JP2001526053A - 核酸の製造方法 - Google Patents
核酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
核酸は、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成することにより製造される。一実施態様では、第１のＲＮＡは増幅されたｍＲＮＡであり、５’末端の知られた配列がポリ（Ｔ）配列を含み、付加工程がポリアデニルトランスフェラーゼを用いてポリ（Ａ）配列を３’末端に付加することを含み、そして逆転写工程がポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む複製領域で開始され、ｃＤＮＡは、非共有結合した複製領域で開始するＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ｃＤＮＡに変換され、二本鎖ｃＤＮＡが転写されて１又はそれ以上の第３のＲＮＡが作成される。
Description
【０００１】 開示される出願は、国立保健研究所によって与えられた認可（契約）番号GM07
048、1RO1DC02253及び5F32DC00193-03号の下での政府の援助を得てなされた。政
府はこれらの発明に権利を有する場合がある。
048、1RO1DC02253及び5F32DC00193-03号の下での政府の援助を得てなされた。政
府はこれらの発明に権利を有する場合がある。
【０００２】 （発明の分野） 本発明の分野は、核酸を製造することである。
【０００３】 （背景） 遺伝子発現により細胞を特徴付けする可能性は、治療、診断及びバイオ／メデ
ィカルテクノロジーにおける広範な用途を提供する。しかしながら、これらの用
途の多くにおいて、幹細胞、癌細胞、同定されたニューロン、胚細胞等の出発又
は供給源物質は高度に制限され、標的とするｍＲＮＡ集団を増幅することが必要
となる。かなりの制限を受けているｍＲＮＡ集団を増幅する２つの方法が存在す
る。一方の方法、ブラディ及びイスコブ(Brady & Iscove)の方法（Brady等, 199
0, Method Mol & Cell Biol 2, 17-25）は、ＰＣＲに基づく方法を用いて、短い
（２００−３００塩基対）、極端にはｍＲＮＡの３’断片しか生成しない。第２
の方法であるエベルワインプロトコール(Eberwine等, (1992) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89, 3010-3014)は、連続的な直線状増幅工程を提供し、制限された 材料からｍＲＮＡ集団を増幅するために現在選択されている方法である。にもか
かわらず、このプロトコールは多くの欠点を有している。例えば、増幅された生
成物は多くの外因性ｍＲＮＡのための全長ａＲＮＡを表現せず、よってこの方法
はプローブ又はｃＤＮＡライブラリを生成するための使用は限定されている。
ィカルテクノロジーにおける広範な用途を提供する。しかしながら、これらの用
途の多くにおいて、幹細胞、癌細胞、同定されたニューロン、胚細胞等の出発又
は供給源物質は高度に制限され、標的とするｍＲＮＡ集団を増幅することが必要
となる。かなりの制限を受けているｍＲＮＡ集団を増幅する２つの方法が存在す
る。一方の方法、ブラディ及びイスコブ(Brady & Iscove)の方法（Brady等, 199
0, Method Mol & Cell Biol 2, 17-25）は、ＰＣＲに基づく方法を用いて、短い
（２００−３００塩基対）、極端にはｍＲＮＡの３’断片しか生成しない。第２
の方法であるエベルワインプロトコール(Eberwine等, (1992) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89, 3010-3014)は、連続的な直線状増幅工程を提供し、制限された 材料からｍＲＮＡ集団を増幅するために現在選択されている方法である。にもか
かわらず、このプロトコールは多くの欠点を有している。例えば、増幅された生
成物は多くの外因性ｍＲＮＡのための全長ａＲＮＡを表現せず、よってこの方法
はプローブ又はｃＤＮＡライブラリを生成するための使用は限定されている。
【０００４】 （関連文献） Sippel (1973) Eur. J. Biochem. 37, 31-40は、大腸菌からのＡＴＰ：ＲＮＡ
アデニルトランスフェラーゼの特徴付けを開示し、Wittmann等 (1997) Biochim.
Biophys. Acta 1350, 293-305は哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼの特徴付けを
開示している。Ghthing等 (1980) Nature 287, 301-306は、全インフルエンザウ
イルスＲＮＡの’３末端のポリアデニル化へのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランス
フェラーゼの使用を開示している。Eberwine等 (1996) 米国特許第5,514,545号 は、ＲＮＡ増幅に基づく単一細胞の特徴付け方法を記載している。Eberwine等 (
1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014は、単一生ニューロンにおけ
る遺伝子発現の分析を記載している。Gubler U 及び Hoffman BJ. (1983) Gene
(2-3), 263-9は、ｃＤＮＡライブラリの作成方法を記載しており、より最近の概
説は、Gubler (1987) Methods in Enzymology, 152, 325-329及びGulber (1987)
Methods in Enzymology, 152, 330-335 を参照のこと。Clontech (Palo Alto,
CA)は、逆転写酵素によりキャップされた新生ｃＤＮＡに対する「ＧＧＧ」プラ イマーを用いる「キャップファインダー」クローニングキットを製造しており、
Clontechniques, 11, 2-3 (Oct 1996)、Maleszka等 (1997) Gene 202, 39-43も 参照のこと。
アデニルトランスフェラーゼの特徴付けを開示し、Wittmann等 (1997) Biochim.
Biophys. Acta 1350, 293-305は哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼの特徴付けを
開示している。Ghthing等 (1980) Nature 287, 301-306は、全インフルエンザウ
イルスＲＮＡの’３末端のポリアデニル化へのＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランス
フェラーゼの使用を開示している。Eberwine等 (1996) 米国特許第5,514,545号 は、ＲＮＡ増幅に基づく単一細胞の特徴付け方法を記載している。Eberwine等 (
1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3010-3014は、単一生ニューロンにおけ
る遺伝子発現の分析を記載している。Gubler U 及び Hoffman BJ. (1983) Gene
(2-3), 263-9は、ｃＤＮＡライブラリの作成方法を記載しており、より最近の概
説は、Gubler (1987) Methods in Enzymology, 152, 325-329及びGulber (1987)
Methods in Enzymology, 152, 330-335 を参照のこと。Clontech (Palo Alto,
CA)は、逆転写酵素によりキャップされた新生ｃＤＮＡに対する「ＧＧＧ」プラ イマーを用いる「キャップファインダー」クローニングキットを製造しており、
Clontechniques, 11, 2-3 (Oct 1996)、Maleszka等 (1997) Gene 202, 39-43も 参照のこと。
【０００５】 （発明の概要） 本発明は、核酸を製造するための方法及び組成物を提供する。一般的な方法は
、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡ種の３’末端に知られた核酸配列
を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形
成する工程を含む。一実施態様によれば、第１のＲＮＡは増幅されたｍＲＮＡで
あり、５’末端の知られた配列がポリ（Ｔ）配列を含み、付加工程がポリアデニ
ルトランスフェラーゼを用いてポリ（Ａ）配列を３’末端に付加することを含み
、そして逆転写工程がポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を
含む複製領域で開始される。得られたｃＤＮＡ転写物は、一本鎖であり、第２の
ＲＮＡから単離され、場合によっては二本鎖ｃＤＮＡに、好ましくは非共有結合
した複製領域で開始するＤＮＡポリメラーゼによって変換されてもよい。またｃ
ＤＮＡは、転写されて１又はそれ以上の第３のＲＮＡを形成してもよい。他の実
施態様では、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合した
ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成
させ、そのｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、その一本鎖ｃＤＮＡ
を二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そしてその二本鎖ｃＤＮＡを転写して第１のＲＮＡ
を作成することによるｍＲＮＡの増幅により第１のＲＮＡが製造される。
、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡ種の３’末端に知られた核酸配列
を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形
成する工程を含む。一実施態様によれば、第１のＲＮＡは増幅されたｍＲＮＡで
あり、５’末端の知られた配列がポリ（Ｔ）配列を含み、付加工程がポリアデニ
ルトランスフェラーゼを用いてポリ（Ａ）配列を３’末端に付加することを含み
、そして逆転写工程がポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を
含む複製領域で開始される。得られたｃＤＮＡ転写物は、一本鎖であり、第２の
ＲＮＡから単離され、場合によっては二本鎖ｃＤＮＡに、好ましくは非共有結合
した複製領域で開始するＤＮＡポリメラーゼによって変換されてもよい。またｃ
ＤＮＡは、転写されて１又はそれ以上の第３のＲＮＡを形成してもよい。他の実
施態様では、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合した
ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成
させ、そのｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、その一本鎖ｃＤＮＡ
を二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そしてその二本鎖ｃＤＮＡを転写して第１のＲＮＡ
を作成することによるｍＲＮＡの増幅により第１のＲＮＡが製造される。
【０００６】 （本発明の好ましい実施態様の詳細な説明） 以下の好ましい実施態様及び実施例は、例示のために提供され、何ら限定する
ものではない。
ものではない。
【０００７】 一般的な方法は、５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３’末端に知
られたヌクレオチド配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを
逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む。第１のＲＮＡの５’末端における知
られた配列は、プライマーに標的を提供するのに十分である他に大きくは出発物
質の性質で定義される。例えば、出発物質がｍＲＮＡである場合、５’末端の知
られた配列はポリ（Ａ）配列及び／又は（ｂ）ｍＲＮＡの内部ｍＲＮＡ配列を含
み得る。あるいは、出発物質が増幅されたＲＮＡ、又はａＲＮＡである場合、知
られた配列はポリ（Ｔ）配列又は知られたｍＲＮＡ内部配列の補体を含み得る。
知られた５’配列は、有利には、プライマー標的部位、ＲＮＡポリメラーゼ部位
などの付加的配列を含んでよい。例えば、ポリ（Ｔ）配列などのプライマー標的
部位及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の両方が存在すると、下流側増幅
又は転写の機会を増加させる（図２及び以下の関連する文を参照）。
られたヌクレオチド配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを
逆転写してｃＤＮＡを形成する工程を含む。第１のＲＮＡの５’末端における知
られた配列は、プライマーに標的を提供するのに十分である他に大きくは出発物
質の性質で定義される。例えば、出発物質がｍＲＮＡである場合、５’末端の知
られた配列はポリ（Ａ）配列及び／又は（ｂ）ｍＲＮＡの内部ｍＲＮＡ配列を含
み得る。あるいは、出発物質が増幅されたＲＮＡ、又はａＲＮＡである場合、知
られた配列はポリ（Ｔ）配列又は知られたｍＲＮＡ内部配列の補体を含み得る。
知られた５’配列は、有利には、プライマー標的部位、ＲＮＡポリメラーゼ部位
などの付加的配列を含んでよい。例えば、ポリ（Ｔ）配列などのプライマー標的
部位及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の両方が存在すると、下流側増幅
又は転写の機会を増加させる（図２及び以下の関連する文を参照）。
【０００８】 付加工程は、任意の従来方法によって行ってよい。例えば、ポリアデニルトラ
ンスフェラーゼ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼは、選択されたヌクレオチドを３’
末端に付加するのに用いられる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、広範な原核生物及
び真核生物供給源から誘導され、商業的に入手可能で良く特徴付けされている。
他の例では、１又はそれ以上の選択されたオリゴヌクレオチドを付加するのにリ
ガーゼが用いられる。これらの酵素は同様に、種々の供給源から容易かつ広く入
手可能であり、良く特徴付けされている。
ンスフェラーゼ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼは、選択されたヌクレオチドを３’
末端に付加するのに用いられる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、広範な原核生物及
び真核生物供給源から誘導され、商業的に入手可能で良く特徴付けされている。
他の例では、１又はそれ以上の選択されたオリゴヌクレオチドを付加するのにリ
ガーゼが用いられる。これらの酵素は同様に、種々の供給源から容易かつ広く入
手可能であり、良く特徴付けされている。
【０００９】 付加される知られた３’配列は同様に、プライマーに標的を提供するのに十分
である他に付加された知られた配列の性質は付加方法によってのみ制限される便
宜的事項である。例えば、リガーゼ媒介オリゴヌクレオチド付加を用いると、標
的として用いられ得る本質的に任意の知られた配列が３’末端に付加される。ポ
リアデニルトランスフェラーゼ媒介付加では、一般にポリ（Ｎ）配列の付加がよ
り便利であり、ポリ（Ａ）配列を添加するときは最適な効果を示す多くのそのよ
うなトランスフェラーゼである。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加につ
いては、付加される配列は一般に５から５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは６
から２５ヌクレオチドの範囲、より好ましくは７から１５ヌクレオチドの範囲で
ある。
である他に付加された知られた配列の性質は付加方法によってのみ制限される便
宜的事項である。例えば、リガーゼ媒介オリゴヌクレオチド付加を用いると、標
的として用いられ得る本質的に任意の知られた配列が３’末端に付加される。ポ
リアデニルトランスフェラーゼ媒介付加では、一般にポリ（Ｎ）配列の付加がよ
り便利であり、ポリ（Ａ）配列を添加するときは最適な効果を示す多くのそのよ
うなトランスフェラーゼである。ポリアデニルトランスフェラーゼ媒介付加につ
いては、付加される配列は一般に５から５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは６
から２５ヌクレオチドの範囲、より好ましくは７から１５ヌクレオチドの範囲で
ある。
【００１０】 逆転写工程は、一般的には３’末端配列にハイブリッド形成するのに十分な相
補性を持つプライマーを付加することにより形成された、第２のＲＮＡ種（３’
配列を付加した第１の種）の３’末端又はその近傍の非共有結合複製領域で開始
される。従って、３’末端はポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工程は好ましくはポ
リ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む複製領域で開始され
る。多くの応用では、プライマーは付加的機能配列、例えばＴ７又はＴ３ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターなどの１又はそれ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター配列、１又はそれ以上のプライマー配列などを含む。
補性を持つプライマーを付加することにより形成された、第２のＲＮＡ種（３’
配列を付加した第１の種）の３’末端又はその近傍の非共有結合複製領域で開始
される。従って、３’末端はポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工程は好ましくはポ
リ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む複製領域で開始され
る。多くの応用では、プライマーは付加的機能配列、例えばＴ７又はＴ３ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターなどの１又はそれ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター配列、１又はそれ以上のプライマー配列などを含む。
【００１１】 好ましい実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーター配列であり、少なくとも野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーター配列のヌクレオチド−１７から＋６を含み、上流フランキング配列
、特に上流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列の好ましくは
少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドに結合している。付加
的下流フランキング配列、特に下流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフラン
キング配列、例えばヌクレオチド＋７から＋１０も有利に用いられる。例えば、
特別な一実施態様では、プロモーターは、クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーター配列のヌクレオチド−５０から＋１０を含む。表Ｉは、例示的プロ
モーター配列及びそれらの主題の方法における相対的転写効率を与える（列挙し
たプロモーター配列は、２３ヌクレオチドの天然クラスＩＩＩＴ７プロモーター
上流フランキング配列に結合している）。
リメラーゼプロモーター配列であり、少なくとも野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーター配列のヌクレオチド−１７から＋６を含み、上流フランキング配列
、特に上流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフランキング配列の好ましくは
少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドに結合している。付加
的下流フランキング配列、特に下流Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターフラン
キング配列、例えばヌクレオチド＋７から＋１０も有利に用いられる。例えば、
特別な一実施態様では、プロモーターは、クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーター配列のヌクレオチド−５０から＋１０を含む。表Ｉは、例示的プロ
モーター配列及びそれらの主題の方法における相対的転写効率を与える（列挙し
たプロモーター配列は、２３ヌクレオチドの天然クラスＩＩＩＴ７プロモーター
上流フランキング配列に結合している）。
【００１２】 表Ｉ．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の転写効率 プロモーター配列 転写効率 T AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG A ＋＋＋＋ （配列番号：１、クラスIIIT7RNAホ゜リメラーセ゛フ゜ロモーター） T AAT ACG ACT CAC TAT AGG CGC ＋ （配列番号：２、Eberwine等 (1992) 上掲） T AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG A ＋ （配列番号：３、Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA）
【００１３】 転写されたｃＤＮＡは、当初は一本鎖であり、第２のＲＮＡから広範な確立さ
れた方法によって単離される。例えば、これらの方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅＨ
などのヌクレアーゼ、熱又はアルカリなどの変性剤、及び／又は電気泳動による
鎖の分離で処理することを含む。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は多くの良く確立された
技術によって行ってよく、それらは、３’-末端ヘアピンループプライミング又 は、例えば、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な外来プライマーの付加によ
って、又はホフマン-ガブラー(Hoffman-Gubler)プロトコールに従って形成され た非共有結合複製領域で重合が開始される方法を含む。この後者の実施態様では
、ｃＤＮＡ単離及び二本鎖ｃＤＮＡの変換工程は、例えば、１回のインキュベー
ション工程においてＲＮＡをＲＮａｓｅＨに接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ
ポリメラーゼに接触させて同時に実施してもよい。いずれにしても、これらの方
法は、非常に小さな、例えば単一細胞の出発物質からｃＤＮＡライブラリを作成
するのに用いることができる。
れた方法によって単離される。例えば、これらの方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅＨ
などのヌクレアーゼ、熱又はアルカリなどの変性剤、及び／又は電気泳動による
鎖の分離で処理することを含む。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は多くの良く確立された
技術によって行ってよく、それらは、３’-末端ヘアピンループプライミング又 は、例えば、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端に相補的な外来プライマーの付加によ
って、又はホフマン-ガブラー(Hoffman-Gubler)プロトコールに従って形成され た非共有結合複製領域で重合が開始される方法を含む。この後者の実施態様では
、ｃＤＮＡ単離及び二本鎖ｃＤＮＡの変換工程は、例えば、１回のインキュベー
ション工程においてＲＮＡをＲＮａｓｅＨに接触させ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ
ポリメラーゼに接触させて同時に実施してもよい。いずれにしても、これらの方
法は、非常に小さな、例えば単一細胞の出発物質からｃＤＮＡライブラリを作成
するのに用いることができる。
【００１４】 特別な実施態様では、この方法はさらに、一本又は二本鎖ｃＤＮＡを繰り返し
転写して複数の第３のＲＮＡを作成する、事実上第１のＲＮＡ種を増幅する工程
を含む。好ましい転写条件は、クラスＩＩＩＴ７プロモーター配列（配列番号：
１）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを以下の反応条件下で用いる：４０ｍＭのトリ
スｐＨ７．９、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ
、２ｍＭのＮＴＰ（Pharmacia）、４０単位のＲＮＡｓｉｎ（Promega）、３００
−１０００単位のＴ７RNAポリメラーゼ（６．１６Ｐｒｅｐ）。酵素は、２０ｍ ＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ
のＤＴＴ及び５０％のグリセロール中に、２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及
び３００−３５０単位／μＬの活性で貯蔵する。例示すると、このポリメラーゼ
の１−３μＬが５０μＬ反応に用いられた。テンプレートの出発濃度は、ピコグ
ラム量（単一細胞レベル）から１μｇ又はそれ以上までの直線状プラスミドＤＮ
Ａで変えられる。最終的なＮａＣｌ濃度は、好ましくは６ｍＭを超えない。
転写して複数の第３のＲＮＡを作成する、事実上第１のＲＮＡ種を増幅する工程
を含む。好ましい転写条件は、クラスＩＩＩＴ７プロモーター配列（配列番号：
１）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを以下の反応条件下で用いる：４０ｍＭのトリ
スｐＨ７．９、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ
、２ｍＭのＮＴＰ（Pharmacia）、４０単位のＲＮＡｓｉｎ（Promega）、３００
−１０００単位のＴ７RNAポリメラーゼ（６．１６Ｐｒｅｐ）。酵素は、２０ｍ ＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ
のＤＴＴ及び５０％のグリセロール中に、２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及
び３００−３５０単位／μＬの活性で貯蔵する。例示すると、このポリメラーゼ
の１−３μＬが５０μＬ反応に用いられた。テンプレートの出発濃度は、ピコグ
ラム量（単一細胞レベル）から１μｇ又はそれ以上までの直線状プラスミドＤＮ
Ａで変えられる。最終的なＮａＣｌ濃度は、好ましくは６ｍＭを超えない。
【００１５】 より特別な実施態様では、第１のＲＮＡはＲＮＡ、特にｍＲＮＡの増幅によっ
て作成されたもの自体である。例えば、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ
）尾部にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、
一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして二本鎖ｃＤＮＡを転写して第
１のＲＮＡを作成することによるｍＲＮＡの増幅により作成される。図１は、本
発明のこの一連のｍＲＮＡ増幅例の図であり、以下の各工程を明示している。
て作成されたもの自体である。例えば、第１のＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡのポリ（Ａ
）尾部にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを作成し、
一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そして二本鎖ｃＤＮＡを転写して第
１のＲＮＡを作成することによるｍＲＮＡの増幅により作成される。図１は、本
発明のこの一連のｍＲＮＡ増幅例の図であり、以下の各工程を明示している。
【００１６】 （ａ）５’-Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-オリゴ(ｄＴ)２４-３’か
らなるオリゴヌクレオチドプライマーを、成熟ｍＲＮＡの３’末端に存在するポ
リ（Ａ）トラクトにアニーリングし、逆転写酵素を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合
成してＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドを生成する（ＲＮＡは白抜き枠で、ＤＮＡは 黒塗り枠で表す）；、 （ｂ）ハイブリッドをＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガー
ゼで処理して一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する； （ｃ）このｃＤＮＡから大量の増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成するのに
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる。Eberwine等, PNAS 89: 3010-3014, 1992 に よって利用された変性プロモーター配列に比較したときの改変されたＴ７ポリメ
ラーゼプロモーター配列の我々の配列への取り込みがａＲＮＡの収量を格段に増
大させる； （ｄ）ａＲＮＡにポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）を付随させる。
この改変が、次の工程で元のプロトコールに比較して極めて長い第１のｃＤＮＡ
鎖を生成する； （ｅ）ａＲＮＡの変性及び除去の後、Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-
オリゴ(ｄＴ)プライマーをこの新たに合成したポリ（Ａ）配列にアニーリングし
、第１のｃＤＮＡ鎖を合成するのに逆転写酵素を用いる。第２のｃＤＮＡ鎖及び
ポリメラーゼプロモーターの相補的鎖を（ｂ）のように合成する；そして、 （ｆ）次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡテンプレートから
ａＲＮＡを生成する。
らなるオリゴヌクレオチドプライマーを、成熟ｍＲＮＡの３’末端に存在するポ
リ（Ａ）トラクトにアニーリングし、逆転写酵素を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合
成してＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドを生成する（ＲＮＡは白抜き枠で、ＤＮＡは 黒塗り枠で表す）；、 （ｂ）ハイブリッドをＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガー
ゼで処理して一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する； （ｃ）このｃＤＮＡから大量の増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成するのに
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる。Eberwine等, PNAS 89: 3010-3014, 1992 に よって利用された変性プロモーター配列に比較したときの改変されたＴ７ポリメ
ラーゼプロモーター配列の我々の配列への取り込みがａＲＮＡの収量を格段に増
大させる； （ｄ）ａＲＮＡにポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）を付随させる。
この改変が、次の工程で元のプロトコールに比較して極めて長い第１のｃＤＮＡ
鎖を生成する； （ｅ）ａＲＮＡの変性及び除去の後、Ｔ７-ＲＮＡポリメラーゼプロモーター-
オリゴ(ｄＴ)プライマーをこの新たに合成したポリ（Ａ）配列にアニーリングし
、第１のｃＤＮＡ鎖を合成するのに逆転写酵素を用いる。第２のｃＤＮＡ鎖及び
ポリメラーゼプロモーターの相補的鎖を（ｂ）のように合成する；そして、 （ｆ）次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡテンプレートから
ａＲＮＡを生成する。
【００１７】 他の実施態様は、或る合成工程の間に付加配列の取り込みを含む。これらの配
列は、例えば、増幅したＲＮＡＰＣＲ増幅、第２のｃＤＮＡ鎖全体の合成無しの
直接第２ラウンド増幅などを可能にする。この実施態様は図２に図示する。 （ａ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーもポリ(T)とＴ７配 列との間に異なるＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６で示す；Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
部位も可能である）に対するプライマー部位を含む以外は図１の工程（ａ）と同
じである； （ｂ）これは、図１の工程の（ｂ）である； （ｃ）これは、ａＲＮＡがその５’末端にＲＮＡポリメラーゼ部位を有する以
外は図１の工程（ｃ）と同じである； （ｄ）これは、図１の工程（ｄ）と同じである； （ｅ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のプライミングのために用いるオリゴヌ
クレオチドも、その５’末端にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間プライミン
グ部位として用いるのに好適な付加配列を有している以外は図１の工程（ｅ）と
同じである。また、ＳＰ６又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も第１のｃＤＮＡ鎖
にコピーされることに注意されたい。この第１のｃＤＮＡ鎖が、その５’及び３
’末端の両方に独特な配列を有するので、それは、全ての配列の全増幅のための
ＰＣＲ反応において、ａＲＮＡ合成の他のラウンドを実施するための代替物とし
て直接使用できる。 （ｆ）第１のｃＤＮＡ鎖は、ＳＰ６又は好ましくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部
位の相補的部分を取り込むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりａ
ＲＮＡ合成のために直接使用できる。あるいは、第１のｃＤＮＡ鎖は、第２の鎖
合成を通して二本鎖ｃＤＮＡに変換でき、次いでａＲＮＡ合成が続く。
列は、例えば、増幅したＲＮＡＰＣＲ増幅、第２のｃＤＮＡ鎖全体の合成無しの
直接第２ラウンド増幅などを可能にする。この実施態様は図２に図示する。 （ａ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーもポリ(T)とＴ７配 列との間に異なるＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６で示す；Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
部位も可能である）に対するプライマー部位を含む以外は図１の工程（ａ）と同
じである； （ｂ）これは、図１の工程の（ｂ）である； （ｃ）これは、ａＲＮＡがその５’末端にＲＮＡポリメラーゼ部位を有する以
外は図１の工程（ｃ）と同じである； （ｄ）これは、図１の工程（ｄ）と同じである； （ｅ）これは、第１のｃＤＮＡ鎖合成のプライミングのために用いるオリゴヌ
クレオチドも、その５’末端にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間プライミン
グ部位として用いるのに好適な付加配列を有している以外は図１の工程（ｅ）と
同じである。また、ＳＰ６又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位も第１のｃＤＮＡ鎖
にコピーされることに注意されたい。この第１のｃＤＮＡ鎖が、その５’及び３
’末端の両方に独特な配列を有するので、それは、全ての配列の全増幅のための
ＰＣＲ反応において、ａＲＮＡ合成の他のラウンドを実施するための代替物とし
て直接使用できる。 （ｆ）第１のｃＤＮＡ鎖は、ＳＰ６又は好ましくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部
位の相補的部分を取り込むオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりａ
ＲＮＡ合成のために直接使用できる。あるいは、第１のｃＤＮＡ鎖は、第２の鎖
合成を通して二本鎖ｃＤＮＡに変換でき、次いでａＲＮＡ合成が続く。
【００１８】 この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許
出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているよう
に、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、
例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照
らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それら
にある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。
出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているよう
に、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、
例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照
らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それら
にある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。
【００１９】
【配列表】
【図１】 ｍＲＮＡ増幅のための本発明の一実施態様を示す図である。
【図２】 第２のプロモーター配列を用いた本発明の他の実施態様を示す図
である。
である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１１月２２日（１９９９．１１．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ルー，パーシー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720， バークレー，デプト． オブ モレキュラ ー アンド セル バイオロジー， 205 エルエスエー， ユニバーシティ オブ カリフォルニア，バークレー， (72)発明者 ガイ，ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720， バークレー，デプト． オブ モレキュラ ー アンド セル バイオロジー， 269 エー エルエスエー， ユニバーシティ オブ カリフォルニア，バークレー， (72)発明者 リン，デービッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720， バークレー，デプト． オブ モレキュラ ー アンド セル バイオロジー， 265 エルエスエー， ユニバーシティ オブ カリフォルニア，バークレー， Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA12 FA02 HA19 4B064 AF23 CA21 CC03 CC24 CD15 DA13 DA20
Claims (20)
- 【請求項１】 ５’末端に知られた配列を持つ第１のＲＮＡの３｀末端に知
られた核酸配列を付加して第２のＲＮＡを形成し、当該第２のＲＮＡを逆転写し
てｃＤＮＡを形成する工程を含む核酸の製造方法。 - 【請求項２】 付加工程が、第１のＲＮＡを少なくとも１つの（ａ）ヌクレ
オチド及びポリアデニルトランスフェラーゼ及び（ｂ）オリゴヌクレオチド及び
リガーゼと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ３’末端の知られた配列がポリ（Ａ）配列を含む、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 ５’末端の知られた配列が、少なくとも１つの（ａ）ポリ（
Ｔ）又はポリ（Ａ）配列及び（ｂ）ｍＲＮＡの内部配列又はその補体を含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ５’末端の知られた配列が、ポリ（Ｔ）配列及びＲＮＡポリ
メラーゼプロモーター配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 ３’末端の知られた配列がポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工
程がポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む非共有結合し
た複製領域で開始される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 ３’末端の知られた配列がポリ（Ａ）配列を含み、逆転写工
程がポリ（Ａ）配列にハイブリッド形成したポリ（Ｔ）配列を含む非共有結合し
た複製領域で開始され、前記ポリ（Ｔ）配列がＲＮＡポリメラーゼプロモーター
配列及びプライマー配列の少なくとも１つに共有結合する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項８】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、第２のＲＮＡから単離される、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、第２のＲＮＡから、ＲＮＡをＲＮ
ａｓｅＨ、変性剤、及びアルカリの少なくとも１つに接触させることを含む方法
によって単離される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、二本鎖ｃＤＮＡに変換される、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、二本鎖ｃＤＮＡに変換され、当
該変換が非共有結合した複製領域で開始される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、ＲＮＡをＲＮａｓｅＨに接触さ
せ、一本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼに接触させる工程を含み、それにより
ＤＮＡポリメラーゼが非共有結合した複製領域で変換を開始する方法によって二
本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一
本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマーに接触させる工程を含み、それによりＤ
ＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドプライマーの｀３末
端の非共有結合した複製領域で変換を開始する方法によって二本鎖ｃＤＮＡに変
換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一
本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及びＲＮＡポリメラーゼプロモーターに
接触させる工程を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及びオ
リゴヌクレオチドプライマーの｀３末端の非共有結合した複製領域で変換を開始
する方法によって二本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一
本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及び天然クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーター配列を含むＲＮＡポリメラーゼプロモーターに接触させる工
程を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオ
チドプライマーの｀３末端の非共有結合した複製領域で変換を開始する方法によ
って二本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、ＲＮＡを変性剤に接触させ、一
本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマー及び約３〜１００ヌクレオチドの上流フ
ランキング配列に結合した配列番号：１を含むＲＮＡポリメラーゼプロモーター
に接触させる工程を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ｃＤＮＡ及び
オリゴヌクレオチドプライマーの｀３末端の非共有結合した複製領域で変換を開
始する方法によって二本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 ｃＤＮＡを繰り返し転写して複数の第３のＲＮＡを形成す
る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 ｃＤＮＡが一本鎖であり、二本鎖ｃＤＮＡに変換され、当
該方法が二本鎖ｃＤＮＡを繰り返し転写して複数の第３のＲＮＡを形成する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 第１のＲＮＡがｍＲＮＡの増幅により作成される、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項２０】 第１のＲＮＡが、 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に結合したポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド
をｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部にハイブリッド形成させ、当該ｍＲＮＡを転写して
一本鎖ｃＤＮＡを作成し、当該一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、そし
て当該二本鎖ｃＤＮＡを逆転写して第１のＲＮＡを作成する工程によるｍＲＮＡ
の増幅により作成される、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6958997P | 1997-12-12 | 1997-12-12 | |
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| US09/049,806 US6114152A (en) | 1997-12-12 | 1998-03-27 | Methods for making nucleic acids |
| US09/049,806 | 1998-03-27 | ||
| PCT/US1998/026806 WO1999029907A1 (en) | 1997-12-12 | 1998-12-14 | Methods for making nucleic acids |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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-
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050215 |
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