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。
その結果、プライマープールＩを用いた場合、２４反応液のうち８反応液で４００ｂｐから４０００ｂｐの範囲でいろいろなサイズの単一のＰＣＲ増幅断片が得られた。該増幅断片は、それらの反応液よりマイクロコン−１００にてプライマー除去、脱塩後、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するシークエンスプライマー（タグ配列）を用いて、常法通り、ダイレクトシークエンスを行なった。その結果、ゲノムＤＮＡにおいても約１０００塩基の配列を決定することができ、本発明の核酸塩基配列決定方法が有効であることを確認した。
（３）ＰＣＲにおいて、市販のＥｘＴａｑバッファーを用いた場合についても同様に検討した。ＰＣＲ反応液組成は、タカラ ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭ ｄＮＴＰ混合物以外は、上記（２）と同じ条件で行った。上記反応液をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で、、９４℃ ３分の熱変性後、９８℃ １０秒、５０℃ １０秒、７２℃ ２分を１サイクルとした４０サイクルのＰＣＲを行った。反応液２μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅したＤＮＡ断片を確認した。その結果、各プライマープールにおいて上記（２）と同様の結果が得られた。
実施例８
サーモコッカス リトラリス ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子、サーモコッカス セラー ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの調製
サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ５４７３）、サーモコッカス セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ２４７６）それぞれ１１ｍｌ相当分の菌体を集め、５００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、１００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に１００μｌのＴＥに溶解してそれぞれゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｆ１（配列番号１０）とオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｒ０（配列番号１１）を合成した。
上記実施例８−（１）で調製したサーモコッカス リトラリス とサーモコッカス セラーのゲノムＤＮＡ溶液各５μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｆ１及び１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｒ０をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、マイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例８−（２）で得た約０．５ｋｂのサーモコッカス リトラリス由来の断片ＴｌｉＦ１Ｒ０のとサーモコッカス セラー由来の断片ＴｃｅＦ１Ｒ０の塩基配列を決定し、それをもとにＴｌｉＦ１Ｒ０の上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−１（配列番号１２）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−２（配列番号１３）を合成した。また、ＴｃｅＦ１Ｒ０の上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−１（配列番号１４）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−２（配列番号１５）を合成した。さらに、表７に示す４８種類のプライマーを合成した。表７中のタグ配列を配列表の配列番号１６に示す。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子全域のクローニング
ＴｌｉＦ１Ｒ０、上流、下流を含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１７に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１８に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｌｉＮｄｅ（配列番号１９）及びＴｌｉＢａｍ（配列番号２０）を合成した。
同様に、ＴｃｅＦ１Ｒ０、上流、下流を含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２１に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｃｅＮｄｅ（配列番号２３）及びＴｃｅＢａｍ（配列番号２４）を合成した。
実施例８−（１）で得たサーモコッカス リトラリス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｌｉＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｌｉＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＬＩ２２３ＮｄおよびｐＴＬＩ２０４を作製した。
また、サーモコッカス リトラリス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｃｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｃｅＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７を作製した。
（５）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例８−（２）で得られたｐＴＬＩ２２３Ｎｄ、ｐＴＬＩ２０４、ｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。ｐＴＬＩ２０４のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２５に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２６に示す。ｐＴＬＩ２２３Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＬＩ２０４とくらべて４８４番目のＴがＣに置きかわっていた。また、アミノ酸配列では１６２番目のフェニルアラニンがロイシンに置きかわっていた。
また、ｐＴＣＥ２０７のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２７に示す。該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２８に示す。ｐＴＣＥ２６５Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＣＥ２０７とくらべて１４番目のＡがＧに置きかわっており、６９３から６９６番目が欠失していた。また、アミノ酸配列では５番目のグルタミン酸がグリシンに置きかわっており、２３１番目のフェニルアラニンが欠失していた。
（６）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＴＬＩ２２３Ｎｄ、ｐＴＣＥ２６５Ｎｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む１０ｍｌのＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を１９６μｌのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にｐＴＬＩ２０４、ｐＴＣＥ２０７で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液の酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においてもＲＮａｓｅＨ活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。このように、本発明の方法により、ライブラリーを作製することなく、ゲノムより直接目的の遺伝子を簡便、迅速にクローニングできることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、鋳型に特異的なプライマーと特定の塩基配列を有するプライマーとでＰＣＲすることによって得られるＰＣＲ産物をシークエンシングすることにより、迅速で低コストの核酸の塩基配列決定方法が提供される。
Claims (7)
- 核酸の塩基配列決定方法であって、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を別々に増幅し、鋳型核酸に特異的なプライマーの配列を基点にした鎖長の異なるＤＮＡ増幅断片の群を調製する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し、該特定の塩基配列の３’末端側あるいは５'末端側にランダムな組合せ、Ｎ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃの混合）部分を有していてもよい；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片を、タグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用してダイレクトシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とする核酸塩基配列決定方法。 - 鋳型核酸を増幅する工程が、ポリメラーゼ チェーン リアクション(ＰＣＲ)であることを特徴とする請求項１記載の核酸塩基配列決定方法。
- さらにシングルバンドの増幅断片を精製する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の核酸塩基配列決定方法。
- ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲの工程に用いることを特徴とする請求項２記載の核酸塩基配列決定方法。
- ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼのいずれかより選択されるＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１記載の核酸塩基配列決定方法。
- 試料から鋳型核酸を調製した後に、実施することを特徴とする請求項１記載の核酸塩基配列決定方法。
- 鋳型核酸が、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣライブラリー、ゲノムあるいはｃＤＮＡの形で提供されることを特徴とする請求項６記載の核酸塩基配列決定方法。
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