JP2000325079A

JP2000325079A - ｃＤＮＡの５’−キャップ依存的増幅方法

Info

Publication number: JP2000325079A
Application number: JP2000133924A
Authority: JP
Inventors: Manfred W Mueller; ダブリュー．ミュラーマンフレート; Wolfgang M Schmidt; エム．シュミットヴォルフガング
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-02
Publication date: 2000-11-28
Also published as: US6558927B1; EP1072686A2; EP1072686A3; DE19920611A1; US20030203389A1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の目的は、可能である最も簡単な方法
で、かつできる限り効率的に、完全な５’末端を有する
ｃＤＮＡを得るのに用いられる、ｃＤＮＡの修飾、クロ
ーニング又は増幅のためのさらなる方法を提供すること
である。【解決手段】マグネシウム²⁺イオン及びマンガン²⁺イオ
ンの存在下に第一鎖ｃＤＮＡ合成を行う、ｃＤＮＡの修
飾、クローニング又は増幅の方法、並びに第一鎖ｃＤＮ
Ａ合成後に、マンガン²⁺イオンの存在下に直接ｃＤＮＡ
をインキュベートする、ｃＤＮＡの修飾、クローニング
又は増幅の方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸のクローニング
と増幅の分野に属し、５’末端において完全であるｃＤ
ＮＡのクローニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インビボにて転写されたメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分子解析は、通常、いわゆるｃＤ
ＮＡを調製し、クローニングすることにより行なわれ
る。このために、以前単離され、ポリアデニル化された
ｍＲＮＡを、最初にオリゴ−ｄＴプライマーを用いて逆
転写する、すなわち、かかるｍＲＮＡに相補的な一本鎖
ｃＤＮＡに転写する。続いて、前記一本鎖ｃＤＮＡに相
補的な第二鎖を、当業者に公知の方法で重合し、二本鎖
ｃＤＮＡを形成する。慣例の分子生物学的方法〔サムブ
ルーク（Sambrook) 、モレキュラークローニング，ラボ
ラトリーマニュアル（Molecular Cloning, Laboratory
Manual），第２版，第１４章を参照のこと〕を用いてｃ
ＤＮＡ又はｃＤＮＡの一部を増幅及びクローニングした
後、続いてｍＲＮＡの配列を決定することが可能であ
る。しかしながら、この方法の不利な点は、完全な５’
末端を有するｃＤＮＡを同定し、クローン化することが
ほとんど不可能であり、又は非常に低い効率で行なわれ
得るに過ぎないということである。この理由は、分子内
二次構造の形成並びに出発材料の量が制限されＲＮＡ含
量が不充分な程度にあることによる、非効率的な逆転写
反応にある。さらに不利な点は、第二鎖を合成する方法
に起因し、慣例の方法においてｍＲＮＡの末端５’配列
の損失が生ずるということである。

【０００３】この問題を克服するために過去において開
発された種々の方法は、付加的な選抜基準として、完全
なｃＤＮＡの５’末端において生ずる、ｍＲＮＡのキャ
ップ構造を用いることに集約される。これは、７位でメ
チル化され、実際のｍＲＮＡに５’−５’結合により連
結される末端グアノシン残基である。

【０００４】オリゴキャッピング法〔マルヤマ（Maruya
ma）とスガル（Sugaru）、ジーン（Gene） 138,171-17
4,1994 〕においては、キャップ構造を、最初に適切な
ホスファターゼ処理により酵素的に除去し、適切なライ
ゲーション工程でｍＲＮＡの５’末端に連結されるオリ
ゴヌクレオチドで置換する。しかしながら、この方法
は、多くの酵素的な工程及び出発材料として多量のポリ
−Ａ−ｍＲＮＡを必要とする。

【０００５】他の１つの方法、キャップファインダー法
〔クロンテック（Clontech），クロンテクニックス（Cl
ontechniques） 11,1(1996),マレズカ（Maleszka）とス
タンゲ（Stange）、ジーン（Gene） 202,39-43(1997)〕
はいわゆるテンプレートスイッチ効果に導く、逆転写酵
素の末端ターミナルトランスフェラーゼ活性に基づいて
いる：第一鎖ｃＤＮＡ合成において、少数のデオキシ−
シトシン残基が、適切な条件下に、逆転写酵素によりｃ
ＤＮＡの３’末端に選択的に付加される。これは、グア
ノシン残基からなる３’末端を有するいわゆるテンプレ
ートスイッチオリゴヌクレオチドのためのアンカー配列
を生じ、該オリゴヌクレオチドは、アンカー配列にハイ
ブリダイズした後、ｃＤＮＡの第二鎖合成のためのプラ
イマーとして働く。しかしながら、明らかにｍＲＮＡの
７−メチル−グアノシン−キャップ構造にて始まり、シ
トシン残基を付加する逆転写酵素のターミナルトランス
フェラーゼ活性は、以前には詳細に調べられてはおら
ず、それゆえ、ｍＲＮＡテンプレート又はｃＤＮＡ末端
の特定の二次構造の、テンプレートスイッチ活性に対す
る影響は、本発明時には知られておらず、先行技術によ
れば、本反応は非常に低い効率で行なわれ得るに過ぎな
い。

【０００６】別法（国際公開第９７／２６３６８号パン
フレット）においては、適切なアンカー配列は、第一鎖
ｃＤＮＡの３’末端にアンカー配列として２〜４個のリ
ボヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの代わり）
を結合するプロセスにおいて、前記逆転写酵素とは異な
るターミナルトランスフェラーゼ酵素の助けにより合成
される。しかしながら、この方法の不利な点は、ｃＤＮ
Ａ合成を５’−キャップｍＲＮＡについて選択的に行な
うことができないことである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、可能
である最も簡単な方法で、かつできる限り効率的に、完
全な５’末端を有するｃＤＮＡを得るのに用いられる、
ｃＤＮＡの修飾、クローニング又は増幅のためのさらな
る方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
マグネシウム²⁺イオン及びマンガン²⁺イオンの存在下
に第一鎖ｃＤＮＡ合成を行う、ｃＤＮＡの修飾、クロー
ニング又は増幅の方法、（２）第一鎖ｃＤＮＡ合成後
に、マンガン²⁺イオンの存在下に直接ｃＤＮＡをインキ
ュベートする、ｃＤＮＡの修飾、クローニング又は増幅
の方法、（３）ｃＤＮＡ合成の際に、マンガン²⁺イオ
ンの濃度が少なくとも１ｍＭであって、最高でも２０ｍ
Ｍである、前記（１）又は（２）記載の方法、（４）
ｃＤＮＡ合成後、ターミナルトランスフェラーゼの非存
在下に、リボヌクレオチド三リン酸又は修飾ヌクレオチ
ド三リン酸とｃＤＮＡとを反応させる、前記（１）〜
（３）いずれか記載の方法、（５）３’オーバーハン
ギング末端を有し、かつ反応産物の３’末端に相補的で
あるさらなる二本鎖核酸分子に、反応産物を連結する、
前記（４）記載の方法、（６）前記のさらなる核酸分
子がＤＮＡベクター又はアダプター分子である前記
（５）記載の方法、（７）前記のさらなる核酸分子を
反応産物の３’末端にライゲートする前記（５）又は
（６）記載の方法、（８）５〜１０体積％のＤＭＳＯ
の存在下にライゲーションを行う前記（７）記載の方
法、（９）９０％以上の効率で、特異的ライゲーショ
ンを行う前記（８）記載の方法、（１０）固定可能な
基により提供されるプライマーを用いて増幅を行う前記
（７）〜（９）いずれか記載の方法、（１１）前記二
本鎖ＤＮＡアダプター分子が固定可能な基により提供さ
れる前記（７）〜（９）いずれか記載の方法、（１２）
増幅反応を数回行う前記（１０）又は（１１）記載の
方法、（１３）ネスティドＰＣＲを行う前記（７）〜
（１２）いずれか記載の方法、（１４）増幅産物を直
接配列決定する前記（１０）〜（１２）いずれか記載の
方法、（１５）５’−ｄＴ_3-4ｄＧ₃−３’からなる
３’オーバーハングを含む二本鎖ＤＮＡアダプターの混
合物、並びに（１６）５’−ｄＣ_3-4ｒＡ_3-4−３’
からなる、非ｍＲＮＡテンプレートによりコードされる
３’末端を特徴とする第一鎖ｃＤＮＡ、に関する。

【０００９】

【発明の実施の態様】本発明の技術的目的は、デオキシ
−シトシンを用いて第一鎖ｃＤＮＡを伸長するターミナ
ルトランスフェラーゼ反応が、マグネシウム^{2 +}イオン
の存在下並びにマンガン^{2 +}イオンの存在下に逆転写酵
素により行なわれるということで達成される。使用対象
のマンガン濃度は、好ましくは１〜２０ｍＭであり、至
適条件下では８ｍＭである。

【００１０】１つの態様において、マンガン^{2 +}イオン
をｃＤＮＡ第一鎖合成の際に用いられるバッファー系に
予め含有させておくことができる。他方、第一鎖ｃＤＮ
Ａ合成をマンガン^{2 +}イオンの非存在下に行った後、マ
ンガン^{2 +}イオンの存在下にインキュベーションを直接
行なうことができる。かかる場合、最初に用いられた逆
転写酵素は、これらの条件下でなお活性である。

【００１１】このプロセスにおいて、逆転写酵素は、新
規に合成されたｃＤＮＡの３’末端における２〜４個の
デオキシ−シトシン残基の効率的な付加に導くターミナ
ルトランスフェラーゼ活性を顕現する。この反応は、極
めて効率的で、また、ｍＲＮＡテンプレートの５’末端
におけるキャップ構造の存在に依存的である。

【００１２】両態様において、本発明によるＭｎ^{2 +}イ
オンの存在下におけるデオキシ−ヌクレオチドテーリン
グは、テーリング反応の効率を単に高めるだけではな
い。同時に、反応、即ち、ｍＲＮＡテンプレート上の
５’−キャップ構造の存在下における２〜４個のデオキ
シ−シトシン残基の付加の特異性が保持される。

【００１３】使用対象の酵素がいかなるＲＮアーゼＨ活
性をも有すべきでないということのみを除いて、いずれ
の逆転写酵素をも使用できる。

【００１４】いわゆる「アンカープライマー」は、好ま
しくは、２つの部分からなる、第一鎖合成のためのプラ
イマーとして用いられる：いわゆる「アンカー配列」
は、５’末端に位置しており、後に起こる増幅反応にお
いてＰＣＲプライマーのための標的配列として働き得
る。対照的に、３’末端は、同定対象のｍＲＮＡとハイ
ブリダイズし得る配列からなる。これは、例えば、ｍＲ
ＮＡのポリ−Ａテール３’末端とハイブリダイズするオ
リゴ−ｄＴ配列であり得る。

【００１５】本発明によるｃＤＮＡ合成後に、好ましい
態様においては、逆転写酵素とは異なるターミナルトラ
ンスフェラーゼの存在下に、リボヌクレオチド三リン酸
又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド三リン酸若しくは
２’−Ｏ−アミノヌクレオチド三リン酸等の同等の誘導
体と第一鎖ｃＤＮＡとを反応させ、その３’末端にリボ
ヌクレオチド残基のアンカー配列を形成する。特定のリ
ボヌクレオチド三リン酸を用いる場合、かかる反応を制
御リボヌクレオチドテーリング（ＣＴＲＴ）という。該
リボヌクレオチドは、好ましくはＣＴＰではない；ＡＴ
Ｐの使用が特に有利である。

【００１６】本発明はまた、次いで反応産物を、該反応
産物の３’末端に相補的な３’−オーバーハンギング末
端を有するさらなる二本鎖核酸分子に連結する方法に関
する。適切なさらなる二本鎖核酸分子は、例えば、続く
増幅のためのＰＣＲプライマーのための標的配列を有す
る、ＤＮＡベクター又は短いアダプター分子である。

【００１７】さらに、使用対象の二本鎖核酸分子は、増
幅終了後の、続く解析を容易にする配列を含み得る。こ
れらとしては、例えば、原核生物のＴ７、Ｔ３又はＳＰ
６プロモーター等のインビトロでの転写に好適なプロモ
ーター配列及び制限切断部位を挙げることができる。か
かる制限切断部位としては、ＮｏｔＩ等のいわゆるレア
カッター（rare cutter ）酵素のためのレア切断部位が
特に好ましい。

【００１８】かかるさらなる二本鎖核酸分子は、好まし
くは前記反応の産物の３’末端にライゲートされる。こ
れに関連して、第一鎖ｃＤＮＡへのアダプターのハイブ
リダイゼーションは、ＤＭＳＯを含む標準ライゲーショ
ンバッファーの存在下が特に効率的であり、９０％を超
える効率で達成され得ることが判明している。５〜１０
体積％の濃度のＤＭＳＯが有利であることが明らかにな
っている。反応の至適化の際には、７．５体積％の濃度
と決定された。

【００１９】この工程は、アダプター又はベクターの選
抜の結果として、特異的な３’オーバーハングを有する
全長ｃＤＮＡ分子の事実上の選抜を含む。これらのオー
バーハングは、初期に合成された全長ｃＤＮＡの３’末
端に完全に相補的であるということを本質的に特徴とす
る。これは、ＡＴＰをターミナルトランスフェラーゼ反
応に用いる場合、３個のデオキシ−グアノシン残基が続
く３又は４個のデオキシ−チミジン残基からなるオーバ
ーハングにより達成される。

【００２０】逆転写酵素のテーリング反応の際、及び制
御リボヌクレオチドテーリングの際に、各ｃＤＮＡ分子
に付加されるヌクレオチド残基の数は完全には一致しな
いという事実から、アダプターが、３’オーバーハング
が３〜４個のデオキシ−チミジン残基の間で変化してな
り、また可能であれば３〜４個のデオキシ−グアノシン
残基の間で変化してなる分子の混合物からなる場合、そ
れは有利であることが明らかとなっている。

【００２１】その結果、５’−ｄＴ_3-4ｄＧ₃−３’か
らなる３’オーバーハングを含む二本鎖ＤＮＡアダプタ
ーの混合物はまた、本発明の主題である。本発明はま
た、５’−ｄＣ_3-4ｒＡ_3-4−３’からなる、非ｍＲＮ
Ａテンプレートによりコードされる３’末端を有する一
本鎖ｃＤＮＡに関する。

【００２２】ＰＣＲを用いる本発明による続く増幅にお
いて、いくつかの基本方法間で区別することが可能であ
る。

【００２３】Ａ）ｃＤＮＡ遺伝子バンクの構築アダプタープライマー及びいわゆるアンカープライマー
を含有したプライマー対をこのために用いる。前記のよ
うに、使用対象のアダプタープライマーは、二本鎖配列
のＤＮＡアダプター分子を対象とするものである。対照
的に、アンカープライマーの配列は、逆転写酵素反応に
よる第一鎖ｃＤＮＡ合成の際にｃＤＮＡの５’末端に結
合されたアンカー部分に相当する。この方法にて形成さ
れる増幅産物のプールは、潜在的に多数の異なる全長ｃ
ＤＮＡを含んでおり、それを用いて慣用の分子生物学的
方法によりｃＤＮＡ遺伝子バンクを調製し得る。

【００２４】図１は、本発明による方法の概要を示す：
本方法は、逆転写酵素（ＲＴ）による全長第一鎖ｃＤＮ
Ａの３’末端への３〜４個のシトシン残基の５’キャッ
プ依存的付加〔１．、塩化マンガンを含む反応バッファ
ーのインベンティブ（inventive ）な使用を伴う〕を、
酵素ターミナルトランスフェラーゼ及びｒＡＴＰによる
ｃＤＮＡ末端の制御リボヌクレオチドテーリング（ＣＲ
ＴＣ）の技術（２．）と組み合わせる。この方法にて形
成される末端配列モチーフ（５’−ｄＣ₃ｒＡ _3-4）
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる、全長ｃＤＮＡの二本
鎖ＤＮＡアダプター（５’−ｄＴ_3-4ｄＧ₃）への選択
的なライゲーション（３．）を可能にする。この方法
は、ｍＲＮＡの完全な５’配列を含む全長ｃＤＮＡの特
異的な増幅に導く。次いで、ｃＤＮＡバンクを、ＰＣＲ
による適切な増幅の後、構築し得る（５．２．）。

【００２５】Ｂ）部分配列情報が得られ得る特異的ｍＲ
ＮＡの単離と増幅この工程において、いわゆるアダプタープライマー及び
ｍＲＮＡプライマーを増幅のためのプライマーとして用
いる。アダプタープライマーは、二本鎖領域のＤＮＡア
ダプター分子を対象とするものである。対照的に、ｍＲ
ＮＡプライマーは、該ｍＲＮＡの以前既知の配列部分に
相補的である。この方法において得られる増幅産物は、
それらの５’末端において完全であるが、ｍＲＮＡプラ
イマーの選択に依存してそれらの３’末端において特定
の長さが欠失した配列部分を有するｃＤＮＡである。

【００２６】同定対象のｍＲＮＡが弱い発現を示す種で
ある場合、付加的なプライマー対を用いて、ネスティド
ＰＣＲにおいて再度増幅させ得る。かかるプライマー対
の一方のプライマーは、順に二本鎖アダプター配列に対
して適用され、もう一方のプライマーはｍＲＮＡの内部
配列に対して適用される。

【００２７】特定の態様において、アダプタープライマ
ーは、ビオチン等の固定可能な標識を含み得る。その結
果、形成される増幅産物は、ストレプトアビジンでコー
トされた固相に結合され得る。この方法において、増幅
産物を、例えばダイレクトシークエンシングにより、よ
り容易に解析し得る。

【００２８】本発明はさらに、固定可能な基と共に提供
されるプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅する方法に
関する。一方、別の態様においては、二本鎖ＤＮＡアダ
プター分子が固定可能な基と共に提供される。結果とし
て、ｃＤＮＡ依存的に生ずる増幅産物を、さらなる解析
のために固相に結合し得る。

【００２９】本発明はさらに、増幅反応を数回行うこと
を特徴とする特定の方法に関する。この繰り返し増幅
は、ネスティドＰＣＲの形で、いくつかの増幅プライマ
ーを用いて行われ得る。

【００３０】本発明はまた、増幅産物を次いで直接的に
配列決定するインベンティブな方法の特定の態様に関す
る。

【００３１】前記方法に加えて、ディファレンシャルデ
ィスプレー（国際公開第９３／１８１７６号パンフレッ
ト）、遺伝子発現の連続分析（米国特許第５，６９５，
９３７号明細書）、サブトラクティブハイブリダイゼー
ション〔ワング（Wang) ら、プロシーディングオブ
ナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエ
イ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA） 88:11505 (1991)〕
又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼの助けによる線型増幅等の
特殊な解析形式に基づく他の増幅方法はまた、本発明の
主題である。

【００３２】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３３】実施例１：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TMＲＴ
の５’−キャップ依存的ターミナルトランスフェラーゼ
活性ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TMＲＴ（ギブコＢＲＬ社製）の
ターミナルトランスフェラーゼ活性を、標準法により調
製した５’−キャップ（１；４）、５’−リン酸（２；
５）又は５’−ＯＨ（３；６）末端を有する、インビト
ロにて転写した２２６ｎｔＲＮＡ〔ウサギ由来のβ−
グロビン、ＧｅｎＢａｎｋＶ００８８２、ＫｐｎＩと
ＥｃｏＲＩとの間でｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＫＳにお
いてクローン化されたフラグメント（６３３〜１３３５
位）、Ｔ３転写、プラスミドのＮｃｏＩ消化による終
結〕を用いて、下記条件下に試験した。

【００３４】１０μｌ（８ｎｇ／μｌ）ＲＮＡ〔８９ｎｇ〕１μｌ（１μＭ）オリゴ（³²Ｐ−標識）〔各０．０５μＭ〕４μｌ（５×）ＲＴバッファー〔５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ８．３、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂〕１μｌ（１００ｍＭ）ＤＴＴ〔５ｍＭ〕１μｌ（２０×）ＭｎＣｌ₂バッファー〔８ｍＭＭｎＣｌ₂〕１μｌ（１０ｍＭ）ｄＮＴＰ〔０．５ｍＭ〕１μｌ（４０ｕ／μｌ）ＲＮアーゼ阻害剤〔４０ユニット〕１μｌ（２００ｕ／μｌ）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ II ^TM 〔２００ユニット〕全量：２０μｌ

【００３５】β−グロビン特異的５’−末端３２Ｐ標識
２０量体をオリゴヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋＶ０
００８８２、ヌクレオチド６６１〜６８０位）として用
いた。

【００３６】反応混合物を８０℃で３分間変性し、酵素
添加前に３分間４℃でクールショックを与えた。酵素添
加後、混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。
次いで、反応産物を１０％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿
素ゲル上で分離し、ホスファーイメージャー（PhoshorI
mager ）上で定量した。グロビン遺伝子のクローン化フ
ラグメント由来の同じオリゴヌクレオチドにより調製し
た配列を、長さの対照として用いた。その結果を図２に
示す。トランスフェラーゼ活性は、マンガン無添加のＲ
Ｔバッファー（１〜３）において、ヌクレオチドの付加
を１個に制限する；反応は、５’−ＯＨ（２、５７％
＋１）又は５’−リン酸（３、２２％＋１）と比較し
て、５’−ＣＡＰ末端（１、７３％＋１）を有するｍ
ＲＮＡテンプレートにより、より高い進行性で生ずる。
対照的に、塩化マンガンを含むバッファー系（４〜６）
を用いる場合、逆転写酵素のトランスフェラーゼ活性
は、ｍＲＮＡテンプレートの５’末端におけるキャップ
構造に依存的であるだけでなく、より効率的である。＋
２ｎｔを超える分子の割合は９１％である。５’−リン
酸末端（５）の場合における＋１ｎｔのもの５７％と＋
３ｎｔのもの３９％及び５’−ＯＨ末端（６）の場合に
おける＋１ｎｔのもの４０％、＋２ｎｔのもの２２％と
＋３ｎｔのもの３４％と比較して、５’−キャップ末端
（４）の場合、＋３ｎｔのもの４９％と＋４ｎｔのもの
４２％である。

【００３７】他方、反応混合物をさらに１０分間インキ
ュベートする前には、ｃＤＮＡ合成後まで終濃度１０ｍ
Ｍの塩化マンガンを添加しなかった。反応開始時に塩化
マンガンを添加する場合と比較して、テーリング反応の
効率に関して何ら有意な差は見出せなかった。

【００３８】実施例２：５’−キャップ依存的ターミナ
ルトランスフェラーゼ活性：種々のＲＴの比較実施例１に記載の実験を種々の逆転写酵素を用いて繰り
返した。その結果を図３に示す。ＲＮアーゼＨ活性を有
するＲＴ及び該活性を有さないＲＴ〔Ｍｕ−ＭＬＶ
（３、４）とＡＭＶ（５、６）とＥｘｐａｎｄ^TMＲＴ
（１、２）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM（７、８）〕
を、５’−キャップｍＲＮＡテンプレートを用いて、ｃ
ＤＮＡ合成の際のターミナルトランスフェラーゼ活性に
関して比較した。このため、製品の個々の反応バッファ
ーを、その元の形で（１、３、５、７）、又は添加物と
して８ｍＭ塩化マンガンを含んだもの（２、４、６、
８）で試験した。塩化マンガン依存的トランスフェラー
ゼ活性を、ＲＮアーゼＨ欠失酵素の場合においてのみ見
出した。これに関連して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TMと
Ｅｘｐａｎｄ^TMＲＴは、３又は４個のシトシン残基の取
り込み効率に関してのみ僅かに異なっていた〔Ｅｘｐａ
ｎｄ^TMＲＴ（２）：＋３：４３％、＋４：３１％；Ｓｕ
ｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM（８）：＋３：８％、＋４：８１
％〕。

【００３９】実施例３：Ｅｘｐａｎｄ^TMＲＴのターミナ
ルトランスフェラーゼ活性：マンガン依存性実施例１に記載の実験を、Ｅｘｐａｎｄｒｅｖｅｒｓ
ｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ^TM（ロシュモレキュラ
ーバイオケミカルズ社製）と種々の濃度の塩化マンガン
〔０ｍＭ（１）、２ｍＭ（２）、４ｍＭ（３）、８ｍＭ
（４）、１０ｍＭ（５）（ｃＤＮＡ合成後にさらに１５
分間インキュベーションした際）〕を用いて、図４に示
すように繰り返した。第３及び第４のヌクレオチドの取
り込みに関して以下の効率を決定した：２３％（０ｍ
Ｍ）、４３％（２ｍＭ）、６３％（４ｍＭ）、７３％
（８ｍＭ）、７０％（１０ｍＭ、インキュベーション
後）。

【００４０】実施例４：ターミナルトランスフェラーゼ
によるｒＡＴＰ−テーリング（リボテーリング）適切な精製後（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社
製、ハイピュアピュアリフィケーションキット）、実施
例１で本発明により合成したｃＤＮＡを、３７℃で３０
分間、以下の反応混合物においてインキュベートした。

【００４１】２０μｌｃＤＮＡ６μｌ（５×）ＴｄＴバッファー〔２００ｍＭＫ−カコジル酸塩、２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ６．６、０．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ〕３μｌ（２５ｍＭ）ＣｏＣｌ₂ 〔２．５ｍＭ〕０．５μｌ（１０ｍＭ）ＡＴＰ〔１６７μＭ〕０．５μｌ（２５Ｕ／μｌ）ターミナルトランスフェラーゼ〔１２．５ユニット〕全量：３０μｌ

【００４２】反応効率を解析するために、同じ反応条件
下に、ｃＤＮＡの代わりに³²Ｐ標識したデオキシ−オリ
ゴヌクレオチド（２０量体）を用いて、実験を繰り返し
た。その結果を図５に示す。反応産物を２０％ポリアク
リルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分離し、ホスファーイメ
ージャー上で定量した。３個（６４％）、４個（２５
％）又は５個（５％）のアデノシン残基の付加から、全
反応効率は９４％であると決定した。

【００４３】実施例５：アダプターへの選択的ライゲー
ション標準のエタノール沈澱後、ターミナルトランスフェラー
ゼで予め処理したｃＤＮＡを１５μｌの水に再懸濁し、
アダプター分子の集団とライゲートした：該アダプター
は、〔５’−Ｔ_3-4Ｇ₃−３’〕の６〜７個のヌクレオ
チド３’オーバーハングを有する５０塩基対の二本鎖領
域からなった。ライゲーション混合物は以下のように構
成された：

【００４４】１３μｌＡＴＰテール化ｃＤＮＡ２μｌ（５０ｎｇ／μｌ）５６／５７ｂｐアダプター〔１００ｎｇ、３ｐｍｏｌ〕２μｌ（１０×）ライゲーションバッファー〔６６ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ〕１．５μｌＤＭＳＯ〔７．５体積％〕１．５μｌ（１ｕ／μｌ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔１．５ユニット〕全量：２０μｌ

【００４５】アダプターオーバーハングをｃＤＮＡの
３’テール化末端に選択的にハイブリダイズさせるた
め、３７℃で５分間及び２４℃で２分間インキュベーシ
ョン後、該混合物をライゲーションのために１６℃で１
６時間インキュベートした。

【００４６】アダプターへのライゲーションの選択性に
ついても、³²Ｐ標識したオリゴヌクレオチド（２０量
体）を用いるアッセイにおいて試験した。その結果を図
６に示す。適合性３’末端（３’−ＣＣＣ、１〜４）と
非適合性３’末端（３’−ＡＧＣ、５〜８）を有するオ
リゴヌクレオチドとを比較した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３又は７）又は添加物としてさらにＤＭＳＯ（７．５
体積％）（４又は８）を含む標準ライゲーション混合物
中にて、実施例４（１又は６）に記載のｒＡＴＰテーリ
ング後に、オリゴヌクレオチド（１又は５）をアダプタ
ー〔５’−Ｇ₃Ｔ_3- ₄〕へライゲートした。反応産物を
１５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルにて分離し、
ホスファーイメージャー上で定量した。ＤＭＳＯ添加
（４）の結果、ｃＤＮＡフラクションの９３％（標準条
件下に７７％の３と比較して）が適合性３’−末端とラ
イゲートする。さらに、ライゲーション条件は選択的で
ある、即ち、Ｃで終結した分子であっても、バッファー
中ＤＭＳＯを用いて、１４％（７）又は８％（８）だけ
が、これらの条件下でライゲートする。このことは、完
全なｃＤＮＡの選択的な単離を増加させる。

【００４７】実施例６：本発明により調製し、修飾した
ヒトＧＡＰＤＨ−ｃＤＮＡの増幅と５’−ＲＡＣＥによ
る増幅との比較ヒト細胞株ＭＯＬＴ−３〔ＡＴＣＣストレインコレクシ
ョン（strain collec-tion）Ｎｏ．ＣＲＬ−１５５２〕
から単離された種々の量のポリ−Ａ＋ｍＲＮＡ（１０ｎ
ｇ、２．５ｎｇ、０．５ｎｇ、１００ｐｇ、２０ｐｇ）
を用い、本発明による、デオキシ−シトシンテーリン
グ、ｒＡＴＰによるターミナルトランスフェラーゼ反応
及びアダプターによるライゲーションを行い、実施例
１、４及び５に従って、本発明によるｃＤＮＡ合成を行
った。

【００４８】次いで、ＧＡＰＤＨの特異的増幅のため、
以下の条件下にＰＣＲ反応を行った：２μｌ実施例５でのライゲーションのアリコート１μｌ（５０μＭ）プライマーＳＴＩ−２〔１μＭ〕１μｌ（５０μＭ）プライマーＧＡＰＤＨ−２／Ｍ〔１μＭ〕１μｌ（１０ｍＭ）ｄＮＴＰ〔０．５ｍＭ〕５μｌ（１０×）Ｅｘａｐａｎｄ^TMバッファー〔ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製、１．５ｍＭＭｇ⁺⁺含有〕３９．５μｌＨ₂Ｏ０．５μｌ（３．５ｕ／μｌ）Ｅｘａｐａｎｄ^TM 〔ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製〕全量：５０μｌ

【００４９】温度サイクル：１× ３０秒、７２℃ １× ３分、９４℃ ３５× ２０秒、９４℃ ３０秒、６４℃ ４０秒、７２℃ １× ５分、７２℃

【００５０】ＧＡＰＤＨ−２Ｍは、約７０℃の融解温度
Ｔｍ（計算値）を有する、ＧＡＰＤＨ遺伝子のエキソン
４（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃ．Ｎｏ．Ｊ０４０３８）由
来のヌクレオチド８３〜１０６位に相当する２４量体で
ある。ＳＴＩ−２プライマーは２０個のデオキシヌクレ
オチド長を有し、約６９℃の融解温度Ｔｍ（計算値）を
有した。同じ増幅プライマー及び先行技術として既知の
５’ＲＡＣＥ法の増幅プロトコル〔フロフマン（Frohma
nn），M ．(1994) ピイシイアールメソッヅアンドア
プリケーションズ（ PCR Methods and Applications
）, 4, 540-558〕を用い、同等の混合物にてＧＡＰＤ
Ｈを増幅させた。

【００５１】ＰＣＲ産物を１．２５％アガロースゲルに
て分離し、デンシトメトリーにより評価した。図７に示
す結果は、本発明の方法の感度が先行技術の５’ＲＡＣ
Ｅ法よりかなり高いものであることを示している。

【００５２】実施例７：増強ＣＲＴＣによるＰＣＲ増幅
物のダイレクトシークエンシング転写開始の方向にて、ＧＡＰＤＨ遺伝子〔ＧｅｎＢａｎ
ｋａｃｃ．Ｎｏ．Ｊ０４０３８、エルコラニ（Ercola
ni）L.，フローレンス（Florence）B.，デナロ（Denar
o）M.，アレキサンダー（Alexander ）M.；機能的なヒ
トグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子の単離と全配列；ジャーナルオブバイオロジカル
ケミストリー（J. Biol. Chem.） 263:15335-15341 (19
88) 〕のエキソン３由来のヌクレオチド７８〜９７位に
相当するＩＲＤ８００蛍光標識ＧＡＰＤＨプライマーを
用いて、シュミット（Schmitt ）とミューラー（Mulle
r）、ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucl. Acids
Res.） 24, 1789-1791 (1996) に記載のジデオキシ法
の原理に従い、実施例６で本発明により得られた増幅産
物を配列決定した。図８に示すように、かかる配列は、
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の転写開始（矢印）の正確な配置
を示す。

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、非常に容易かつ効率的
に完全な５’末端を有するｃＤＮＡを得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、キャップ選択的ＣＲＴＣのための方法
の概略図である。

【図２】図２は、第一鎖ｃＤＮＡ合成を示す図である。
塩化マンガンの存在下における逆転写酵素の５’−キャ
ップ依存的ターミナルトランスフェラーゼ活性。

【図３】図３は、種々の逆転写酵素による５’−キャッ
プ依存的ターミナルトランスフェラーゼ活性を示す図で
ある。

【図４】図４は、逆転写酵素のターミナルトランスフェ
ラーゼ活性のマンガン依存性を示す図である。

【図５】図５は、ｒＡＴＰによる制御リボヌクレオチド
テーリングを示す図である。

【図６】図６は、全長ｃＤＮＡの選択的ライゲーション
を示す図である。

【図７】図７は、ＰＣＲの助けによるインベンティブな
増幅を示す図である。

【図８】図８は、インベンティブな増幅ｃＤＮＡのダイ
レクトシークエンシングを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヴォルフガングエム．シュミットオーストリア国ウィーンアー−1030 ヘッツガッセ 12／11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マグネシウム²⁺イオン及びマンガン²⁺イ
オンの存在下に第一鎖ｃＤＮＡ合成を行う、ｃＤＮＡの
修飾、クローニング又は増幅の方法。
【請求項２】第一鎖ｃＤＮＡ合成後に、マンガン²⁺イ
オンの存在下に直接ｃＤＮＡをインキュベートする、ｃ
ＤＮＡの修飾、クローニング又は増幅の方法。
【請求項３】ｃＤＮＡ合成の際に、マンガン²⁺イオン
の濃度が少なくとも１ｍＭであって、最高でも２０ｍＭ
である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】ｃＤＮＡ合成後、ターミナルトランスフ
ェラーゼの非存在下に、リボヌクレオチド三リン酸又は
修飾ヌクレオチド三リン酸とｃＤＮＡとを反応させる、
請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】３’オーバーハンギング末端を有し、か
つ反応産物の３’末端に相補的であるさらなる二本鎖核
酸分子に、反応産物を連結する、請求項４記載の方法。
【請求項６】前記のさらなる核酸分子がＤＮＡベクタ
ー又はアダプター分子である請求項５記載の方法。
【請求項７】前記のさらなる核酸分子を反応産物の
３’末端にライゲートする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】５〜１０体積％のＤＭＳＯの存在下にラ
イゲーションを行う請求項７記載の方法。
【請求項９】９０％以上の効率で、特異的ライゲーシ
ョンを行う請求項８記載の方法。
【請求項１０】固定可能な基により提供されるプライ
マーを用いて増幅を行う請求項７〜９いずれか記載の方
法。
【請求項１１】前記二本鎖ＤＮＡアダプター分子が固
定可能な基により提供される請求項７〜９いずれか記載
の方法。
【請求項１２】増幅反応を数回行う請求項１０又は１
１記載の方法。
【請求項１３】ネスティドＰＣＲを行う請求項７〜１
２いずれか記載の方法。
【請求項１４】増幅産物を直接配列決定する請求項１
０〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１５】５’−ｄＴ_3-4ｄＧ₃−３’からなる
３’オーバーハングを含む二本鎖ＤＮＡアダプターの混
合物。
【請求項１６】５’−ｄＣ_3-4ｒＡ_3-4−３’からな
る、非ｍＲＮＡテンプレートによりコードされる３’末
端を特徴とする第一鎖ｃＤＮＡ。