JPH0353882A

JPH0353882A - 核酸配列の増幅方法およびクローニング方法

Info

Publication number: JPH0353882A
Application number: JP1189875A
Authority: JP
Inventors: Masayasu Araki; 正健荒木; Junichi Miyazaki; 純一宮崎; Kenichi Yamamura; 研一山村; Munetaka Ichikawa; 市川　宗孝; Fukusaburo Hamada; 福三郎濱田
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1989-07-21
Filing date: 1989-07-21
Publication date: 1991-03-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】・１本発明は、試料中に存在する核酸配列の増幅方法および
クローニング方法に関する。より詳細には、試料中に微
旦にしか存在しない核酸配列に合成り〉・力一を付加し
、この合成リンカーの塩基配列に相補的なプライマーを
用いて遺伝子増幅反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａ
ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　ＰＣＲ）を行うことにより
、標的の遺伝子をクローニング可能なレベルまで量的に
増幅させることを特徴とする核酸配列の増幅方法、およ
びこのようにして増幅した遺伝子を適当なベクターにク
ローニングする方法に関する。

−゛Ｉｎ近年の遺伝子工学における技術の進歩に伴い、種々の外
来遺伝子を微生物等の宿主細胞を利用して発現させるこ
とが可能となった。すなわち、今日では、所望の物質を
コードする構造遺伝子を単離（クローニング）すること
ができれば、これを既存のベクター系、発現系に導入す
ることによって比較的容易に目的の物質を発現させるこ
とが可能なまでに遺伝子組換えの技術が急速に進歩して
きている。

これに伴い、ＤＮＡもしくはＲＮＡを取り扱う技術も急
速に進歩し、近年では種々の制限酵素や修飾酵素等、さ
らには目的に合わせた遺伝子操作キットも市販されてい
る。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの修飾酵素、ＲＮＡか
らｃＤＮＡを合成する為に必要な酵素、プラスミドやフ
ァージ等のクローニングベクター系および外来遺伝子発
現の為の宿主細胞等も市販のものにより容易に入手でき
るようになった６しかしながら、遺伝子工学により何が
目的の生理活性物質を産生させるような場合には、その
ような生埋活性物質をコードしている遺伝子をクローニ
ングすることが、今日においても依然として目的達成の
大きな律速段階となっている．特に、サンプル中に微量
にしか存在しない未知のウイルスの遺伝子をクローニン
グする場合のように、目的の物質をコードする遺伝子を
含む核酸自体の絶対量が非常に少ない場合には、目的遺
伝子のクロニングが非常に難しかった。すなわち、特定
のウイルス等、物理的性状により精製可能な粒子からそ
の粒子中に存在する核酸を抽出し、クローニングする場
合、これまでの技術では量的な制約から、ある程度以上
の核酸量を確保しないと目的遺伝子をクローニングする
ことは不可能であった。

これまでの未知遺伝子のクローニング方法としては、Ｓ
ＤＳプロテアーゼ法やグアニジン・チオシアネート法等
により試料中がら核酸のみを分離し、これを適当な制限
酵素で切断し、得られた遺伝子断片をクローニングベク
ターとライゲーションさせるという方法が最も多く用い
られてきた。

しかしながら、前にも述べたように、目的遺伝子の絶対
量が非常に少ない場合には、このような従来の遺伝子操
作法では目的の遺伝子断片をベクターに組み込むことが
できなかった。

また、一般的な遺伝子増幅方法としては、標的の遺伝子
を適当なベクターに組み込み、これを大腸菌のような宿
主細胞に導入し、その細胞を複製・増殖させることによ
り目的の遺伝子（ベクターに組み込んだ遺伝子断片）も
増幅させ、細胞がら遺伝子を回収するという方法が広く
用いられているが、この方法もベクターに組み込むこと
ができた遺伝子断片にしか使用することはできず、ｉｓ
の方法ではクローニングできない程の微量の核酸配列に
関しては、遺伝子を増幅させることはでさなかった。

近年、このような問題点を解決するひとつの方法として
、微量の目的遺伝子を増幅させる方法が開発されている
。これは、Ｐ　Ｃ　Ｒ　（　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈ
ａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法と呼ばれる遺伝子の増幅
方法であり、既に一部の塩基配列が判明しているＤ）Ｉ
Ａ配列をプライマーとして利用することにより目的の遺
伝子断片のみを増幅させクローニングするという方法で
ある（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　
Ｖｏｌ．２３９ｐ４８７−４９１．　１９８８＞．このようなＰＣＲ法の開発によって特定の配列が既に知
られている遺伝子断片の増幅及びクローニングは可能と
なったが、塩基配列が全く解明されていない未知の遺伝
子については従来のＰＣＲ法を用いることは通常不可能
であった。

唯一、Ｓａｉｋｉらは、上記の文献の中でサブクローニ
ングの手段としてＰＣＲ法を用いた方法を報告しており
、その中でクローニングベクターのクロニングザイトの
両側の核酸配列をプライマーとしてＰＣＲ反応を行うこ
とで未知核酸配列を増幅することが可能であることを示
している。しかしながら、この方法もあくまで通常の方
法においてクローニングが成功した後の応用法であって
、通常の方法ではクローニングが不可能なような微量の
核酸配列にＰＣＲ法を応用することは不可能であった。

同様に、ある特殊な分化状態にあるｌｓ胞で発現してい
るメッセンジャーＲＮＡをクローニングする場合にも同
様の問題点が残されていた。

髪艷立且狛本発明者らは、塩基配列が一切解析されていなような未
知の遺伝子をクローニングする際において、合成リンカ
ーを利用することにより、未解析の遺伝子断片の増幅に
も従来のＰＣＲ法を用いることが可能なことを見いだし
た。さらにこの増幅反応を繰り返し行うことにより、こ
れまでの技術ではクローニングできなかった微量の核酸
もクロニング可能になることを見いだし本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明は、試料中に含まれる全ＤＮＡま−１
０一たはｃＤＮＡを対象としてこれに人工合成したリンカ−
　ＤＮＡを付加し、このリンカー部分の塩基配列に相補
的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を
行い、試料中にごく微量にしか存在しない核酸をクロー
ニング可能なレベルまで増幅させ、これをクローニング
する方法に関する。

さらに、本発明の遺伝子増幅方法は、従来のＰＣＲ法の
ように対象の遺伝子に応じたプライマーをその都度調製
する必要がなく、合成リンカーを用いることで対象とな
る核酸の塩基配列に関係なくいかなる核酸をも容易に増
幅させることができるために、一般的な遺伝子クローニ
ングにおいてもイソビトロ核酸増幅方法として広く応用
することが可能となる．日》本発明の核酸配列増幅方法の対象となる核酸としては、
ＤＮＡおよびＲＮ＾のいずれでも構わず、例えばウイル
スＤＩＮＡ．＊乳類動物細胞ゲノムＤＮＡ、メッセンジ
ャーＲＮ＾等すべて含まれる．試料から、核酸を分離する方法としては、常法−１１− に従い行うことができ、ＳＤＳプロテアーゼ法や、グア
ニジン・チオシアネート法がその代表的な方法として挙
げられる。

さらに常法に従い、試料中の核酸配列から直鎖状の二本
鎖ＤＮＡを調製し、本発明の遺伝子増幅方法を適用させ
る試料とする。

例えば、試料中の核酸が、染色体ＤＮＡなどの長いＤＮ
Ａである場合には、制限酵素消化などの処理を行うこと
によって、遺伝子増幅反応が可能な長さの直鎖状二本鎖
ＤＮＡの形にすることにより本発明の遺伝子増幅方法を
適用する．本発明の遺伝子増幅方法では、対象の遺伝子
フラグメントが２Ｋｂｐ程度以下の長さであれば問題な
く本法を適用できるが、それ以上の長さであれば上記の
ように、辿当な制限酵素で処理することにより本法を適
用することが可能となる。また、試料中の核酸が、環状
二本鎖ＤＮＡである場合には、制限酵素などの処理を行
うことによって直鎖状の二本鎖ＤＮＡの形にして本法を
適用する．一方、試料中の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ１２一である場合には、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮ
Ａを合成し、直鎖状二本鎖ＤＮＡの形にしてから本法を
適用することができ、また、試料中の核酸がＲＮＡであ
る場合には、ＤＮａｓｅ処理など適当な処理を行って不
必要なＤＮＡを除いた後で、オリゴｄＴやランダムヘキ
サマーなどの適当なプライマーを用髪）てｃＤＮＡを合
威し、直鎖状二本鎖ＤＮＡの形にして本発明の遺伝子増
幅方法を適用することができる．本発明に用いられる合
成リンカーとしては、基本的には通常のリンカーでも使
用することは可能であるが、本発明の遺伝子増幅方法を
より効率よく行う為には、下記のような工夫された合成
リンカーが使用される．まず、対象のＤＮＡ配列の両端
にリンカーをひとつだけ結合させるために、リンカーの
一方の末端は平滑末端であり片方は突出末端であるよう
な合成リンカーであることが好まし〜）．さらに、通常
のリンカーは、バリンドローム配列を含むもの、もしく
は全体の配列がパリンドローム構造となっているものが
ほとんどであるが、本発明に用いる合成リンカーとして
は、リンカー−１３− 中の塩基配列の中にパリンドローム配列を有しないもの
が特に好ましい。これは、ＰＣＲ法を行う上で、合成リ
ンカーの配列に相補性のあるプライマーのセルファニー
リングが起きないようにするためである．尚、合威リン
カー中の塩基配列に６塩基または８塩基程度のパリンド
ローム配列がある場合でも、本発明の増幅方法を使用す
ることは可能であるが、リンカー全体がパリンドローム
配列からなるようなあまり長いパリンドローム配列を合
成リンカー中に有することは望ましくない．また、遺伝
子増幅反応後の目的遺伝子のクローニングを容易にする
為に、該リンカーの中に適当な制限酵素切断部位認識配
列を組み込むことができる．そのような制限酵素認識配
列としては、対象の核酸配列途中の部位を切断すること
なく対象となる如何なる核酸配列についてもクローニン
グを容易に行うために、自然界の塩基配列の中にはあま
り存在しない塩基配列を認識する制限酵素認識配列、例
えば、Ｎｏｔ　ＩやＢｓｔＸＩ等の制限酵素認識部位が
その例として挙げられる。

−１４− このような合成リンカーを、常法を用いて対象の二本鎖
ＤＮＡの両端に結合させる。合成リンカーを結合させる
場合の、標的のＤＮＡ断片とリンカーＤＮＡの量的な条
件としては、標的のＤＮＡ断片に較べて量的に合成リン
カーを過剰に加えてライゲーション反応させることが必
要である．対象となる遺伝子断片が量的に把握もしくは
推測できる場合には、リンカーの量が標的のＤＮＡ断片
の量よりモル比で１００倍以上存在するような条件でラ
イゲーション反応を行うことが好ましい。

このようにして得られる、両端に合成リンカーが結合し
た標的の二本鎖ＤＮＡについて、クレノウフラグメント
またはＴａｑポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼを用
いてＰＣＲ法を実施する．ＰＣＲ法実施の際には、上記
で用いた合成リンカーの塩基配列に相補性のあるプライ
マーＤＮＡを使用することが本発明の最も大きな特徴と
なり、このようにリンカーに相補性を有するプライマー
を用いることで、如何なる塩基配列についても、ＰＣＲ
反応により遺伝子を増幅させることが可能になる。ＰＣ
Ｒ法−１５− 補性を有するプライマーを用いる点以外、例えば反応条
件等は、周知の手法により実施することができる．　　
（参照：　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２３９　　ｐ４
８７−４９１１９８８）プライマーの長さとしても、通常のＰＣＲ法に用いられ
る程度のものが適当であり、好ましくは、１０塩基〜３
０塩基程度の長さのＩ）ＮＡ断片である。このような、
合威リンカー及びプライマーとなるＤＮＡ断片は、市販
のＤＮＡＩ！！；威機により容易に調製することができ
る。

本発明の遺伝子増幅方法においても、従来のＰＣＲ法と
同様にＰＣＲ　（ポリメラーゼチェイン反応）を複数回
繰り返すことにより、必要な程度まで遺伝子を増幅させ
ることができる。例えば、ＰＣＲを２０サイクル行えば
、標的の遺伝子断片をスタート時の１万倍〜１００万倍
程度まで量的に増幅させることができる．ＰＣＲ　（反応〉は、市販の温度コントロールシステム
を組み合わせて手で行うことも可能である。

１６一このように、ＰＣＲ法により増幅された遺伝子断片は、
使用した合成リンカーの種類に応じて、これにふさわし
いベクターに容易に組み込むことができる。

たとえば、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片の両端
が平滑末端であることをそのまま活かし、平滑末端の導
入部位を有するベクターに組み込むことができる。一方
、予め制限酵素認識部位を組み込んだリンカー　特に特
殊な制限酵素認識配列を含む合成リンカーを使用した場
合には、この制限酵素で標的のＤＮＡ断片を処理し、こ
れと同じ切口を有するベクターに組み込むこともできる
。使用した合成リンカーに含まれる制限酵素認識部位以
外にこのＤＮＡ断片を組み込みたい場合には、その導入
部位（制限酵素認識部位〉に即した第２の合成リンカー
ＤＮＡを上記により得られたＤＮＡ断片にさらに結合さ
せることにより所望の制限酵素部位に組み込むことも可
能である。

本発明は、如何なる塩基配列の核酸断片についても、応
用可能なインビト口の遺伝子増幅方法で１７− あり、これまでの技術では増幅させることのできなかっ
た、微量の未知の核酸配列をも量的に増幅させることが
可能となる。さらに、試料中の核酸全体を増幅させる場
合において、従来のＰＣＲ法では、その都度標的の核酸
配列に応じてプライマーを調製する必要があったが、本
発明の合成リンカーとこれに相補的なプライマーを用い
ることで、対象となるＤＮＡの塩基配列を選ばず、従来
のＰＣＲ法に代わって容易に遺伝子増幅反応を行うこと
ができる．また、本操作はイソビトロにおいて行なわれる為、宿主
細胞等のいかなる生物の繁殖をも伴わずに容易な操作で
行うことが出来、生物の繁殖に件って起こり得る感染等
の危険や操作上の不都合をも回避することができる。

以下、本発明を実施例に従ってより詳細に説明するが、
これは本発明の応用の一例を示すものであって、これに
制限されるものではない。

実施例Ｎｏｔ　Ｉ　　　　　　＋ン・一ＤＮＡｌ８− マーＤＮＡ　　Δ　：ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ３８１Ａ　
ＤＮＡ合成機〉を用いて、下記の３種のＤＮＡを合成し
た。

ＤＮＡＩ：　　　５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡ
Ａ−３’ＤＮＡ２：　　　５’−ＣＣＣＴＴＴＡＡＧＣ
ＧＧＣＣＧＣＡＡＴ−３’ＤＮＡ３：　　　５’−ＴＴ
ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴ−３’上記ＤＮＡＩとＤＮ
Ａ２を混合しアニーリングすることにより下記のリンカ
ーを得る。

制限酵素１（ｏｔ　Ｉ認識部位このリンカーは、片側が平滑末端、片側が突出末端にな
っていることを特徴としており、末端が平滑である直鎖
状二本鎖ＤＮＡの両端に１個ずつ結合することができる
。又、このリンカーは、８塩基認識の制限酵素Ｎｏｔｌ
の認識部位を持つことを特徴としており、リンカーの結
合後制限酵素Ｎｏｔｌで消化することにより、目的とす
るＤＮＡをその内部を切断しないまま、適当なベクター
ＤＮＡのＮｏｔ工部位にクローニングすることが可能で
ある．ー１９ーローニン　　ベクローニングベクターとしては、Ｎｏｔｌ制限酵素部位
を有するプラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｌＩ　（Ｋ
Ｓ４）　［ストラテジーン＃２１２２θ７］を用い、こ
れを制限酵素Ｎｏｔｌで消化し、仔牛小腸由来アルカリ
フオスファターゼによって脱リン酸化してベクターＤＮ
Ａとした。

ローニン　コン　ロー合成リンカーおよびベクターが使用可能であることを確
認するために、ＤＮＡ分子量マーカー［φＸ　１７４／
　ＨｉｎｃＩｒ切断断片］をサンプルとして下記実験を
行った。この分子量マーカーは、φＸ１７４ａｍ３　Ｆ
ＲＩ　ＤＮＡを制限酵素旧ｎｃＩＩで切断完全分解した
もので、両端が平滑末端の１０５７ｂｐ，　７７０ｂｐ
．　６１２ｂｐ．　４９５ｂｐ，　３９２ｂｐ，　３４
５ｂｐ，　３４１ｂｐ，　３３５ｂｐ，　２９７ｂｐ２
９１ｂｐ，　２１０ｂｐ，　１６２ｂｐ及び７９ｂｐの
二本鎖ＤＮＡ断片の混合物である。

まず、Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼを用いて、ＤＮＡ
ＩとＤＮＡ２の５′末端にリン酸を付加した．得られた
リン酸付加ＤＮＡＩ及びＤＮＡ２　（　ｐＤＮＡ１及び
ｐＤＮＡ２　）を上記ＤＮＡ分子量マーカー水溶液に添
加し、Ｔ４　ＤＮＡリ−２〇一ガーゼを用いて連結させた．制限酵素ＮｏｔＩで消化し
た後、ベクターＤＮＡを添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させた。得られたＤＮＡ混合液を大腸菌コン
ビテント細胞（　ＢＲＬ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｃｙＤＦ［　５α、＃８２６３ＳＡ）に添加し、
プレート（アンビシリン及びＸ−ｇａｌ添加Ｌ−ｂｒｏ
ｔｈ）にまき、３７℃一夜培養した。得られた形質転換
体のうち、白色コロニーから１２個を選択し液体培地《
アンンビシリン添加Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で培養した．培養
して得られた菌体からプラスミドＤＮＡを抽出後、制限
酵素Ｎｏｔ　Ｉで消化し、６％アクリルアミドゲル電気
泳動を行った。

エチジウムブロ，マイド（　ＥｔＢｒ　）による染色に
より得られた泳動パターンにより、解析した１２クロー
ンのうち８クローンにサンプルＤＮＡがクローニングさ
れていた。

１ゝ　一　　　　−　マー　　　ＰＣＢ（３）で使用し
たＤＮＡ分子量マーカーφＸ　１７４／旧ｎｃ　Ｕ　ｄ
ｉｇｅｓｔ　（　５５０ｎｇ　）にＰＤＮＡＩ及びｐＤ
ＮＡ２（各４０ｐｍｏｌ　）を添加し、Ｔ４　　ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させた（φＸ　−Ｌｉｇ．　）。

次にＤＮＡ３を−２ｌ一プライマーとして、　ＰＣＲ反応を行った．２．５ユニ
ットＴａｑＤＮＡ　ポリメラーゼ（タカラ＃２５３０　
）　．２００ｐｍｏｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ　３、２００μＭ　
ｄＮＴＰ　（　ｄＡＴＴ’、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰ　）、５０ｍＭ　ＫＣＩ，　　１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８，３、１．　５ｍＭ　ＭｇＣＩ２
、０．０２％Ｂ　Ｓ　Ａ、及びサンフルＤＮＡとしてφ
Ｘ−Ｌｉｇ．　２０ｎｇ又は２００ｐｇを混合し、流動
パラフィンを重層した。市販の温度コントロールシステ
ムを用いて、９０℃　１分間、５５℃　１分間、７０℃
　５分間の温度変化を２０サイクル行った。ＰＣＲ反応
後、フェノール処理、エタ沈を行い、６％アクリルゲル
電気泳動及び１．５πアガロースゲル電気泳動を行った
。

この結果から下記のことが確一認された。

（ｉ）ＰＣＲ反応により、各フラグメントは１万倍〜１
０万倍増幅している．（ｉｉ）各フラグメントは両端にリンカーが各１個付加
した分だけ（約３０ｂｐ）バンドがシフトしている．（
ｉｉｉ）　ＤＮＡ３をプローブにしたサザーンハイブリ
ダイゼーションを行い、リンカーが確かに付加して増幅
されていることを確認した。

一２２一（ｉｖ）リンカーライゲーションの際のサンプルＤＮＡ
とリンカーのモル比の検討を行い、リンカー量は、モル
数でＤＮＡ断片の数百倍〜千倍以上必要であることがわ
かった。

ス　　　ｃＤＮＡ　　　ローニン応用例としてＲＮＡウイルスであるＡ型肝炎ウイルス（
ＨＡＶ）ｃＤＮＡのクローニングを行った。ＨＡＶ感染
細胞から回収精製したウイルス約ＩＱＩ１！個から、Ｓ
ＤＳ・プロテアーゼＫ法によりＲＮ　Ａ　１００ｎｇを
回収した。

ランダムプライマーを使用したｃＤＮＡ合威キット（ア
マシャム、ｃＤＮＡ合成システム・ブラス〉を用いて、
ＨＡＶ−ＲＮＡ　　１０ｎｇ（■〉、ｌｎｇ　（■）、
１００ｐｇ　（■〉及び１０ｐｇ　（■）を処理し、二
重鎖ｃＤＮＡを合成した。

各々、２０βのＴＥ溶液とした後、次の条件でリンカー
を付加した。

Ａ．　　ｃＤＮＡ　　２．５ｄ　＋リンカー（ｐＤＮＡ
１及びｐＤＮＡ２）　　　　５ｐｍｏｌＢ．　　　　　
　　７１　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．５ｐｍｏｌＣ．ｎ＋ｕ０．０５ｐ
ｍｏｌ一２３− Ｄ，ノｒ＋０．００５ｐｍｏｌＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、Ｔａｑ　Ｄ
ＮＡボリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行った。

ＤＮＡ３をプライマーとし、９０℃　１分間、５５℃１
分間、７０℃　５分間の２０サイクルを行い、一部分取
して、６％アクリルアミドゲル電気泳動を行ったが、Ｅ
ｔＢｒ染色で何も検出できなかったので、さらに２０サ
イクルのＰＣＲ反応を行い２０ｄ　Ｔ　Ｅ溶液とした。

そのうち２βを用いて６ｘアクリルアミドミニゲル電気
泳動でスメアーなバンドを確認した後、２パを用いて１
．５ｘアガロースゲル電気泳動を行いサザーンプロット
を行った。すでにクローニングしていたＨＡＶ　　ｃＤ
ＮＡ断片（約２ｋｂ、塩基配列確認ずみ）をプローブと
して使用した。

その結果、■のＡ〜Ｄ及び■のＡ〜Ｃで、ＨＡＹ−ｃＤ
ＮＡとハイブリッドするスメアーなバンドが検出された
。特に、　■のＡ．Ｂ及び■のＢでは、大量のＨＡＶｃ
ＤＮＡが検出され、リンカー量としてはＱ．　５ｐｍｏ
＋が最適であった．さらに■Ｂについて、５一分取し、制限酵素Ｎｏｔ一２
４一 ■で消化した後、２で調製したベクターＤＮＡを添加し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。得られたＤＮＡ混合
液を大腸菌コンビテント細胞（ＢＲＬ、ＭＡＸＥｆｆｉ
ｃｉｅｎｃｙ　　ＤＨ５α、＃８２５８ＳＡ　）に添加
し、プレート（アンピシリン及びＸ−ｇａｌ添加Ｌ−ｂ
ｒｏｔｈ　）にまき、３７℃で一晩培養した。得られた
トランスフ才一マントから１２０個をひろってコロニー
ハイブリを行なった。ブローブには、前記ＨＡＶ　　ｃ
ＤＮＡ断片〈全長の約２０％〉を用いた．その結果、３
４個の陽性クローンが得られた。

以上の結果から、ＨＡＶ　ＲＮＡ　ｌｏｇからスタート
して、本発明を用いることにより、簡単にｃＤＮＡ断片
をクローニングできることがわかった．実施例（１）と
同様にして、ＤＮＡ４　（１７ｍｅｒ）及びＤＮＡ５（
１９ｍｅｒ）を合成した。

ＤＮＭ・　５　−ＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧ
−３ＤＮＡ５；　　５゜−ＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴ
ＣＴＴＣＧＧ−３′ＤＮＡ４とＤＮＡ５を混合すると、
アニーリングして下−２５− 記リンカーとなる。

制限酵素ＢｓｔＸＩ認識部位ＤＮＡ　　　ＤＮ＾　　いｆ−　Ｐ　Ｃ　Ｒコン　ロー
験実施例（３）で使用したＤＮＡ分子量マーカーφＸ１７
４／ＨｉｎｃＩＩ処理５５Ｐｇ（０．　４ｆｍｏｌ末端
相当〉にリン酸付加ＤＮＡ４　（ＰＤＮＡ４）及びリン
酸付加ＤＮＡ５　（ｐＤＮＡ５）を各々（Ａ）５ｐｍｏ
ｌ、（Ｂ）０．５ｐｍｏｌ．　　（ｃ）０．０５ｐｍｏ
ｌ．　　（Ｄ）Ｏｍｏｌ添加した，　　Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結させ、エタノール沈澱後、各々５．
５μｌのＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔ｛ＣＩＰＨ７．
５．　１＋ｉＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させた（１０ｐｇ／
μ１）。

次に（Ａ）〜（Ｄ）各１μｌを用いて、下記のＰＣＲ反
応を行った。２．５ユニットＴａｑ　ＤＮＡボリメラー
ゼ、２００ｐｍｏｌ　ＤＮＡ４（プライマー）、２００
μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ　ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ及び
ｄＴＴＰ）５０１Ｉ＋Ｍ　ＫＣＩ，　　１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ　ｐｌ［８．３１．　５ｍＭ　　ＭｇＣＩ
２，　０．　０２ＸＢＳＡ、及びサンプルＤＮＡを混合
し、流動パラフィンを重層した。市販の温度コントロー
ルシステムを用いて　９４℃１分間、５５℃２分間、７
２℃２分間の温度変化を２６サイクル行った。

一２６一ＰＣＲ反応後、フェノール処理、エタノール処理、エタ
ノール沈澱を行い、各々ＴＲＩＯμｌに溶解させた後、
５μｌを分取して、６ｘアクリルアミドゲルにて電気泳
動を行った。その結果以下のことが確認された。

（ｉ）ＰＣＲ反応により、各フラグメントは１０万倍〜
１００万倍に遺伝子量が増幅している。

（１１）各フラブメントは、約３０〜４０ｂＰ分だけバ
ンドがシフトしており、両端にリンカーが各１個付加さ
れていることが確認された。

（ｉｉｉ）遺伝子増幅反応の対象となるＤＮＡフラグメ
ントのサイズとしては、少なくとも１５０ｂｐ〜１００
０ｂｐの範囲では問題なく遺伝子増幅させることができ
る。

（ｉｖ）本発明の反応に用いる合成リンカーの量として
は、モル比で、サンプルＤＮＡフラグメントの数百倍か
ら千倍程度であることが望ましい。

ＤＮＡ４及びＤＮＡ５を用いることにより．　１５０ｂ
ｐ〜１０００ｂｐの遺伝子断片を効率的に増幅すること
ができた．この後、このようにして得られるＤＮＡ断片
の両端が平滑末端であることを利用して、平滑末端の切
断部位を有するベクターに組み込むことができる。

一２７− カー付加、ＥＣＯＲＩ制限酵素処理、ゲルｔ過によるフ
リーのリンカーの除去などの操作を行うことによりプラ
スミドベクター（　ｐＵｃ１８など〉及びファージベク
ター（λｇｔｌｌなど〉のＥｃｏＲ１部位にクローニン
グすることが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料中に微量含まれている核酸配列を増幅する方
法であって、（ａ）試料中の核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（ｂ）この核酸配列に合成リンカーを付加し、（ｃ）該
リンカー部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプ
ライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅
反応を行うことを特徴とするイソビトロでの核酸配列の
増幅方法。
（２）前記合成リンカーが、二本の一本鎖合成ＤＮＡが
アニーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方は
平滑末端であるが他方は突出末端であるような合成リン
カーである前記第（１）項記載の核酸配列の増幅方法。
（３）前記合成リンカーの突出末端が、５′末端の方が
１塩基以上突出した形状である前記（２）項記載の核酸
配列の増幅方法。
（４）前記合成リンカーの突出末端が、３′末端の方が
１塩基以上突出した形状である前記（２）項記載の核酸
配列の増幅方法。
（５）前記合成リンカーが、その塩基配列中にパリンド
ローム構造を含まない塩基配列である前記第（１）項記
載の核酸配列の増幅方法。
（６）前記合成リンカーが、その塩基配列中に、自然界
にはまれにしか存在しない制限酵素認識部位を有する塩
基配列である前記第（１）項記載の核酸配列の増幅方法
。
（７）前記制限酵素認識部位が、８塩基認識の制限酵素
である前記第（６）項記載の核酸配列の増幅方法。
（８）８塩基認識の制限酵素がＮｏｔ I またはＳｆｉ
I である前記第（７）項記載の核酸配列の増幅方法。
（９）試料中に微量含まれている核酸配列を増幅し、ク
ローニングする方法であって、（ａ）試料中の核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（ｂ）この核酸配列に合成リンカーを付加し、（ｃ）該
リンカー部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプ
ライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅
反応を行い、（ｄ）得られる二本鎖ＤＮＡ断片が平滑末端を有するこ
とを利用して５′末端にリン酸を付加した後、切断面が
平滑末端になるような適当な制限酵素で切断したベクタ
ーに結合させることを特徴とする核酸配列のクローニン
グ方法
（１０）試料中に微量含まれている核酸配列を増幅し、
クローニングする方法であつて、（ａ）試料中の核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（ｂ）この核酸配列に合成リンカーを付加し、（ｃ）該
リンカー部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプ
ライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅
反応を行い、（ｄ）得られる二本鎖ＤＮＡ断片のリンカー部分に含ま
れている制限酵素認識部位をその制限酵素で切断し、こ
れを同じ酵素で切断した末端を有するベクターに結合さ
せることを特徴とする核酸配列のクローニング方法。
（１１）前記（ｄ）で使用する制限酵素が、８塩基認識
の制限酵素である前記第（１０）項のクローニング方法
。
（１２）８塩基認識の制限酵素がＮｏｔ I またはＳｆ
ｉ I である前記第（１１）項記載のクローニング方法
。
（１３）試料中に微量含まれている核酸配列を増幅し、
クローニングする方法であって、（ａ）試料中の核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（ｂ）この核酸配列に合成リンカーを付加し、（ｃ）該
リンカー部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプ
ライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅
反応を行い、（ｄ）得られる二本鎖ＤＮＡ断片が平滑末端を有するこ
とを利用して、５′末端にリン酸を付加した後、適当な
制限酵素認識部位を有する第２のリンカーを付加し、第
２のリンカーに含まれている制限酵素認識部位をその制
限酵素で切断し、同じ制限酵素で切断した末端を有する
ベクターに結合させることを特徴とする核酸配列のクロ
ーニング方法。
（１４）上記第（１）項記載の核酸の増幅方法に用いる
為の合成リンカーであって、合成リンカーが、その塩基
配列中にパリンドローム構造を含まない塩基配列である
ことを特徴とする合成リンカー。
（１５）上記合成リンカーが、制限酵素ＢｓｔＸ I ま
たはＭｂｏII認識配列を有する塩基配列である前記第（
１４）項記載の合成リンカー。
（１６）上記第（１）項記載の核酸の増幅方法に用いる
為の合成リンカーであって、合成リンカーが８塩基認識
の制限酵素認識配列を有することを特徴とする合成リン
カー。
（１７）上記制限酵素認識配列が、制限酵素Ｓｆｉ I
またはＮｏｔ I 認識配列である前記第（１６）項記載
の合成リンカー。