DE3929030A1 - Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren - Google Patents

Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren

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DE3929030A1
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    • C12Q1/6867Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase

Description

Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren, dessen Verwendung in Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren und Reagentien, die zur Anwendung dieser Verfahren geeignet sind.
Der Nachweis von Nukleinsäuren in Proben findet in jüngster Zeit immer mehr Anwendung in der molekularbiologischen und genetischen Grundlagenforschung, in der klinischen Diagnostik und der Biotechnologie. Zweck dieses Nachweises ist beispielsweise das Auffinden von Pathogenen in biologischen Proben oder von spezifischen Nukleotidsequenzen in Genomen. Dabei kommt es insbesondere darauf an, auch sehr niedrige Konzentrationen nachweisen zu können. Für solche Anwendungen hat es sich als erforderlich erwiesen, die nachzuweisenden Nukleinsäuren in einem vorgeschalteten Schritt zu vermehren und dann erst nach konventionellen Methoden nachzuweisen.
Ein solches Vorgehen wird in der EP-A-02 01 184 vorgeschlagen. Die zu vermehrende Nukleinsäure wird mit zwei einzelsträngigen Oligonukleotidprimern versetzt, die jeweils zu einem unterschiedlichen Strang der zu vermehrenden Nukleinsäure komplementär sind. Die Primer werden zu jeweils einem komplementären Strang der Nukleinsäure verlängert. Jeder der dadurch gebildeten Doppelstränge ist wieder als zu vermehrende Nukleinsäure einsetzbar, jedoch erst nachdem er in Einzelstränge getrennt wurde. Jeder der beiden komplementären Nukleinsäureeinzelstränge kann nun in den folgenden Zyklen mit neuen Oligonukleotidprimer umgesetzt und analog vermehrt werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß große Mengen an Oligonukleotidprimern eingesetzt werden müssen. Außerdem müssen die gebildeten Nukleinsäuredoppelstränge jedesmal zwischen den eigentlichen Vermehrungsschritten in einem zusätzlichen Reaktionsschritt physikalisch voneinander getrennt werden. Dazu sind entweder erhöhte Temperaturen oder zusätzliche Reagentien erforderlich. Beides ist der Einfachheit der Reaktionsführung nicht zuträglich. Auch in der WO 88/10 315 ist ein solches Verfahren beschrieben, welches jedoch die beschriebenen Probleme nicht löst; insbesondere werden auch hier mehr als äquimolare Mengen, bezogen auf die resultierende Nukleinsäuremenge, an Promoter-Oligonukleotid benötigt. Die Verfahren des Standes der Technik haben ferner den Nachteil, daß sie durch die Vielzahl der hintereinandergeschalteten Reaktionsschritte relativ langsam arbeiten.
Es bestand daher ein Bedarf an einem Verfahren zur Vermehrung von Nukleinsäuren, welches schnell, in wenigen Reaktionsschritten ohne Anwendung von Reaktions-Zyklen, insbesondere ohne Temperaturzyklen und mit möglichst wenigen, einfachen Reagentien auskommt.
Die Aufgabe der Bereitstellung eines solchen Verfahrens wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren unter Verwendung einer Nukleinsäure A, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure A mit mindestens zwei Adaptoren, die jeweils eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche mit jeweils einem Teil eines Stranges der Nukleinsäure A hybridisierbar ist, und von denen mindestens einer eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält, unter Bedingungen umsetzt, bei denen eine zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure A im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure gebildet wird, die außerdem mindestens einen Adaptor enthält, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz aufweist, und den so gebildeten Komplex aus Nukleinsäure A und im vorherigen Schritt gebildeter Nukleinsäure unter für eine Replikationsreaktion geeigneten Bedingungen mit einem oder mehreren Proteinen des Replikationssystems umsetzt, die allein oder gemeinsam die Bildung von Nukleinsäuresequenzen katalysieren, welche mindestens die Nukleotidsequenz eines Adaptors, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz sowie eine Nukleotidsequenz enthält, die entweder im wesentlichen homolog oder im wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure A ist. Ein weiterer Gegenstand sind Reagenzien zur Durchführung dieses Verfahrens.
Im Folgenden wird als eine zu einer anderen Nukleinsäure im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure eine Nukleinsäure bezeichnet, deren Nukleotidsequenz mit einer anderen Nukleotidsäuresequenz hybridisieren kann, obgleich die Basenpaarung in einer oder mehreren Nukleotiden nicht der Regel nach Watson und Crick entspricht.
Als eine zu einer anderen Nukleinsäure im wesentlichen homologe Nukleinsäure wird eine Nukleinsäure bezeichnet, deren Nukleotidsequenz sich von der Nukleotidsequenz der anderen Nukleinsäure in einer oder mehreren Nukleotiden unterscheidet, die aber dennoch mit einer zu der anderen Nukleinsäure komplementären Nukleotidsequenz hybridisieren kann.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Nukleinsäuren A alle Arten von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dazu gehören sowohl RNS als auch DNS, beide in Einzel- oder Doppelstrangform, natürlichen wie synthetischen Ursprungs. Wenn die Nukleinsäuren in doppelsträngiger Form vorliegen, müssen sie in Einzelstränge überführt werden. Dies kann auf konventionelle Weise geschehen, beispielsweise durch Erhitzen oder mit Hilfe geeigneter Reagentien, wozu auch doppelstrangaufwindende Enzyme, wie Helikase, zählen.
Die Herkunft der Nukleinsäuren spielt keine Rolle. Bevorzugt können Nukleinsäuren in Lösungen, Suspensionen, aber auch fixiert an Festkörpern, oder in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten Zellen bzw. Gewebsschnitten, oder an isolierten Chromosomen vermehrt werden. Besonders bevorzugt ist die Vermehrung von gelösten Nukleinsäuren. Beispiele sind virale DNS, bakterielle RNA oder zelluläre genomische DNS. Das Medium, in dem die einzelsträngigen Nukleinsäuren vorliegen, wird im Folgenden als Probemedium bezeichnet. Dieses Medium kann neben der Nukleinsäure A auch noch andere Bestandteile, insbesondere Nukleinsäuren, enthalten, die nicht vermehrt werden sollen.
Zur Herstellung von Nukleinsäuren wird das Probemedium mit mindestens zwei Adaptoren versetzt. Bevorzugt ist die Zugabe von zwei Adaptoren pro einzelsträngige Nukleinsäure A. Die Adaptoren müssen mit einem Strang der einzelsträngigen Nukleinsäure A hybridisierbar sein. Dies ist erfüllt, wenn jeder Adaptor eine Nukleotidsequenz enthält, die im wesentlichen komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz des einen Stranges der Nukleinsäure A. Die Adaptoren können sowohl Ribo- als auch Deoxyribonukleotide beinhalten. Bevorzugt enthalten sie Deoxyribonnukleotide. Mindestens zwei der Adaptoren hybridisieren mit der zu vermehrenden Nukleinsäure in voneinander getrennten Bereichen. Diese Hybridisierungsbereiche liegen bevorzugt 50 bis ca. 20 000, besonders bevorzugt 100 bis 8000 Nukleotide voneinander entfernt und überlappen daher nicht miteinander. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Adaptoren in dem Bereich, in dem sie mit der Nukleinsäure hybridisieren sollen, einzelsträngig vorliegen.
Die Nukleotidsequenz des einzelsträngigen hybridisierenden Bereiches der Adaptoren ist so gewählt, daß freie Enden dieser einzelsträngigen Bereiche nach der Hybridisierung dieser Einzelstrangbereiche mit der Nukleinsäure aufeinander zu zeigen. Es ist daher mindestens ein Adaptor mit einem einzelsträngigen 5′- Ende und einer mit einem einzelsträngigen 3′-Ende beteiligt. Bevorzugt ist das 3′-Ende des einen Adaptors ein Hydroxylende, und das 5′-Ende des zweiten Adaptors weist eine Phosphatgruppe auf. Der einzelsträngige Bereich der Adaptoren ist bevorzugt 15 bis 60, besonders bevorzugt 20 bis 40 Nukleotide lang.
Mindestens einer, bevorzugt zwei der Adaptoren weisen außerdem einen Bereich auf, der im wesentlichen nicht mit der zu vermehrenden Nukleinsäure hybridisieren kann. Bevorzugt ist dieser Bereich doppelsträngig. Dieser Adaptor oder diese zwei Adaptoren enthalten in diesem Bereich eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz. Der Bereich kann im Fall eines Doppelstrangbereichs beispielsweise durch die Doppelstrangsequenz als solche oder ihre Sekundärstruktur gebildet werden. Unter Replikationssystem werden die zur Replikation einer Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien verstanden. Dazu gehört insbesondere ein Replikationsenzym, bevorzugt eine DNA-Polymerase. Solche Replikationssysteme sind beispielsweise aus den Phagen PRD1, ⌀15, M29, Nf, GA-1, Cp1 und ⌀29 sowie Eukaryonten wie Adenoviren bekannt. Bevorzugt ist das Repliationssystem des Phagen ⌀29. Nukleotidsequenzen, die für Replikationssysteme spezifisch sind, sind bevorzugt die "origin of replication" (ori)-Sequenzen. (B. Lewin, Genes III, Verlag John Wiley 1987). Im Falle des Phagen ⌀29 sind diese bevorzugt 12 bis 59 Nukleotide (nt) lang. Jeder der ⌀29-ori-Bereiche enthält bevorzugt einen 6 Nukleotide langen Doppelstrangbereich.
Bevorzugt weist mindestens einer der Adaptoren in einem Bereich, der bevorzugt nicht der zur Hybridisierung mit der Nukleinsäure vorgesehene einzelsträngige Bereich ist, einen an einen oder beide Nukleotidstränge gebundenen Rest auf. Dieser Rest ist bevorzugt ein Protein oder eine Komponente aus Zellextrakten. Das Protein kann vielfältige Funktionen haben. Als besonders vorteilhaft haben sich eine adaptorbindende und eine replikationsinitiierende Funktion herausgestellt. Als besonders zweckmäßig bei Verwendung des Replikationssystems von ⌀29 hat sich das Protein p3 des Phagen ⌀29 erwiesen. Die Bindung des Restes an den Adaptor ist bevorzugt kovalent. Im Falle des Proteins p3 hat sich die Bindung mittels einer Reaktion mit dem ⌀29-Protein p2 und dATP als geeignet erwiesen. Im Fall von p3 ist es nicht unbedingt erforderlich, jedoch bevorzugt, daß ein Adaptor schon zu Anfang der Hybridisierungsreaktion des Adaptors und der Nukleinsäure mit p3 kovalent verbunden ist. Die Bindung kann auch erst nach der Hybridisierung erfolgen. Besonders bevorzugt ist der Fall, daß zwei Adaptoren eingesetzt werden, die an den 5′-Enden des doppelsträngigen Bereichs jeweils ein Protein p3 gebunden haben. In diesem Fall ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders wirksam. Es ist jedoch beispielsweise auch möglich, einen Adaptor mit einem doppelsträngigen spezifischen Bereich und einen Adaptor mit einem einzelsträngigen Bereich einzusetzen.
Die Nukleinsäure A, wird mit den Adaptoren unter Bedingungen umgesetzt, bei denen die Adaptoren mit den entsprechenden Bereichen eines Stranges der Nukleinsäure A hybridisieren. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht dann die Bildung einer Nukleinsäure B vor, die zumindest zum Teil im wesentlichen komplementär zu der Nukleinsäure A ist und mindestens einen Adaptor mit umfaßt, der eine für das Replikationssystem spezifische Sequenz enthält. Die Länge der Nukleinsäure B ist festgelegt durch die Länge der Adaptoren und die Länge des zwischen den einzelsträngigen Enden der hybridisierten Adaptoren liegenden Nukleotidisequenz der zu vermehrenden Nukleinsäure A. Die Bildung der Nukleinsäure B geschieht bevorzugt in einer sogenannten "gap-filling"-Reaktion. Bedingungen hierfür sind bekannt, beispielsweise aus Maniatis et al. (Molecular Cloning, 1982, Verlag Goldspring Harbour Laboratory) oder Davis et al. (Base Methods in Molecular Biology, 1986, Verlag Elsevier). Enzyme, die in der "gap-filling" Reaktion eingesetzt werden, sind solche Polymerasen, die in der Lage sind, zwischen 3′- und 5′-Enden von doppelsträngigen Bereichen einen komplementären Strang zu synthetisieren. Je nach Art der Nukleinsäure A handelt es sich um RNA-abhängige DNA- Polymerasen, beispielsweise Phagen-kodierte DNA-Polymerasen, wie Reverse Transkriptase, oder DNA-abhängige DNA-Polymerasen wie T7-, T3- oder T4-DNA-Polymerase, Klenow-Enzym oder Taq-DNA- Polymerase. Besonders bevorzugt sind DNA-Polymerasen, die keine Strangtrennungsaktivitäten aufweisen, wie T4-DNA-Polymerase. Bevorzugt wird außerdem eine DNA-Ligase beispielsweise E.coli- Ligase eingesetzt.
Ergebnis der "gap-filling"-Reaktion ist die Bildung eines zu dem zwischen den Adaptoren liegenden Bereichs der Nukleinsäure A im wesentlichen komplementären Nukleinsäurestranges, der kovalent an das einzelsträngige Ende mindestens eines Adaptors, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält, gebunden ist. Diese neu gebildete Nukleinsäure wird im Folgenden Nukleinsäure B genannt.
Bevorzugt ist der Fall, daß in die neu gebildete Nukleinsäure B die Nukleotidsequenz zweier Adaptoren eingebaut sind. Dies ist beispielsweise durch den zusätzlichen Einsatz einer DNA-Ligase zu erreichen.
Wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Umsetzung des gebildeten Komplexes aus Nukleinsäure A und Nukleinsäure B mit einem oder mehreren Proteinen eines Replikationssystems, die unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, über eine in-vitro Replikationsreaktion, die eine enzymatische Strangtrennung beinhaltet, zu Nukleinsäure B oder den zu ihr mindestens teilweise komplementären Nukleinsäuren unter Verwendung geeigneter Kofaktoren und/oder Zellextrakte eine komplementäre Nukleinsäure C bzw. D zu bilden. Besonders bevorzugt sind solche Proteine, die dazu ohne erneuten Zusatz von Adaptoren in der Lage sind. Ein solches Enzym ist bei Verwendung von ⌀29­ ori-Sequenzen beispielsweise das Protein p2 des Phagen ⌀29 zusammen mit p3 und dATP.
Die Komponenten des Replikationssystems können beispielsweise einzeln, als Gemisch oder in Form eines Extraktes zugegeben werden. Bevorzugt ist die Zugabe gereinigter Komponenten.
Das Enzym bindet dazu an den Erkennungsbereich des Adaptors und bildet unter Mitwirkung von Nukleosidtriphosphaten die komplementäre Nukleinsäure C bzw. D. Ein Protein des Replikationssystems hat die Eigenschaft, eine Strangaufwindung (strand displacement) durchzuführen. Im Falle von ⌀29 hat p2 sowohl DNA-Polymerase- als auch Strangaufwindungsaktivitäten. Ein separater Denaturierungsschritt zwischen einzelnen Vermehrungsschritten kann wegen der enzymatischen Strangtrennung während der Vermehrungsreaktion entfallen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat so den Vorteil, daß es kontinuierlich und schnell verlaufen kann. Für den Fall, daß zwei Adaptoren verwendet wurden, die jeweils eine Erkennungsstelle für das Enzym aufweisen, ist das Verfahren besonders vorteilhaft, da prinzipiell die Bildung der Nukleinsäuren C bzw. D bei beiden Adaptoren beginnen kann. Die Vermehrungsreaktion wird daher stark beschleunigt.
Die Reaktion zur Bildung der Nukleinsäuren C bzw. D aus dem Komplex kann nun mehrmals hintereinander ablaufen, da auch die frisch gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D Komplexe bilden können, deren Umsetzung mit dem Enzym ohne separate zwischengeschaltete Reaktionsschritte zu weiteren Nukleinsäuren D und C führt. Im Idealfall wird ein exponentieller Anstieg der Menge an den Nukleinsäuren C und D erreicht. Zur Bildung der Nukleinsäuren C und D werden keine weiteren Adaptoren benötigt. Die gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D enthalten insbesondere jeweils mindestens eine Nukleotidsequenz der Adaptoren und mindestens eine Nukleotidsequenz, die im wesentlichen komplementär oder homolog zu der Nukleinsäure A oder einem Teil davon ist. Die Länge dieser Nukleotidsequenz entspricht der Nukleinsäure A in dem Bereich, der zwischen den einzelsträngigen Enden der Adaptoren lag. Bevorzugt enthalten die gebildeten Nukleinsäuren B, C und D daher nur einen Teil der Nukleinsäure A.
Wenn die gewünschte Anzahl von Nukleinsäuren C und D gebildet ist, kann die Reaktion beendet werden. Dies geschieht bevorzugt durch Zugabe eines Stoppreagenzes, beispielsweise EDTA. Die zur Herstellung der Nukleinsäuren erforderliche Reaktionszeit wird gegenüber den Verfahren des Standes der Technik durch das erfindungsgemäße Verfahren stark herabgesetzt. Sie hängt wie bei den bekannten Verfahren unter anderem von der Länge der gebildeten Nukleinsäuren ab.
Die Nukleinsäuren C und D bzw. aus ihnen gebildete Komplexe können Gegenstand weiterer Reaktionen sein. Beispielsweise können aus ihnen gebildete Doppelstränge mit Restriktionsenzymen geschnitten werden. In diesem Fall werden bevorzugt Adaptoren eingesetzt, die in ihrem doppelsträngigen Bereich eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym aufweisen.
Die Adaptoren können auch eine Sequenz zur Hybridisierung mit M13­ universellen Sequenzierungsprimern und/oder M3 universellen reverse Sequenzierungsprimern enthalten.
Die Nukleinsäuren C und D können auch Gegenstand von Reaktionen zur Einführung von radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierungen sein, sodaß die Nukleinsäuren C und D leicht nachgewiesen werden können.
Ob die gewünschte Anzahl von Nukleinsäuren C und D gebildet wurde, kann durch bekannte Methoden ermittelt werden, beispielsweise durch Gelchromatographie.
Prinzipiell können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren neben der Nukleinsäure A auch weitere Nukleinsäuren bzw. Teile davon mit unterschiedlicher Nukleotidsequenz in demselben Probemedium zur Herstellung von Nukleinsäuren verwendet werden. Voraussetzung ist, daß für jeden Nukleinsäureeinzelstrang die entsprechenden Adaptoren vorhanden sind. War die in der Probe vorliegende Nukleinsäure ursprünglich eine doppelsträngige Nukleinsäure, so können beide Einzelstränge vermehrt werden, wenn sie als Einzelstrang vorliegen. Falls die Nukleotidsequenzen nicht Bereiche mit gleicher Nukleotidsequenz aufweisen, benötigt man dann vier Adaptoren, die bevorzugt an unterschiedliche, nicht komplementäre Sequenzen binden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat verschiedene Vorteile: Die Reaktionsequenz kann, beispielsweise bei Verwendung des Replikationssystems des Phagen ⌀29, bei einer Temperatur durchgeführt werden; hohe Temperaturen zur Denaturierung sind nicht erforderlich. Die in vitro-Replikation funktioniert mit langen DNS-Fragmenten bis zu 19 kb (mit ⌀29 DNS) und mindestens bis zu 7 kb (M13-Genom) mit heterologer DNS. Im Vergleich dazu ist die Größe der nach EP-A-0201184 amplifizierbaren Sequenzen maximal 3-4 kb.
Die Amplifikationsrate ist theoretisch höher bzw. die Vermehrung der Nukleinsäuren schneller als bei anderen Target- Amplifikationsmethoden. Die Methode ist, da bei 30°C-37°C durchführbar, zur Amplifikation in in situ- Hybridisierungsexperimenten, beispielsweise in Zellabstrichen, fixierten Zellen bzw. Gewebsschnitten, oder an isolierten Chromosomen, anwendbar. Die relativ kurzen Adaptoren diffundieren in Gewebe ähnlich gut wie Oligonukleotide.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Replikation nicht von der Sekundärstruktur des Gesamtkomplexes abhängig ist. Daher ist es möglich, auch lange Nukleinsäuren herzustellen.
Durch Einführung von Restriktionsenzym-Schnittstellen in den Adaptoren zwischen einzelsträngiger Region (spezifisch für Nukleinsäure A) und der für das Replikationssystem spezifischen Region können die entstandenen Produkte z.B. direkt kloniert bzw. sequenziert werden oder als Probe von den Adaptor-Sequenzen freigeschnitten werden. Dies ist mit den Produkten aus Transskriptions-Amplifikationsverfahren nicht möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren ist außerordentlich zeitsparend und äußerst empfindlich. Inklusive Adaptorhybridisierung, gap-filling und Replikation ergibt sich für ein 100-Nukleotide enthaltendes Teilstück der Nukleinsäure A ein Zeitbedarf bis zu ca. 1 h mit einer theoretischen Amplifikationsrate von 2692; Verfahren des Standes der Technik würden hierfür im günstigsten Fall 2-4 h benötigen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Eintopfreaktion geführt werden, bevorzugt über aufeinanderfolgende Zugabe zuerst der Komponenten der gap-filling-Reaktion und dann der Komponenten für die in-vitro Replikation.
Die in der Vermehrungsreaktion entstehenden Nukleinsäuren B, C und D haben bevorzugt die gleiche Länge. Dies ist vorteilhaft, da eine homogene Nukleinsäurepopulation gleichmäßigere Bedingungen für deren Nachweis, beispielsweise bei Hybridisierungen, ermöglicht.
Die Nukleinsäuren B, C und D sind DNS. Dies hat den Vorteil, daß die aus ihnen gebildeten Nukleinsäuren C und D wieder als Templat für Bildung von D und C in der gleichen Reaktion ohne zwischengeschaltete separate Reaktionsschritte benutzt werden können. Dadurch, daß die neu gebildeten Nukleinsäuren B, C und D bereits mindestens eine für das Replikationssystem spezifische Sequenz aufweisen, ist die erneute Zugabe von Adaptoren überflüssig.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung einer Vielzahl von Kopien von Nukleinsäuren A oder Teilen von ihr bzw. dazu komplementären Nukleinsäuren verwendet werden. Dies ist insbesondere in der molekularbiologischen und genetischen Grundlagenforschung, in der klinischen Diagnostik und der Biotechnologie, oder zum Studium von Struktur und Funktionen seltener Gene wichtig.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren A, welches das oben genannte Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren einschließt.
Dazu wird eine Probe, von der vermutet wird, daß sie die nachzuweisende Nukleinsäure enthält, dem oben genannten Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren ausgesetzt, wobei die nachzuweisende Nukleinsäure genauso behandelt wird, wie oben für die Nukleinsäure A beschrieben.
Die Nukleinsäuren B, C und D können dann mit Hilfe von modifizierten oder nicht modifizierten Nukleosidtriphosphaten hergestellt werden. Bevorzugt werden modifizierte Nukleosidtriphosphate eingesetzt. Solche modifizierten Nukleosidtriphosphate sind bekannt. Die Modifikation kann beispielsweise im Ersatz eines oder mehrerer Reste des Nukleosidtriphosphates durch einen radioaktiven, fluoreszierenden, farbigen, immunreaktiven, biospezifisch bindefähigen oder chemisch reaktiven Rest bestehen. Geeignete immunreaktive Reste sind beispielsweise Haptene, wie Digoxigenin oder Sulfonsäurereste biospezifisch bindefähige Reste sind beispielsweise Vitamine, wie Biotin, und ein chemisch reaktiver Rest ist beispielsweise eine zusätzliche Aminogruppe oder Sulfhydrylgruppe, die evtl. über eine Brücke an dem Nukleotidtriphosphat angebracht ist. Im Fall des Einsatzes modifizierter Nukleosidtriphosphate wird zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge der Nukleinsäure A einfach die Menge oder die Anwesenheit der Nukleinsäuren B, C bzw. D über die eingebaute Modifizierung nach Abtrennung nicht umgesetzter Nukleosidtriphosphate bestimmt. Das Vorgehen über Inkorporierung bereits modifizierter Nukleotide ist besonders vorteilhaft, da dann übliche weitere Hybridisierungsschritte mit markierten Nukleinsäuresonden oder Elongationsreaktionen entfallen können.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, in die modifizierte Nukleotidphosphate eingebaut sind, sind bekannt, im Fall der Haptenmarkierung beispielsweise aus der EP-A-03 24 468, im Fall der Biotinmarkierung aus der DE-A-29 15 082.
Bevorzugt werden die hybridisierten Nukleinsäuren dazu an Molekularsieben oder Affinitätsmaterialien, die einen Rest der Nukleinsäure, beispielsweise p3 erkennen und binden, von nicht umgesetzten Komponenten getrennt. Anschließend wird die Menge an Markierung bestimmt.
Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Einsatz nicht modifizierter Nukleosidtriphosphate, die gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D durch Hybridisierung mit einer wenigstens zum Teil dazu im wesentlichen komplementären modifizierten Nukleinsäure nachzuweisen. Diese Nukleinsäuren können nachweisbar sein oder gemacht werden. Auch solche Verfahren sind bekannt. Beispielhaft beschrieben ist ein solches Verfahren in der US-A-43 58 535 oder der EP-A-01 92 168.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren ist wegen des möglichen Einbaus modifizierter Nukleosidtriphosphate auch hervorragend als Verfahren zur Herstellung modifizierter Nukleinsäuren, insbesondere modifizierter DNS geeignet. Solche modifizierten Nukleinsäuren finden als sogenannte Probes in der DNS-Diagnostik Verwendung. Ist die Modifizierung eine nachweisbare Gruppe oder eine Gruppe, die in eine nachweisbare Gruppe umgewandelt werden kann, so erhält man Nukleinsäuren, wie sie als Detektionsprobe beispielsweise in der US-A-43 58 535 eingesetzt werden. Ist die Modifizierung eine bindefähige Gruppe, beispielsweise eine immunreaktive Gruppe oder Biotin, so erhält man Nukleinsäuren, wie sie in der EP-A-00 97 373 beschrieben sind. Sie sind als Fangprobe beispielsweise des in der EP-A-01 39 489 Verfahrens einsetzbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren vereinigt die Vorteile des Verfahrens zur Vermehrung von Nukleinsäuren bzw. Teilen davon mit denen der Markierung während der Vermehrung.
Mit diesem Verfahren können sowohl DNS als auch RNS nachgewiesen werden. Im Falle von RNS ist der Nachweis von rRNS bevorzugt, da hier besonders hohe Empfindlichkeiten bzw. geringe Reaktionszeiten möglich sind. Dadurch wird beispielsweise Speziesdiagnostik möglich. Diese Speziesdiagnostik ist aber auch möglich über bakterienspezifische Gene wie Toxingene oder Pathogenitätsfaktoren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Mutagenese über Mutageneseadaptoren oder über Adaptoren, die im hybridisierenden einzelsträngigen Bereich mindestens einen mismatch haben, oder zum Nachweis von Mutationen über Adaptoren, die im hybridisierenden einzelstränigen Bereich mindestens einen mismatch haben, verwendet werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Nukleinsäuren wird durch die in­ vitro Verwendung des Replikationssystems des Phagen ⌀29 zur Bildung der Nukleinsäure C bzw. D aus dem Komplex der Nukleinsäuren A und B möglich. Dieses Replikationssystem ist beispielsweise in Biochim. Biophys. Act 951 (1988) 417-424 beschrieben.
Zum Start werden zwei Adaptoren zur sequenzspezifischen Amplifikation benutzt. Diese Adaptoren enthalten als Doppelstrang den linken und rechten origin of replication (ori) des Phagen ⌀ 29 und eine einzelsträngige targetspezifische Region. Das Replikationssystem von ⌀29 wurde gewählt, da für die in vitro- Replikation neben den Nukleosidtriphosphaten nur die DNS- Polymerase p2 und ein an den 5′-Enden der Adaptoren korrekt gebundenes Protein p3 und freies p3 sowie dATP notwendig sind. Nach Hybridisierung der Adaptoren wird mit dNTPs und T4-DNA- Polymerase die einzsträngige Lücke zwischen beiden Adaptoren geschlossen und durch E. coli-Ligase zu einem kompletten Strang ligiert. Danach wird mit p2 und p3 die Replikationsreaktion initiiert und mit dNTPs die Replikation durchgeführt. Die ⌀ 29 DNS-Polymerase wird mit EDTA nach entsprechender Reaktionszeit (abhängig von Template-Länge) inhibiert. Die Detektion der Amplifikationsprodukte ist sowohl in Gel unter Hybridisierung mit markierten Nukleinsäureprobes oder durch während der Amplifikationsreaktion eingebaute markierte Nukleotide möglich.
Folgende Bedingungen haben sich als vorteilhaft erwiesen:
Gapfilling-Reaktion:
Konzentration der Adaptoren 100-500 µM;
Temperatur 30-37°C;
Probevolumen 20-50 µl;
Puffersubstanzen, bevorzugt Tris HCl pH 7.5-8.0, 20-100 mM;
Salze, bevorzugt MgCl₂ 2 mM-15 mM, (NH₄)₂SO₄;
Hilfsmittel: DTT 1-10 mM, BSA 50-250 µg/ml;
Nukleosidtriphosphate: 50-250 µM;
Hybridisierungsdauer 5′-15′;
Polymerasen 2-5 U; Ligase 2-5 U, Inkubation 5′-30′.
Replikation:
Volumen 20-50 µl;
p3: 20-400 ng;
p2: 2-300 ng;
Puffer: Tris pH 7.5, 20-100 mM, Salze MgCl₂: 2-15 mM, (NH₄)₂SO₄: 20-50 mM, Hilfsstoffe: Spermidin 1-5 mM. Inkubationszeit 15′ (für sehr kurze Regionen) bis 90′ (für lange Regionen). Nukleotide: wie oben jedoch alternativ: ³²P-dNTPs, Biotin-dNTPs oder Digoxin- dNTPs.
Detektion:
  • a) Agarosegel bei direkter markierter Nukleinsäure,
  • b) Hybridisierung mit radioaktiv oder nicht radioaktiv markierter Probe-DNS, dot, Southern-blot, z. B. an Membranen:
    • 1) Fixierung mit UV, 250 nm
    • 2) Fixierung über Hybridisierung mit wandgebundenen komplementären Nukleinsäuren,
  • oder in Mikrotiterplatten, Tubes (aus Nylon, NC, Kunststoff, Streptavidin-beschichtetem Kunststoff, Säulen oder Beads etc.).
Die angegebenen Werte dienen als Richtwerte. Es ist selbstverständlich, daß ein Fachmann Abwandlungen vornehmen kann.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann theoretisch bis zur Detektion vollständig in einer Lösung ohne Abtrennung irgendwelcher Komponenten geführt werden. Erst dann ist eine Abtrennung überschüssigen Markierungsmittels erforderlich.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind die in den oben genannten Verfahren eingesetzten Adaptoren, bestehend aus mindestens einem einzelsträngigen Nukleinsäurebereich, der im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz einer zu vermehrenden Nukleinsäure, und einem doppelsträngigem Bereich, der eine Sequenz zur Erkennung einer DNS-Polyerase enthält. Bevorzugt sind Adaptoren, die zusätzlich ein Protein gebunden enthalten.
In Fig. 1 und 2 ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren schematisch am Beispiel der proteingeprimten in­ vitro-Replikation mit Hilfe des Replikationssystems des Phagen ⌀29 gezeigt.
Fig. 1 zeigt die Umsetzung von Nukleinsäure A (1) mit zwei Adaptoren (2, 3), die in ihren einzelsträngigen Bereichen (6, 5) mit unterschiedlichen Bereichen der einzelsträngigen Nukleinsäure A hybridisieren. Jeder der Adaptoren 3 und 2 enthält außerdem jeweils eine Nukleotidsequenz zur spezifischen Bindung des Replikationssystems (4, 7). Außerdem ist hier der Fall gezeigt, daß die Adaptoren am 5′-Ende das Protein p3 kovalent gebunden enthält. Durch gap-filling wird der Komplex 8 gebildet.
In Fig. 2 ist die Replikation des Komplexes 8 gezeigt. Durch das Replikationssystem des Phagen ⌀29, welches insbesondere die Proteine p2 und p3 enthält, sowie dATP und die übrigen Nukleosidtriphosphate werden die Nukleinsäuren C bzw. D gebildet, die wiederum Komplexe bilden, die wie Komplex 8 Grundlage für die Replikation sein können. Bei jeder neuen Replikation bilden sich somit neue Nukleinsäuren C und D. Sobald die gewünschte Menge an Nukleinsäuren erreicht ist, kann der Prozeß gestoppt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel 1
Als Adaptoren werden 4 Oliognukleotide verwendet. Der linke Adaptor besteht aus einem Nukleinsäurestrang von 6 nt, wobei 46 nt dem 5′-Ende der linken origin of replication Sequenz von ⌀29 aus PNAS, 78, 2596-2600, 1981; Virology, 155, 474-483, 1986; Gene, 43, 1-11, 1986; NAR, 16/13, 5895-5913, 1988 und 20 nt HBV- spezifischen Sequenzen (EP-B-00 13 828) entsprechen, und einem Gegenstrang zur ori-Region von 46 nt. Der rechte Adaptor besteht aus einem Nukleinsäurestrang von 79 nt, wobei 59 nt dem 3′-Ende der rechten ori-Sequenz von ⌀29 und 20 nt HBV-spezifischen Sequenzen (EP-B-00 13 828) entsprechen, und einem Gegenstrang zur ori-Region von 59 nt. Die HBV-Sequenzen sind komplementär zur einzelsträngigen Region im HBV-Genom und begrenzen einen Bereich von 106 nt.
HBV-Template (HBV-Genom, 0,5 µg-0,5 fg) wird mit den Adaptoren in Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM; MgCl2, 10 mM; (NH4)2 SO4, 20 mM; Dithiothreitol (DTT), 2 mM; Bovinem Serumalbumin (BSA), 200 µg/ml; dATP, 150 µM; dCTP, 150 µM; dGTP, 150 µM; dTTP, 150 µM; NAD, 26 µM; in einem Volumen von 20 µl gemischt, so daß die Adaptoren-Oligonukleotide in einer Konzentration von 250 nM vorliegen. Diese Lösung wird zum Binden der Adaptoren 15′ bei 30°C inkubiert. Zur Auffüllung der Lücke zwischen den beiden gebundenen Adaptoren werden 2 U T4-DNS-Polymerase und 2 U E. coli-DNS-Ligase in 5 µl des oben angegebenen Puffers zugegeben und 10′bei 30°C inkubiert.
Zur Initiation der Replikation (PNAS, 79, 5522-5526, 1982; PNAS, 80, 4282-4252, 1983; PNAS, 81, 5374-5378, 1984; PNAS, 81, 80-84, 1984; PNAS, 82, 6404-6408, 1985; J. Biol. Chem., 264/15, 8935-8940; 1989) werden danach 150 ng des terminalen Proteins von ⌀29 (p3) und 80 ng der ⌀29-Polymerase (p2) in 25 µl Tris HCl, pH 7,5, 50 mM; MgCl2, 10 mM; Spermidin, 2 mM; (NH4)2 SO4, 20 mM; zugefügt und 30′ bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wird mit 10 mM EDTA und 0,1% SDS gestoppt. Zur Detektion werden die Replikationsprodukte in einem 0,8% Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Beispiel 2
Die Adaptoren werden hierzu an den 5′-Enden der ⌀ 29-spezifischen ori-Sequenzen mit dem ⌀29-Protein p3 (aus PNAS, 77, 6425-6428, 1980; NAR 13/21, 7715-7728, 1985; gekoppelt. Die Kopplung von p3 an das spezifische 5′-Ende wird durch in vitro-Replikation des jeweiligen Oligonukleotids zusammen mit seinem Gegenstrang unter den in Beispiel 1 genannten Replikationsbedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotide enthalten als Doppelstrang nur an einem Ende die ori-spezifischen Sequenzen. Daher kann p3 nur hier am 5′-Ende binden, der zweite Strang enthält kein p3-Molekül. Durch Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Antikörpern gegen p3, werden diese Stränge aus dem Gemisch an eine Oberfläche gebunden und nach Auswaschen der p3-freien Stränge eluiert. Die Oberfläche kann dabei mit Streptavidin gesättigt und der <p3<- Antikörper mit Biotin gekoppelt sein. Die Adaptor-p3-Moleküle werden dann wie in Beispiel 1 in die Amplifikationsreaktion mit einer entsprechenden Template DNS eingesetzt. Die Doppelstränge können jedoch auch an Sephadex AcA 500 abgetrennt werden.
Beispiel 3
Die Reaktion wird mit Adaptoren, welche sowohl p3 kovalent gebunden haben oder auch p3 nicht enthalten, wie im Beispiel 1 mit der Adaptor-Hybridisierung gestartet. Die dNTP-Konzentrationen für die Auffüllung der Lücke zwischen linkem und rechtem Adaptor betragen jedoch 33 µM für jedes Deoxynucleotid. Nach Elongation für 10′ bei 30°C werden zur Initiation der Replikation neben den in Beispiel 1 genannten Substanzen 25 µ Ci (a32p) dATP, (= 3000 Ci/mM) und dCTP, dGTP bzw. dTTP, zu je 150 µM zugefügt und ebenso wie in Beispiel 1 inkubiert.
Gestoppt wird die Reaktion wie in Beispiel 1. Die Reaktionsprodukte werden entweder nach Gelelektrophorese als spezifische Schwärzung auf dem Röntgenfilm detektiert oder nach Auftropfen auf Nylonmembranen, Fixierung durch UV-Bestrahlung und Exposition eines Röntgenfilms mit der getrockneten Membran detektiert. Vor dem Auftropfen auf Nylonmembranen werden die Amplifikationsprodukte durch Gelfiltration mit einer Sephadex G- 50-Säule von nichteingebauten dNTPs getrennt und durch Äthanolfällung konzentriert.
Beispiel 4
Die Experimente werden wie in Beispielen 1-3 durchgeführt, für die Hybridisierungsreaktionen der Adaptoren werden jedoch nur die beiden Oligonukleotide, welche dem linken Adaptor entsprechen (+/- p3 kovalent gebunden), und das Oligonukleotid, welches die HBV- spezifische Sequenz und das 3′-Ende der rechten ⌀29 ori-Region enthält, zugefügt. Nach der gap-filling Reaktion wie in Beispielen 1-3 wird mit dem Substanzgemisch zum Start der Replikationsreaktion der Gegenstrangs zur ori-Region zum rechten Adaptor (+/-p3 kovalent gebunden) zugefügt, so daß die Konzentration dieses Oligonukleotids 250 nM beträgt. Inkubation, Reaktionsstopp und Detektion wird wie in den Beispielen 1-3 durchgeführt.
Beispiel 5
32p-markierte Amplifikationsprodukte werden wie in Beispiel 3 durch Gelfiltrationen mit Sephadex G-50 von nicht eingebauten Deoxynucleotiden getrennt. Danach werden die Amplifikationsprodukte durch 10′Inkubation bei 95°C denaturiert und 4 hrs mit 20 ng eines zur amplifizierten Region sequenzhomologen Oligonucleotids von 40 nt, welches mit Biotin markiert ist (EP-A-00 97 373) in 200 µl mit Formamid, 10%; SSC, 5×; Denhardt′sche Lösung, 1×; Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM; in Streptavidin beschichteten Tubes bei 45°C hybridisiert. Die Konzentration des Oligonucleotids beträgt dabei 8 nM. Nach Hybridisierung/Wandbindung wird zweimal 30′bei 37°C mit 200 µl SSC, 2×; und SDS, 0,2%; gewaschen und im Szintillationszähler die gebundenen radioaktiven Amplifikationsprodukte gemessen.
Beispiel 6
Unmarkierte Amplifikationsprodukte, wie in Beispiel 1, 2 oder 4 hergestellt, werden nach Gelfiltration wie in Beispiel 5 sowohl mit einem biotinmarkierten zur amplifizierten Region homologen Oligonucleotid von 40 nt und einem zweiten zu dieser Region homologen Oligonucleotid von 40 nt, welches Digoxigenin-markiert ist, bei 45°C hybridisiert. Dabei zeigen diese Oligonucleotide keine Kreuzhybridisierung. 200 µl Hybridisierungsansatz enthalten die beiden Oligonucleotide, je 8 nM, Formamid, 10%; SSC, 5×; Denhardt′sche Lösung, 1×; Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM. Es wird 4hrs in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten hybridisiert und danach mit Konjugatpuffer (Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM; NaCl, 09%; BSA, 1%; Pluronic T 68, 0,5%) 1× 10′bei 37°C gewaschen. Anschließend wird mit 40 U <Digoxigenin<-Alkalische Phosphatase- Konjugat 30′ bei 37°C inkubiert und danach 5× mit je 200 µl Tris HCl, 100 mM; und NaCl, 150 mM gewaschen. Anschließend wird 30′ bei 37°C mit 4-Methylumbelliferyl-Phosphat (0,1 mM) inkubiert und im Dynatech Microfluor-Reader gemessen.

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren unter Verwendung einer Nukleinsäure A, dadurch gekennzeichnet, daß
  • - die Nukleinsäure A mit mindestens zwei Adaptoren, die jeweils eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche mit jeweils einem Teil eines Stranges der Nukleinsäure A hybridisierbar ist, und von denen mindestens einer eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält, unter Bedingungen umsetzt, bei denen eine zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure A im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure gebildet wird, die außerdem mindestens einen Adaptor enthält, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz aufweist, und
  • - den so gebildeten Komplex aus Nukleinsäure A und der im vorherigen Schritt gebildeten Nukleinsäure unter für eine Replikationsreaktion geeigneten Bedingungen mit einem oder mehreren Proteinen des Replikationssystems umsetzt, die allein oder gemeinsam die Bildung von Nukleinsäuresequenzen katalysieren, welche mindestens die Nukleotidsequenz eines Adaptors, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz sowie eine Nukleotidsequenz enthält, die entweder im wesentlichen homolog oder im wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure A ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Replikation durch mindestens ein Protein initiiert wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bedingungen die zur Bildung der komplementären Nukleinsäure führen, die Verwendung von Nukleosidtriphosphaten, einer DNS-Polymerase und einer Ligase beinhalten.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die vermehrte Nukleinsäure DNS ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleotidtriphosphat mindestens ein modifiziertes Nukleotidtriphosphat eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Adaptoren eingesetzt werden.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Adaptoren im wesentlichen nicht zueinander komplementär sind.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Adaptoren nicht zu den gleichen Nukleotidsequenzen komplementär sind.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Adaptoren zu Nukleotidsequenzen der zur vermehrenden Nukleinsäure komplementär sind, die mindestens 1 Nukleotid voneinander entfernt sind.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Adaptoren jeweils
  • - einen einzelsträngigen Nukleinsäurebereich, der im wesentlichen komplementär zu einem Teil der zu vermehrenden Nukleinsäure ist und mit diesem Teil der Nukleinsäure hybridisieren kann, und
  • - einen doppelsträngigen Nukleinsäurebereich, der im wesentlichen nicht mit der zu vermehrenden Nukleinsäure hybridisieren kann, der jedoch eine Sequenz zur Erkennung des oben genannten Enzyms aufweist, enthalten.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der doppelsträngige Bereich eine ori-Sequenz für die Replikation ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß an den doppelsträngigen Bereich ein oder mehrere Proteine gebunden sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein das Protein p3 des Phagen ⌀29 ist.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eines der zur Bildung von Nukleinsäuren aus dem gebildeten Komplex eingesetzten Proteine eine DNS- Polymerase-Aktivität aufweist.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein das Protein p2 des Phagen ⌀29 ist.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10-15, dadurch gekennzeichnet, daß der Einzelstrangbereich des ersten Adaptors ein freies 3′-Ende aufweist, während der Einzelstrangbereich des zweiten Adaptors ein freies 5′-Ende aufweist.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Adaptoren im doppelsträngigen Bereich eine Restriktionsenzymschnittstelle aufweist.
18. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuren oder Teilen davon und Bestimmung der gebildeten Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß als Vermehrungsverfahren ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 angewendet wird.
19. Adaptornukleinsäure, bestehend aus mindestens einem einzelsträngigen Nukleinsäurebereich, der im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz einer zu vermehrenden Nukleinsäure, und einem doppelsträngigen Bereich, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält.
20. Adaptornukleinsäure gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß an sie ein Protein gebunden ist.
21. Adaptornukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ori-Sequenz des Phagen ⌀29 beinhaltet.
22. Adaptornukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym aufweist.
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