JPH07177885A - 核酸の特異的クローニング方法 - Google Patents
核酸の特異的クローニング方法Info
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- JPH07177885A JPH07177885A JP6223265A JP22326594A JPH07177885A JP H07177885 A JPH07177885 A JP H07177885A JP 6223265 A JP6223265 A JP 6223265A JP 22326594 A JP22326594 A JP 22326594A JP H07177885 A JPH07177885 A JP H07177885A
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- dna
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規の核酸の特異的クローニング方法を提供
すること。 【構成】 第１工程において、互いに一部相補的な２つ
のプライマーの二本鎖コンビネーションを一本鎖ＤＮＡ
鎖の３'末端にライゲートさせ、第２工程において、ラ
イゲートしたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対
して相補的なプライマーを使用して、ＤＮＡポリメラー
ゼによって第２鎖を合成し、次いで、所望により、第３
工程において、得られたｃＤＮＡを増幅させることから
なる核酸のクローニング方法。 【効果】 核酸の特異的クローニングが良好に行われ
る。
すること。 【構成】 第１工程において、互いに一部相補的な２つ
のプライマーの二本鎖コンビネーションを一本鎖ＤＮＡ
鎖の３'末端にライゲートさせ、第２工程において、ラ
イゲートしたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対
して相補的なプライマーを使用して、ＤＮＡポリメラー
ゼによって第２鎖を合成し、次いで、所望により、第３
工程において、得られたｃＤＮＡを増幅させることから
なる核酸のクローニング方法。 【効果】 核酸の特異的クローニングが良好に行われ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の特異的クローニ
ング方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、２つの
一部相補的な二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して一本
鎖ＤＮＡをライゲートさせ、第２鎖を合成し、次いで、
所望により、２つの特異的オリゴヌクレオチドおよび試
薬により標的ＤＮＡを特異的に増幅させることからなる
核酸のクローニング方法に関する。
ング方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、２つの
一部相補的な二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して一本
鎖ＤＮＡをライゲートさせ、第２鎖を合成し、次いで、
所望により、２つの特異的オリゴヌクレオチドおよび試
薬により標的ＤＮＡを特異的に増幅させることからなる
核酸のクローニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】情報運搬体としての核酸は、これまでに
知られている全ての生物における生命の特異的な形態に
ついての基盤である。該核酸は、タンパクをコードして
いるが、触媒的または構造的効果も有する。デオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）については、多くの核酸クローニング
および増殖方法が確立された。これに対して、特に、稀
に生じるＲＮＡのクローニングおよび全長におけるＲＮ
Ａのクローニングのために、リボ核酸（ＲＮＡ）をクロ
ーン化するのは、なお、比較的困難である。
知られている全ての生物における生命の特異的な形態に
ついての基盤である。該核酸は、タンパクをコードして
いるが、触媒的または構造的効果も有する。デオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）については、多くの核酸クローニング
および増殖方法が確立された。これに対して、特に、稀
に生じるＲＮＡのクローニングおよび全長におけるＲＮ
Ａのクローニングのために、リボ核酸（ＲＮＡ）をクロ
ーン化するのは、なお、比較的困難である。
【０００３】現在のＲＮＡクローニング方法は、細胞か
ら全ＲＮＡまたはmＲＮＡの単離、リバーストランスク
リプターゼ（ＡＭＶ、ＭoＭuＬＶ）によるＲＮＡのcＤ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドへの翻訳、ＲＮase Ｈによる
ＲＮＡ部分の分解、これに次ぐ、クレノウ（Ｋlenow)
ＤＮＡポリメラーゼを使用する相補的cＤＮＡ鎖の合成
に基づいている［標準的な方法としてアウスベル（Ａus
ubel）ら（編集者）１９８７ カレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐr
otocols in Ｍolecular Ｂiology）に開示されてい
る]。ＤＮＡの第２鎖の合成は、プライマーを必要とす
る。該プライマーは、ＲＮase Ｈ消化により得られる短
いＲＮＡフラグメントで構成されており［グブラー（Ｇ
ubler)、１９８７、メソッズ・オブ・エンザイモロジー
（Ｍethods of Ｅnzymology) １５２、３３０−３３
５]、これは、古典的な方法における場合には一本鎖cＤ
ＮＡの巻戻しによって［グブラー、１９８７、メソッズ
・オブ・エンザイモロジー １５２、３２５−３２
９］、または、高度に変質した短いオリゴヌクレオチド
の添加によっても［ファインバーグ（Ｆeinberg)、フォ
ゲルシュタイン（Ｖogelstein)、１９８３ アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａnalytical Ｂiochemistr
y) １３２、６−１３］形成させることができる。全て
の場合、プライマーの欠損により相補鎖が全く合成され
ないので、一本鎖cＤＮＡの３'末端は、クローニングに
おいて消失する。次いで、この方法で生成された二本鎖
ＤＮＡを、好適なアダプターのクローニングを介して、
ベクター（プラスミド、コスミド、ファージ）に特異的
にクローン化させ、次いで、有効に、細菌中に形質転換
させるか、またはファージ中に包み込ませることができ
る。
ら全ＲＮＡまたはmＲＮＡの単離、リバーストランスク
リプターゼ（ＡＭＶ、ＭoＭuＬＶ）によるＲＮＡのcＤ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドへの翻訳、ＲＮase Ｈによる
ＲＮＡ部分の分解、これに次ぐ、クレノウ（Ｋlenow)
ＤＮＡポリメラーゼを使用する相補的cＤＮＡ鎖の合成
に基づいている［標準的な方法としてアウスベル（Ａus
ubel）ら（編集者）１９８７ カレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐr
otocols in Ｍolecular Ｂiology）に開示されてい
る]。ＤＮＡの第２鎖の合成は、プライマーを必要とす
る。該プライマーは、ＲＮase Ｈ消化により得られる短
いＲＮＡフラグメントで構成されており［グブラー（Ｇ
ubler)、１９８７、メソッズ・オブ・エンザイモロジー
（Ｍethods of Ｅnzymology) １５２、３３０−３３
５]、これは、古典的な方法における場合には一本鎖cＤ
ＮＡの巻戻しによって［グブラー、１９８７、メソッズ
・オブ・エンザイモロジー １５２、３２５−３２
９］、または、高度に変質した短いオリゴヌクレオチド
の添加によっても［ファインバーグ（Ｆeinberg)、フォ
ゲルシュタイン（Ｖogelstein)、１９８３ アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａnalytical Ｂiochemistr
y) １３２、６−１３］形成させることができる。全て
の場合、プライマーの欠損により相補鎖が全く合成され
ないので、一本鎖cＤＮＡの３'末端は、クローニングに
おいて消失する。次いで、この方法で生成された二本鎖
ＤＮＡを、好適なアダプターのクローニングを介して、
ベクター（プラスミド、コスミド、ファージ）に特異的
にクローン化させ、次いで、有効に、細菌中に形質転換
させるか、またはファージ中に包み込ませることができ
る。
【０００４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の研究を
介して刊行物に記載された方法によってＲＮＡクローニ
ングのさらなる改良を行うことができた［サイキ（Ｓai
ki）ら、サイエンス（Ｓcience) １９８８、２３９、４
８７−４９１]。これらの２つの方法の組合せによっ
て、非常に少ない初期量のＲＮＡ（少量の出発細胞）の
クローニングまたは非常に稀に生じるＲＮＡのクローニ
ングが可能になる。
介して刊行物に記載された方法によってＲＮＡクローニ
ングのさらなる改良を行うことができた［サイキ（Ｓai
ki）ら、サイエンス（Ｓcience) １９８８、２３９、４
８７−４９１]。これらの２つの方法の組合せによっ
て、非常に少ない初期量のＲＮＡ（少量の出発細胞）の
クローニングまたは非常に稀に生じるＲＮＡのクローニ
ングが可能になる。
【０００５】cＤＮＡクローニングにおけるＰＣＲの使
用のために予め必要な条件は、cＤＮＡがその３'末端お
よび５'末端で既知のヌクレオチド配列のＤＮＡ領域を
有していることである。mＲＮＡの３'に対して相補的
な、ポリ−dＴテールを有するオリゴヌクレオチドによ
って、cＤＮＡの５'末端で、既知の一連のヌクレオチド
を有する配列を比較的簡単に挿入することができる。
用のために予め必要な条件は、cＤＮＡがその３'末端お
よび５'末端で既知のヌクレオチド配列のＤＮＡ領域を
有していることである。mＲＮＡの３'に対して相補的
な、ポリ−dＴテールを有するオリゴヌクレオチドによ
って、cＤＮＡの５'末端で、既知の一連のヌクレオチド
を有する配列を比較的簡単に挿入することができる。
【０００６】cＤＮＡの３'末端で特異的な配列をつなぎ
止める（anchor）のは非常に困難である：従前に刊行物
に記載された方法は、以下のとおりである。
止める（anchor）のは非常に困難である：従前に刊行物
に記載された方法は、以下のとおりである。
【０００７】ターミナルトランスフェラーゼによるホモ
ポリマー（例えば、dＧまたはdＡ）の合成。この方法
は、「cＤＮＡ末端の迅速増幅法」（Ｒapid Ａmplificat
ion ofcＤＮＡ Ｅnds)（ＲＡＣＥ法）または「アンカー
ＰＣＲ法」（Ａnchored ＰＣＲ）として知られている
［フローマン（Ｆrohman）ら、１９８８、ＰＮＡＳ ８
５、８９９８−９００２]。この方法は、cＤＮＡの３'
末端でホモポリマーを合成し、次いで、ＰＣＲを行うこ
とに基づいており、ここで、１つのプライマーは、一本
鎖cＤＮＡの新しく合成された３'ホモポリマー末端に対
して相補的であり、第２プライマーは、cＤＮＡの５'末
端の領域に対して相同的である。
ポリマー（例えば、dＧまたはdＡ）の合成。この方法
は、「cＤＮＡ末端の迅速増幅法」（Ｒapid Ａmplificat
ion ofcＤＮＡ Ｅnds)（ＲＡＣＥ法）または「アンカー
ＰＣＲ法」（Ａnchored ＰＣＲ）として知られている
［フローマン（Ｆrohman）ら、１９８８、ＰＮＡＳ ８
５、８９９８−９００２]。この方法は、cＤＮＡの３'
末端でホモポリマーを合成し、次いで、ＰＣＲを行うこ
とに基づいており、ここで、１つのプライマーは、一本
鎖cＤＮＡの新しく合成された３'ホモポリマー末端に対
して相補的であり、第２プライマーは、cＤＮＡの５'末
端の領域に対して相同的である。
【０００８】近年、増幅工程を含む２つのさらなる方法
が文献に開示された。これらの方法は、共に、Ｔ４ Ｒ
ＮＡリガーゼを使用する。このリガーゼまたは別の一本
鎖特異性リガーゼは、いずれも、cＤＮＡの３'末端にプ
ライマーをつなぎ止めるために使用される。次いで、次
なる増幅法（ＰＣＲ）で、１つが一本鎖cＤＮＡの逆転
写物のさらなる５'領域に対して相同的であり、１つが
このライゲートしたプライマーに対して相補的である２
つのさらなるプライマーを使用する［トロウト（Ｔrout
t）ら、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９８２３−９８２
５]［ダマス・マレット・フォー・ローン・プーラン・
ローラー・ソシエテ・アノニム（ＤumasＭallet for Ｒ
hone Ｐoulenc Ｒorer ＳＡ)、フランス特許第９１０８
２９４号]。別法としては、逆転写によって形成された
一本鎖ＤＮＡを、各々、それらの５'または３'を介して
一緒に連結することができ（ヘッド−トゥ−テイル)、
その結果、増幅されるべきcＤＮＡの予め定義された配
列に対して、１つが相同的であり、１つが相補的である
２つの特異的プライマーを、次なる増幅法で使用するこ
とができる［ホフマン（Ｈofmann)、ブライアン（Ｂria
n) １９９１、ＰＣＲ・メソッズ・アンド・アプリケー
ション（ＰＣＲ Ｍethods and Ａpplication) １、４３
−４５]。
が文献に開示された。これらの方法は、共に、Ｔ４ Ｒ
ＮＡリガーゼを使用する。このリガーゼまたは別の一本
鎖特異性リガーゼは、いずれも、cＤＮＡの３'末端にプ
ライマーをつなぎ止めるために使用される。次いで、次
なる増幅法（ＰＣＲ）で、１つが一本鎖cＤＮＡの逆転
写物のさらなる５'領域に対して相同的であり、１つが
このライゲートしたプライマーに対して相補的である２
つのさらなるプライマーを使用する［トロウト（Ｔrout
t）ら、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９８２３−９８２
５]［ダマス・マレット・フォー・ローン・プーラン・
ローラー・ソシエテ・アノニム（ＤumasＭallet for Ｒ
hone Ｐoulenc Ｒorer ＳＡ)、フランス特許第９１０８
２９４号]。別法としては、逆転写によって形成された
一本鎖ＤＮＡを、各々、それらの５'または３'を介して
一緒に連結することができ（ヘッド−トゥ−テイル)、
その結果、増幅されるべきcＤＮＡの予め定義された配
列に対して、１つが相同的であり、１つが相補的である
２つの特異的プライマーを、次なる増幅法で使用するこ
とができる［ホフマン（Ｈofmann)、ブライアン（Ｂria
n) １９９１、ＰＣＲ・メソッズ・アンド・アプリケー
ション（ＰＣＲ Ｍethods and Ａpplication) １、４３
−４５]。
【０００９】これら刊行物記載の方法は、全て、それら
の使用を制限する欠点を有する。特に、プライマーを使
用する工程を常に正しく制御できるわけではなく、特に
ホモポリマーの場合に、プライマーの特異性が制限され
ることが強調されるべきである。このことは、相当な量
のバックグラウンドシグナルを導くだけでなく、少なく
とも増幅に基づかないこれらの方法の場合、ＰＣＲ依存
工程においてある程度まで、ＲＮＡ（通常、mＲＮＡ）
の５'末端の配列情報を含有しない生成物をも導く。全
ての細胞および組織試料から、これらの方法を行うの
に、および、得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを好結
果にクローン化させるのに充分なＲＮＡを単離すること
ができないので、少なくとも増幅に基づかない方法は、
遺伝子バンクを確立するために限定された程度まで使用
することができるだけである。
の使用を制限する欠点を有する。特に、プライマーを使
用する工程を常に正しく制御できるわけではなく、特に
ホモポリマーの場合に、プライマーの特異性が制限され
ることが強調されるべきである。このことは、相当な量
のバックグラウンドシグナルを導くだけでなく、少なく
とも増幅に基づかないこれらの方法の場合、ＰＣＲ依存
工程においてある程度まで、ＲＮＡ（通常、mＲＮＡ）
の５'末端の配列情報を含有しない生成物をも導く。全
ての細胞および組織試料から、これらの方法を行うの
に、および、得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを好結
果にクローン化させるのに充分なＲＮＡを単離すること
ができないので、少なくとも増幅に基づかない方法は、
遺伝子バンクを確立するために限定された程度まで使用
することができるだけである。
【００１０】ホモポリマーの合成を含む方法は、ターミ
ナルトランスフェラーゼが、dＧもしくはdＡ、またはd
ｃもしくはdＴを介する非常に長いホモポリマー鎖をあ
まり有効には合成せず、該反応が制御困難であるという
事実によって非常に制限される。
ナルトランスフェラーゼが、dＧもしくはdＡ、またはd
ｃもしくはdＴを介する非常に長いホモポリマー鎖をあ
まり有効には合成せず、該反応が制御困難であるという
事実によって非常に制限される。
【００１１】さらなる欠点は、次なる増幅において明ら
かになる。使用したプライマー（例えば、ホモポリマー
dＣまたはdＡプライマー）は、望ましくないクローン化
フラグメントのバックグラウンドを相当に増加させる非
特異的増幅生成物を形成し易い。
かになる。使用したプライマー（例えば、ホモポリマー
dＣまたはdＡプライマー）は、望ましくないクローン化
フラグメントのバックグラウンドを相当に増加させる非
特異的増幅生成物を形成し易い。
【００１２】別の増幅依存性方法は、一本鎖分子をライ
ゲートさせることができる酵素、好ましくは、Ｔ４ Ｒ
ＮＡリガーゼを使用する。このリガーゼは、(ＲＮＡお
よびＤＮＡの）短いオリゴヌクレオチドおよびフラグメ
ントをライゲートさせ易く、コンカテマー一本鎖cＤＮ
Ａの収率は、比較的低い。したがって、増幅生成物の収
率も、相当に低い。
ゲートさせることができる酵素、好ましくは、Ｔ４ Ｒ
ＮＡリガーゼを使用する。このリガーゼは、(ＲＮＡお
よびＤＮＡの）短いオリゴヌクレオチドおよびフラグメ
ントをライゲートさせ易く、コンカテマー一本鎖cＤＮ
Ａの収率は、比較的低い。したがって、増幅生成物の収
率も、相当に低い。
【００１３】次に、オリゴヌクレオチドプライマーを、
cＤＮＡにライゲートさせるだけでなく、ＲＮＡならび
にcＤＮＡおよびＲＮＡの短いフラグメントにもライゲ
ートさせる。かかるライゲーション生成物は、誤って増
幅した生成物のバックグラウンドを増加させ、非常に時
間を消費する精製工程を必要とし、該精製工程は、結果
として物質の損失を含む。
cＤＮＡにライゲートさせるだけでなく、ＲＮＡならび
にcＤＮＡおよびＲＮＡの短いフラグメントにもライゲ
ートさせる。かかるライゲーション生成物は、誤って増
幅した生成物のバックグラウンドを増加させ、非常に時
間を消費する精製工程を必要とし、該精製工程は、結果
として物質の損失を含む。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記の従来
技術の欠点を解決する新規核酸クローニング方法を提供
するものである。
技術の欠点を解決する新規核酸クローニング方法を提供
するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、第１工程にお
いて、互いに一部相補的な２つのプライマーの二本鎖コ
ンビネーションを一本鎖ＤＮＡ鎖の３'末端にライゲー
トさせ、第２工程において、ライゲートしたオリゴヌク
レオチドの少なくとも一部に対して相補的なプライマー
を使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって第２鎖を合成
し、次いで、所望により、第３工程において、得られた
ｃＤＮＡを増幅させることを特徴とする核酸のクローニ
ング方法を提供するものである。
いて、互いに一部相補的な２つのプライマーの二本鎖コ
ンビネーションを一本鎖ＤＮＡ鎖の３'末端にライゲー
トさせ、第２工程において、ライゲートしたオリゴヌク
レオチドの少なくとも一部に対して相補的なプライマー
を使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって第２鎖を合成
し、次いで、所望により、第３工程において、得られた
ｃＤＮＡを増幅させることを特徴とする核酸のクローニ
ング方法を提供するものである。
【００１６】すなわち、本発明方法は、２つの一部相補
的な二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して一本鎖ＤＮＡ
をライゲートさせ、次いで、第２鎖を合成し、２つの特
異的オリゴヌクレオチドによって標的ＤＮＡを有効かつ
特異的に増幅させることができることによる核酸のクロ
ーニング方法である。本発明の好ましい適用は、クロー
ン、特にmＲＮＡの完全な５'末端を表すクローンを生成
させることである。このプロセスで使用する生成物は、
生成物の高い特異性を保証する。ライゲーション工程の
生成物の増幅が望ましいか否か、およびこの望ましい程
度を自由に測定することが可能である。
的な二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して一本鎖ＤＮＡ
をライゲートさせ、次いで、第２鎖を合成し、２つの特
異的オリゴヌクレオチドによって標的ＤＮＡを有効かつ
特異的に増幅させることができることによる核酸のクロ
ーニング方法である。本発明の好ましい適用は、クロー
ン、特にmＲＮＡの完全な５'末端を表すクローンを生成
させることである。このプロセスで使用する生成物は、
生成物の高い特異性を保証する。ライゲーション工程の
生成物の増幅が望ましいか否か、およびこの望ましい程
度を自由に測定することが可能である。
【００１７】したがって、本発明の１つの適用は、以下
の工程によって特徴付けられるクローニングスキームで
ある。
の工程によって特徴付けられるクローニングスキームで
ある。
【００１８】第１工程において、さらなる工程のため
に、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖部分を有する二本鎖ＤＮ
Ａを、製造、生成、単離、または他の方法で入手する
（標的ＤＮＡ)。ＲＮＡから製造する場合、高温で操作
することができる酵素を使用するのが特に好都合である
ことが証明される。
に、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖部分を有する二本鎖ＤＮ
Ａを、製造、生成、単離、または他の方法で入手する
（標的ＤＮＡ)。ＲＮＡから製造する場合、高温で操作
することができる酵素を使用するのが特に好都合である
ことが証明される。
【００１９】第２工程において、個々の実験に必要なプ
ライマーを製造、生成、単離、または他の方法で入手す
る。この場合、ＤＮＡの３'末端にライゲートさせるべ
きプライマーをその５'末端でホスホリル化することに
注意しなければならない。
ライマーを製造、生成、単離、または他の方法で入手す
る。この場合、ＤＮＡの３'末端にライゲートさせるべ
きプライマーをその５'末端でホスホリル化することに
注意しなければならない。
【００２０】さらなる工程において、少なくとも一端、
好ましくは一端が相補的領域を超えて伸びている（突出
末端（overhang)）２つの部分相補的プライマーの混合
物を製造する（オリゴヌクレオチド、または可能であれ
ばポリヌクレオチド)。この突出末端は、変性領域、例
えば、古典的ヌクレオチドの１つを意味するか、あるい
は、好ましくは、デオキシイノシンを有する修飾ヌクレ
オチドは、各々可能な位置に存在する。この結果、混合
物中の突出末端の各位置で使用される各塩基の好ましい
同一に表現を生じる。この方法で記載されたこのプライ
マー混合物を、以下、プライマー対と称する。
好ましくは一端が相補的領域を超えて伸びている（突出
末端（overhang)）２つの部分相補的プライマーの混合
物を製造する（オリゴヌクレオチド、または可能であれ
ばポリヌクレオチド)。この突出末端は、変性領域、例
えば、古典的ヌクレオチドの１つを意味するか、あるい
は、好ましくは、デオキシイノシンを有する修飾ヌクレ
オチドは、各々可能な位置に存在する。この結果、混合
物中の突出末端の各位置で使用される各塩基の好ましい
同一に表現を生じる。この方法で記載されたこのプライ
マー混合物を、以下、プライマー対と称する。
【００２１】さらなる工程において、プライマー対の標
的ＤＮＡへのライゲーションが、調製され、行われる。
後者２つの工程は、一緒に行うことができる。過剰のプ
ライマーを、例えば、ライゲーションを開始する前にゲ
ル濾過することによって、除去することが推奨される。
的ＤＮＡへのライゲーションが、調製され、行われる。
後者２つの工程は、一緒に行うことができる。過剰のプ
ライマーを、例えば、ライゲーションを開始する前にゲ
ル濾過することによって、除去することが推奨される。
【００２２】ライゲーション生成物の増幅は、可能であ
る限りライゲーション混合物の前精製、希釈または濃縮
後、さらなる工程で行うことができる。この方法におけ
る増幅温度は、既知の測定（ＵＳ ４,６８３,１９５お
よび４,６８３,２０２）と同様に選択されるべきであ
る。
る限りライゲーション混合物の前精製、希釈または濃縮
後、さらなる工程で行うことができる。この方法におけ
る増幅温度は、既知の測定（ＵＳ ４,６８３,１９５お
よび４,６８３,２０２）と同様に選択されるべきであ
る。
【００２３】Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡの二本鎖
領域に対するその特異性のため、ライゲーション反応の
ための好ましい酵素である。該ライゲーションは、１５
℃〜２５℃で１〜１６時間行うことが推奨される。この
プロセスでは、通常、高温で短時間および低温で長いイ
ンキュベーション期間を組み合わせる。該ライゲーショ
ンは、好ましくは１６℃で一晩行われる。最近、熱安定
性リガーゼも入手可能になっている。使用されるべきオ
リゴヌクレオチドを選択する場合、長さが充分であり、
Ｇ／Ｃ比が適切であること、および次なるクローニング
で使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部
位が入手可能であることに注意するのが望ましい。
領域に対するその特異性のため、ライゲーション反応の
ための好ましい酵素である。該ライゲーションは、１５
℃〜２５℃で１〜１６時間行うことが推奨される。この
プロセスでは、通常、高温で短時間および低温で長いイ
ンキュベーション期間を組み合わせる。該ライゲーショ
ンは、好ましくは１６℃で一晩行われる。最近、熱安定
性リガーゼも入手可能になっている。使用されるべきオ
リゴヌクレオチドを選択する場合、長さが充分であり、
Ｇ／Ｃ比が適切であること、および次なるクローニング
で使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部
位が入手可能であることに注意するのが望ましい。
【００２４】最終工程において、増幅生成物は、次のさ
らなる処理、例えば、配列決定またはクローニングのた
めに調製される。例えば、バックグラウンドを減少させ
たり、特異性を増加させたりするために、該増幅生成物
を、さらなる、いわゆる「ネステッド（nested)」ＰＣ
Ｒに付すのが望ましいことも証明される。第１の増幅に
おいて、通常、例えば、コストのために、逆転写のため
と同一のプライマーをいわゆる下流プライマーとして使
用する。第２のネステッド増幅において、上方にシフト
される、すなわち、一本鎖ＤＮＡの３'末端に近く位置
する下流プライマーを選択する。好適な酵素を使用する
場合、原則的には、１つの容器中で全ての酵素反応を連
続的に行うことができる。
らなる処理、例えば、配列決定またはクローニングのた
めに調製される。例えば、バックグラウンドを減少させ
たり、特異性を増加させたりするために、該増幅生成物
を、さらなる、いわゆる「ネステッド（nested)」ＰＣ
Ｒに付すのが望ましいことも証明される。第１の増幅に
おいて、通常、例えば、コストのために、逆転写のため
と同一のプライマーをいわゆる下流プライマーとして使
用する。第２のネステッド増幅において、上方にシフト
される、すなわち、一本鎖ＤＮＡの３'末端に近く位置
する下流プライマーを選択する。好適な酵素を使用する
場合、原則的には、１つの容器中で全ての酵素反応を連
続的に行うことができる。
【００２５】本発明は、好ましくは、mＲＮＡから逆転
写によって形成される一本鎖ＤＮＡ上で使用される。Ｒ
ＮＡの生成およびこのＲＮＡの逆転写は、公知の刊行物
記載のプロトコールに従って行われる［例えば、アウス
ベルら、１９８７（編集者）カレント・プロトコールズ
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrot
ocols of Ｍolecular Ｂiology）]。ＤＮＡの３'末端に
ライゲートさせるプライマーを除く全てのプライマーの
５'末端をホスホリル化するのは必要ではなく、不都合
である。
写によって形成される一本鎖ＤＮＡ上で使用される。Ｒ
ＮＡの生成およびこのＲＮＡの逆転写は、公知の刊行物
記載のプロトコールに従って行われる［例えば、アウス
ベルら、１９８７（編集者）カレント・プロトコールズ
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrot
ocols of Ｍolecular Ｂiology）]。ＤＮＡの３'末端に
ライゲートさせるプライマーを除く全てのプライマーの
５'末端をホスホリル化するのは必要ではなく、不都合
である。
【００２６】ゲノムＤＮＡは、さらなる工程によってプ
ライマー対へのライゲーションのために鋳型として使用
することもできる。この工程において、(プライマー
が、例えばファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのため
に、適切なプロモーター配列を含有する場合）ＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼによる伸長のための鋳型としてＤＮＡの既知部
分に対して相補的または相同的であるプライマーによっ
て、ゲノムＤＮＡを一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに転換さ
せる。次なるライゲーションのために好適な基質は、一
本鎖生成物を精製することによって、例えば、一本鎖分
子のための特異的カラム（例えば、ヒドロキシルアパタ
イト）またはＲＮＡ特異的カラムによって、あるいは、
例えば使用したプライマーがこの方法のために好適な修
飾（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン）を含有する場
合には親和性精製によって、これから得ることもでき
る。
ライマー対へのライゲーションのために鋳型として使用
することもできる。この工程において、(プライマー
が、例えばファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのため
に、適切なプロモーター配列を含有する場合）ＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼによる伸長のための鋳型としてＤＮＡの既知部
分に対して相補的または相同的であるプライマーによっ
て、ゲノムＤＮＡを一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに転換さ
せる。次なるライゲーションのために好適な基質は、一
本鎖生成物を精製することによって、例えば、一本鎖分
子のための特異的カラム（例えば、ヒドロキシルアパタ
イト）またはＲＮＡ特異的カラムによって、あるいは、
例えば使用したプライマーがこの方法のために好適な修
飾（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン）を含有する場
合には親和性精製によって、これから得ることもでき
る。
【００２７】制限エンドヌクレアーゼに対して耐性を有
する生成物が得られるいくつかの用途のために、ｍ5dＣ
（５位でメチル化されたデオキシシトシン）などの修飾
ヌクレオチドを使用するのも望ましい。
する生成物が得られるいくつかの用途のために、ｍ5dＣ
（５位でメチル化されたデオキシシトシン）などの修飾
ヌクレオチドを使用するのも望ましい。
【００２８】「図１」は、実施例１〜４の方法を概略示
す流れ図である。逆転写後、プライマー対を一本鎖cＤ
ＮＡにライゲートさせ、次いで、逆転写に使用したプラ
イマーおよびcＤＮＡにライゲートさせたプライマーの
一部に対して相補的であるプライマーを用いてＰＣＲに
付した。増幅生成物の精製後、初期cＤＮＡの３'末端の
近くに位置する配列に対して相同的である、別の下流プ
ライマーではなく、同一の上流プライマーを用いて、第
２ＰＣＲを行った。これにより得られた増幅生成物をク
ローニングのために調製した。
す流れ図である。逆転写後、プライマー対を一本鎖cＤ
ＮＡにライゲートさせ、次いで、逆転写に使用したプラ
イマーおよびcＤＮＡにライゲートさせたプライマーの
一部に対して相補的であるプライマーを用いてＰＣＲに
付した。増幅生成物の精製後、初期cＤＮＡの３'末端の
近くに位置する配列に対して相同的である、別の下流プ
ライマーではなく、同一の上流プライマーを用いて、第
２ＰＣＲを行った。これにより得られた増幅生成物をク
ローニングのために調製した。
【００２９】
【実施例】実施例１および２ならびに実施例３および４
の概要をまとめて「図１」に示す。逆転写後、プライマ
ー対を一本鎖cＤＮＡにライゲートさせ、次いで、逆転
写のため使用したプライマーおよびcＤＮＡにライゲー
トしたプライマーの一部に対して相補的なプライマーを
用いてＰＣＲに付した。増幅生成物の精製後、初期cＤ
ＮＡの３'末端の近くに位置する部位に対して特異的で
はあるが相同的ではない、別のプライマーではなく、同
一の上流プライマーを用いて行った。次いで、得られた
増幅生成物をクローニングのために調製した。
の概要をまとめて「図１」に示す。逆転写後、プライマ
ー対を一本鎖cＤＮＡにライゲートさせ、次いで、逆転
写のため使用したプライマーおよびcＤＮＡにライゲー
トしたプライマーの一部に対して相補的なプライマーを
用いてＰＣＲに付した。増幅生成物の精製後、初期cＤ
ＮＡの３'末端の近くに位置する部位に対して特異的で
はあるが相同的ではない、別のプライマーではなく、同
一の上流プライマーを用いて行った。次いで、得られた
増幅生成物をクローニングのために調製した。
【００３０】実施例１ 逆転写による特異的cＤＮＡの調製 刊行物記載の方法［アウスベルら １９８７]に従って、
ＲＮＡを調製した。ジーン−アセンブラー・プラス（Ｇ
ene−Ａssembler plus)（ファルマシア（Ｐharmacia)）
でオリゴヌクレオチドを合成し、脱トリチル化後、Ｇ
５０カラムを介して遠心によって精製した。逆転写混合
物３０μl中、mＲＮＡに対して相補的な特異的プライマ
ー（３０pmol）を使用した。この反応を以下のバッファ
ー：１０mＭトリス（Ｔris）ＨＣl（pＨ８.３)、５０m
Ｍ ＫＣl、５mＭ ＭgＣl2、各１mＭのdＮＴＰ（dＡＴ
Ｐ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ）中で行った。該反応
混合物は、全ＲＮＡ ３μg、ＲＮＡsin ４０単位および
ＭoＭuＬＶリバーストランスクリプターゼ５０単位をも
含有しており、無菌再蒸留水で３０μlに調製した。逆
転写を４２℃で１５分間行った。次いで、核酸をエタノ
ールで沈殿させ、ＲＮase消化バッファー（１０mＭ Ｔr
is ＨＣl（pＨ７.５)、３００mＭ ＮaＣl、５mＡ ＥＤ
ＴＡ）３５０μl中に取った。ＲＮase Ａ（１.５単位）
およびＲＮase Ｔ１（７００単位）を添加して、残存す
るＲＮＡを３７℃で３０分間消化する。該混合物中に存
在するcＤＮＡ生成物を遠心カラム（セファデックス
（Ｓephadex) Ｇ５０）によって精製した。凍結乾燥お
よびエタノール沈殿化によるcＤＮＡを含有する溶離液
の体積を減少させた後、該生成物を無菌再蒸留水で６μ
lに調製した。
ＲＮＡを調製した。ジーン−アセンブラー・プラス（Ｇ
ene−Ａssembler plus)（ファルマシア（Ｐharmacia)）
でオリゴヌクレオチドを合成し、脱トリチル化後、Ｇ
５０カラムを介して遠心によって精製した。逆転写混合
物３０μl中、mＲＮＡに対して相補的な特異的プライマ
ー（３０pmol）を使用した。この反応を以下のバッファ
ー：１０mＭトリス（Ｔris）ＨＣl（pＨ８.３)、５０m
Ｍ ＫＣl、５mＭ ＭgＣl2、各１mＭのdＮＴＰ（dＡＴ
Ｐ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ）中で行った。該反応
混合物は、全ＲＮＡ ３μg、ＲＮＡsin ４０単位および
ＭoＭuＬＶリバーストランスクリプターゼ５０単位をも
含有しており、無菌再蒸留水で３０μlに調製した。逆
転写を４２℃で１５分間行った。次いで、核酸をエタノ
ールで沈殿させ、ＲＮase消化バッファー（１０mＭ Ｔr
is ＨＣl（pＨ７.５)、３００mＭ ＮaＣl、５mＡ ＥＤ
ＴＡ）３５０μl中に取った。ＲＮase Ａ（１.５単位）
およびＲＮase Ｔ１（７００単位）を添加して、残存す
るＲＮＡを３７℃で３０分間消化する。該混合物中に存
在するcＤＮＡ生成物を遠心カラム（セファデックス
（Ｓephadex) Ｇ５０）によって精製した。凍結乾燥お
よびエタノール沈殿化によるcＤＮＡを含有する溶離液
の体積を減少させた後、該生成物を無菌再蒸留水で６μ
lに調製した。
【００３１】実施例２ 一本鎖標的ＤＮＡに対するプライマー対のライゲーショ
ン ライゲーションに必要な２つのプライマー（プライマー
対）の配列を「図１」に示す。５'末端が実施例１のcＤ
ＮＡの３'末端にライゲートさせるべきであるプライマ
ーをホスホリル化した。６６mＭトリスＨＣl（pＨ７.
５)、５mＭ ＭgＣl2、１mＭ ＤＴＴおよび実施例１で生
成した第３のcＤＮＡを含有する溶液１０μl中、各プラ
イマーまたはプライマー混合物１０pmolを用いて、１６
℃で一晩、ライゲーションを行った。インキュベーショ
ン後、該混合物を７０℃で５分間維持し、次いで、室温
に冷却し、ＡＴＰ（１０nmol）およびＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング（Ｂoehringer Ｍ
annheim ＧmbＨ）)（１単位）の添加によって開始し
た。
ン ライゲーションに必要な２つのプライマー（プライマー
対）の配列を「図１」に示す。５'末端が実施例１のcＤ
ＮＡの３'末端にライゲートさせるべきであるプライマ
ーをホスホリル化した。６６mＭトリスＨＣl（pＨ７.
５)、５mＭ ＭgＣl2、１mＭ ＤＴＴおよび実施例１で生
成した第３のcＤＮＡを含有する溶液１０μl中、各プラ
イマーまたはプライマー混合物１０pmolを用いて、１６
℃で一晩、ライゲーションを行った。インキュベーショ
ン後、該混合物を７０℃で５分間維持し、次いで、室温
に冷却し、ＡＴＰ（１０nmol）およびＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング（Ｂoehringer Ｍ
annheim ＧmbＨ）)（１単位）の添加によって開始し
た。
【００３２】実施例３ ライゲーション反応のアリコットの増幅 ヌクレオチドdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰの各
々４０nmolおよび２つのプライマー（逆転写のために使
用したプライマーおよびライゲートしたプライマーに対
して相補的な別のプライマー）の各々５０pmolを使用し
て、バッファー混合物（１０mＭトリスＨＣl（pＨ８.
３)、５０mＭ ＫＣl、２mＭ ＭgＣl2、０.１mg／mlゼラ
チン）１００μl中で増幅を行った。該混合物をライゲ
ーション混合物（実施例２）の４０％およびＴaqポリメ
ラーゼ２単位も含有していた。９４℃で４５秒、４２℃
で３０秒、７２℃で９０秒からなるサイクルを２５サイ
クル通して増幅を行った。
々４０nmolおよび２つのプライマー（逆転写のために使
用したプライマーおよびライゲートしたプライマーに対
して相補的な別のプライマー）の各々５０pmolを使用し
て、バッファー混合物（１０mＭトリスＨＣl（pＨ８.
３)、５０mＭ ＫＣl、２mＭ ＭgＣl2、０.１mg／mlゼラ
チン）１００μl中で増幅を行った。該混合物をライゲ
ーション混合物（実施例２）の４０％およびＴaqポリメ
ラーゼ２単位も含有していた。９４℃で４５秒、４２℃
で３０秒、７２℃で９０秒からなるサイクルを２５サイ
クル通して増幅を行った。
【００３３】実施例４ 実施例３からの増幅生成物の第２「ネステッド」増幅 １.５％アガロースゲル（アウスベルら）上で実施例３
からのＰＣＲ混合物の２０％を電気泳動で分離し、予想
されるサイズのバンドを切り出し、グラスミルク（Ｇla
ssmilk)（ジーンクリーン（ＧeneＣlean)、Ｂio １０
１、アメリカ合衆国カリフォルニア州）を用いて精製し
た。この方法で溶離したＤＮＡを、次いで、無菌蒸留水
３０μl中に入れた。この５μlを、逆転写のために使用
したプライマーの代わりに、初期cＤＮＡの３'末端の近
くにある被験ＲＮＡに対して特異的でもあるプライマー
を使用した以外は、実施例３におけると同一の条件下で
行う新しい増幅のために選択した。もちろん、ライゲー
ション混合物の新しいアリコットは、添加しなかった。
（適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化の前および
後に)、前記ゲル電気泳動によって、この増幅混合物の
アリコットを分析した。消化生成物の精製（前記を参
照）の後、これらは、さらなるクローニング工程に好適
な形態で存在した。
からのＰＣＲ混合物の２０％を電気泳動で分離し、予想
されるサイズのバンドを切り出し、グラスミルク（Ｇla
ssmilk)（ジーンクリーン（ＧeneＣlean)、Ｂio １０
１、アメリカ合衆国カリフォルニア州）を用いて精製し
た。この方法で溶離したＤＮＡを、次いで、無菌蒸留水
３０μl中に入れた。この５μlを、逆転写のために使用
したプライマーの代わりに、初期cＤＮＡの３'末端の近
くにある被験ＲＮＡに対して特異的でもあるプライマー
を使用した以外は、実施例３におけると同一の条件下で
行う新しい増幅のために選択した。もちろん、ライゲー
ション混合物の新しいアリコットは、添加しなかった。
（適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化の前および
後に)、前記ゲル電気泳動によって、この増幅混合物の
アリコットを分析した。消化生成物の精製（前記を参
照）の後、これらは、さらなるクローニング工程に好適
な形態で存在した。
【００３４】以下に、本発明の実施態様について記載す
る。 (１) 第１工程において、互いに一部相補的な２つのプ
ライマーの二本鎖コンビネーションを一本鎖ＤＮＡ鎖の
３'末端にライゲートさせ、第２工程において、ライゲ
ートしたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して
相補的なプライマーを使用して、ＤＮＡポリメラーゼに
よって第２鎖を合成し、次いで、所望により、第３工程
において、得られたｃＤＮＡを増幅させることを特徴と
する核酸のクローニング方法。 (２) 鋳型ＲＮＡの逆転写によって一本鎖ＤＮＡを形成
する前記(１)のクローニング方法。 (３) 鋳型ＤＮＡのプロセシングによって一本鎖ＤＮＡ
を形成する前記(１)のクローニング方法。 (４) 第２鎖合成および制限エンドヌクレアーゼによる
消化に対して耐性を有する生成物を形成させるＰＣＲに
おいて修飾オリゴヌクレオチドを使用する前記(２)また
は(３)のクローニング方法。 (５) オリゴヌクレオチドにおける修飾塩基としてｍ5
Ｃを使用する前記(４)のクローニング方法。 (６) プライマー伸長によって製造されたcＤＮＡを分
離する前記(３)のクローニング方法。 (７) アフィニティークロマトグラフィーによって分離
を行う前記(６)のクローニング方法。 (８) 修飾プライマーまたはオリゴヌクレオチドによっ
て分離を可能にする前記(７)のクローニング方法。 (９) 分離のためにビオチニル化またはジゴキシゲニル
化した標識プライマーを使用する前記(８)のクローニン
グ方法。 (１０) プライマーとして、生成物中に制限酵素認識部
位を生じさせるオリゴヌクレオチドを使用する前記(１)
のクローニング方法。 (１１) プライマー対のオーバーハングが３ヌクレオチ
ドよりも多く、かつ、６ヌクレオチドよりも少ない前記
(１)のクローニング方法。 (１２) 二本鎖ＤＮＡに対して特異的な酵素の存在によ
って、ライゲーションを起こさせる前記(１)のクローニ
ング方法。 (１３) 酵素がＴ４ ＤＮＡリガーゼである前記(１２)
記載のクローニング方法。 (１４) 酵素が熱安定リガーゼである前記(１２)のクロ
ーニング方法。 (１５) 逆転写のために熱安定酵素を使用する前記(２)
のクローニング方法。 (１６) 熱安定酵素がリバーストランスクリプターゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔth ＤＮＡ
ポリメラーゼである前記(１５)のクローニング方法。 (１７) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって二本
鎖ＤＮＡを生成させる前記(１)のクローニング方法。 (１８) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがイー・コリ
（Ｅ.coli）由来のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラ
グメントである前記(１７)のクローニング方法。 (１９) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが熱安定ＤＮ
Ａポリメラーゼである前記(１７)のクローニング方法。 (２０) 熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＴaq Ｐolである
前記(１９)のクローニング方法。 (２１) 二本鎖ＤＮＡを生成させるために、形成された
一本鎖ＤＮＡを精製させる修飾プライマーを使用する前
記(１７)のクローニング方法。 (２２) 修飾がビオチンであり、かつ、アフィニティー
マトリックスがアビジンまたはストレプトアビジンであ
るか、あるいは、修飾がジゴキシゲニンであり、かつ、
アフィニティーマトリックスが抗ＤＩＧ抗体である前記
(２１)のクローニング方法。 (２３) ライゲーション温度が１５〜２５℃であり、ラ
イゲーションを１〜１６時間行う前記(１２)のクローニ
ング方法。 (２４) 第３工程において、一本鎖ＤＮＡにライゲート
させられる配列領域の一部に対して相補的な、さらなる
新しいプライマーを使用する前記(１)のクローニング方
法。 (２５) 次いで、増幅サイクルを数回行う前記(２４)の
クローニング方法。
る。 (１) 第１工程において、互いに一部相補的な２つのプ
ライマーの二本鎖コンビネーションを一本鎖ＤＮＡ鎖の
３'末端にライゲートさせ、第２工程において、ライゲ
ートしたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して
相補的なプライマーを使用して、ＤＮＡポリメラーゼに
よって第２鎖を合成し、次いで、所望により、第３工程
において、得られたｃＤＮＡを増幅させることを特徴と
する核酸のクローニング方法。 (２) 鋳型ＲＮＡの逆転写によって一本鎖ＤＮＡを形成
する前記(１)のクローニング方法。 (３) 鋳型ＤＮＡのプロセシングによって一本鎖ＤＮＡ
を形成する前記(１)のクローニング方法。 (４) 第２鎖合成および制限エンドヌクレアーゼによる
消化に対して耐性を有する生成物を形成させるＰＣＲに
おいて修飾オリゴヌクレオチドを使用する前記(２)また
は(３)のクローニング方法。 (５) オリゴヌクレオチドにおける修飾塩基としてｍ5
Ｃを使用する前記(４)のクローニング方法。 (６) プライマー伸長によって製造されたcＤＮＡを分
離する前記(３)のクローニング方法。 (７) アフィニティークロマトグラフィーによって分離
を行う前記(６)のクローニング方法。 (８) 修飾プライマーまたはオリゴヌクレオチドによっ
て分離を可能にする前記(７)のクローニング方法。 (９) 分離のためにビオチニル化またはジゴキシゲニル
化した標識プライマーを使用する前記(８)のクローニン
グ方法。 (１０) プライマーとして、生成物中に制限酵素認識部
位を生じさせるオリゴヌクレオチドを使用する前記(１)
のクローニング方法。 (１１) プライマー対のオーバーハングが３ヌクレオチ
ドよりも多く、かつ、６ヌクレオチドよりも少ない前記
(１)のクローニング方法。 (１２) 二本鎖ＤＮＡに対して特異的な酵素の存在によ
って、ライゲーションを起こさせる前記(１)のクローニ
ング方法。 (１３) 酵素がＴ４ ＤＮＡリガーゼである前記(１２)
記載のクローニング方法。 (１４) 酵素が熱安定リガーゼである前記(１２)のクロ
ーニング方法。 (１５) 逆転写のために熱安定酵素を使用する前記(２)
のクローニング方法。 (１６) 熱安定酵素がリバーストランスクリプターゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔth ＤＮＡ
ポリメラーゼである前記(１５)のクローニング方法。 (１７) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって二本
鎖ＤＮＡを生成させる前記(１)のクローニング方法。 (１８) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがイー・コリ
（Ｅ.coli）由来のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラ
グメントである前記(１７)のクローニング方法。 (１９) ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが熱安定ＤＮ
Ａポリメラーゼである前記(１７)のクローニング方法。 (２０) 熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＴaq Ｐolである
前記(１９)のクローニング方法。 (２１) 二本鎖ＤＮＡを生成させるために、形成された
一本鎖ＤＮＡを精製させる修飾プライマーを使用する前
記(１７)のクローニング方法。 (２２) 修飾がビオチンであり、かつ、アフィニティー
マトリックスがアビジンまたはストレプトアビジンであ
るか、あるいは、修飾がジゴキシゲニンであり、かつ、
アフィニティーマトリックスが抗ＤＩＧ抗体である前記
(２１)のクローニング方法。 (２３) ライゲーション温度が１５〜２５℃であり、ラ
イゲーションを１〜１６時間行う前記(１２)のクローニ
ング方法。 (２４) 第３工程において、一本鎖ＤＮＡにライゲート
させられる配列領域の一部に対して相補的な、さらなる
新しいプライマーを使用する前記(１)のクローニング方
法。 (２５) 次いで、増幅サイクルを数回行う前記(２４)の
クローニング方法。
【００３５】
【発明の効果】本発明によると、核酸の特異的クローニ
ングが良好に行われた。
ングが良好に行われた。
【図１】 実施例１〜４の方法を概略示す流れ図。
Claims (4)
- 【請求項１】 第１工程において、互いに一部相補的な
２つのプライマーの二本鎖コンビネーションを一本鎖Ｄ
ＮＡ鎖の３'末端にライゲートさせ、 第２工程において、ライゲートしたオリゴヌクレオチド
の少なくとも一部に対して相補的なプライマーを使用し
て、ＤＮＡポリメラーゼによって第２鎖を合成し、次い
で、 所望により、第３工程において、得られたｃＤＮＡを増
幅させることを特徴とする核酸のクローニング方法。 - 【請求項２】 鋳型ＲＮＡの逆転写によって一本鎖ＤＮ
Ａを形成する請求項１記載のクローニング方法。 - 【請求項３】 鋳型ＤＮＡのプロセシングによって一本
鎖ＤＮＡを形成する請求項１記載のクローニング方法。 - 【請求項４】 第２鎖合成および制限エンドヌクレアー
ゼによる消化に対して耐性を有する生成物を形成させる
ＰＣＲにおいて修飾オリゴヌクレオチドを使用する請求
項２または３記載のクローニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4332463A DE4332463A1 (de) | 1993-09-24 | 1993-09-24 | Verfahren zur spezifischen Klonierung von Nukleinsäuren |
| DE4332463-0 | 1993-09-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07177885A true JPH07177885A (ja) | 1995-07-18 |
Family
ID=6498466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6223265A Pending JPH07177885A (ja) | 1993-09-24 | 1994-09-19 | 核酸の特異的クローニング方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0645449B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07177885A (ja) |
| AT (1) | ATE214096T1 (ja) |
| DE (2) | DE4332463A1 (ja) |
| DK (1) | DK0645449T3 (ja) |
| ES (1) | ES2173897T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996017932A1 (fr) * | 1994-12-09 | 1996-06-13 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede d'inhibition de l'hybridation non specifique dans une extension d'amorce |
| US8809518B2 (en) | 2000-10-05 | 2014-08-19 | Riken | Oligonucleotide linkers comprising a variable cohesive portion and method for the preparation of polynucleotide libraries by using said linkers |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753462A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-19 | Zymogenetics, Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| AU6045196A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Zymogenetics Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| DE19601385A1 (de) * | 1996-01-16 | 1997-07-17 | Mueller Manfred W | Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäure |
| EP0981535A4 (en) * | 1997-05-12 | 2000-11-29 | Life Technologies Inc | PROCESSES FOR PRODUCING AND PURIFYING NUCLEIC ACID MOLECULES |
| US6399334B1 (en) | 1997-09-24 | 2002-06-04 | Invitrogen Corporation | Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof |
| US6368834B1 (en) | 1999-04-06 | 2002-04-09 | Genome Technologies, Llc | PCR genome walking with synthetic primer |
| US6083727A (en) * | 1999-06-30 | 2000-07-04 | Incyte Pharmaceuticals Inc. | Methods and compositions for producing 5' enriched cDNA libraries |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666839A (en) * | 1982-12-01 | 1987-05-19 | Amgen | Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin |
| DE3929030A1 (de) * | 1989-09-01 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren |
| GB9011454D0 (en) * | 1990-05-22 | 1990-07-11 | Medical Res Council | Polynucleotide amplification |
| FR2678639B1 (fr) * | 1991-07-03 | 1993-09-17 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de clonage d'acides nucleiques. |
-
1993
- 1993-09-24 DE DE4332463A patent/DE4332463A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-09-17 EP EP94114675A patent/EP0645449B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-17 ES ES94114675T patent/ES2173897T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-17 AT AT94114675T patent/ATE214096T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-17 DK DK94114675T patent/DK0645449T3/da active
- 1994-09-17 DE DE59410068T patent/DE59410068D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-19 JP JP6223265A patent/JPH07177885A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996017932A1 (fr) * | 1994-12-09 | 1996-06-13 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede d'inhibition de l'hybridation non specifique dans une extension d'amorce |
| US8809518B2 (en) | 2000-10-05 | 2014-08-19 | Riken | Oligonucleotide linkers comprising a variable cohesive portion and method for the preparation of polynucleotide libraries by using said linkers |
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