JPH03147787A - 新しいｄｎａクローニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新しいＤＮＡクローニング方法に関する。

〔従来の技術〕

遺伝子クローニングにおける最も重要なポイントは、組
換え体ＤＮＡの集団から目的の遺伝子を含むクローンを
選択することにある。組換え体ＤＮＡの集団としてはゲ
ノムＤＮＡを制限酵素等で断片化し、適当なベクターに
つないだゲノムＤＮＡライブラリーや、細胞や組織から
ｍ　ＲＮ　Ａを調製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成してベク
ターにつないだｃＤＮＡライブラリーがある。ライブラ
リーから目的のクローンを選択するのに従来用いられて
きた方法には次のようなものが挙げられる。例えば遺伝
子産物のアミノ酸配列の一部が既知の場合、そこから可
能なりＮＡ配列を推定しこれを化学合成してプローブと
して用いる。合成したＤＮＡプローブをアイソトープや
ビオチン、蛍光色素等で標識しゲノムライブラリーある
いはｃ　ＤＮＡライブラリーからコロニー又はプラーク
ハイブリダイゼーション法により目的とするクローンを
選択する。

化学合成したＤＮＡをｃＤＮＡ１ｓｔストランド合或の
プライマーとして用い、その際に標識された基質を取込
ませて目的とする遺伝子に特異的なプローブを作製する
方法もある。相同性の高い塩基配列を持つ遺伝子が既に
クローニングされている場合は、その一部をプローブと
してスクリーニングを行うこともできる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのクローニング方
法として従来用いられてきた、ファージベクターあるい
はコスミドベクターで上述したようにゲノムＤＮＡ又は
ｃＤＮＡライブラリーを作製後プローブによりスクリー
ニングする方法では、ライブラリーの作製が煩雑でかつ
技術を要すること、またコロニーハイブリダイゼーショ
ン、プラークハイブリダイゼーションは時間がかかり過
ぎ、アイソトープを使用する場合が多いことなどの問題
があった。

更にｃＤＮＡの場合、より大きなフラグメントを得よう
とする時（ｃＤＮＡ歩行）、新たにライブラリーを作り
直す必要が出てくる。

本発明の目的は、ＤＮＡをクローニングする際目的ＤＮ
Ａが何であれ、目的ＤＮＡ断片のみを単一なりＮＡとし
て増幅する方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は特定の制限酵素でＤＮＡ
を切断後、共通プライマーのアニルする領域を付加し、
共通プライマーと目的とするＤＮ、Ａに対する特異配列
プライマーを用いて増幅させることを特徴とする目的Ｄ
ＮＡのクローニング方法に関する。

本発明におけるＤＮＡとは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ
をいう。

また本発明における共通プライマーの例としては、ｍＲ
ＮＡのポ！Ｊ　　（Ａ）部分にアニールするプライマー
、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼにより付加したポリモノヌクレオチドにアニールする
プライマー　アダプターにアニールするプライマー　リ
ンカ−にアニールするプライマー　クローニングベクタ
ーの一部分にアニールするプライマー等が挙げられる。

また特異配列プライマーとは、目的ＤＮＡの一部分に完
全にアニールするプライマー等が挙げられる。

更に本発明における増幅とは、プライマーを用いて酵素
的に目的ＤＮＡのコピー数を増やすことである。

本発明者らは、鋭意研究を重ね共通プライマー及びそれ
がアニールする領域を選定し、更に合成したＤＮＡを特
定の制限酵素により切断後、共通プライマーのアニール
領域とライゲーションした後で共通プライマーと特異配
列プライマーを用いて増幅することにより、目的ＤＮＡ
のみが単一なバンドとして効率よく得られることを見出
し、本発明を完成させた。

以下、順を追って本発明を具体的に説明する。

ＤＮＡの調製方法は、公知の方法なら何でも良いが、例
えば特異配列プライマーを用い、公知の方法で抽出した
ＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型にして、目的ＤＮＡ近辺
の領域のみを酵素的に合成しておくほうが望ましい。調
製したＤＮＡは特定の制限酵素により切断しておくこと
により、増幅される目的のＤＮＡの大きさは一定となり
、プローブによるスクリーニングは不要となる。

近年、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　
Ｒｅａｃｔｔ−ｏｎ）が目的とする遺伝子のみを酵素的
に短時間に増幅する方法として開発された〔サイキＳ、
（Ｓａｉｋｉ　Ｓ、）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
〕第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８５）：
］。

ＰＣＲ法によれば酵素として、例えば耐熱性タックポリ
メラーゼを用い、ＤＮＡの変性（９４℃）の工程、プラ
イマーＤＮＡのアニーリング（５５℃）の工程、ＤＮＡ
の相補鎖の酵素的合成（７２℃）の工程より成る温度サ
イクルを任意の回数繰返すことで目的遺伝子のみを指数
的に増幅することができる。ＤＮＡを増幅及びクローニ
ングするにはこのＰＣＲ法を利用するのが最も簡便で迅
速である。

そこで、以下、ＰＣＲ法に従って説明するが、本発明は
、ＰＣＲ法に限定されるものではない。

ＰＣＲ法の共通プライマーとしては、ｍＲＮへのポリ　
（Ａ）１分あるいはターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼにより付加したポリモノヌクレオチ
ドにアニールするプライマーが既に使用されている。し
かしこの場合、モノヌクレオチドのポリマーであること
からＰＣＲ法のプライマーとして使用する場合、条件の
設定が難しい。更にこの方法では、目的のＤＮＡを単一
なバンドとして増幅することは難しい。

そこで本発明者らは、ＰＣＲ法の共通プライマーとして
アダプター及びクローニングベクターの一部を選定した
。

目的ＤＮＡを増幅するための共通プライマーとして、こ
の領域を使用するには、共通プライマーがアニールする
領域を目的ＤＮＡの端に付加することが必要である。

これはＤＮＡＩＪガーゼを用いた公知の方法を用いれば
よい。

プライマー及びプライマーが付加する領域は、相補的で
あれば良いが、その−例として、アダプター及びクロー
ニングベクタ一部分を挙げることができる。

ＰＣＲ法については、タックポリメラーゼを含む遺伝子
増幅キット及び自動遺伝子増幅装置がパーキンエルマー
・シータス社から市販されており、これらを用い、本発
明の方法に従い、目的のＤＮＡ領域の増幅及びクローニ
ングを行えばよい。増幅後の目的ＤＮＡの確認は、例え
ばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を用いて行うことができる。この際、増幅された
ＤＮＡ断片は単一のＤＮＡであり、ＤＮＡ合或合成われ
たプライマー配列を含んでいるので確実に目的のＤＮＡ
クローンをインビトロの系で得ることができる。

このようにして、プローブによるスクリーニングをする
ことなく、目的のＤＮＡをクローニングすることができ
るようになった。

また特異配列プライマーを変えることにより、自由にｃ
ＤＮＡの異なった部分のクローニングができるため、ｃ
ＤＮＡ歩行も容易に行える。

更にＰＣＲ法で増幅したＤＮＡを鋳型として直接用いる
ダイレクトシーフェンス法を組合せることにより、大腸
菌などの生物を使わない完全な試験管内のクローニング
を達成できた。その結果これまでのクローニングシステ
ムに比べて、格段のスピードアップを計れるようになっ
た。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ 腎症候性出血熱ウィルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆ
ｅｖ−ｅｒＨｉｊｌｌ　ｒ６１ａ７　ｓｙｎｄｒｏｍｅ
　ｖｉｒｕｓ、以下ＨＦＲ３Ｖと略す）Ｂ−１株のＰＣ
Ｒ法によるｃ　ＤＮＡ歩行 （１−１）ＨＦＲ３Ｖ　　Ｂ−１株ＲＮＡの調製ＨＦＲ
３Ｖ　　Ｂ−１株をアフリカミドリザル由来腎細胞Ｖｅ
ｒｏ　Ｅ　６に感染させ、イーグルＭＥＭ培地１００ｍ
ｊ！の培養スケールでウィルスを１０日間培養した。培
養細胞をかきとり、遠心分離で沈殿させ濃縮した後、グ
アニジニウムチオシアネート法〔チャーブウィンＪ、Ｍ
、（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　Ｊ、Ｍ、）ら、バイオケミスト
リー（Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１８巻、第５２９４〜５２９９
頁、（１９７９）　］により、全ＲＮＡを精製した。

（１−２）ＨＦＲ３Ｖ　　Ｓ−１株の二本鎖ｃＤＮＡの
調製 ＨＦＲ３Ｖ　　Ｂ−１株のＲＮＡ配列から５　’　−Ｔ
ＡＧＴＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣ−３’なる１４塩基のプラ
イマー（ＨＦＲ３）を台底した。Ｂ−１株全ＲＮＡ５．
２μｇと上記１４塩基プライマー２Ｑ　ｐｍｏｌ、及び
１０倍濃縮緩衝液＝５００ｍＭ）リス（ｔｒｉｓ）−Ｈ
ＣＩ緩衝液ｐＨ８，３５００ｍＭ　　ＣａＣ１ａ １００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ　　ジチオスレイトール ５ｍＭ　　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。

ＴＰ ２μｌを加え全量を２０μｌとし、７０℃、３分間加熱
し４２℃に戻し２０ユニツトのＲＡＶ−２逆転写酵素〔
宝酒造■製〕を加え３０分インキコベートし第１鎮ｃＤ
ＮＡを合成した。

ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）とホフマン（ｔｌｏｆｆｍａ
ｎ）の方法に従ってＲＮａｓｅＨ［宝酒造■製〕　（４
０ユニツト〉とＤＮＡポリメラーゼＩＣｙｊｌ酒造■製
〕（４ユニツト）を用いて第２鎖のＤＮＡを合或し、二
本鎖のｃ　ＤＮＡを得た。次にＥｃｏＲＩ〔賓酒造■製
〕を作用させ、ｃＤＮＡを断片化した。

（１−３）ｐＳＰ６４クローニングベクター（プライマ
ーのアニーリング領域）の 調製 ｐＳＰ６４ベクター５μｇを４０μｍ１×ＥｃｏＲＩ緩
衝液〔組成は寅酒造■・遺伝子工学用試薬カタログ記載
〕中１２０ユニットのＥｃｏＲＩと共に３７℃、１時間
保温した。

更にこのＥｃ　ｏＲＩ消化したｐＳＰ６４ベクター全量
を、１００μｌｌ　ＩＸｃＩＡＰ緩衝液〔責酒造■製、
組成は同社・遺伝子工学用試薬カタログ記載）中３０ユ
ニットのＣＩＡＰと共に３７℃、１５分間、更に５５℃
、１５分間保温した。次にＣＩＡＰを失活させるために
、１／４０容量の２０％ＳＤＳ、１／２０容量の０．５
ＭＥＤＴ八を加え、６８℃、■５分間保温した。その後
フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、最終的に２５
μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

（１−４）ＨＦＲ３Ｖ　　Ｂ−１株二本釦ｃＤＮΔとｐ
ＳＰ６４クローニングベクタ ー（プライマーのアニーリング領域） のライゲーション （１−２）に記載のように調製したＥｃｏＲＩ断片化Ｃ
・ＤＮＡ０．３μｇ　　（２，５μｍ）と（１−３）に
記載のように調製したクローニングベクター０．１μｇ
　　（１μｍ）にライゲーションキット〔寅酒造■製〕
のＡ液１４μｍとＢ液３．５μｌを加え全量を２１μｌ
とし、１６℃で６０分間インキニーベートしライゲーシ
ョン反応を行った。

この際、片方のストランドのＥｃ　ｏＲ１部位の一カ所
にニックが入った状態で結合する。

（１−５）８１Ｍ３プライマーと５Ｐ６Ｐ−１プライマ
ーを用いたＨＦＲ３Ｖ　　Ｂ −１株ｃＤＮＡの特異的増幅（ｃＤ ＮＡ歩行） （１−４）に記載のように調製したライゲーション生成
物全量を０．５−用チューブ（ノクイオビック社〉に取
り、ジーン　アンプＴ′キット　（Ｇｅｎｅ　　　　Ａ
ｍｐ”　　　　Ｋｉｔ）　　　　（／＜　−キ　ン　エ
ＪＬ／マー・シータス社）中の５μｍの１０倍濃度増幅
用緩衝液［１０（１ｍＭ）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，
３，５００ｍＭ　ＫＣＩ、　１５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン〕、８μｌの１．２５　ｍ
Ｍ　ｄ　ＮＴ　Ｐ混合液（ｄＡＴＰＳｄＧＴＰＳｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰ）　　１０ｐｍｏｌの８１Ｍ３ブライ７−　
（５’　−ＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴ
ＡＴＡＣ−３’　”）ｌ　Ｑ　ｐｍｏｌの５Ｐ６Ｐ−１
プライマー（５’　−ＧＴＡＣＡＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴ
ＡＧＡＡＣＧＣＧ−３’　）　、０．２５μｌの５ユニ
ツト／μｌアンブリタツク”　（ＡｍｐｌｉＴａｑＴ′
″）を加え、更に滅菌水を加えて、５０μｌの溶液にし
た。この反応液に５０μｌのミネラルオイル（シグマ社
製）を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイ
クラ−（パーキンエルマー・シスター社）により増幅反
応を行った。

反応条件は９０℃で１分間→５５℃で２分間→７４℃で
３分間のサイクルを２５サイクル行った。

反応後上層のミネラルオイルを除去した後、反応液の５
μｌを取り、３％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅ−ｖｅ）ＧＴＧ
アガロース−１％シー　ケム（ＳｅａＫｅｍ）アガロー
ス（ＦＭＣ社）ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマ
イドでＤＮＡを染色し、特異的に増幅された約１７５ｂ
ｐのバンドを確認した。ＰＣＲ反応の際、５Ｐ６Ｐ＝１
プライマーから伸長する反応はニックの入っている箇所
で反応が停止してしまうため、余分な５Ｐ６Ｐ−１プラ
イマーの消費は無視できる。そのため効率の良い特異的
なＰＣＲ反応が行える。

他の制限酵素（ＥｃｏＲＩ以外）を使用すること以外は
全く同様の反応でき例えば、５ａｕ３ＡＩで３８１ｂｐ
、ＢｇｌＩＩで約１８００ｂｐのＨＦＲ３ＶのｃＤＮＡ
のクローンが得られた。

またＢＩＭ１プライマー（５’　−ＡＧＡＣＴＣＣＧＣ
ＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴＡ−３’を用いたとき、
５ａｕ３ＡＩでは１５３　ｂｐ。

Ｂ、ＯＲＩでは２４６ｂｐのバンドが確認された。

更に、Ｂ　Ｉ　Ｍ　１　ａブライ７−　（５’　−ＣＴ
ＴＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡ−３′
）を用いたとき、５ａｕ３ＡＩでは４４１ｂｐのバンド
が確認された。

実施例２ アシルアミノ酸遊離酵素のＰＣＲ法によるＣＤＮＡクロ
ーニング （２−１）正常ブタ肝臓のｍＲＮＡの抽出・精製及びｃ
ＤＮＡの合成 と殺直後の正常ブタ肝臓を液体窒素で凍結し、−７０℃
で保存していたもの４ｇよりアマジャム社（英国）製Ｒ
ＮＡ抽出キット　（コード番号ＲＰＮ、１２６４）を用
いてＲＮＡの抽出を行い、３．６ｍｇの全ＲＮＡを得た
。これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに通して１３
０μｇのポリ　（Ａ）ＲＮＡを得た。このポリ　（Ａ）
ＲＮＡ８μｇよりアマジャム社製ｃＤＮＡ合成キット（
コード番号ＲＰＮ、１２５６）を使って、オリゴ（ｄＴ
）プライマーによりｃＤＮＡを合威し約２．４μｇ得た
。

次に５ａｕ３ＡＩｌ：１！ｒ酒造■製〕を作用させ、ｃ
ＤＮＡを断片化した。

（２−２）アダプター（プライマーのアニーリング領域
）の調製 ２種類のオリゴヌクレオチド（ＰｉとＰ２）を合成し、
付着末端が５ａｕ３ＡＩによる切断部位となるようにア
ニーリング（６５℃、２０分間保温後室温まで徐冷）に
より、５ａｕ３ＡＩアダプターを調製した。

Ｐ　１　：　５’　−ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴ
ＣＣＡＣＡＧＧＧＧ−３’ Ｐ　２　：５　’　−ＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡ
ＴＣＣＡＧ−３’ ５ａｕ３ＡＩアダプター： ５　’　−ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡ
ＧＧＧＧ−３’３’　　−ＧＡＣＣＴ八ＣＣＴへＡＧＧ
ＴＧＴＣＣＣＣ−５’（２−３）ぶた肝臓二本２１　ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａとアダプター（プライマーのアニーリング
領域） のライゲーション （２−１）記載の５ａｕ３ＡＩ断片化ｃＤＮＡ０．３μ
ｇ　　（２，５μｍ〉と（２−２）記載のＳａ　ｕ　３
　Ａ’Ｉアダプター０．２μｇ　　（１μｎにライゲー
ションキット〔責酒造■製〕のＡ液１４μｌとＢ液３．
５μｌを加え全量を２１μｌとし、１６℃で６０分間イ
ンキニーベートし、ライゲーション反応を行った。

更にこの反応液から未反応のアダプターをセファロース
ＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア社’ＩＪ）１．１ｍよるゲ
ルろ過により除去した。

（２−４）アシルアミノ酸遊離酵素のＮ末アミノ酸配列
から推定したミックスプライマ（Ｐ３ミックスプライマ
ー）と（２− ２）記載のＰ２プライマーを用いたアシルアミノ酸遊離
酵素ｃＤＮＡの特異的増幅（ＣＤＮＡクローニング） （２−３）に記載したように調製したライゲーション生
成物約Ｌｏｎｇを０．５ｍｌ用チューブ（バイオビック
社〉に取すジーンアンプＴＸキット（パーキンエルマー
・シータス社）中のＩＯμｌの１０倍濃度増幅用緩衝液
［１００ｍＭ）ＩＪスーＨＣＩ　５ｐＨ８，３，５００
ｍＭ　ＫＣＩ、１５　ｍＭ　ｉＪｇＣＬ、０．１％（Ｗ
／Ｖ”）ゼラチン〕、１６μｌの１．２５ｍＭ　　ｄＮ
ＴＰ混合液（ｄＡＴＰＸｄＧＴＰ、ｄＣＴＰＳＴＴＰ）
　　５μｌの０．１μｇ／μＡＰ３ミックスプライマー
（ＡＴＧＧＴ　Ｉ　ＧＴ　Ｉ　ＡＴＧＣＣＩＣＡＴＧＧ
、ＡＴＧＧＴＩＧＴＩＡＴＧＣＣＩＣＡＣＧＧ）１μｌ
の０．１μｇ／μｌＰ２プライマー（５’　−ＣＣＣＣ
ＴＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’　）　、０．
５μｌの５ユニット／μｌアンブリタックＴＭを加え、
更に滅菌水を加えて、１００μｌの溶液にした。

この反応液に１００μｌのミネラルオイル（シグマ社）
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラ
−（パーキンエルマー・シータス社）により増幅を行っ
た。

反応条件は９４℃で１分間（変性）１４５℃で２分間（
プライマーのアニーリング）０７２℃で２分間（合成反
応）のサイクルを３５サイクル行った。

反応後、上層のミネラルオイルを除去し、反応液の１０
μｌを取り、３％ヌシーブＧＴＧアガロースー１％シー
　ケム　アガロース（ＦＭＣ社製）ゲル電気泳動を行い
、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、特異的に増
幅されたＮ末から３５８ｂｐのアシルアミノ酸遊離酵素
ＣＤＮＡのバンドを検出した。得られたこのバンドのＤ
ＮＡの塩基配列をダイレクトシーフェンス法により末端
から約１００塩基調べたところ、アシルアミノ酸遊離酵
素をコードする塩基配列であることが確δ忍された。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明したように、本発明により簡便でかつ
迅速なりＮＡのクローニング方法が提供された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、特定の制限酵素でＤＮＡを切断後、共通プライマー
   のアニールする領域を付加し、共通プライマーと目的と
   するＤＮＡに対する特異配列プライマーを用いて増幅さ
   せることを特徴とする目的ＤＮＡのクローニング方法。