JP4043516B2 - 全長cDNAクローニングのための方法及び組成物 - Google Patents

全長cDNAクローニングのための方法及び組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP4043516B2
JP4043516B2 JP52464597A JP52464597A JP4043516B2 JP 4043516 B2 JP4043516 B2 JP 4043516B2 JP 52464597 A JP52464597 A JP 52464597A JP 52464597 A JP52464597 A JP 52464597A JP 4043516 B2 JP4043516 B2 JP 4043516B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cdna
oligonucleotide
rna
full
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP52464597A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2000502905A (ja
Inventor
チエンチク,アレックス
ジュー,ヨーク
ディアチェンコ,リューダ
シーバット,ポール
Original Assignee
クロンテック ラボラトリーズ,インク.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by クロンテック ラボラトリーズ,インク. filed Critical クロンテック ラボラトリーズ,インク.
Publication of JP2000502905A publication Critical patent/JP2000502905A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4043516B2 publication Critical patent/JP4043516B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855Ligating adaptors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

関連出願について
本願は1996年1月3日付けで出願された共係属中米国出願No.08/582,562の一部係属出願である。
発明の分野
本願は全長mRNAの完全な配列情報を有する全長cDNAを選択的に合成するためのより改良された技術に関するものである。
発明の背景
分子生物学の基本的な技術はポリ(A)+RNA(mRNA)を適切な宿主細胞内でcDNAライブラリあるいは表現を作るためにクローニング・ベクターに挿入することができる二本鎖相補性DNA(cDNA)に変換することである。cDNAライブラリ構成技術における進歩は広い範囲での生物学的に重要な蛋白質の発見と調製を可能にしてくれている。
Wu編、Methods in Enzymology(1987)、vol.152で、過去15年間に用いられてきたcDNAライブラリを発生させるためのいくつかの手順についての広範な検討が行われている。ほとんどの場合、cDNAライブラリ構成技術は開始物質としてポリ(A)+RNAを用いる。完全なポリ(A)+RNAはその3′末端のポリアデニル化された『末尾』及び5′末端での特徴的な『CAP構造あるいはキャップ・サイト』によって特徴づけられる。cDNAライブラリ構成のための最も重要な必要条件はポリ(A)+RNAを全長cDNAに完全にコピーし、同時にmRNAによってコード表現されたその蛋白質の構造の完全な配列情報を保持することにある。
ポリ(A)+RNAをcDNAにコピーするためのひとつの一般化され、共通に用いられている方法は、オリゴd(T)プライマからのmRNAの3′末端から始まって5′末端までつながりcDNA:mRNAハイブリッド(Gublerら、1983)を発生させる逆トランスクリプターゼを用いる。このRNA鎖はその後RNase Hの作用でそのハイブリッドから取り除かれ、第2のDNA鎖がDNAポリメラーゼIを用いて合成される。その結果できるds cDNA分子の不均一な混合物は種々の技術を用いて適切な遺伝子組換えDNAベクター分子にクローンすることができる。残念なことに、大部分のmRNAの場合、逆トランスクリプターゼが効率的にそれらを全長DNAにコピーすることができないので、この方法では『全長』cDNAを合成することができない。コピー作用の効率はmRNAの長さと逆比例するから、したがって、『全長』cDNA合成の問題はより長いmRNAの場合より深刻になる。さらに、現在の技術はcDNAの5′及び3′末端に欠失を発生させることができる。
別の方法で、mRNA分子のポリ(A)末尾は先ず直線化ベクターDNAとのオリゴ(dT)結合(ベクター・プライマー)にアニーリングされる(Okayamaら、Pruitt, International Patent, Appl. No.89110816.9)。そして、逆トランスクリプターゼで合成されるcDNAの第1の鎖はオリゴdtによって3′末端で終端されているので、ベクター・プライマへのサーキュレーションによるその後のクローニングがより容易になる。この方法は非全長cDNA合成の故に途中で切れたcDNAを含む多数のcDNAクローンも発生させる。
通常のcDNAライブラリを発生させるための現在の技術の使用の欠陥の結果として、ほとんどのcDNAクローンはmRNAの5′末端近くの配列を欠いている。これは機能性蛋白質をつくるために必要な重要な情報の喪失につながる。『全長』cDNAクローニングのためのcDNAライブラリをより豊富にするための努力を通じて2つの選択手順が開発されている。CAP反復手順(CAPture)においては、全長cDNA:mRNAハイブリッドを生成するためにRNase Aと組み合わせてキャップ結合蛋白質(真核開始ファクター4E)が用いられた(Ederyら、1995;Sonenbergら;米国特許No.5,219,989)。非全長cDNAに対応するより短めの二重体が選ばれないのは、mRNAのCAP構造がヌクレアーゼ措置によってRNAモイアティから除外されるからである。
CAPture法は真正の5′末端を含んだクローンのためのcDNAライブラリを豊かにする可能性を持っていたが、全長cDNAの収率は特に長いcDNAの場合非常に低い(1〜5%)。収率の低さはこの技術の場合重大な欠陥である。
『オリゴ−キャッピング』方法においては、mRNAのCAP構造がオリゴリボヌクレオチドと選択的に置換され、従って、後で全長cDNAの合成のために用いられるキメラ性オリゴヌクレオチド/全長mRNA中間物を発生する(Maruyamaら、1994;Fromomt-Racineら、1993;Katoら、国際特許公報No.0 625 572 A1出願番号No.93921061.3)。しかしながら、この方法は複雑で、アルカリ性ホスファターゼによるmRNAの措置、タバコ酸ピロホスホターゼによるmRNAのデキャッピング、そしてT4 RNAリガーゼによるmRNAの5′末端へのオリゴヌクレオチドの結束を含んでいる。これらの複数の酵素ステップはmRNAを劣化させ、それによってその後のクローニング手順のために不完全なcDNAフラグメントを発生させる。『オリゴ−キャッピング』法を用いて発生されたcDNAライブラリ内でのcDNA挿入物のサイズ分布は通常3kb以下である。これは全長mRNAサイズ分布をかなり下回っており(Katoら、1994)、『オリゴ−キャッピング』技術による『全長』クローニングの効率の低さを示している。
上の説明から分かるように、全長cDNAクローンを含むcDNAライブラリを構成する従来の方法は効率の低さ、及び複数の、時間のかかるステップの使用という制約を有している。従って、RNAから質の高い全長cDNAを発生させる単純な方法が非常に望ましい。
発明の要約
本発明はmRNA分子の5′末端の完全な配列に対応する全長cDNAあるいはcDNAフラグメントを合成する有利な方法を提供する。本発明による方法はRNAを、mRNA−cDNAハイブリッドを合成するためにプライマのテンプレート依存延長を行わせるのに十分な条件下で、RNAにアニールできるcDNA合成プライマ、逆トランスクリプターゼ活性を有する適切な酵素、そしてテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを接触させるステップを含んでいる。このテンプレート切換えオリゴヌクレオチドはRNA分子の5′末端でCAPサイトとハイブリダイズし、テンプレート切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的な一本鎖cDNAの3′末端のCAP依存延長のための短い、延長テンプレートとして機能する。その結果作成される全長一本鎖cDNAはRNA分子の完全な5′末端とテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含んでおり、後で行われるcDNA増幅での普遍的プライミング(priming)サイトとしての機能を果たすことができる。
本発明はこの方法に従って用いることができる新しいテンプレート切換えオリゴヌクレオチドにも関係している。このテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを含むキットも本発明の範囲内に含まれている。
【図面の簡単な説明】
図1は本発明によるテンプレート切換え技術のメカニズムを示している。
図2は全長DNAの5′末端配列をクローニングするために本発明による方法と材料を用いた手順を示している。
図3は本発明による全長cDNAライブラリ構成のための本発明によるPCR法及び材料を示している。
図4はPREアダプタ−プライマ戦略に基づいたCAP切換え全長cDNAライブラリ構成技術を示している。
本発明の詳細な開示
本発明はナノグラム程度の量の総又はポリA+RNAからcDNAライブラリを構成するための組成物及び方法に関するものである。この組成物及び方法はここに述べられているテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを用いる。本発明による方法はmRNA:cDNAハイブリッドを発生させるためにアニールされたプライマのテンプレートに依存した延長を可能ならしめるような条件下でRNAをRNAにアニールすることができるプライマ、逆トランスクリプタターゼ、及びテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに接触させるステップを含んでいる。このテンプレート切換えオリゴヌクレオチドはRNA分子の5′末端でCAPサイトにハイブリダイズすることができ、このテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖cDNAの3′末端のCAP依存延長のための短い延長テンプレートとして機能することができる。その結果できる全長一本鎖cDNAはRNA分子の完全な5′末端とテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含んでいる。このテンプレート切換えオリゴヌクレオチド配列はその後で行われるcDNAの増幅における普遍的プライミング・サイトとして機能することができる。
具体的には、本発明はRNAから全長一本鎖(ss)cDNA、あるいは一本鎖cDNAを合成するための方法を提供する。この方法で合成されたcDNAは3′末端に任意のアンカー配列を有しており、その後にmRNAのキャップ・サイトから始まるRNA分子に相補的なヌクレオチド配列が続いている。好ましい実施の形態においては、本発明のプロセスは以下のステップを含んでいる。
1. mRNA:cDNAハイブリッドを発生させるためプライマのテンプレート依存延長を可能ならしめるのに十分な条件の下でmRNAにアニールされるcDNA合成プライマ(CDSプライマ)と逆トランスクリプターゼ活性を有する酵素の存在下でポリ(A)+RNA又は総RNAのサンプルを培養するステップと、
2. 上記ステップ1で得られた第1鎖cDNA合成混合物を、テンプレートとしてテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを用いて逆トランスクリプターゼによる全長cDNAのCAP依存延長を行わせ、それによって上記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を全長一本鎖cDNA(以下の『アンカー化されたcDNA:mRNAハイブリッド』と称する)の3′末端に付加させることができる本発明のテンプレート切換えオリゴヌクレオチド(『CAP切換えヌクレオチドとも呼ばれる)で培養するステップ。このテンプレート切換えオリゴヌクレオチドはその5′末端に予め選択された任意のヌクレオチド配列と3′末端に少なくともひとつのリボグアニンを有している。
この方法のステップ1とステップ2は時間において分離されているだけである。好ましい実施の形態では、ステップ1の後にステップ2が来る。しかしながら、ステップ1からの第1鎖cDNA合成混合物はステップ2で用いられるテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを含んでいる場合もある。また、テンプレート切換えオリゴヌクレオチドを第1鎖cDNA合成の時点、あるいはその後で反応混合物に加えることもできる。ひとつの好ましい実施の形態において、cDNA合成プライマは修正オリゴ(dT)プライマである。
本発明はまた、ステップ2でアンカー化されたcDNA:mRNAハイブリッドをテンプレートとして用いて標的mRNAの5′末端に対応した全長cDNAフラグメントを分離する方法も含んでいる。この方法は上記実施の形態のステップ1及び2を含み、その後に以下に述べるようなステップ3Aあるいはステップ3Bを含んでいる。
3A.ステップ2で発生されたアンカー化されたcDNA:mRNAハイブリッドを(a)上記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と部分的あるいは完全に対応したオリゴヌクレオチド・プライマ、(b)標的mRNAのヌクレオチド配列に対して相捕的なオリゴヌクレオチド・プライマ、及び(c)有効な量のポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行わせるのに必要な他の試薬との組み合わせで培養するステップ。この培養はPCRを行わせ、それによって標的cDNAの5′末端全長プラグメントに対応する増幅生成物を発生させるのに十分な条件下で行われる。
3B.第1のアンカー化されたcDNA鎖をテンプレートとして用いて、第2のcDNA鎖が合成される条件下でステップ2のcDNA:mRNAハイブリッドを措置するステップ。
全長cDNAを含むcDNAライブラリを発生させる方法も本発明の範囲内である。この方法はテンプレートとしてステップ2で発生されたアンカー化されたcDNA:mRNAハイブリッドとして用いる。この方法は上記実施の形態のステップ1及び2を含み、その後以下に述べるようなステップ3C又は3Dが行われる。
3C.ステップ2で発生されたアンカー化cDNA:mRNAハイブリッドをテンプレート切換えオリゴヌクレオチド及びcDNA合成プライマの配列とそれぞれ部分的あるいは完全に対応したプライマ、及び有効な量のPCRを行わせるのに必要な他の試薬との組み合わせで培養するステップ。この培養は全長ds cDNAの代表的ライブラリに対応する増幅生成物を発生するためのPCRを行わせるのに十分な条件下で行われる。
3D.第1のアンカー化cDNA鎖をテンプレートとして用いて第2のcDNA鎖が合成される条件下でステップ2のアンカー化cDNA:mRNAハイブリッドを処理するステップ。
本発明のひとつの側面で、ステップ2又は3で発生されたcDNA生成物は遺伝子組換えクローニング媒体内に挿入することができ、その宿主はこの技術領域で良く知られた従来の方法によってこれらの媒体で形質変換することができる(Kimmelら、1987)。
本発明は通常の方法では合成が困難であった全長cDNAの合成を可能にしてくれる。本発明は上に述べたような新しいステップ2を含んでおり、このステップ2はこの技術領域で良く知られた標準的なcDNA調製/クローニング手順で用いることができる。本発明による方法でのテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの使用はテンプレートRNAの5′末端とは相補的でないcDNAのネガティブ選択を好適に可能にしてくれ、一方全長cDNAは簡単に選択することができる。さらに、この方法はcDNA合成及びクローニングをかなり単純化することができる。本発明によって調製された全長cDNAライブラリから得られたcDNAクローンはその蛋白質の主要構造に関する情報を含んでいるので、本発明は又コード表現された蛋白質を生成するために前記全長cDNAライブラリから得られたクローンを用いるプロセスにも関係している。
別の側面で、本発明はステップ3で発生された生成されるcDNA生成物をcDNA削除方法で用いるための開始物質として用いることもできる方法を提供してくれる。具体的には、本発明による方法はひとつのDNA群(テスター群)には大量に存在しているが、別のDNA群(ドライバー群)ではそれ程大量に存在していないcDNA種を含んだcDNA群を作成するためのcDNA削除背順と組み合わせて用いることができる。好ましくは、本発明の方法および材料によって増幅されたテスター及びドライバーds cDNAはChenchikら(米国特許No.5,563,340)で述べた抑制減算ハイブリダイゼーション技術と組み合わせて用いられる。例えば、Wiglerら(米国特許No.5,436,142);Hampsonら(Nucl. Acids Res. 20:2899(1992));Yangら(Anal. Biochem. 237:109−114(1996));Balzerら(Nucl. Acids Res. 22:2853−2854(1994))その他が述べている減算ハイブリダイゼーションのその他の方法を用いることもできる。
本発明の方法で調製されたds cDNAはハイブリダイゼーション・プローブとしても用いることができる。ここで用いられている『ハイブリダイゼーション・プローブ』という用語は健康な、あるいは病気にかかったり感染された生物から単離された、あるいはChenchikら(米国特許No.5,565,340)が述べているように差し引かれた総RNAからつくられるcDNAは放射性アイソトープ、蛍光物質、及びその他のレポータグループを用いて、通常の化学的あるいは酵素的ラベリング手順によってラベルすることができるという意味である。ラベルされたcDNAは先行技術で公知の標準的なハブリダイゼーション・アッセイで用いることができ、その場合、ラベルされたcDNAは固体表面上で不動態化された一定の組み合わせの遺伝子に対応する明確に定義されたオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチドと上記一定の不動態化された定義済みのオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチドと有するハイブリダイゼーション・プローブ内での一定のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションによって起こされるハイブリダーゼーション・パターンの形成を可能にするのに十分な時間だけ接触させられる。シンチレーション・カウンティング、オートラジオグラフィ、蛍光測定、熱量測定、あるいは光放射測定など利用可能な従来の技術、ラベリング、ハイブリダイゼーション及び検出のための技術と条件については先行技術において公知である(例えば、Maniatisら、1989;Kellerら、1993参照)。
ラベルされたcDNAはひとつの生物の2つの異なった予め決められた状態でそれぞれ異なって表現された遺伝子を特定するためにも用いることができる(例えば、Maniatisら、1989;国際特許WO95/21944参照)。
第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え手順(ステップ2)後に発生された一本鎖cDNA,あるいは5′−RACE増幅ステップ(ステップ3)後に発生されたds cDNAはその分子を含むssあるいはds核酸の混合物あるいはライブラリからの望ましい相補性標的核酸分子を選択的に回収するためのハイブリダイゼーション・プローブとして用いることもできる。上記ハイブリダイゼーション・プローブがハプテニル化され、1996年1月16日付けの米国特許No.5,484,702及び1996年3月19日付けの米国特許No.5,500,356に述べられているようなハイブリダイゼーション方式、あるいは1989年12月19日付けの米国特許No.4,888,274に述べられているようなRecA蛋白質媒介ハイブリダイゼーションに基づく標的核酸分子をより豊富に供給源を獲得するために用いられるための方法。
全長cDNAクローンを含んだcDNAライブラリの調製のために有益なテンプレート切換えあるいは『CAP切換え』オリゴヌクレオチドも本発明の範囲内である。CAP切換えオリゴヌクレオチドは少なくとも2つの機能を有している。ひとつの機能は第1鎖cDNA合成後に全長mRNAの5′末端で発生された逆トランスクリプターゼ−mRNA−cDNAの全長中間物と選択的に相互作用する能力である。本発明によるCAP切換えオリゴヌクレオチドの第2の機能はCAP切換えオリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いての逆トランスクリプターゼによる全長cDNAの5′mRNA末端(ほとんどの場合CAP依存)延長を可能にすることができる上記全長中間物からの逆トランスクリプターゼのための効率的なテンプレートとしての役割である。CAP切換えオリゴヌクレオチドに相補的な配列はそれによって全長cDNAの3′末端に付加することができる。
mRNAのCAP構造への選択的結合にとって利点をもたらすことができるCAP切換えオリゴヌクレオチドの構造又は配列の修正も本発明の範囲内である。例えば、ひとつの修正はmRNAのCAP構造を結合させることができる蛋白質を有する共有結合で結合するCAP切換えオリゴヌクレオチドを含むこともできる(米国特許No.5,219,984参照)。
本発明は具体的には上記の方法の実施形態に関しており、ここでCAP切換えオリゴヌクレオチドは以下の式で示され:
5′-dN1-dN2-...dNm-rN1-rN2...rNn-3′
ここで、dNはdAMP,dCMP,dGMP及びdTMPから選択されるデオキシリボヌクレオチドを示し、mはゼロか又はゼロより大きく、好ましくは10〜50の範囲の整数であり、rNはAMP,CMP、GMP及びUMPから選択されるリボヌクレオチド、好ましくはGMPであり、nは1以上、好ましくは3〜7の範囲の整数である。1〜10ヌクレオチドのランダム・ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、あるいは異なったハプテン基(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びフルオレスセインなど)との置換、一本鎖CAP切換えオリゴヌクレオチド配列5′−dN1−dN2...dNm−rN1−rN2...rNn−3′の延長を含む部分的に二重鎖の構成を有するDNAを用いてのターミネータ・ヌクレオチド(例えば、3′−アミノNMP、3′−ホスフェートNMP、及び3′−フルオロ NMP)の組み込み、制限サイトの組み込み、及びバクテリオファージRNAポリメラーゼに関するプロモータ配列の組み込みなど、後でのcDNAの精製及びクローニングをしやすくしてくれるが、CAP切換えオリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いて逆トランスクリプターゼによる全長cDNAのmRNA 5′末端表現など未修正CAP切換えオリゴヌクレオチドと同じ機能的活性を保持しているCAP切換えオリゴヌクレオチドの構造の修正におけるいくつかの自明で公知のものは本発明の範囲内である。
また、例えばPCR手順で用いるための本発明による新しいオリゴヌクレオチドを含んだライブラリ構成キットなどのcDNAライブラリ構成キットも本発明の範囲内である。
本発明はまた、本発明の方法に従って用いることができる新しいテンプレート切換えオリゴヌクレオチドにも関係している。
さらに、ひとつ、あるいは複数の容器に本発明のテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを入れたキットも本発明の範囲に含まれる。
CAP切換え技術:本発明による方法と素材は主にcDNA合成における独特のCAP切換えオリゴヌクレオチドの使用に基づいている。このcDNA合成は高収率で全長ds cDNAを発生するための第2のステップにおける第2鎖cDNA合成あるいはPCR増幅のいずれかと組み合わせられた逆トランスクリプターゼを用いポリA+RNAから第1鎖cDNAを合成するステップを含むこともできる。第1鎖cDNA合成反応混合物内に含まれた場合、CAP切換えオリゴヌクレオチドは短い延長テンプレートをつくりだす。第1鎖cDNA合成の過程で、逆トランスクリプターゼ酵素はmRNAテンプレートの5′末端で停止する。この5′末端は通常すべての真核mRNAの5′末端上に存在している7−メチルグアノシンCAP構造を含んでいる。そして、この酵素末端トランスフェラーゼ活性は少数の更に別のヌクレオチド、主にデオキシシチジンを新たに合成されたcDNA鎖の3′末端に付加する。その3′末端にオリゴ(rG)配列を有するCAP切換えオリゴヌクレオチドはcDNA鎖上に存在しているヌクレオチドのデオキシシチジンを大量に含んだ部分を有する塩基対で、延長テンプレートをつくりだす。そして、逆トランスクリプターゼはテンプレートを切換え、CAP切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的なcDNAの合成を引き続き行う。その結果できるss cDNAはその3′末端にmRNAの完全な5′末端及びCAP切換えオリゴヌクレオチド配列の両方と相補的な配列を組み込んでいる。
ここに、ドナーとして5′−キャップ全長mRNAを、そしてアクセプタとして化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてのポリ(A)+RNAからの第1鎖cDNA合成の過程での効率的なテンプレート切換え反応を行わせることができるオリゴヌクレオチド構造(CAP切換えオリゴヌクレオチド)が認められる。全長cDNAの3′末端にオリゴヌクレオチド配列を有するキメラ性cDNA生成物が遺伝子固有プライマとテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの一部に対して相補的なプライマの組み合わせを用いた増幅(例えば5′−RACE)によって明らかになった。本発明による、5′末端の任意の配列を、そして3′末端にランダム配列を有する一組のオリゴヌクレオチドは以下のポリヌクレオチド配列で示される。
Figure 0004043516
ここで、d()はデオキシリボヌクレオチド配列を示しており、(N)11及び(N)9はそれぞれ各塩基位置のランダム・デオキシリボヌクレオチド配列11あるいは9塩基長のdAMP,dGMP,dCMP及びdTTPを示しており、r(N)1-16は各塩基位置でのランダム配列1〜16塩基長のAMP,GMP,CMP及びUMPを示している。
4つのヒトcDNA(平滑筋α−アクチン、平滑筋γ−アクチン、シトスケリタルγ−アクチン及びトランスフェリン・リセプタと5′末端にキャップ構造を持っている、あるいは持っていないモデルRNA)の5′末端(5′−RACE)の効率的な増幅と、そしてその後で行われる増幅生成物の配列分析に基づいて、非常に効率的なCAP依存テンプレート切換え反応を発生させるのに用いることができる保存性構造がオリゴヌクレオチドの3′末端に確認されている。このオリゴヌクレオチド配列も保存性及び非保存性領域の突然変異分析(追加的に分析されたCAP切換えオリゴヌクレオチド、配列番号19〜66参照)は最も効率的なCAP依存テンプレート切換えがその5′末端に任意の配列と3′末端の保存性オリゴ・リボ(G)配列を有する基本的なDNA−RNAキメラ性CAP切換えオリゴヌクレオチドを用いた場合に達成されることを明らかにした。このオリゴヌクレオチドは以下の一般式で示され:
5′−dNx−rGy−3′
ここで、rGyはオリゴrG配列3〜5塩基長を示している。オリゴrG配列はCAP切換えオリゴヌクレオチドに関連した主要テンプレート切換え機能に関与している。上記任意のデオキシリボオリゴヌクレオチド配列はその後で行われるcDNA合成及びクローニング・ステップのために有益になるように選択することができる。
加えて、テンプレート切換え反応は第1の鎖の逆転写中に未熟な段階で終端され、従ってmRNA分子の5′末端に対して相補的な配列を持たないcDNAの場合と比較して、mRNAの5′末端に相補的な配列を有するcDNAに対して最も高い効率を示す。mRNAの5′末端のCAP構造の存在はテンプレート切換え反応にとっての必要条件ではなく、テンプレート切換え反応は5′末端上に存在するCAP構造を有するmRNA上で合成された全長DNA生成物に対して最も有効である。
テンプレート切換えオリゴヌクレオチドの構造の修正は本発明の範囲内にあると考えられる。特に、テンプレート切換え効率には影響を及ぼすが、しかしそのテンプレート切換えオリゴヌクレオチドが未修正テンプレート切換えオリゴヌクレオチドとほぼ同じ機能的活性を保持している修正、つまり、オリゴヌクレオチドをテンプレートとして用いた逆トランスクリプターゼによる全長cDNAのCAP依存延長は本発明の意図する範囲内にある。修正オリゴヌクレオチドは未修正CAP切換えオリゴヌクレオチドの代替物として用いることができる。以下のルールは本発明によれば有益であるこうした修正を要約して示している。
1a:より短い(1〜2塩基)オリゴrG3′末端配列、ひとつあるいは複数のrG残基のrA,rC又はrUとの置換、あるいはオリゴrGのオリゴdGとの置換はその塩基構造の効率を低下させ、より長め(7〜9塩基)のオリゴrG配列はテンプレート切換え効率にそれほどの影響は及ぼさない。
1b:アミノ、ビオチン、ホスフェート、あるいはグリコシル各基によるリボース残基の3′−OH基での3′末端の修正はその後に行われるPCR増幅ステップ(ステップ3A)でバックグランドを大幅に低下させる。
1c:テンプレート切換えオリゴヌクレオチドの任意の部分の配列の変更、部分的なあるいは完全なデオキシリボヌクレオチドの制限サイトを含むリボヌクレオチドとの置換はテンプレート切換え効率に大きな影響は及ぼさない。そのテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの3′末端でのより長めの任意の配列(約22〜42塩基)の使用はテンプレート切換えの効率を低下させるが、より短めの配列(約15〜17塩基)の使用はテンプレート切換えの効率をやや増大させるものの、後で行われるPCR増幅ステップ(ステップ3A,3C)の効率を低下させる。
1d:本開示で利点を受ける技術分野の当業者なら本発明のテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの構造のの他の修正が容易に行えることはすぐ分かるであろう。これらの修正はCAP依存テンプレート切換え反応の効率と特殊性を増大させることができる。例えば、アプテイマー(aptamer)(ランダム・オリゴヌクレオチド)選択技術(Kenanら、1994)を用いると、mRNA分子のCAP構造に効率的に結合するテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの任意の部分のルボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドを見つけて、テンプレート切換え反応の効率を増大させることができる。CAP構造に結合するテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの親和性を増大させるために天然のヌクレオチドを修正ヌクレオチドと置換することで同じ結果を達成することができる。
キメラ性蛋白質−テンプレート切換えオリゴヌクレオチドはその蛋白質部分がCAP構造を認識し、それに結合するように構成することができ、それによってテンプレート切換えオリゴヌクレオチドの効率を向上させることができる。これらのキャップ結合蛋白質あるいは蛋白質部分は先行技術において公知であり、好ましくはCAP構造に対する抗体と真核性開始ファクター4E(eIF−4E)を含んでいる。
本発明による方法及び素材を用いることのもうひとつの利点は先行技術で知られている通常のcDNAクローニング手順と共にこの新しい技術を用いることを可能にしてくれるこの手順の高度の柔軟性である。好適に、本発明は従来の手順で用いられている複数の酵素あるいは精製手順の必要性をなくすことができる。本発明は第1鎖cDNA合成の過程でmRNA−cDNAハイブリッドの5′末端へのテンプレート切換えオリゴヌクレオチドのCAPに依存した自動的、及び直接的付加を行うことができるようにしてくれる。さらに、本発明による方法及び組成物はcDNA合成及びクローニングのための技術で公知の手順と組み合わせることも可能である。個々のステップの順序やCDSプライマの正確な構造、そしてcDNAライブラリ構成に用いられるベクターが変更可能であることは当業者には容易に分かるであろう。従って、ここに開示されているmRNA分子の5′末端の完全な相補的ヌクレオチド配列を含んだ全長cDNAあるいはcDNAフラグメントのクローニングを可能にしてくれる方法及び組成物の修正、置換、及び最適化は本発明の範囲に含まれる。以下にRNAから全長cDNAを効率的に発生させる好ましいステップのみについて述べる。
第1鎖cDNA合成:本発明の方法を従来の手順で用いることによって、DNA合成プライマ:mRNAを含むアニール化された複合体を逆転写のためのテンプレートとして用いることによって第1鎖cDNA合成を実行することができる。プライマの延長はその反応を行うのに必要な他の物質:例えば、デオキシリボヌクレオシド・トリホスフェートATP,CTP,GTP及びTTP,Mg2+、最適緩衝液などが十分に存在している条件の下で、逆トランスクリプターゼあるいはDNAポリメラーゼ逆トランスクリプターゼ活性によって触媒することができる。逆トランスクリプターゼ活性を有する種々のDNAポリメラーゼが第1鎖cDNA合成のために用いることができる。本発明による方法で用いることができるDNAポリメターゼの実例としては高温菌及び古細菌、レトロウイルス、イースト、ニューロスポラ、ショウジョウバエ、霊長類、及びゲッ歯類などの生物から誘導されたDNAポリメラーゼを含んでいる。好ましくは、DNAポリメラーゼはMoloneyマウス白血病ウイルス(M−MLV)(米国特許No.4,493,531)あるいはRNaseH活性を欠いたM−MLV逆トランスクリプターゼ(米国特許No.5,405,776)、ヒトT細胞白血病タイプI(HTLV−I)、仔ウシ白血病ウイルス(BLV)、ロウス・サルコーマ・ウイルス(RSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)あるいはテルムス・アクアティカス(Taq:Thermus aquaticus)あるいはテルムス・サーモフィラス(Tth:Thermus thormophilus)(米国特許No.5,322,770)から単離される。これらのDNAポリメラーゼは生物自体から単離したものであってもよいし、いくつかの例では、市販のものを利用してもよい。本発明に従って用いた場合に有益なDNAポリメラーゼはまたポリメラーゼをコード表現するクローンされた遺伝子を表現する細胞から得ることもできる。cDNA合成の開始物質としては、イースト菌及び植物や動物などの高等生物から得たポリ(A)+RNAまたは総RNAを用いることもできる。
本発明による方法の第1鎖cDNA合成ステップは反応混合物内に本発明によるテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを含むこともできるが、第1鎖cDNA合成実行のための必要な成分という訳ではない。テンプレート切換えオリゴヌクレオチドは第一鎖合成ステップの後に来るテンプレート切換えステップの最中に加えることができる。従って、テンプレート切換えオリゴヌクレオチド分子は第1鎖反応組成物内(例えば、cDNA合成プライマのRNAへのアニーリング中、あるいはRNAを逆トランスクリプターゼ活性を有する酵素と接触している時)に加えることができ、あるいは又、オリゴヌクレオチドは、第1鎖cDNA合成反応の過程、あるいはその終了後に加えることができる。
cDNAクローニングのために用いられるべき戦略に基づいて、種々のcDNA合成プライマ構造をポリ(A)+RNAをテンプレートとして用いた第1鎖cDNA合成のために用いることができ、さらに逆トランスクリプターゼ活性で触媒させることができる。cDNA合成プライマは一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド(Colecloughら、1985に述べられているようなプライマ−制限−末端あるいはPRE、アダプタ)、あるいは一本鎖部分を有するdsベクターを示すベクター・プライマ(Okayamaら、1982)のいずれであっても良い。これら3つのケースのすべてで、cDNA合成プライマの一本鎖部分はポリ(A)+RNAとの結合及び第1鎖cDNA合成の開始に関与している。この方法のひとつの好ましい実施の形態においては、全長cDNAライブラリ構成のために、プライマの3′末端にオリゴdT末尾を含んだCDSプライマがmRNAのポリ(A)部分にアニールされる。5′cDNAの急速な増幅あるいはクローニングのため、及び特定の遺伝子の選択的なクローニングのために、CDSプライマはクローンされるべき標的遺伝子の特定の配列に対応したランダム配列あるいは任意の配列を含んでいても良い。
本発明は特に上記の方法の実施の形態に関係しており、これらの実施の形態でCDSプライマは以下のものにアニールされる。
1a.ポリ(A)+RNAのポリ(A)末尾:このcDNA合成プライマは一本鎖オリゴヌクレオチド、いずれかの部分が二本鎖になったDNAフラグメント、あるいはいずれかの直線ベクター・プライマから選択することができる。ひとつの好ましい実施の形態で、オリゴヌクレオチド・プライマは配列:5′−dN1−dN2−...dNm−dTn−dN1−dN2...dNp−3′を有しており、ここで、mは0以上、好ましくは0〜20の整数を示し;nは8以上、好ましくは8〜30の整数を示し;pは好ましくは0〜3の範囲であり、dNはdAMP;dCMP,dGMP及びdTMPから選択され、あるいはそれらの代表的な混合物を示し;dTはdTMPを示している。1〜10のヌクレオチドを種々のハプテン基(ビオチン、ジオキシジェニン、フルオレスセインなど)を含んだヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、リボヌクレオチド、非天然性ヌクレオチドとの置換、制限サイト、バクテリオファージRNAポリメラーゼ・プロモータ領域の組み込みなど、後で行われる精製やcDNAの使用およびクローニングなどをし易くしてくれ、同時にプライマの主要活性、例えばポリ(A)+RNAのポリ(A)部分からのプライミング活性を保持してくれるようなプライマの構造の修正は本発明の範囲に含まれる。部分的に二本鎖になったDNAプライマあるいは上に述べたような一本鎖末尾配列5′−dN1−dN2...dNm−dTn−dN1−dN2−...dNp−3′を有する線形プラスミド・ベクター、及びポリ(A)+RNAのポリ(A)からの単一鎖cDNA合成に関するプライミング活性の使用も本発明の一部とみなされる。クローニング手順を単純化するために、CAP切換えオリゴヌクレオチドはベクター・プライマの他の末端に取り付けることができる。この場合、ベクター・プライマはその一端にCDSプライマに対応する配列を有しており、他端にはCAP切換えオリゴヌクレオチドを有することになる(CAP切換えプライマ技術)。後で行われるcDNA合成及び自動テンプレート切換えはOkayamaら、1982に述べられているように簡単にクローンできるcDNA−ベクター・キメラ性生成物を発生させる。
1b:mRNAの内部非ポリ(A)部分:これらのオリゴヌクレオチド・プライマは一般式dN1−dN2−...dNqで示され、ここでdNはdAMP,dCMP,dGMP及びdTMP、あるいはこれらの塩基のうちの2〜4の混合物から選択されるデオキシリボヌクレオチドを示し,そしてqは6以上、好ましくは6〜50の範囲の整数を示す。これらのプライマはすべてのmRNAにアニールされるランダム配列、少なくとも1つの任意のmRNAにアニールされた任意の配列、あるいは少なくとも1つのmRNAに対して相補的な配列を持つことができる。また、これらのプライマの配列は後で行われる生成又はクローニング手順を容易に行うことができるようにするために制限サイトあるいは修正塩基(例えばビオチニル化されたもの)を含むことができる。
第2鎖cDNA合成及び/又はPCR増幅:CAP切換え技術に基づく第1鎖cDNA合成はその3′末端にCDSプライマが分岐し、さらにその5′末端でCAP切換えオリゴヌクレオチドが分岐した全長(あるいは全長フラグメントの対応する5′末端)mRNA:cDNAハイブリッド分子中間物を発生させる。こうした中間物は後で従来の手順を用いてクローニングを行うのに適したds cDNA形態に簡単に転化することができる。これらの手順は公知であり、以下のステップを含んでいる。
1. mRNA:cDNAハイブリッドのCDS及びCAP切換え部分に対応するPCRプライマと有効量の他の試薬との組み合わせによるPCRを行うのに必要な条件下での全長cDNAの直接増幅。好ましくは、こうした条件とは長い核酸配列の増幅のために開発され、Cheng(国際特許(1995))及びBames(1995年7月25日付け米国特許No.5,436,149)に述べられている条件とする。
2. 基本的にはOkayamaら(1982)及びGublerら(1993)が述べているようなmRNA:cDNAハイブリッドのmRNA部分の第1鎖cDNAとの置換。このプロセスはE.coli RNase HなどのリボヌクレアーゼによるRNAの消化、DNAポリメラーゼIの活性を有するDNAポリメラーゼを用いての修復合成、そして結束などのステップを含んでいる。この手順は第1鎖cDNA合成に用いられるCDSプライマの構造に依存している。第2鎖cDNA合成はテンプレートとしてmRNA:cDNAあるいはmRNA:cDNAベクター・キメラ性生成物を用い、第1鎖合成のためにベクター・プライマを用いて(CAP切換えベクター・プライマ技術、上記参照)実行することができる。また、上に述べたPREアダプタ戦略によって発生されたmRNA:cDNAハイブリッドは少なくともひとつの制限酵素でPREアダプタとCAP切換えオリゴヌクレオチドに対応する5′及び3′側鎖配列で消化して、同じ制限酵素で消化した通常のベクターに結束することができる。それがmRNA:cDNAハイブリッドの内部での切断を行わない限り、どんな酵素でも用いることができる。
ベクターへのクローニング:PREアダプタ戦略に基づいてベクター・プライマ(CAPスイッチ−ベクタープライマ)を用いる場合、第2鎖cDNA合成後に発生されるds cDNAがすでにそのds cDNAに挿入されており、このステップは必要としない。オリゴヌクレオチドCDSプライマが用いられる場合、第2のステップでPCRあるいはmRNA置換戦略でっくられたds cDNAはアダプタと結束するか、あるいはCDS及びCAP切換えオリゴヌクレオチド側鎖部分に対応する配列内で消化酵素によって消化し、それによって、同じ制限酵素によって消化した後にいずれかの従来のクローニング・ベクター(プラスミド、コスミド、ファージ、レトロウイルス・ベクターなどを含む)に結束されるds cDNA分子を発生させることができる。
その後、全長cDNAライブラリを含む遺伝子組換えDNA分子を全長ds cDNAの高頻度クローニング及びそれからの遺伝子組換え蛋白質の表現において有益な原核ホスト、及び場合によっては真核ホスト内に導入することができる。
本発明によってクローニングが行われると、通常の免疫アッセイでその生成物に対してつくられた標識化プローブ、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体によって検出したり、例えば1994年8月9日付け国際特許WO95/04745でLiらによって述べられているハイブリダイゼーション選択方式で増幅させることができる。
要約:cDNA合成及びクローニングでのCAP切換えオリゴヌクレオチドの使用は全長cDNAライブラリ構成の技術を大幅に単純化及び改善してくれる。主要な利点は以下の通りである。
1. 従来のPCRに基づく標準cDNAライブラリ構成技術のために必要なステップの数を大幅に減らしてくれる(5〜7ステップを2〜3ステップに減少)してくれる第1鎖cDNA合成と定義された配列のcDNAの3′末端への取り付けを含む1段階手順。ステップ数が少なくなることは、本発明による新しい方法と物質が従来のcDNA構成法より効率的で、より簡単であり、手間がかからず、そしてより生産性が高いことを意味している。
2. 本発明によれば、CAP依存テンプレート切換えメカニズムは全長cDNAを合成し、全長cDNAを大部分含んだcDNAライブラリを発生させるためのかなり効率的な技術が可能になる。本発明による方法と物質はcDNAライブラリ内にクローンされるべき全長cDNAを簡単に選択するための新しい方法を提供することができる。
ここで用いられている『全長相補的DNA又はcDNA;という用語はmRNAの5′末端の完全な配列情報を含む全長一本鎖(ss)あるいは二本鎖(ds)cDNA又はcDNAフラグメントを意味する。全長cDNAは特定の(標的)mRNAの5′末端、あるいは第1鎖cDNA合成のためのテンプレートとして用いられるポリA+RNAの群全体の完全な配列情報を含むことができる。
ここで用いられている『全長cDNAライブラリ』という用語はテンプレートとしてのポリA+RNAから合成されたss又はds cDNAの群全体を意味している。全長cDNAは先行技術で公知の種々の応用目的に用いることができ、さらにいずれかの適切なクローニング媒体にクローニングすることができ、そのクローニング媒体でホストを形質変換させることができる。
『テンプレート切換え』という用語はホスホジエチル結合によって相互に共有結合で結合されていない2つの連続的なテンプレートを用いてDNAポリメラーゼによる相補的鎖のテンプレート依存合成のプロセスを意味している。この合成された相補的鎖は両方のテンプレートに相補的な単一の継続的鎖である。通常、第1のテンプレートはポリA+RNAであり、第2のテンプレートはテンプレート切換え又は『CAP切換え』オリゴヌクレオチドである。
ここで用いられている『任意の配列』あるいは『アンカー配列』とは天然又は修正ヌクレオチドの特定の配列を含むいずれかの定義された、あるいは予め選択したオリゴヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいは混合デオキシリボ/リボヌクレオチド配列を意味する。
ここで用いられている『ランダム配列』とは各ヌクレオチド位置にいずれかの天然または修正ヌクレオチドを含んだデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいは混合デオキシリボ/リボヌクレオチド配列として定義されている。
ここで用いられている『全長アンカー化cDNA』は定義された任意の配列を3′末端に有する全長ss cDNAを意味している。
ここで用いられている『mRNA:cDNAハイブリッド』という用語はテンプレートとしてポリA+RNAを用いた逆トランスクリプターゼによって触媒される第1鎖cDNA合成後の生成物を意味している。『mRNA:cDNAハイブリッド』は、そのcDNA部分がテンプレートmRNAの55′末端の完全な配列を含んでいれば全長である。
ここで用いられている『逆トランスクリプターゼ』という用語はテンプレートとしてポリA+RNAあるいは総RNAを用いた第1鎖cDNA合成のために用いることがでいる逆トランスクリプターゼ活性を有するDNAポリメラーゼを意味している。
ここで用いられている2つの配列は、それらの配列が相互にハイブリダイズして非平行(antiparallel)二本鎖核酸構造を形成することができる場合に『相補的』であるとされる。
ここで用いられている『ハプテン』という用語は核酸分子に結合され、他の分子、あるいは『結合リガンド』、例えば抗体、ストレプトアビジン及びビオチン、遷移金属、及び先行技術で公知の他のものによって認識及び結合されることができる分子を意味している。ハプテンの例としてはキレート基、ビオチン、フルオレッセイン、ジゴキシジェニン、抗原、及び先行技術で知られたその他のものを含む。
ここで用いられている『固体基質』という用語はいずれかの公知の方法で結合リガンドあるいはオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチド配列の不動態化のために用いることができる公知の基質を意味している。
ここで用いられている『レポータグループ』は従来の化学的あるいは酵素的ラベリング手順によって全長cDNAに組み込まれた、そしてシンチレーション・カウンティング、オートラジオグラフィ、蛍光測定、熱量測定、光放出測定、及び先行技術で知られたその他の手段によって検出できるいずれかの基を意味している。
ここで用いられている『サブストラックテブハイブリダイゼーション』とはひとつのcDNA群(テスター)内に存在しているが、別のcDNA群(ドライバ)内にはそれ程豊富には存在しない、あるいは見いだされないcDNA種が高度に増幅されて含まれているcDNA群の回収を可能にしてくれる技術を意味している。サブストラックテブハイブリダジエーションの実例としては抑制サブストラックテブハイブリダイゼーション技術(Chenchikら、米国特許No.5,563,340)、表示相違分析(Wiglerら、米国特許No.5,436,142)、及びリンカー捕捉サブストラックション(Yangら、Anal. Biochem. 237:109−114(1996))などを含んでいる。
ここで用いられている『ヌクレオチド類似物』はDNAあるいはRNA内では通常見出されず、テンプレート切換え反応の効率を改善したり、あるいは発生されたアンカー化cDNAの使用法を改善してくれるいくつかの追加的な特徴を有するヌクレオチドを指している。例えば、適切なヌクレオチド類似物はペプチド核酸、イノシン、5−ニトロインドール・デオキシリボフラノシル、5−メチルデオキシシトシン、及び5,6−ジヒドロ−5,6−ジヒドロオキシデオキシチミジンなど延期又は糖−ホスフェート基質の修正を含んでいる。当業者には他のヌクレオチド類似物も明らかであろう。
以下は本発明を実施するための手順を示す実施例である。これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。すべてのパーセンテージは重量で表示されており、すべての混合比率は特に注意がない限り体積比である。
実施例1−CAP切換え技術に基づく全長cDNAの5′末端配列をクローニングするための好ましい方法
全長cDNAの入手は遺伝子の特徴付けにおける最も重要で、往々にして最も困難な作業のひとつである。cDNAライブラリ構成の伝統的な方法は通常部分的なcDNAフラグメントだけをつくりだす。コード表現配列の残りの部分を回収しやすくするために、cDNA末端(RACE)を急速に増幅するためのイン・ビトロでの方法は1988年に提案された(Frohmanら、1988)。これまでいろいろな修正が行われているにも拘らず、現在のRACE技術は複雑で非効率的である。本発明による方法と物質は5′−RACE手順を大幅に単純化し、より効率的にしてくれる方法を提供してくれる。図2はCAP切換え5′−RACE手順を示すフロー・チャートを示しおり、好ましい手順を以下に述べる。例えば、第1鎖合成及びPCRのための類似した酵素活性を有する他の酵素の使用、オリゴ(dT)プライマ及びCAP切換えオリゴヌクレオチドの他の配列の使用、第1鎖合成のためにオリゴ(dT)プライマの代わりに遺伝子固有プライマの使用など手順における自明の修正はすべて本発明の範囲内である。
ステップ1.第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え手順
cDNA合成プライマ(オリゴd(T)プライマ)10pmol
Figure 0004043516
(V=G,A又はC;N=G,A,T又はC)
及び50pmolのCAP切換えオリゴヌクレオチド(CSO1):
Figure 0004043516
(pは3′ホスフェート基)
を5μlの純水内で、混合物を70℃の温度下で2分間加熱し、その後氷上で2分間冷やして、1μgのヒト胎盤ポリ(A)+RNA(CLONTECH Laboratories,Inc.Palo Alto,CA)にアニールした。その後、アニールされたプライマーRNAを200単位のM−NLV RNase H−逆トランスクリプターゼ(SuperScriptII逆トランスクリプターゼ、Life Technologies)と混合して最終体積を10μlとし、50mM トリス塩酸(22℃でpH8.3);75mM KCl;6mM MgCl2:1mM DTT;及びdATP,dCTP,dGTP,dCTP,及びdTTPを各1mMずつ含むようにした。第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え反応はエア・インキュベータ内で42℃の温度下で1.5時間行われ、その後氷冷した。また、オリゴd(T)プライマの代わりにランダムd(N)6プライマ(500ng)あるいはヒト・ベータ−アクチン抗センス遺伝子固有プライマ:
Figure 0004043516
あるいはヒト・トランスフェリン・リセプタ抗センス遺伝子固有プライマ:
Figure 0004043516
を有して第1鎖cDNAを合成した。
その後、混合物を5mlの10mMトリシン−KOH(22℃でpH8.5)及び0.1mM EDAを加えて500倍に希釈し、氷上で冷却して、−20℃で保存した。
ステップ2.5′−RACE Advantage KlenTaqポリメラーゼ・ミックス(CLONTECH Laboratories,Inc.)を用いてPCR増幅を行った。このキットはKlenTaq−1及びDeepVent DNAポリメラーゼ(New England Bio Labs)、そしてTaqStart抗体(CLONTECH Laboratories,Inc.)の混合物を含んでいる。TaqStart抗体は自動的ホット・スタートPCRを可能にしてくれる。増幅は5μlの希釈第1鎖cDNA;40mMトリシン−KOH(22℃でpH9.2);3.5mM Mg(OAc)2;10mM KOAc;75μg/ml BSA;dATP,dGTP,dCTP及びdTTPを各200μM;CAP切換えプライマ(CSP1)、5′-d(CTAATACGACTCACTATAGGGC)-3′(配列ID番号12)及び遺伝子固有プライマ(ベータ−アクチン又はトランスフェリン・リセプタに対するGSP1)各0.2μM、そして1μlの50%KlenTaqポリメラーゼ・ミックスを含んだ50μl体積内で行われた。PCR反応の温度パラメータは以下の通りであった:94℃で1分間、94℃で30秒間と72℃で5分間を5サイクル;そして94℃で30秒間と70℃で5分間を5サイクル;そして94℃で30秒間と68℃で5分間を25サイクル;そして68℃で最終延長が10分間。PCR生成物は1.2%アガロース/EtBrゲルを1×TBE緩衝液に溶かしたもので検査した。DNAサイズ・マーカーとして1kb DNAラッダー(Life Technologies)を用いた。
ヒト・ベータ−アクチンとトランスフェリン・リセプタcDNA 5′−RACE反応の両方とも予想されたサイズの全長増幅5′−RACE生成物に対応する単一バンドを発生する。その後で18のランダムに採り上げた5′−RACEクローンのクローニング及び配列分析の結果ベータ−アクチン及びトランスフェリン・リセプタ5′末端フラグメントに対する同一性が裏づけられる。さらに、増幅された5′−RACE生成物の5′末端配列はその後にCAP切換えオリゴヌクレオチドが続いた全長ベータ−アクチン及びトランスフェリン・リセプタmRNAの配列と正確に対応している。この実施例はCAP切換え5′−RACEがcDNAの5′末端配列の増幅だけでなく、転写開始サイトの正確なマッピングにも効率的に使用できることを示している。
実施例2−全長cDNAライブラリ構成のためのCAP切換えPCRに基づく手法
本発明の方法と物質は10〜100ngの総RNAをテンプレートとして用いたcDNAの構成のために有効に用いることができる。ヒト・バイオプシー組織、病原性微生物、異なった発展段階の組織などの10〜50mgの『難しい』細胞からこの少量の総RNAを精製するために、先行技術で公知のいずれの従来の手順でも用いることができる。図3内のフロー・チャートはこの手順の主要ステップを示している。図3のいくつかの個別の、非基本的なステップ、CDS構造の構造、CAP切換えオリゴヌクレオチド及びアダプタは全体的な手順の効率を変えないで変えることができる。例えば、アダプタ結束ステップ(ステップ3)の代わりに、PCRによって発生されたds cDNAはCDS及びCAP切換えオリゴヌクレオチド側鎖部分に対応する配列内の稀少切断制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ベクター内に直接クローンすることができる。また、TA−クローニング・ベクター、鈍化末端結束などのPCR生成物のための先行技術で公知の他の従来の手順もCAP切換え全長cDNAライブラリのクローニングと発生のために用いることができる。本発明の方法及び物質の使用に基づく上記好ましいいずれのそうした変更も本発明の範囲内である。
ステップ1.第1鎖合成−テンプレート切換え 10pmolのcDMA合成プライマ(オリゴd(T)プライマ)CDS1;
Figure 0004043516
(ここで、V=G又はA又はC;N=G又はA又はT又はC)及び10pmolのCAP切換えオリゴヌクレオチド(CSO2):
Figure 0004043516
をその混合物を70℃の温度下で2分間加熱し、その後2分間氷冷して5μlの純水中で100ngのヒト骨格筋総RNA(CLONTECK Laboratories,Inc.)にアニールした。第1鎖cDNA合成はそのアニールされたプライマーRNAを200単位のM−MLV RNase H−逆トランスクリプターゼ(SuperScriptII逆トランスクリプターゼ、Life Technologies)と混合して最終体積が50mM トリス塩酸(22℃でpH8.3);75mM KCl;6mM MgCl2;1mM DTT;及びdATP,dGTP,dCTP及びdTTPを含んで50μlとなるようにすることによって開始された。第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え反応はエア・インキュベータ内で42℃の温度下で1.5時間行われ、その後氷冷された。
ステップ2.PCRによる全長cDNAの発生 Advantage Klen Taqポリメラーゼ・ミックス(CLONTECH Labnoratories,Inc.)を用いて全長cDNAのPCR増幅を行った。増幅は2μlの第1鎖cDNA;40mMのトリシン−KOH(22℃でpH9.2);3.5mM Mg(OAc)2;10mM KOAc;75μg/ml BSA;dATP,dGTP,dCTP及びdTTPを各200μM;CAP切換えプライマ(CSP1)とCDS1プライマ1各0.2μM、そして1mlのKlentaqポリマー・ミックスを含んだ100μl体積中で行った。PCR反応の温度パラメータは以下の通りであった。95℃で1分間、続いて95℃で15秒間と68℃で5分間を20〜22サイクル;その後68℃で最終的延長を10分間。PCR生成物は1.2%アガロース/EtBrゲルを1×TBE緩衝液に加えたものの中で検査した。DNAサイズ・マーカーとして1kb DNAラッダー(Life Technologies)を用いた。
ステップ3.アダプタ結束 PCRステップで発生された50μlのds cDNAを2μlのプロティナーゼK(2mg/ml)と組み合わせて、45℃の温度下で1時間培養して、その後70℃の温度で10分間変性ステップを行った。その後、3μl(15単位)のT4 DNAポリメラーゼを反応混合物に加えて、さらに16℃の温度で30分間培養した。その後、半分の体積の4M酢酸アンモニウム(35μl程度)と3.7体積の95%エタノール(約260μl)を加えてds cDNAを沈殿させた。撹拌後、微量遠心分離装置内で20分間、14,000rpm内ですぐに遠心分離した。ペレットを撹拌せずに80%エタノールで洗浄して、上に述べたのと同様に10分間遠心分離した後、空気乾燥して、16μlの純水内に溶解した。その後、16℃の温度で以下の条件下でds cDNAをアダプタに一昼夜かけて結束させた。16μlのds cDNA溶液、50mMトリス塩酸(22℃でpH7.8)、10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP,5%ポリエチレン・グリコール(M. W. 8,000)、2μMのアダプタ、(Ad1):
Figure 0004043516
(ここでp=3′ホスフェート基)、及び1単位のT4 DNAリガーゼ(Life Technologies)、総体積:30μl。その後、10mM EDTAを70μl加えて結束混合物を停止させた。このds cDNAを一度はフェノール/クロロホルム/イソアミル・アルコール(25:24:1、体積/体積)で、さらに一度クロロホルム/イソアミル・アルコール(24:1、体積/体積)で抽出して、その後3M酢酸ナトリウム10μlと95%エタノール250μlを加えて沈殿させた。撹拌した後、微量遠心分離装置内で20分間、14,000r.p.m.でチューブをすぐに遠心分離にかけた。ペレットは撹拌せずに80%エタノールで洗浄し、上に述べたのと同様に10分間遠心分離にかけ、空気乾燥させてから、20μlの純水に溶解させた。アダプタ結束ds cDNAはその後37℃の温度で10分間、以下の条件下でホスホリル化した。最終体積30μl内にアダプタ結束ds cDNA溶液20μl、50mMトリス塩酸(22℃でpH7.8)、10mM MgCl2,1mM DTT,1mM DTT,1mM ATP、30単位のT4ポリヌクレオチド・キナーゼ(Epicenter Technology)。その後、2μlの0.2M EDTAを付加して、70℃の温度下で15分間熱不活性化させてホスホリル化反応を終わらせた。
ステップ4.cDNAサイズ分留及びクローニング 前のステップで発生されたホスホリル化アダプタ結束ds cDNAを10mMトリス塩酸(pH7.4)、30mM NaCl,0.5mM EDTAで均衡させた1.2mlのSephacryl S500 O(Pharmacia)ゲルろ過カラム上で分留した。これら分画内でのcDNAのサイズ分布を1.1%アガロース/EtBrゲル・アガロースと1kb DNAサイズ・マーカー(Life Technologies)を共に用いて分析した。0.5kbより長いcDNAサイズに対応する画分を一緒にプールして(総体積250μl)、1/10体積(25μl)の3M酢酸ナトリウム、1.5μlの20mg/mlグリコーゲン及び2.5体積(400μl)の95%エタノールを加えて沈殿させた。
撹拌後、微量遠心分離装置内で20分間14,000r.p.mでチューブをすぐに遠心分離にかけた。ペレットを撹拌しないで80%エタノールで洗浄して、上に述べたのと同様に10分間遠心分離にかけ、その後15μlの純水に溶解した。その後、ds cDNAを以下の条件下で一昼夜かけてλgt11 EcoRIベクター・アーム(CLONTECH Laboratories,Inc.)に結束させた。総体積25μl中に5μlのds cDNA溶液、50mMトリス塩酸(22℃でpH7.8)、10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP、5%ポリエチレン・グリコール(M. W. 8,000)、25μgのλgt11 EcoRIアーム、及び2.5単位のT4 DNAリガーゼ(Life Technologies)。この結束混合物をその後、Sambrookら(1989)による実験室マニュアルに述べられているような標準手順でパッケージした。
本発明の方法及び物質を用いて発生されたライブラリの品質の高さを確認する目的で、挿入サイズを判定するため50の遺伝子組換えファージ・クローンをランダムに選択した。これら挿入物のサイズ分布は0.5〜4.5kbの範囲で、2.0〜3.0kbの範囲に最も集中しており、これはcDNAライブラリ構成のために用いられた総RNA内の骨格筋ポリ(A)+RNAのサイズ分布に対応している。Delta Tth DNAポリメラーゼ配列決定キット(CLONTECH Laboratories,Inc.)を用いて同じ50の挿入物を配列決定した。これらの配列のうちの10個はGenBankデータベースの検索で確認された。これらはトランスフェリン・リセプタ、リボソーム性蛋白質L7、ミオシン軽鎖2、LIM領域蛋白質、ATPaseファクター6、チロクロームCオキシダーゼ、シトスケリタルγ−アクチン、平滑筋α−アクチン及び平滑筋γ−アクチンであった。3つのcDNAに関しては、それらのクローンの配列はGenBankで発表されているものより長かった。7つのcDNAに関しては、それらの配列はキャップ・サイトから始まる全長mRNA配列に正確に対応していた。
これらのデータは本発明の方法と組成物が非常に高いレベルの全長cDNAクローンを有する高品質cDNAライブラリを発生させるためのcDNAライブラリ構成のために用いることができることを示している。
実施例3−PREアダプタ−プライマ戦略を用いてのCAP切換え全長cDNAライブラリ構成
CAP切換え法は先行技術で公知の標準的な従来の(PCRに基づかない)技術を有効に組み合わせることもできる。その結果、従来の手順はかなり単純化され、そして、cDNAフラグメント・ライブラリではなく全長cDNAが発生される。この実施例で、cDNA合成の開始物質として、ポリ(A)+RNAを用いた。図4のフロー・チャートは主としてColecloughら(1985)が述べた従来のPREアダプタ−プライマ手順に基づいたCAP切換えcDNAライブラリ構成技術の主要ステップを示している。図4に示すような同様の酵素活性、CDSプライマ(PREアダプタ・プライマ)、CAP切換えオリゴヌクレオチド及びベクターを有する酵素の選択、そしてクローニングに用いられる制限サイトの選択を本手順の有効性を変えないで変更できることは当業者には自明であろう。この手順におけるひとつの修正は先ず第2鎖合成(ステップ3)を実行して、その後制限消化を行い(ステップ2)、そしてベクターへのクローニング(ステップ4)を行う。別の修正では、制限消化(ステップ2)の代わりに実施例2で述べたアダプタ結束手順の使用を含めることができる。第1鎖cDNA合成(ステップ1)のためにPREアダプタ−プライマの代わりにベクター・プライマを使用することも可能である。この場合、ベクター・プライマはひとつの末端に第1鎖合成を開始するためにオリゴd(T)配列を持つことができ、さらに別の末端に全長第1鎖cDNA合成が完了した後自動テンプレート切換えを行わせるためにCAP切換えオリゴヌクレオチド配列を持つことができる。本発明による方法と物質を用いる好ましい手順におけるいずれのこうした変更も本発明の範囲内にある。
ステップ1.全長mRNA:cDNAハイブリッドの発生
10pmolのcDNA合成プライマ(CDS3):
Figure 0004043516
(ここで、V=G又はA又はC;N=G又はA又はT又はC)及び10pmolのCAP切換えオリゴヌクレオチド(CSO3):
Figure 0004043516
を12.5μlの純水内で、70℃の温度下で加熱して5μgのヒト骨格筋ポリ(A)+RNA(CLONTECH Laboratories,Inc.)にアニールし、その後氷上で2分間冷却した。その後、50mMトリス塩酸(22℃でpH8.3)、75mM KCl,6mM MgCl2,1mM DTT及びdATP,dGTP,dCTPとdTTPを各1mMずつ含む総体積25μl内で、アニールされたプライマRNAを1000単位のM−ML V RNase H逆トランスクリプターゼ(SuperScriptII逆トランスクリプターゼ、Life Technologies)と混合することによって第1鎖cDNA合成−テンプレート切換えを開始した。この第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え反応はエア・インキュベータ内で42℃の温度で1.5時間続けられてから、150μg/mlグリコーゲン、10mM EDTAを合わせて75μl追加して停止させた。mRNA:cDNAハイブリッドは一度はフェノル/クロロフォルム/イソアミル・アルコール(25:24:1、体積/体積)、一度はクロロホルム/イソアミル・アルコール(24:1、体積/体積)で抽出され、その後半体積の4M酢酸アンモニウム(約40μl)と3.7体積の95%エタノール(約300μl)を加えて沈殿させた。攪拌後、チューブをすぐに微量遠心分離装置内で20分間14,000r.p.mで遠心分離にかけた。ペレットを撹拌せずに80%エタノールで洗浄して、10分間程度遠心分離にかけてから、空気乾燥して、50μlの純水中に溶解した。
ステップ2.制限消化 ステップ1で発生されたmRNA:cDNAハイブリッドをEcoRI制限エンドヌクレアーゼによる非直接クローニングのために(直接クローニングに対してはEcoRI及びNotI又はEcoRI及びXhoI)、50mMトリス塩酸(pH7.5)、100mM NaCl,10mM MgCl2,1mM DTT及び50単位のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(New England BioLabs)を含んだ100mlの反応混合物内で37℃の温度で1時間消化した。2mg/mlグリコーゲン、0.2M EDTAを合わせて5μlを加えることでこの反応を停止した。
EcoRI末端を有するmRNA:cDNAハイブリッドを一度はフェノール/クロロホルム/イソアミル・アルコール(25:24:1、体積/体積)、一度はクロロホルム/イソアミル/アルコール(24:1、体積/体積)で抽出して、その後半体積の4M酢酸アセテート(約40μl)と3.7体積の95%エタノール(約300μl)を加えて沈殿させた。攪拌後、チューブをすぐに微量遠心分離装置内で20分間14,000r.p.mで遠心分離にかけた。ペレットを攪拌せずに80%エタノールで洗浄して、10分間程度遠心分離にかけてから、空気乾燥して、50μlの純水中に溶解した。
ステップ3.ベクターへの結束 EcoRIで消化したmRNA:cDNAハイブリッドはその後以下の条件下で16℃の温度で一昼夜かけてλgt11 EcoRIベクター・アーム(CLONTECH Laboratories,Inc.)に結束させた。総体積20μl中に、50μlのmRNA:cDNAハイブリッド溶液、50mMトリス塩酸(22℃でpH7.8)、10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP,5%ポリエチレン・グリコール(M. W. 8,000)、25μgのλgt11 EcoRIアーム、及び2.5単位のT4 DNAリガーセ(Life Technologies)。
ステップ4.第2鎖cDNA合成 第2鎖cDNA合成は20μlのベクター結束mRNA:cDNAハイブリッド、20mMトリス 塩酸(22℃でpH7.5)、100mM KCl,10mM(NH42SO4,0.15mM β−NAD,50μg/ml BSA,300単位/ml E.coli DNAポリメラーゼ1、12単位/ml E.coli RNase H及び60単位/ml E.coli DNAリガーゼを含む総体積100μl内で行われた。この反応混合物は16℃の温度下で1.5時間培養され、その後4μlの2mg/mlグリコーゲン、0.2M EDTAを加えて反応を停止させた。ds cDNAは一度はフェノール/クロロホルム/イソアミル・アルコール(25:24:1、体積/体積)、一度はクロロホルム/イソアミル・アルコール(24:1、体積/体積)で抽出して、その後、半体積の4M酢酸アンモニウム(約35μl)と3.7体積の95%エタノール(約260μl)を加えて沈殿させた。攪拌後、チューブをすぐに微量遠心分離装置内で20分間14,000r.p.mで遠心分離にかけた。ペレットを攪拌せずに80%エタノールで洗浄して、10分間程度遠心分離にかけてから、空気乾燥して、50μlの純水中に溶解した。
その後、全長cDNAをSambrookら(1989)の実験室マニュアルに述べられている標準手順を用いてパッケージした。本発明による方法と物質を用いて発生されたライブラリの品質を確認するために、PCRに基づく技術に関して実施例2で行ったのと同じ品質管理実験を行った。全長cDNAライブラリのサイズ分布と効率の高さは両方のライブラリに対して同様であった。
これらのデータは本発明の方法と組成物が非常に高いレベルで全長cDNAクローンを含んだ高品質cDNAライブラリを発生させるためにPREアダプタ−プライマ戦略に基づくcDNAライブラリ構成に用いることができることを示している。
実施例4.CAP切換え技術を用いてのds cDNA増幅のための好ましい方法とcDNAサブトラクションにおけるこのds cDNAの使用
本発明による方法と物質はナノグラム・レベルの総あるいはポリA+RNAから高品質cDNAをつくりだすためにも用いることができた。図1のフロー・チャート(ステップ1及び2)はこの手順の主要なステップを含んでいる。CDSプライマ、CAP切換えオリゴヌクレオチドの構造や異なった反応成分の添加時期などで手順全体の効率を変えなくても一定の修正が可能であることは当業者には明らかであろう。
本発明のひとつの実施の形態で、本発明の方法と物質によって増幅されたds cDNAがcDNA減算方法との組み合わせて用いられた。通常の方法でcDNA合成のために総RNAが用いられた場合、リボソーム性RNAは、合成がオリゴ(dT)でプライムされた場合でもポリA+RNAフラクションと共に転写される。このcDNAがcDNA減算手順で用いられた場合、リボソーム性RNAの余剰分、ゲノム性DNA及びポリA+RNAフラクションに対応する低濃度のcDNAなどの不純物は減算的ハイブリダイゼーションの効率を低下させる。しかしながら、本発明の方法と物質によって発生されたcDNAは、総RNAが開始物質として用いられても減算的ハイブリダイゼーション手順のために直接用いることができる。ひとつの好ましい準実施の形態で、本発明の方法と物質によって増幅されたテスター及びドライバーds cDNAは抑制減算的ハイブリダイゼーション技術(Chenchikら、米国特許No.5,565,340)との組み合わせで用いられた。例えば、Wiglerら(米国特許No.5,436,142);Hampsonら(Nucl. Acids Res. 20:2899(1992));Yangら(Anal. Biochem. 237:109−114(1996));Balzerら(Nucl. Acids. Res. 22:2853−2854(1994))などによって述べられたその他の減算的ハイブリダイゼーション法もテスター及び/又はドライバーに対応し、本発明の訪欧で増幅されたss又はds cDNAを用いて実施することができる。
ステップ1.第1鎖合成−テンプレート切換え 10pmolのcDNA合成プライマ(オリゴd(T)プライマ)CDS3:
Figure 0004043516
及び10pmolのCAP切換えオリゴヌクレオチド(NalsmG3):
Figure 0004043516
を、5mlの純水中で、その混合物を70℃の温度下で2分間加熱して、2つの別個のチューブ内で各テスター及びドライバー総RNA(CLONTECH Laboratories,Inc.)内でアニールして、その後氷冷した。その後第1鎖cDNA合成を50mMトリス塩酸(22℃でpH8.3)、75mM KCl,6mM MgCl2,1mM DTT、そしてdATP,dGTP,dC−TP及びdTTP各1mMを含んだ最終体積10ml内で、上記のアニールされたプライマーRNAを200単位のM−MLV RNase H−逆トランスクリプターゼ(SuperScriptII逆トランスクリプターゼ、Life Technologies)と混合することによって開始した。第1鎖cDNA合成−テンプレート切換え反応はエア・インキュベータ内で1.5時間、42℃の温度下で行われ、その後40mlのTE緩衝液(10mMトリス[pH7.6]、1mM EDTA)を加えて希釈し、72℃の温度で7分間加熱した。
ステップ2.cDNA増幅
全長cDNAのPCR増幅はAdvantage KlenTaqポリメラーゼ・ミックス(CLONTECH Laboratories,Inc.)を用いて行った。増幅は5mlの希釈された第1鎖cDNA,40mMトリシン−KOH(22℃でpH9.2)、3.5mM Mg(OAc)2,10mM KOAc,75mg/ml BSA,dATP,dGTP,dCTP及びdTTP各200mM,0.2mMのPCRプライマ(Nalsm):
Figure 0004043516
2mlのKlenTaqポリメラーゼ・ミックスを含む100ml体積内で行われた。PCR反応の温度パラメータは以下の通りである。95℃で1分、その後に95℃で15秒と68℃で5分間を17〜19サイクル、その後で68℃での最終延長10分間。PCR生成物は1×TAE緩衝液内に1.2%アガロース/EtBrゲルを解かしたものの中で検査された。DNAサイズ・マーカーとして、1kb DNAラッダー(Life Technologies)を用いた。反応は2mlの0.5M EDTAを付加して停止した。
ステップ3.cDNAの精製
それぞれ2つの試験管から組み合わせたテスター及びドライバーcDNA生成物に等量のフェノール:クロロホルム:イソアミル・アルコール(25:24:1)を加える。よく撹拌する。その後、各フェーズを分離するために14,000rpmで10分間遠心分離にかける。最上(水性)層と取り除いて、それを清潔な1.5mlチューブ内に入れる。n−ブタノール700mlを加え攪拌する。ブタノール抽出によりPCR生成物を40〜70mlに濃縮することができる。その溶液を室温で14,000rpmで1分間遠心分離にかける。上部層(有機性n−ブタノール)を取り除いて捨てる。40〜70mlだけで反応を終了したくない場合は、同じ体積のn−ブタノールでブタノール抽出ステップを繰り返す。ゲルマトリックスを完全に再懸濁させるように0.75ml CHROMA SPIN−1000(CLONTECH Laboratories,Inc.)カラムを数回さかさまにする。カラムから一番上のキャップを取り除いて、その後下側のキャップを取り除く。カラムを1.5ml遠心分離管あるいは17×100mmチューブに入れる。チューブ内にすぐ集まるすべてのカラム緩衝液は捨てて、1.5mlの1×TNE緩衝液(10mMトリス塩酸(pH8.0)、10mM NaCl,0.1mM EDTA)を加える。緩衝液をカラム・マトリックス内でゲル・ビーズの表面が見えるまで重力でカラムから流れ出るようにする。サンプルをゲル・ベッドの平坦な表面に慎重に、そしてゆっくり与える。サンプルをカラムの内壁に沿って流れないようにする。25mlの1×TNE緩衝液を加えて、その緩衝液がカラムから完全に流れ出るようにする。さらに150mlの1×TNE緩衝液を加えて、カラムから完全に流れ出るようにする。カラムを清潔な1.5ml微量遠心分離管に移す。1×TNE緩衝液を入れて、これを精製cDNAフラクションとして回収する。精製されたcDNAフラクション内にPCR生成物が存在していることを確認するために、ステップ2で述べたようにアガロース/EtBrゲル分析を行う。
ステップ4.cDNA減算
RsaI消化とcDNA減算をChenchikら(米国特許No.5,565,340)に詳しく述べられているように行う。
なお、ここに述べられている実施例と実施の形態は説明の目的のためだけに示されるものであって、種々の修正や変更は当業者にな明らかであろうし、さらに本願の精神と範囲内にあり、添付される特許請求の範囲にあるものである。
Figure 0004043516
Figure 0004043516
Figure 0004043516
Figure 0004043516
配列のリスト
(1)一般情報
(i)出願人情報:
出願人名称:クロンテック ラボラトリーズ,インク.
街路住所:イースト メドウ サークル 1020
都市:パロ アルト
州:カリフォルニイア
国:アメリカ合衆国
郵便番号:94303
電話番号:(415)424-8222 Fax:(415)424-1352
(ii)発明の名称:全長cDNAクローニングの方法
(iii)配列の数:66
(iv)対応する住所
(A)あて先:サリワンチック アンド サリワンチック
(B)街路:2421 エヌ.ダブリュ.41スト ストリート,スイート エイ−1
(C)都市:ゲインズヴィル
(D)州:フロリダ
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:32606
(v)コンピュータ読取方式:
(A)メディア タイプ:フロッピー ディスク
(B)コンピュータ:アイビーエム ピーシー コンパティブル
(C)オペーレーティング システム:ピーシー−ドス/エムエス−ドス
(D)ソフトウエア:パテントイン リリース #1.0,ヴァージョン #1.25
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:アメリカ合衆国
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人に関する情報:
(A)氏名:サリワンチック,デービッド アール.
(B)登録番号:31,794
(C)参考/処理番号:CL−7
(ix)電信電話情報:
(A)電話:(904)375-8100
(B)ファックス:(904)372-5800
Figure 0004043516
(ここで、VはG又はA又はC;NはG又はA又はT又はC)
Figure 0004043516
(ここで、pは3′−リン酸基)
Figure 0004043516
(ここで、pは3′−リン酸基)
Figure 0004043516
(ここで、VはG又はA又はC;NはG又はA又はT又はC)
Figure 0004043516
追加CAPスイッチ・オリゴヌクレオチド:
Figure 0004043516
Figure 0004043516
Figure 0004043516
Figure 0004043516
(ここで、NH2,BIO及びGLYは、それぞれ、リボース残基の3′位置に結合したアミノ、ビオチン及びグリセロール基)
Figure 0004043516
Figure 0004043516
Figure 0004043516
(ここで、I,Uはそれぞれイノシン及びデオキシリボフラノシル−5−ニトロインドール・リン酸)
Figure 0004043516
(ここで、Fはリボース残基の3′位置に結合したフルオロ基)
Figure 0004043516
Figure 0004043516
(ここで、VはA,G又はC;及びNはA,G,C又はT)

Claims (22)

  1. RNA分子及びテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的なDNAを調製する方法であって、該方法は
    (a)cDNA合成プライマを前記RNA分子にアニーリングし、第1のcDNA鎖を合成してRNA−cDNA中間体を形成するステップ、
    (b)前記RNA−cDNA中間体をテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに接触させるステップ、
    ここにおいて、前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドは、その5′末端に予め選択した任意のヌクレオチド配列とその3′末端に少なくとも3つのリボグアニン残基を有しているものであり、その3′末端のリボグアニンは前記RNA−cDNA中間体の第1のcDNA鎖の3′末端でヌクレオチドと塩基対を形成するものであり、そして前記第1のcDNA鎖の3′末端の延長のためのテンプレートとして機能するものである、そして
    (c)第1のcDNA鎖の3′末端を延長して、RNA分子及びテンプレート切換えオリゴヌクレオチドに対して相補的なDNAを調製するステップ
    を含むことを特徴とする方法。
  2. さらに、前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドの予め選択したヌクレオチド配列の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマを用いて第1のDNA鎖を増幅するステップを含んでいる請求項1の方法。
  3. RNA分子が前記RNAの5′末端に付加された7−メチルグアノシンCAP構造を有している請求項1の方法。
  4. リボグアニン残基のリボースの3′−OH基がアミノ、ビオチン、ホスフェート、グリセロール、及びフルオロ基で構成されるグループから選択される化学基を含んでいる請求項1の方法。
  5. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが前記RNAの5′CAP構造に結合する蛋白質を含んでいる請求項1の方法。
  6. 蛋白質が真核性開始ファクター4E及び抗CAP構造抗体からなるグループから選択される請求項の方法。
  7. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが
    5'−dN1−dN2−…dNm−rN1−rN2 −…rN (n-2) −rN (n-1) −rN n−3'
    の式で示され、
    dNがdAMP、dCMP、dGMP及びdTMPで構成されるグループから選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、mは0およびそれ以上の整数であり、
    rNがAMP、CMP、GMP及びUMPから選択されるリボヌクレオチドであり、そしてnが以上の整数であり、rN (n-2) 、rN (n-1) 、rN n 、がGMPである請求項1の方法。
  8. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが配列ID番号9,13,1820,21,22,23,24,25,26,2729,30,31,32,33,34,35,36,3740,4144,4550,51,52,53,54,55,56,57,5865,66,6886,8790,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107及び108で構成されるグルーブから選択される請求項1の方法。
  9. cDNA合成プライマが少なくとも1つの標的mRNAに相補的な配列を含んでいる請求項1の方法。
  10. cDNA合成プライマがポリA+RNAのポリ(A)部分に対して相補的な配列を含んでいる請求項1の方法。
  11. 前記cDNA合成プライマが配列ID番号8,16,67,109,110及び111で構成されたグループから選択される請求項1の方法。
  12. 請求項1の方法において、全長アンカー化cDNAが少なくとも1つのハプテン基を有しており、さらに、ハプテニル化されたアンカー化cDNAをこのハプテニル化されたアンカー化cDNAのハプテンの結合リガンドとインキュベートするステップを含んでいて、前記結合リガンドは基質に接合されているものであり、前記インキュベートは、ハプテニル化されたアンカー化cDNAプローブが基質の結合リガンドに結合された状態になるのに十分な条件下でインキュベートされていて、
    その後、基質に結合したハプテニル化されたアンカー化cDNAをすべての未結合分子から回収するステップと、そして
    基質に結合したハプテニル化アンカー化cDNAプローブを、前記ハプテニル化アンカー化cDNAを放出するのに十分な条件の下でインキュベートするステップと
    を含んでいる方法。
  13. さらに、ステップ(c)で発生された全長アンカー化cDNAをDNAポリメラーゼによって第2のcDNA鎖が合成される条件下で処理して、前記全長アンカー化cDNA鎖をテンプレートとして用いて、それによって全長ds cDNAを発生させるステップを含んだ請求項1の方法。
  14. さらに、ステップ(c)で発生された前記全長アンカー化cDNAを、前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対応したヌクレオチド配列を有するプライマ及び前記cDNA合成プライマの組み合わせと、PCRを実行するのに必要な有効な量の他の試薬で、PCRを実行して全長ds cDNAを発生させるのに十分な条件下でインキュベートするステップを含む請求項1の方法。
  15. 前記プライマが配列ID番号10,11,12,17,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82及び83によって構成されるグループから選択される請求項14の方法。
  16. さらに、前記全長ds cDNAをレポータ基でラベルするステップと、
    前記ラベルされた全長ds cDNAを固体基質上で不動態化された特定の遺伝子の組に対応する定義されたオリゴヌクレオチド/ポリヌクレチドと、その一定の不動態化され定義されたオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチドを有する上記ラベルされた全長ds cDNA内の一定のポリヌクレオチド配列間でのハイブリダイゼーションに起因する表面上でハイブリダイゼーションのパターンを形成するのに十分な条件下で接触させるステップと、そして
    前記レポータ基の検出によってこれらのパターンを明らかにするステップとを含む請求項14の方法。
  17. その5′末端に予め選択されたヌクレオチド配列を有し、さらにその3′末端に少なくとも3つのリボグアニン残基を有している請求項1で使用するテンプレート切換えオリゴヌクレオチドを1つあるいは複数のコンパートメントの中に含む、cDNAを調製するためのキット
  18. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが
    5'−dN1−dN2−…dNm−rN1−rN2 −…rN (n-2) −rN (n-1) −rN n−3'
    の式で示され、
    ここでdNはdAMP、dCMP、dGMP、dGMP及びdTMPで構成されるグループから選択されるデオキシリボヌクレオチドを示しており、mは0以上の整数を示しており、
    rNAMP、CMP、GMP及びUMPから選択されるリボヌクレオチドであり、そしてnが3以上の整数であり、rN (n-2) 、rN (n-1) 、rN n 、がGMPである請求項17のキット
  19. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが配列ID番号9,13,1820,21,22,23,24,25,26,2729,30,31,32,33,34,35,36,3740,4144,4550,51,52,53,54,55,56,57,5865,66,6886,8790,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107及び108で構成されるグルーブから選択される請求項17のキット
  20. 前記リボグアニン残基のリボースの3′−OH基がアミノ、ビオチン、ホスフェート、グリセロール、及びフルオロ基で構成されるグループから選択される化学基を含んでいる請求項17のキット
  21. 前記テンプレート切換えオリゴヌクレオチドが前記RNAの5′CAP構造に結合する蛋白質を含んでいる請求項17のキット
  22. 前記蛋白質が真核性開始ファクター4E及び抗CAP構造抗体からなるグループから選択される請求項21のキット
JP52464597A 1996-01-03 1997-01-03 全長cDNAクローニングのための方法及び組成物 Expired - Lifetime JP4043516B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/582,562 1996-01-03
US08/582,562 US5962271A (en) 1996-01-03 1996-01-03 Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
PCT/US1997/000368 WO1997024455A2 (en) 1996-01-03 1997-01-03 METHODS AND COMPOSITIONS FOR FULL-LENGTH cDNA CLONING

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2000502905A JP2000502905A (ja) 2000-03-14
JP4043516B2 true JP4043516B2 (ja) 2008-02-06

Family

ID=24329625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52464597A Expired - Lifetime JP4043516B2 (ja) 1996-01-03 1997-01-03 全長cDNAクローニングのための方法及び組成物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5962271A (ja)
EP (1) EP0871780B1 (ja)
JP (1) JP4043516B2 (ja)
AT (1) ATE428800T1 (ja)
DE (1) DE69739356D1 (ja)
ES (1) ES2325044T3 (ja)
WO (1) WO1997024455A2 (ja)

Families Citing this family (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766891A (en) 1994-12-19 1998-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase
EP2354251B1 (en) 1997-04-03 2014-10-15 Life Technologies Corporation Compositons and methods for reverse transcriptase-Polymerase chain reaction (RT-PCR)
CA2287542A1 (en) 1997-04-22 1998-10-29 Life Technologies, Inc. Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US20040185493A1 (en) * 1997-05-12 2004-09-23 Invitrogen Corporation Methods for production and purification of nucleic acid molecules
ATE283353T1 (de) 1997-06-12 2004-12-15 Sloan Kettering Inst Cancer Kovalente bindung von dna zu rna strängen katalysiert durch vaccinia topoisomerase
US6140086A (en) * 1997-08-15 2000-10-31 Fox; Donna K. Methods and compositions for cloning nucleic acid molecules
DE19741714C2 (de) * 1997-09-22 2002-03-21 Inst Molekulare Biotechnologie Verfahren zur Synthese und Amplifikation von Nukleinsäuren
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US20040157256A1 (en) * 1998-09-17 2004-08-12 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Immobilized cDNA libraries
CA2364267A1 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
JP2002539784A (ja) * 1999-03-19 2002-11-26 インヴィトロゲン・コーポレーション 大腸菌トポイソメラーゼiii及びその相同体を使用して全長核酸配列を得る方法
WO2000070095A2 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Dade Behring Inc. Homogeneous isothermal amplification and detection of nucleic acids using a template switch oligonucleotide
US7482443B2 (en) * 2000-03-09 2009-01-27 Genetag Technology, Inc. Systems and methods to quantify and amplify both signaling probes for cDNA chips and genes expression microarrays
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
BR0014182A (pt) 1999-09-13 2002-05-21 Nugen Technologies Inc Processos e composições para amplificação isotérmica linear de sequências polinucleotìdicas
US7078501B2 (en) 2000-02-25 2006-07-18 Invitrogen Corporation Topoisomerase linker-mediated amplification methods
US8673570B2 (en) * 2000-03-09 2014-03-18 Genetag Technology, Inc. System and methods to quantify and amplify both signaling and probes for cDNA chips and gene expression microarrays
EP1136551A1 (en) * 2000-03-24 2001-09-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Berlin Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
AU2001251069A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-08 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, The NationalInstitutes Of Health Gene profiling arrays
AU2001253589B2 (en) * 2000-04-17 2007-08-16 Dyax Corp Methods of constructing display libraries of genetic packages for members of a diverse family of peptides
US8288322B2 (en) * 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
EP1356094B1 (en) * 2000-06-26 2010-01-13 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US7662791B2 (en) * 2000-08-02 2010-02-16 University Of Southern California Gene silencing using mRNA-cDNA hybrids
US6465219B1 (en) 2000-08-07 2002-10-15 Genemed Biotechnologies, Inc. Polynucleotide pools enriched in either high-abundance or low-abundance sequences
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
ATE315086T1 (de) 2000-08-21 2006-02-15 Invitrogen Corp Methoden und reagenzien für molekulares klonieren
AU2001292959A1 (en) 2000-09-22 2002-04-02 Clontech Laboratories, Inc. Highly sensitive proteomic analysis methods and kits and systems for practicing the same
WO2002036788A2 (fr) * 2000-11-06 2002-05-10 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications
JP3777158B2 (ja) * 2000-11-10 2006-05-24 アミコージェン・インコーポレイテッド 一方向性の一本鎖dna切片を用いた組換えdnaライブラリーの製造方法
US20060008817A1 (en) 2000-12-08 2006-01-12 Invitrogen Corporation Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules
WO2002061034A2 (en) 2000-12-08 2002-08-08 Invitrogen Corporation Compositions and methods for rapidly generating recombinant nucleic acid molecules
US6919189B2 (en) 2000-12-11 2005-07-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nested oligonucleotides containing a hairpin for nucleic acid amplification
CA2430329A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
WO2002065093A2 (en) * 2001-02-14 2002-08-22 Baylor College Of Medicine Methods and compositions of amplifying rna
ATE361996T1 (de) 2001-03-09 2007-06-15 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur vervielfältigung von rna sequenzen
EP1390537B1 (en) 2001-03-09 2013-11-13 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
KR100762261B1 (ko) 2001-04-27 2007-10-04 (주)바이오니아 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머
AU2011211347B2 (en) * 2001-05-07 2015-02-19 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli (3)
US8137911B2 (en) * 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
EP1275734A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Method for random cDNA synthesis and amplification
US20030104432A1 (en) * 2001-07-27 2003-06-05 The Regents Of The University Of California Methods of amplifying sense strand RNA
US20040006033A1 (en) * 2001-08-06 2004-01-08 Zhu York Yuan-Yuan Methods for identifying low-abundance polynucleotides and related compositions
DK1436404T3 (da) * 2001-09-19 2010-03-08 Alexion Pharma Inc Manipulerede templates og deres anvendelse i single-primer amplifikation
US7414111B2 (en) * 2001-09-19 2008-08-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
US20030175749A1 (en) * 2001-12-08 2003-09-18 Jong-Yoon Chun Annealing control primer and its uses
DE60323067D1 (de) * 2002-03-11 2008-10-02 Nugen Technologies Inc Verfahren zur erzeugung doppelsträngiger dna mit einem 3'-einzelstranganteil und verwendungen dieser komplexe zur rekombination
JP2003289869A (ja) * 2002-04-02 2003-10-14 Tosoh Corp 非定型抗酸菌Mycobacteriumavium検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法
EP1369480A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-10 Bioneer Corporation Process for preparation of full-length cDNA and anchor used for the same
AU2003238702A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-31 Kabushiki Kaisha Dnaform Method of utilizing the 5'end of transcribed nucleic acid regions for cloning and analysis
EP1371726A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-17 Rijksuniversiteit Groningen Method for amplifying RNA
AU2003261168A1 (en) * 2002-07-19 2004-02-09 Althea Technologies, Inc. Strategies for gene expression analysis
US7205128B2 (en) * 2002-08-16 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method for synthesis of the second strand of cDNA
US20050118602A1 (en) * 2002-10-10 2005-06-02 Yin-Xiong Li Gene profiling of single or multiple cells
EP1567675A4 (en) 2002-11-21 2006-05-10 Epict Technologies METHODS OF USING PRIMERS THAT CODE A STRAND OF A BICATENARY PROMOTER
JP4517114B2 (ja) * 2003-03-28 2010-08-04 国立障害者リハビリテーションセンター総長 cDNA合成方法
CA2521084A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
GB0319332D0 (en) * 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
CA2536565A1 (en) * 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
WO2005052128A2 (en) * 2003-11-25 2005-06-09 Argos Therapeutics, Inc. Mrna transfected antigen presenting cells
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050153333A1 (en) * 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
CA2465396A1 (en) * 2004-04-20 2005-10-20 Shawn Burgess Rapid integration site mapping
US20080293581A1 (en) * 2004-05-24 2008-11-27 Rogler Charles E Rna Expression Microarrays
ITPC20040022A1 (it) * 2004-05-26 2004-08-26 Carlo Crespi Pistone per apparecchiature dosatrici in particolare per il settore alimentare e/o chimico farmaceutico, con sistemi di tenuta migliorati
US20060057622A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-16 University Of Florida Low cycle amplification of RNA molecules
WO2006086668A2 (en) * 2005-02-09 2006-08-17 Epicentre Technologies Compositions and methods employing 5'-phosphate-dependent nucleic acid exonucleases
US7504240B2 (en) * 2005-03-10 2009-03-17 Masanori Hirano Methods for synthesizing polynucleotides using a single primer
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
US7745393B2 (en) * 2005-11-03 2010-06-29 Jumi Shin Minimalist bZIP proteins and uses thereof
AT502823B1 (de) * 2005-11-29 2007-06-15 Seitz Alexander Dr Polynukleotid-amplifikation
ATE551349T1 (de) * 2005-11-30 2012-04-15 Epict Technologies Corp Methode unter verwendung von reversibel blockierten markierungsoligonukleotiden
US20080145844A1 (en) * 2006-01-25 2008-06-19 Evrogen Joint Stock Company Methods of cDNA preparation
DE102006020885A1 (de) 2006-05-05 2007-11-08 Qiagen Gmbh Einführung von Sequenzelementen in Nukleinsäuren
US20080220423A1 (en) * 2006-05-19 2008-09-11 Soren Moller Oligonucleotide probes useful for detection and analysis of microRNA precursors
US8314220B2 (en) * 2007-01-26 2012-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods compositions, and kits for detection of microRNA
WO2009006438A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US9873957B2 (en) 2008-03-13 2018-01-23 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
EP2268661B1 (en) 2008-03-31 2017-11-08 Council of Scientific & Industrial Research Method of cloning stable stress tolerant superoxide dismutase using degenerate primers
CA2968164C (en) 2008-04-24 2019-08-20 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr1, cdr2, and cdr3 and novel lc cdr1, cdr2, and cdr3 designs
WO2009154303A2 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Riken A method of manufacturing a mixture of amplified double-stranded nucleic acids comprising unknown sequence
US20100035249A1 (en) * 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
EP2175018B1 (en) 2008-10-08 2011-06-08 Icon Genetics GmbH Process of clean cloning
DK3002337T3 (en) 2009-03-30 2019-02-18 Illumina Inc ANALYSIS OF EXPRESSION OF GENES IN SINGLE CELLS
CN102597265A (zh) 2009-10-21 2012-07-18 里博克斯艾克斯有限公司 使用热稳定的rna依赖的rna聚合酶进行指数式扩增rna的方法
WO2011048198A2 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Riboxx Gmbh Method and rna reactor for exponential amplification of rna
EP2333104A1 (en) 2009-12-11 2011-06-15 Lexogen GmbH RNA analytics method
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
CN101864413A (zh) * 2010-05-27 2010-10-20 东北农业大学 5’-race接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
HRP20220796T1 (hr) 2010-10-01 2022-10-14 ModernaTX, Inc. Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracil i njihove uporabe
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
GB201106254D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013038534A1 (ja) * 2011-09-14 2013-03-21 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JP5503021B2 (ja) * 2011-09-14 2014-05-28 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
CN104364392B (zh) 2012-02-27 2018-05-25 赛卢拉研究公司 用于分子计数的组合物和试剂盒
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2684954A1 (en) 2012-07-10 2014-01-15 Lexogen GmbH 5´ protection dependent amplification
WO2014021938A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and apparatus for nucleic acid synthesis using oligo-templated polymerization
US9422602B2 (en) 2012-08-15 2016-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for determining nucleic acid degradation
JP6338221B2 (ja) * 2012-10-24 2018-06-06 タカラ バイオ ユーエスエー, インコーポレイテッド 核酸生成物を生成するための、テンプレートスイッチに基づく方法
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
JP2015536672A (ja) 2012-11-28 2015-12-24 エービーウィズ バイオ,インク. 単一プライマー増幅における使用のための遺伝子特異的なテンプレートの調製
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
WO2014144713A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods of sequencing the immune repertoire
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
US10266894B2 (en) 2013-08-23 2019-04-23 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Methods and compositions for cDNA synthesis and single-cell transcriptome profiling using template switching reaction
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015057319A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Clontech Laboratories, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
WO2015058780A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Biontech Ag Method and kit for determining whether a subject shows an immune response
WO2015094861A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Clontech Laboratories, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
WO2015173402A1 (en) * 2014-05-14 2015-11-19 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Synthesis of double-stranded nucleic acids
US10900065B2 (en) 2014-11-14 2021-01-26 University Of Washington Methods and kits for labeling cellular molecules
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
ES2975332T3 (es) 2015-02-19 2024-07-04 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
EP3298170B1 (en) 2015-05-21 2021-12-29 Cofactor Genomics, Inc. Methods for generating circular dna from circular rna
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
ES2745694T3 (es) 2015-09-11 2020-03-03 Cellular Res Inc Métodos y composiciones para normalización de biblioteca de ácido nucleico
WO2017048993A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Takara Bio Usa, Inc. Methods for preparing a next generation sequencing (ngs) library from a ribonucleic acid (rna) sample and compositions for practicing the same
EP3350314A4 (en) 2015-09-18 2019-02-06 Twist Bioscience Corporation BANKS OF OLIGONUCLEIC ACID VARIANTS AND SYNTHESIS THEREOF
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
ES2914225T3 (es) 2015-10-16 2022-06-08 Modernatx Inc Análogos de cap de ARNm con enlace de fosfato modificado
WO2017066797A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
EP3362460A1 (en) * 2015-10-16 2018-08-22 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs and methods of mrna capping
WO2017079593A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
CN115920796A (zh) 2015-12-01 2023-04-07 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
JP6417603B2 (ja) 2016-01-27 2018-11-07 株式会社ダナフォーム Rnaの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法およびdnaエレメントの分析方法
EP3448868B1 (en) 2016-04-27 2021-12-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Mirna transcriptome methods and compositions
ES2956757T3 (es) 2016-05-02 2023-12-27 Becton Dickinson Co Codificación con códigos de barras moleculares precisa
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
WO2017212072A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Umc Utrecht Holding B.V. Human leukocyte antigen restricted gamma delta t cell receptors and methods of use thereof
EP3486321A4 (en) * 2016-06-23 2020-01-15 Riken SYSTEM FOR T CELL RECEPTOR AND B CELL RECEPTOR ANALYSIS USING ONE-STEP RT-PCR WITH MATRIX SWITCHING
US10240148B2 (en) 2016-08-03 2019-03-26 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for preventing concatemerization during template-switching
CN109790535A (zh) * 2016-07-29 2019-05-21 新英格兰生物实验室公司 防止模板转换期间连环化的方法和组合物
WO2018023068A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for preventing concatemerization during template- switching
CA3034769A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
JP7050057B2 (ja) 2016-11-10 2022-04-07 タカラ バイオ ユーエスエー, インコーポレイテッド 増幅二本鎖デオキシリボ核酸の作製方法ならびに該方法で使用する組成物及びキット
WO2018089860A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 2D Genomics Inc. Methods for processing nucleic acid samples
GB2573069A (en) 2016-12-16 2019-10-23 Twist Bioscience Corp Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
JP7104048B2 (ja) 2017-01-13 2022-07-20 セルラー リサーチ, インコーポレイテッド 流体チャネルの親水性コーティング
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US10894959B2 (en) 2017-03-15 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
CN107058289A (zh) * 2017-04-01 2017-08-18 吉林大学 一种mRNA的正义链的整体扩增方法
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3635135A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
AU2018284227B2 (en) 2017-06-12 2024-05-02 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
CN111566125A (zh) 2017-09-11 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 Gpcr结合蛋白及其合成
EP3684949B1 (en) * 2017-09-22 2024-04-17 University of Washington In situ combinatorial labeling of cellular molecules
GB2583590A (en) 2017-10-20 2020-11-04 Twist Bioscience Corp Heated nanowells for polynucleotide synthesis
JP2021508244A (ja) 2017-12-15 2021-03-04 ベイラー カレッジ オブ メディスンBaylor College Of Medicine Mrnaの増幅のための方法及び組成物
WO2019126209A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Cellular Research, Inc. Particles associated with oligonucleotides
AU2019205269A1 (en) 2018-01-04 2020-07-30 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112639130B (zh) 2018-05-18 2024-08-09 特韦斯特生物科学公司 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法
EP3837380A4 (en) 2018-08-17 2022-05-11 Cellecta, Inc. MULTIPLEX PREPARATION OF BARCODE GENE-SPECIFIC DNA FRAGMENTS
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 5’転写物配列の決定
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
CN109750052B (zh) * 2018-12-12 2024-03-19 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩黄嘌呤氧化脱氢酶XDH/XO cDNA全长序列及应用
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
EP3670667A1 (en) 2018-12-19 2020-06-24 Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin Identification of cognate pairs of ligands and receptors
WO2020136438A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Biobloxx Ab Method and kit for preparing complementary dna
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
CN113574178A (zh) 2019-01-23 2021-10-29 贝克顿迪金森公司 与抗体关联的寡核苷酸
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
JP2022522668A (ja) 2019-02-26 2022-04-20 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ
WO2020176678A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
WO2020184551A1 (ja) * 2019-03-13 2020-09-17 東洋紡株式会社 核酸の生成および増幅
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US20200392485A1 (en) * 2019-05-09 2020-12-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED cDNA SYNTHESIS
CA3144644A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021037368A1 (en) 2019-08-29 2021-03-04 Institute For Research In Biomedicine METHODS FOR RAPID cDNA PRODUCTION AND CLONING
AU2020356471A1 (en) 2019-09-23 2022-04-21 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
WO2021092386A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Becton Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
WO2021133842A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
EP4127221A4 (en) * 2020-03-24 2024-04-17 Cellecta, Inc. SINGLE CELL GENETIC ANALYSIS
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
CA3183029A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Hifibio (Hk) Limited Methods for identification of cognate pairs of ligands and receptors
EP4450639A2 (en) 2020-06-25 2024-10-23 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US20220177950A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Whole transcriptome analysis in single cells
JP2024512463A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 イルミナ インコーポレイティッド 増幅されたライブラリからの望ましくない断片の選択的枯渇のためのブロッキングオリゴヌクレオチド
EP4347879A1 (en) 2021-06-03 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2024121293A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag System and method for total nucleic acid library preparation via template-switching

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL37076A (en) * 1971-06-16 1974-05-16 Littauer U A method for stepwise synthesis of oligoribonucleotides of defined sequence using 2'(3')-o-acyl-nucleoside diphosphates and polynucleotide phosphorylase
CA1335428C (en) * 1988-06-14 1995-05-02 Steven C. Pruitt Cdna cloning vectors
US5219989A (en) * 1988-12-13 1993-06-15 Mcgill University Bifunctional protein for the isolation of capped mRNA
KR920700360A (ko) * 1989-03-22 1992-02-19 하리크 프리드리히 미끄럼 베어링
ATE186464T1 (de) * 1990-05-23 1999-11-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur regulierung der rns-aktivität durch abänderung der rns ''5'- cap-struktur''
YU187991A (sh) * 1990-12-11 1994-09-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3-(2)-amino-ali tiol-modifikovani, s fluorescentnom bojom vezani nukleozidi, nukleotidi i oligonukleotidi, postupak za njihovo dobijanje i njihova upotreba
JP3337748B2 (ja) * 1992-09-25 2002-10-21 財団法人神奈川科学技術アカデミー 完全長cDNAの合成方法、その中間体の製造方法及び完全長cDNAを含む組換えベクターの製造方法
US5436149A (en) * 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
ES2203635T3 (es) * 1994-04-27 2004-04-16 Novartis Ag Nucleosidos y oligonucleotidos con grupos 2'-eter.

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997024455A2 (en) 1997-07-10
EP0871780A2 (en) 1998-10-21
EP0871780B1 (en) 2009-04-15
ATE428800T1 (de) 2009-05-15
ES2325044T3 (es) 2009-08-24
DE69739356D1 (de) 2009-05-28
US5962272A (en) 1999-10-05
JP2000502905A (ja) 2000-03-14
US5962271A (en) 1999-10-05
WO1997024455A3 (en) 1997-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4043516B2 (ja) 全長cDNAクローニングのための方法及び組成物
US20210062244A1 (en) Nucleic acid amplification
Chenchik et al. Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5′ and 3′ ends by amplification of adaptor-ligated cDNA
JP4289443B2 (ja) Pcrの過程でdna断片の増幅を抑制する方法
US6066457A (en) Global amplification of nucleic acids
JP2648802B2 (ja) 増強された核酸増幅方法
US20150275257A1 (en) Nucleic Acid Amplification
JP3641206B2 (ja) 核酸の非特異的増幅法
JP2007502610A (ja) 増幅法
JPH07500735A (ja) メッセンジャーrnaの同定、単離およびクローニング
US20050175993A1 (en) Method for making full-length coding sequence cDNA libraries
JP2001526053A (ja) 核酸の製造方法
US6706476B1 (en) Process for amplifying and labeling single stranded cDNA by 5′ ligated adaptor mediated amplification
EP1608784B1 (en) Global linear non-biased nucleic acid amplification
WO1990001064A1 (en) Sequence-specific amplification techniques
JP2006508677A (ja) 遺伝子発現のオリゴヌクレオチド誘導分析
AU620628B2 (en) Dna amplification and subtraction techniques
JP5128031B2 (ja) RecAタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法
WO2002004627A1 (fr) Procede hautement efficaces permettant de fabriquer des sondes d'arn

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20031215

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060516

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20060809

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20060809

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060925

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070529

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070828

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20071023

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20071114

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101122

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111122

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121122

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131122

Year of fee payment: 6

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term