JPH02238882A - ｃＤＮＡ合成方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学に利用されるｃＤＮＡ合成方法及び
キットに関する。

〔従来の技術〕

従来のｃＤＮＡ合成システムは大きく分けてラムダファ
ージベクターにクローニングする方法と直接プラスミド
にクローニングする方法の２つがある。

後者に代表される方法がオカヤマ・バーグ法〔モレキュ
ラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（　Ｍｏ
ｌ．（：ａｌｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　、第２巻、第
１６１頁（１９Ｂ２）　］であり、比較的大きなｃＯＮ
Ａでもクロニングでき、かつ、クローニングされたｃＤ
ＮＡを簡単に回収できる点で大きなメリットを持ってい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしこのシステムに用いるベクター・プライマーを調
製するのに多大の労力と時間を費やし、生産量も少ない
のが欠点である。そこでより迅速にベクター・プライマ
ーを大量生産できる方法としてガイ　ベルメア（　Ｇｕ
ｙ　Ｂｅｌｌｅｍａｒｅ　）らのファ一シミドベクター
を利用した方法がある〔ジーン（．Ｇｅｎｅ　）、第５
２巻、第１１〜ｌ９頁（１９８７））。

この方法では、まずポリ（ｄＴ）テールがクローニング
されたファージミドベクターを環状化１本鎖ＤＮＡとし
て回収し、このＤＮＡに相補的なプライマーを合成し、
アニーリングさせ、部分的に２本鎖ＤＮＡを形成させる
。次に制限酵素によってこの部分を切断し、３′末端に
ボ！Ｉ　（ｄＴ）テールを備えたベクター・プライマー
を調製する。そのベクター・プライマーにポリ（Ａ”）
ｍＲ　Ｎ　Ａをアユリングし逆転写酵素によってｃＤＮ
Ａを合成する。更にアルカリによってＲＮＡ部分を分解
、ＴｄＴによってポリ（ｄＧ）テールを付加し、大腸菌
に形質転換させるための環状化を１本鎮リンカーによっ
て行っている。

このシステムでは逆転写酵素によって合成されるのが、
ＲＮＡを鋳型にした部分のみの場合に環状化することが
できる。しかし本発明者らが追試したところ、逆転写酵
素によりベクタ一部分の相補鎮合成も行われ、リンカー
によって環状化することができず、このシステムは成功
しなかった。

また１本鎖のＤＮＡのまま大腸菌に形質転換すること自
体その形質転換効率を環状２本＃ＪＩ　Ｄ　Ｎ　Ａに比
べ１／１００〜１／１　０　０　０に落としている。

本発明の目的は、これらの課題を解決したｃＤＮＡ合成
方法及びそれに用いるキットを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はｃＤＮＡ合
成方法に関する発明であって、３′末端にポリ　（ｄＴ
）テールを備えた１本鎖のベクター・プライマーとポリ
（ｄＴ）テール領域外の相補＄Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａをあらか
じめアニーリングさせ部分的に２本鎖となつたベクター
・プライマーを調製した後、ポリ（Ａ＋）ｍＲ　Ｎ　Ａ
をアニーリングし、ｃＤＮＡ合成を行い、修飾酵素を作
用させることよりｃＤＮＡを含む２本鎮のベクターＤＮ
Ａを合成した後リガーゼによって環状化し、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作成することを特徴とする。

そして、本発明の第２の発明はキットに関する発明であ
って、上記ｃＤＮＡ合成を行うため少なくとも次のＡ〜
Ｈの試薬： Ａ．３′末端にポＵ　（ｄＴ）テールを備え部分的に２
本鎖となったベクター・プライマー Ｂ，逆転写酵素 Ｃ．ＲＮａｓｅ　Ｈ Ｄ．ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｅ．Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ Ｆ．リガーゼ Ｇ、Ｂ〜Ｆの各修飾酵素に対する濃縮バッファ一Ｈ．　
ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ＴＴ　Ｐを含む
ことを特徴とする。

本発明者らは、前記欠点を改良すべく次のようなｃＤＮ
Ａ合成システムを開発したく第１図》。すなわち、第１
図は本発明方法の一般的な１例を示す工程図である。

ポリ（ｄＴ）テールが３′末端に付加している１本鎖ベ
クター・プライマーとポリ（ｄＴ）テール領域外の相補
鎖ＤＮＡを完全に又は部分的にアニーリングさせ部分的
に２本鎖のベクター・プライマーを調製する。そしてポ
リ（Ａ＋）ｍＲ　Ｎ　Ａをアニーリングし、逆転写酵素
によってｃＤＮＡを合成する。このとき逆転写酵素はポ
！Ｉ　（ｄＴ）領域外に１本鎖の部分が存在していたと
しても相補鎮合成反応を行うが、その活性を促進させる
ためクレノー酵素を加えるのもよい。

次にＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩによってＲＮ
Ａ部分をＤＮＡに変え、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによっ
て２本鎖ＤＮＡの末端を完全にプラントエンド化する。

最後にリガーゼによってセルフライゲーションを行い環
状化し、大腸菌に形質転換する。

本ｃＤＮＡ合成方法は、まずファージミドベクターの使
用により１本鎖のベクター・プライマーが迅速かつ大量
に生産できる点で有利である。更にリンカーを用いるこ
となくｃロＮ八を含むブラスミドを環状化できる。また
オカヤマ・バーグ法及びガイベルメアらの方法では、ｃ
ＤＮＡのＮ末側にボＩＪ（ｄＧ）テールが存在すること
になり、これはジデ才キシシークエンスを行う際この領
域を越えてシークエンスができないという欠点があるが
、本ｃＤＮＡ合成システムではＣロＮ＾のＮ末側にポリ
（ｄＧ）領域は存在しないので、蛋白のＮ末側からのジ
デオキシシークエンスが可能である。また本ｃＤＮＡ合
成方法は、ガイ　ベルメアらの方法のように環状１本Ｉ
ＪＩＤ　ＮＡのまま大腸菌に形質転換するよりも環状２
本鎖ＤＮＡを形質転換することによって、形質転換効率
を１００〜１０００倍に上げることができる。

そのためより多くのｃＤＮＡライブラリーを作ることが
可能である。

本ｃＤＮＡ合成方法に用いるボ！Ｊ’（ｄＴ）テールを
備え部分的に２本鎖のベクター・プライマー、逆転写酵
素、ＲＮａｓｅＨ，　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■、Ｔ　
４　０Ｎ＾ボリメラーゼ、リガーゼ、上記各種修飾酵素
に対応する濃縮バツファ−、ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ，　ｄ
ＧＴＰ，　ＴＴＰをそろえてキットとしておくことで本
ｃＤＮＡ　　合成方法を簡便に行うことができる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例によって限定されるものではない。

実施例１ （１）　　ベクター・プライマーの調製ｐＮｔｌＴ−８
　（第２図にその遺伝地図を示す）を大腸菌Ｍ　Ｖ　１
１８４に形質転換し、アンビシリンを加えた液体培地で
振とう培養し、ＯＤ６００の値が０．３前後になったと
ころでヘルパーファージＭ１　３Ｋ０７を加え、更に２
０時間以上振とう培養した。

遠心にて培養上清を集めポリエチレングリコールを加え
ることによって、ファージのコート蛋白に包まれた１本
鎖ｐＮＵＴ−８を沈殿させた。それをフェノール、クロ
ロホルム処理して１本鎮ＤＮＡを回収した。その結果１
００艷の培養スケールで約４００μｇの１本鎮ρＮｔｌ
Ｔ−１１　　Ｄ　Ｎ　Ａを得ることができた。

次に１６ベースプライマ−５　’　ＧＴＣＧＡＣＴＣＴ
＾６＾＾ＡＡ＾３′を合成し、このブライマー２０００
ｐｍｏｌと環状１本鎮ρＮｔｌＴ−８　　Ｄ　Ｎ　Ａと
をアニーリングし、制限酵素Ｘｂ　Ｉ　　４０００ユニ
ットを用いてアニーリング位置を１か所切断した。この
ＤＮＡから遊離のブライマーを除去し、精製したところ
、３′末端にポリ（ｄＴ）テール２８個が付着した１本
鎖のベクター・プライマーが約３００μｇ得られた。

（２）　１本鎮ベクター・プライマーのボＩＪ　（ｄＴ
）テール領域外の相補鎖ＤＮＡの作成 環状２本鎮ｐＮＵＴ−８　　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｏｏμｇ
をＰｓＴ　１１０００Ｌ　ニット、ＢａｍＨＩ　　１０
００　ユニットを用いて完全分解し、エキソヌクレアー
ゼｌ０００ユニットを加えＢａｍＨ　Ｉによって切断さ
れた３′末端から２本，ｔＪＩＤＮＡが１本＄Ｊｉ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　ニなるようニＤ　Ｎ　Ａを分解した。この１
本鎖ＤＮＡを精製したところ（１）で精製したベクター
・プライマーに相補的な１本鎮ＤＮＡが約４０μｇ得ら
れた。

（３）　　ｃＤＮＡライブラリーの作成（１）で得られ
たポリ（ｄＴ）テールを含む１本ＩＪＩ　Ｄ　ＮＡと（
２）で得られた相補鎮１本鎖ＤＮＡとをアニリングし、
これをベクター・プライマーとしたキット（表１）を利
用してラットの肝臓から得られたポリ（Ａ＋）ｍＲ　Ｎ
　Ａをアニーリングさせ、ｃＤＮＡ合成を行い、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作成した。

表１　　ｃＤＮＡ合成キット（５回分）■．　ポリ（ｄ
Ｔ）テール１本鎖ベクター・プライマー（０．２５μｇ
／μｌ）　　　　２０μｌ４． バツファ一Ｃ ３０００μ！ ５．　逆転写酵素　（２０ユニット／μｌ＞　　１０μ
β６．　　ＲＮａｓｅＨ　　　　　（　４０ユニット／
μＪ！）　　　５μｆ？．ＤＮＡ　ポ　リ　メ　ラ　ー
ゼ　Ｉ　　（Ｄニット／　μ　１　）　　５μ　ｌ８．
　　　７４ＤＮ　　Ａ　ポ　リ　メ　ラ　ーゼ　（１１
ニット／　μ　１　）　　５μ　ｌ９．　　　Ｔ４ＤＮ
Ａ　　リ　ガーゼ　（３５旧ニット／μ　ｉ　）　　　
５０μ　βバツファ一Ａ２μβにベクター・プライマー
溶液４　μ１　（１．０ｕｇ）、ポリ（Ａ”）ｍＲＮＡ
溶液１３μ！（２μｇ）を加え、アニーリングさせた後
、逆転写酵素１μ１（２０ユニット）を加え４２℃、３
０分ｃＤＮＡ合成を行った。

次にバツファ一Ｂ７μｌ、水６０μ！を加え溶かしＲＮ
ａｓｅＨ　ｌμ１　　（４０ユ−ット）ＤＮＡポリメラ
ーゼ１μ１（４ユニット）を加え、１２℃、１時間イン
キユベートし、更に２０℃、１時間インキュベートした
。

次に酵素を失活させるため７０℃、５分加熱し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１μｌ（１ユニット）を加え、３７℃
、５分インキユベートした。フェノール、クロロホルム
処理、イソブロビルアルコール沈殿を行いＤＮＡを精製
、回収した。バツファ一０６００μｌに溶かし、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１０μβ（　３５００ユニット）を加え、
１６℃、１５時間インキユベートし大腸菌に形質転換さ
せた。アンビシリンを含む培地に生育したコロニーの数
を調べることによってライブラリーの大きさを調べた。

（表２）表　　　　２ ２本鎖ｐＮＵＴ−８ベクター・プライマーを用いたｃＤ
ＮＡライブラリー サンプル　　　　　アンビシリン耐性形質転換体（個／
ベクター１μｓ） ラ’７　｝　（７）肝ｆｉ　　　　　　７．２　）＜　
　１０５なおベクター・プライマーの調製からｃＤＮＡ
ライブラリーの作成までを第３図に工程図として示した
。

（３）　　得られたｃＤＮＡのサイズの検定（２）にお
いてｃＤＮＡを含むプラスミドを形質転換させた大腸菌
をアンビシリンを加えた液体培地にて培養し、集菌した
。この菌体ペレットからアルカ！Ｉ−ＳＯＳ法にてブラ
スミドを精製し制限酵素ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩによって
ｃＤＮＡの両端を切断し、アガロースゲル電気泳動を行
いｃＤＮＡのサイズを調べた。

その結果約５ｏｏｂｐから３０００ｂｐ程度のｃＤＮＡ
が合成されていることが判明した。

（４）　　ｃＤＮＡのＮ末からのジデオキシ・シークエ
ンス直鎖状１本鎖ｐＮＩＩＴ−８をベクター・プライマ
ーとするｃＤＮＡ合成システムによって得られたラット
の肝臓のＣロＮ＾ライブラリーからランダムに１０個の
ｃＤＮＡを含むクローンを培養し、ヘルパーファージを
感染させ１本鎮の環状化ＤＮＡを得た。これら鋳型ＤＮ
Ａに対してＳ．Ｐ６プロモーターにアニタングする２４
ベースプライマー： ５’　ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴ
ＡＧ　　３’を用いてジデオキシシークエンシングを行
った。

シークエンス反応にはタカラ（　ＴａＫａＲａ　）　Ｍ
　１　３シークエンスキット（宝酒造製）及びα−３２
Ｐ−ｄＣＴＰを用いた。６％変性ポリアクリルアミドゲ
ルを用い電気泳動し、Ｘ線フィルムによる露光の結果ど
のクローンもｃＤＮＡのＮ末から４００塩基以上塩基配
列を解析することができた。

〔発明の効果〕

本発明によるｃＤＮＡ合成方法はベクター・プライマー
の迅速な大量生産を可能にするという顕著な効果を上げ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の一般的な１例を示す工程図、第２
図はｐＮｔｌＴ−８の遺伝地図、第３図は本発明方法の
１実施例を示す工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、３′末端にポリ（ｄＴ）テールを備えた１本鎖のベ
   クター・プライマーとポリ（ｄＴ）テール領域外の相補
   鎖ＤＮＡをあらかじめアニーリングさせ部分的に２本鎖
   となつたベクター・プライマーを調製した後、ポリ（Ａ
   ＾＋）ｍＲＮＡをアニーリングし、ｃＤＮＡ合成を行い
   、修飾酵素を作用させることによりｃＤＮＡを含む２本
   鎖のベクターＤＮＡを合成した後リガーゼによつて環状
   化し、ｃＤＮＡライブラリーを作成することを特徴とす
   るｃＤＮＡ合成方法。 ２、ｃＤＮＡ合成を行うため少なくとも次のＡ〜Ｈの試
   薬： Ａ、３′末端にポリ（ｄＴ）テールを備え部分的に２本
   鎖となつたベクター・プライマー Ｂ、逆転写酵素 Ｃ、ＲＮａｓｅＨ Ｄ、ＤＮＡポリメラーゼ I Ｅ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ Ｆ、リガーゼ Ｇ、Ｂ〜Ｆの各修飾酵素に対応する濃縮バッファー Ｈ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰを含むこと
   を特徴とするキット。