JP2015536672A - 単一プライマー増幅における使用のための遺伝子特異的なテンプレートの調製 - Google Patents
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Abstract
本開示は、遺伝子特異的なプライマーを使用せずに１以上の抗体遺伝子の増幅に役立つ、操作されたテンプレートを作製する方法に関する。より具体的には、１より多い抗体遺伝子の特異的な増幅を可能にするポリメラーゼ連鎖反応の設定において、これらの方法を使用して、テンプレートを設計する。【選択図】図１Ａ
Description
本出願は、２０１２年１０月２８日に出願された米国仮出願第６１／５５０，８６５号の利益を主張し、該仮出願は、引用により本明細書に組み込まれる。
核酸の増幅及び増幅産物の検知のための方法は、核酸配列を検知し、同定し、定量化し、及び分析するために使用されることがある。核酸の増幅は、抗体など関連する遺伝子からのライブラリの構築において重要な工程である。
これらのライブラリは特異的な望ましい活性を有する抗体のためにスクリーニングされ得る。核酸分析は、例えば、病原体の検知及び同定、定義された表現型につながる遺伝子変化の検出、遺伝子疾患又は疾病への感受性の診断、発生中の及び定義された刺激に応じた遺伝子発現の評価、及び様々なゲノム・プロジェクトなど、様々な目的のために重要である。核酸増幅方法の他の応用は、まれな細胞の検知、病原体の検知、悪性腫瘍における変化した遺伝子発現の検知等を含む。
単一プライマーを使用する増幅方法は、米国特許第５，５０８，１７８号；５，５９５，８９１号；５，６８３，８７９号；５，１３０，２３８号；及び５，６７９，５１２号において開示されている。米国特許第５，７４４，３０８号において、プライマーはＤＮＡ／ＲＮＡのキメラ・プライマーである。テンプレート転換オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）及びオリゴヌクレオチドの遮断を使用する代替的な増幅方法が、米国特許第５，６７９，５１２号；第５，９６２，２７２号；及び６，２５１，６３９号に開示されている。これらの増幅方法のいくつかにおいて、ＴＳＯ増幅方法はキメラＤＮＡプライマーを利用する。
核酸の増幅はまた、定性分析（例えば明確な核酸配列の存在の検知など）及び定義された遺伝子配列の定量化（例えば、病原性の配列の量の評価、及び遺伝子増殖又は欠失の決定、及び標準から悪性の細胞種への細胞形質転換において有用）に役立つ。
遺伝子分析、薬物耐性につながる変異の検知、ゲノム薬理学などに関連するように、核酸配列における配列変化の検知は変異遺伝子型の検知ために重要である。
遺伝子分析、薬物耐性につながる変異の検知、ゲノム薬理学などに関連するように、核酸配列における配列変化の検知は変異遺伝子型の検知ために重要である。
核酸の増幅には多くのバリエーションがあり：例えば指数関数的な増幅、リンクした線形増幅、ライゲーションベースの（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ）増幅、及び転写ベースの（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ）増幅である。指数関数的な核酸の増幅方法の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それは多数の出版物において開示されてきた。実際に、ＰＣＲは最も一般に用いられている標的増幅方法である。ＰＣＲは、変性、２つの異なるオリゴヌクレオチド・プライマーのそれぞれ標的鎖の反対の鎖へのハイブリダイゼーション、及びヌクレオチド・ポリメラーゼによるプライマー伸張の多数のサイクルに基づいて、標的配列の複数の二本鎖のコピーを作る。
従来のＤＮＡ増幅は、ＰＣＲのための２つの遺伝子特異的なプライマーを必要とする。プライマーがそれぞれそれの特有の最適なアニーリング温度を有するので、特定の遺伝子を特異的に及びよい効率で増幅するのは簡単ではない。これは抗体遺伝子の増幅に関して特に懸念される。これらの方法において、フォワードプライマーは抗体遺伝子のフレームワーク１領域にアニーリングする（ａｎｎｅａｌ）傾向があり、ここでいくつかの体細胞変異及び変動がいくらかのあいまい性（ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ）を可能にするためにより低いアニーリング温度の使用を要求する。しかしながら、通常、抗体遺伝子の定常部にアニーリングし、他の遺伝子の非特異的な増幅へ導くリバースプライマーについては、これは最適でない。これらの因子は、増幅後において、増幅された遺伝子の特異性及びカバーされるレパートリーを相当低下させ、全体的に歪んだ多様性と珍しいが重要な遺伝子の損失を結果として生じる。
現在知られており使用されている標的増幅方法は、いくつかの欠点を有する。例えば、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及び転写介在増幅（ＴＭＡ）などの転写ベースの増幅方法は、プライマーによる増幅産物へのポリメラーゼ・プロモーター配列の組み込みの必要性によって、限定的であり：これは、非特異的な増幅において結果として生じる傾向にあるプロセスである。
したがって、これらの欠点を克服する改良された核酸の増幅法が必要とされている。本明細書で提供される方法はこの必要性を満たし、付加的な利益を提供する。
本開示は、遺伝子特異的なプライマーを使用せずに遺伝子の増幅に役立つ操作されたテンプレートを作成する方法に関する。より具体的には、これらの方法を使用して操作されたテンプレートは、遺伝子特異的なプライマーを使用せずに、ＰＣＲ設定における抗体遺伝子の特異的な増幅を可能にする。
加えて、本明細書で提供される方法は、ニック・ライゲーションとポリメラーゼ伸長を使用する、操作された核酸テンプレートの生成を記述する。いくつか場合において、本明細書で提供される方法は、操作されたテンプレートを生成するための方法の中間の工程としてニック・ライゲーションを使用する、ポリヌクレオチドへのあらかじめ決められた配列の付加を含む。いくつかの場合において、ニック・ライゲーションの工程に先立ち、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにある在来の制限エンドヌクレアーゼ認識配列に逆相補的（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）である配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドと接触する。例えば、ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドのアニーリングの後、制限エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼ認識配列でオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを切断することがある。いくつかの場合には、制限消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）の後、ニック・ライゲーション反応が実行されて、ポリヌクレオチドにあらかじめ決められた配列を加えることがある。
本明細書で提供される方法は、ニック・ライゲーションに先立つ、ポリヌクレオチド内にある在来の制限エンドヌクレアーゼ制限部位に伴う任意の制限エンドヌクレアーゼの使用を可能にする。例えば、ポリヌクレオチドにあらかじめ決められた配列を加えるために制限エンドヌクレアーゼと制限エンドヌクレアーゼ認識配列の特定のセットの使用を必要とする、当業者に周知である方法と異なり、ニック・ライゲーションの利点は、１セットの制限エンドヌクレアーゼを使用する方法を制限しない。
本明細書には様々な実施形態において、操作されたテンプレートを作成する方法が記載され、該方法はポリヌクレオチドの相補的な部分、つまり第１鎖ｃＤＮＡ又は第２のｃＤＮＡ鎖いずれかへオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程を含み、ここでオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングするあらかじめ決められた配列を有し、アニーリングしたポリヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼの存在下で連結される。
本開示にはまた、少なくとも１つの切断部位、第１部分（ａ ｆｉｒｓｔ ｐｏｒｔｉｏｎ）及び第２部分（ｓｅｃｏｎｄ ｐｏｒｔｉｏｎ）を備えたポリヌクレオチドを含む操作されたテンプレートを作成する方法が提供され、該方法は：（ａ）切断部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎ）を作成する工程；（ｂ）切断部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）ポリヌクレオチドの第１部分を第１オリゴヌクレオチドの第１部分にアニーリングし、第１オリゴヌクレオチドの第２部分を第２オリゴヌクレオチドの第１部分にアニーリングする工程であって、該第２オリゴヌクレオチドは第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｄ）オリゴヌクレオチドの第１部分を第２オリゴヌクレオチドの第２部分へ連結して、第１のあらかじめ決められた配列を備えた操作される前のテンプレートを作成する工程；（ｅ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該１セットのプライマーの少なくとも１つのプライマーが工程（ｄ）の操作される前のテンプレート内のポリヌクレオチドの第１部分に実質的に相補的な第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、工程；及び、（ｆ）テンプレートが、１つの末端で第１のあらかじめ決められた配列、及び、異なる末端で第２のあらかじめ決められた配列を含むように、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
本開示はまた、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端で切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；（ｄ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングする工程であって、第１アダプター・オリゴヌクレオチドが、切断されたポリヌクレオチドの５’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列含む、工程；（ｄ）切断されたポリヌクレオチドの５’末端を第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程；（ｅ）操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；（ｆ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該プライマー少なくとも１つのプライマーが第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、工程；及び（ｇ）操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するように、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
本開示はまた、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；（ｄ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを、工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的であり、該第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｅ）切断されたポリヌクレオチドの５’末端を第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それによりあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程；（ｆ）操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；（ｇ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーが第２のあらかじめ決められた配列を有する、工程；及び（ｈ）操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するように、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
本開示は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｅ）５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍で、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程であって、（ｃ）の切断を含む、工程；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングする工程であって、該第１アダプター・オリゴヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの３’末端及びアニーリングする第１部分及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドの３’末端及びへアニーリングする第２部分を有し、第２のアダプター・オリゴヌクレオチドは第２あらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を、第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
本開示は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は、：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｅ）５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成し、工程（ｃ）の切断を含む工程；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的にアニーリングし、第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を、第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
本開示は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーは第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；（ｂ）第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する第２ポリヌクレオチドを合成する；（ｃ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、第２ポリヌクレオチドへアニーリングして、少なくとも二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作成し、二本鎖部分は制限部位を含む、工程；（ｄ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２ポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｅ）切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去し、それにより３’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第１アダプター・オリゴヌクレオチドは 第２ポリヌクレオチドの３’末端及びへアニーリングする第１部分及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドの３’末端及びへアニーリングする第２部分を有し、第２のアダプター・オリゴヌクレオチドは第２あらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）切断したポリヌクレオチドの３’末端を、第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
いくつかの他の実施形態において、本明細書は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は、：（ａ）１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーは第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；（ｂ）第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する第２ポリヌクレオチドを合成する；（ｃ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、第２ポリヌクレオチドへアニーリングして、少なくとも二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作成し、二本鎖部分は制限部位を含む、工程；（ｄ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２ポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｅ）切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去し、それにより３’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的にアニーリングし、第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）切断したポリヌクレオチドの３’末端を、第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結して、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照した後、当業者にとり容易に明白となるであろう。
引用による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これによりその全体において引用により組込まれる配列表を、含んでいる。２０１３年１１月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、４４７１２−７０４．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、て１７，３３８バイトのサイズである。２０１３年ノベンバー２６日上で作成された上述のＡＳＣＩＩ写しは４４７１２−７０４．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１７，３３８バイトのサイズである。
本発明の詳細は、その構造と操作の両方に関して、添附図面の研究によって部分的に収集されることがあり、ここで同様の参照符号は同様の部分を指す：
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を第１鎖ｃＤＮＡに少なくとも付けることにより作成される、本発明の例示的実施形態である。
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を第１鎖ｃＤＮＡに少なくとも付けることにより作成される、本発明の別の例示的実施形態である。
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を第２鎖ｃＤＮＡに少なくとも付けることにより作成される、本発明の例示的実施形態である。
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を第２鎖ｃＤＮＡに少なくとも付けることにより作成される、本発明の別の例示的実施形態である。
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、第２鎖ｃＤＮＡの少なくとも制限消化により作成される、本発明の例示的実施形態である。
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートは、第２鎖ｃＤＮＡの少なくとも制限消化により作成される、本発明の別の例示的実施形態である。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定される、マウス血清のＣＤ８０及びＣＤ８０への反応性のグラフである。
ＴＲＩ試薬を使用してホモジナイズされたマウス脾臓から単離したＲＮＡの純度を示す、診断のアガロースゲルの画像である。
本明細書に記載されている方法を使用して単一プライマー増幅の結果を示す、診断のアガロースゲルの２つの画像（κ鎖，左；ＩｇＧ１，右）である。
免疫化の前及び後の、４つの異なるペプチドへのマウス血清の反応性を示すグラフである。
免疫化の前及び後の、４つの異なるペプチドへのマウス血清の反応性を示すグラフである。
ＴＲＩ試薬を使用してホモジナイズされたマウス（ＥＲＫマウス）の脾臓から単離したＲＮＡの純度を示す、診断のアガロースゲルの画像である。
本明細書に記載されている方法を使用して単一プライマー増幅の結果を示す、診断のアガロースゲルの画像（κ鎖，左；ＩｇＧ１，右）である。
用語「ａ」、「ａｎｄ」、「ｔｈｅ」、及び、開示される実施形態の記載内容における（特に、以下の請求項における）同様の指示物は、本明細書に他に示されない又は文脈によって明確に否定されない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されよう。
値の幅が提供される場合、介在する各々の値は、値の範囲の上限と下限の間において、文脈が明らかに別途指示しなければ下限の単位の１０分の１までで、明確に開示されることは理解されよう。任意の定められた値または定められた範囲の介在する値と、任意の他の定められた値又は定められた範囲の介在する値との間の、より小さな各々の範囲は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限下限は、独立して、その範囲に含まれることもあり除外されることもあり、どちらかの極限がより小さな範囲に含まれている場合、どちらの極限もより小さな範囲に含まれていない場合、または両方の極限がより小さな範囲に含まれている場合において、各範囲はまた本発明内に包含され、これは定められた範囲内の特別に除外された制限にさらされる。定められた範囲が１つの制限又は両方の制限を含む場合、それら含まれた制限の何れか又は両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
本明細書で使用されているように、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」又は「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」又は「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｕＭ」又は「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎＭ」はナノモル濃度を意味し、「ｐＭ」はピコモル濃度を意味し、「ｆＭ」はフェムトモル濃度を意味する。
用語「単離された」は、タンパク質をコード化する特定のタンパク質又は核酸が、本発明に従って単離される状態を指す。タンパク質及びそれらをコード化する核酸には、それらの自然な環境において、又はこうした調製が組み換えＤＮＡ技術による場合それらが調製されている（例えば細胞培養）環境において見出される他のポリペプチド又は核酸のような物質は、無い又は実質的に無い。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に言及がなければ、無制限の用語（すなわち、「限定しないが、含む」）として解釈されることである。
用語「接続された（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」及び「連結された（ｌｉｇａｔｅｄ）」は、何か介在するものがある場合でも、部分的に又は全体として内側に含まれ、付着し、又はともに連結されている、と解釈されることである。本明細書に他に示されない又は文脈によって明確に否定されない限り、本明細書に記載の全ての方法は、任意の適切な順で実行することが出来る。
本明細書に提供される、全ての例、又は例示的な言語（例えば、「〜など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、例示的実施形態をより良く解明するように単に意図されるものであり、他に請求されない限り本発明の範囲を制限しない。本明細書中の言語は、例示的実施形態の実行に不可欠なものとして、請求されない要素を示すものとして解釈されるべきでない。
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖及び１以上のリン酸基から成るポリヌクレオチドの単量体単位を指す。自然発生の塩基（グアニン、（Ｇ）、アデニン、（Ａ）、シトシン、（Ｃ）、チミン、（Ｔ）、及びウラシル、（Ｕ））は、典型的にプリン又はピリミジンの誘導体であるが、自然発生の及び非自然発生の塩基アナログも含まれることは理解されよう。、自然発生の糖は、ペントース（五炭糖）、デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）、又はリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、自然発生の及び非自然発生の糖アナログも含まれることは理解されよう。核酸は典型的には、核酸を形成するリン酸結合又はポリヌクレオチドを介して、連結されるが、他の多くの結合（例えば、限定しないが、ホスホロチオエート 、ボラノリン酸及びその類似物）が当該技術分野で周知である。
本明細書で使用される、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のどちらにおいても、任意の長さのヌクレオチドの重合体の形体を指す。これらの用語は分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖と一本鎖ＤＮＡ、及び二本鎖と一本鎖ＲＮＡを含む。前記用語は、ヌクレオチドアナログ、及び、限定しないが、メチル化された及び／又はキャッピング された（ｃａｐｐｅｄ）ポリヌクレオチドのような修飾されたポリヌクレオチドから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログを、同等物として含む。
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖の形体又は二本鎖の形体のいずれかにおいて、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）の重合体の形体を指す。この用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、それを任意の特定の第三の形体に限定しない。したがってこの用語は、とりわけ直鎖状 のＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウィルス、プラスミド及び染色体において見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する際に、配列は、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわちｍＲＮＡに相同の配列を有する鎖）に沿った５’から３’の方向における配列のみを与える通常の慣例に従って、本明細書に記載されることがある。
ＤＮＡの「コード配列」又は「コード領域」は、適切な発現調節配列の制御下に置かれた際、インビボで転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列（「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」）の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドン及び３’（カルボキシル）末端での翻訳の終止コドンによって決定される。コード配列は、限定しないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物の（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含みうる。ポリアデニル化信号及び転写終結の配列は、通常コード配列の３’側に位置するであろう。用語「非コードの配列」又は「非コードの領域」は、アミノ酸に翻訳されないポリヌクレオチド配列の領域（例えば５′及び３′非翻訳領域）を指す。
用語「リーディングフレーム」は、二本鎖ＤＮＡ分子の、６つのあり得るリーディングフレーム、つまり各方向における３つのうちの、１つを指す。使用されるリーディングフレームは、どのコドンがＤＮＡ分子のコード配列内のアミノ酸をコード化するために使用されかを決定する。
本明細書で使用されているように、「アンチセンスの」核酸分子は、タンパク質をコード化する「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含み、該配列は例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖（ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）に相補的であるか、ｍＲＮＡ配列に相補的であるか、又は遺伝子のコード鎖に相補的である。したがって、アンチセンスの核酸分子は、センスの核酸分子へ水素結合し得る。
用語「塩基対」又は（「ｂｐ」）は、二本鎖ＤＮＡ分子における、チミン（Ｔ）とアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の関係を指す。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）はチミンに関して置換される。
本明細書中に使用されるように、「コドン」は、転写され及び翻訳される際、単一のアミノ酸残基をコード化し、ＵＵＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧの場合には、終結シグナルをコード化する３つのヌクレオチドを指す。アミノ酸をコード化するコドンは、当該技術分野で周知である。
例えば「Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃ．」からのプログラム「Ｈｕｍａｎ ＊ Ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」からのコドン利用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）チャートにおいて示されるように、最適なコドン利用は発現した遺伝子のコドン利用の頻度によって示される。コドン利用はまた、例えば「Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖによる"Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ，"Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １４９：１２５−１３１ （１９８１）」において記述されている。高発現するヒト遺伝子において最も頻繁に使用されるコドンは、推定的に、ヒト宿主細胞における発現用の最適なコドンであり、したがって、合成のコード化配列の構築のための基礎を形成する。
本明細書で使用されているように、「揺らぎの位置」は、コドンの第３の位置を指す。コドンの揺らぎの位置の内のＤＮＡ分子における変異は、典型的には、アミノ酸レベルでは無変化又は保存的な（ｓｉｌｅｎｔ ｏｒ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）変異を結果として生じる。例えばグリシン（すなわちＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、及びＧＧＧ）をコード化する４つのコドンがあり、したがって任意の揺らぎの位置のヌクレオチドの他の任意のヌクレオチドへの変異は、コード化されたタンパク質のアミノ酸レベルでの変化を結果としてもたらさない、すなわち、無変化な置換である。
用語「遺伝子」、「組み換え遺伝子」及び「遺伝子コンストラクト」は、本明細書に使用されるように、ＤＮＡ分子、又はタンパク質をコード化するＤＮＡ分子の一部分を指す。ＤＮＡ分子は、タンパク質をコード化するオープンリーディングフレーム（エキソン配列として）を含み得、さらにイントロン配列を含むことができる。本明細書に使用されているように、用語「イントロン」はタンパク質に翻訳されず、たいていエキソン間に見られる、与えられた遺伝子において存在するＤＮＡ配列を指す。通常、１以上のプロモータ、エンハンサー、リプレッサー及び／又は、当該技術分野で周知であるような、遺伝子の活性又は発現を調節するための他の調節配列に、遺伝子が操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）リンクされる（又はそれを含みうる）ことは望ましい。
本明細書で使用されているように「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され、介在配列（イントロン）が取り除かれた、組み換え型のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用されているように、用語「操作可能にリンクした」は、互いに機能的に関係する又はカップルする（ｃｏｕｐｌｅｄ）ような２つのポリヌクレオチド領域間の関係を、記述する。例えば、プロモーター（又は他の発現調節配列）は、それがコード配列の転写を制御する（及び達成することができる）場合、コード配列に操作可能にリンクされている。操作可能にリンクしたプロモーターはたいてい、コード配列の上流に位置するが、それは必ずしもコード配列に隣接していない。
「発現調節配列」は、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネーター、配列内リボソーム進入部位 （ＩＲＥＳ）など、ＤＮＡ調節配列であり、これらは宿主細胞においてコード化配列の発現を提供する。典型的な発現調節配列は「ＧｏｅｄｄｅｌによるＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）」において記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが細胞において結合し、コード配列の下流（３’方向）の転写を発生させることができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用されているように、プロモーター配列は転写開始部位によってその３’末端に境界があり、上流（５’方向）へ拡がって、バックグラウンドを超えて検知可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小限の塩基数又は要素数を含む。プロモーター配列内では、ＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）と同様に、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１と共にマッピングすることにより都合よく定義される）が見られる。真核生物プロモーターは頻繁に、しかし常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０及び３５のコンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガーノ配列を含む。
様々異なるソースからの、恒常的な誘導性の及び抑制可能なプロモーターを含む多くのプロモーターが、当該技術分野において周知である。代表的なソースは例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母菌、細菌の細胞種を含み、これらソースからの適切なプロモーターは容易に入手可能であり、又は、公にオン・ラインで、又は例えば他の商業上又は個人のソースと同様にＡＴＣＣなどの保管場所から入手可能な配列に基づいて、合成して作ることができる。プロモータは一方向性かもしれないし（すなわち、１方向に転写を開始する）、又は双方向性かもしれない（すなわち、３つ’又は５’方向のいずれかに転写を開始する）。プロモータの限定しない例は例えば、Ｔ７細菌発現システム、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現システム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターを含む。誘導性のプロモーターは、Ｔｅｔシステム（米国特許第５，４６４，７５８号及び第５，８１４，６１８号）、エクジソン誘導システム（Ｎｏ ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３（８）３３４６−３３５１）、Ｔ−ＲＥｘ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）， ＬａｃＳｗｉｔｃｈＲ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ））、及び Ｃｒｅ−ＥＲＴ・タモキシフェン誘導リコンビナーゼ システム （Ｉｎｄｒａ ら． Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）ｅ９９；米国特許第７，１１２，７１５号）を含む。Ｋｒａｍｅｒ及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００５） ３０８ １２３−１４４、又は、所望の細胞における発現に適した、当該技術分野において既知である任意のプロモーターを、一般に参照されたい。
本明細書で使用されているように「ミニマルプロモーター」は、転写開始部位を定義する部分的なプロモーター配列を指すが、それ自身に転写を開始させる能力はなく、仮にあったとしても効率的に開始させる能力はない。こうしたミニマルプロモーターの活性は、テトラサイクリンにコントロールされるトランス活性化因子などアクチベーターの、操作可能にリンクした結合部位への結合に依存する。
用語「ＩＲＥＳ」又は「配列内リボソーム進入部位」は、ポリシストロニックなメッセンジャーＲＮＡでコード化されるコード配列の翻訳を増強するように働くポリヌクレオチドの要素を指す。ＩＲＥＳ要素は、リボソームを直接動員しメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子へ結合させることにより、典型的なリボソーム・スキャンに関与する７−メチル・グアノシン・キャップを迂回することによって、翻訳の開始を媒介する。ＩＲＥＳ配列の存在は、所望のタンパク質のキャップ非依存性の翻訳レベルを増加させ得る。初期の出版物はＩＲＥＳ配列を「翻訳エンハンサー」として言及している。例えば、カルディオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒａｌ）のＲＮＡの「翻訳エンハンサー」は、ボリス＝ローリーにＰａｌｍｅｎｂｅｒｇらによるの米国特許第４，９３７，１９０号及びＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅによる米国特許第５，７７０，４２８号において述べられている。
本明細書に使用されるように用語「エンハンサー」は、例えば操作可能にリンクされる遺伝子又はコード配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、コード配列から何キロベースも離れて位置し、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターンまたはＤＮＡ構造における変化を媒介することができる。様々な異なるソースからの多くのエンハンサーが当該技術分野において周知であり、クローン化されたポリヌクレオチドとして、又はその内部で入手可能である（例えば他の市販の又は個人のソースと同様にＡＴＣＣなどのデポジトリから）。プロモータ（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む多くのポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列を含む。操作可能にリンクしたエンハンサーは、コード配列の上流に、配列内に、又は下流に位置し得る。用語「Ｉｇ‐エンハンサー」は、Ｉｇ座位内にマッピングされたエンハンサー領域由来のエンハンサー要素を指す（例えばこうしたエンハンサーは、重鎖（mu）５′エンハンサー、軽鎖（カッパー）５′エンハンサー、カッパおよびmuのイントロン性のエンハンサー、および３′エンハンサーを含む（（Ｐａｕｌ ＷＥ （Ｅｄ．） Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３） ｐａｇｅｓ ３５３−３６３；米国特許第． ５，８８５，８２７号を全般的に参照されたい））。
「ターミネーター配列」は転写の終了を結果としてもたらす配列である。ターミネーター配列は当該技術分野において周知であり、限定しないが、ポリＡ（例えばＢｇｈポリＡ及びＳＶ４０ポリＡ）ターミネーターを含む。転写の終了のシグナルは、典型的には３′非翻訳領域（又は「３′ＵＴ」）の領域、随意のイントロン（介在配列又は「ＩＶＳ」とも呼ばれる）及び１以上のポリ・アデニル化シグナル（「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」）を含む。ターミネーター配列は、「ＩＶＳ−ｐＡ」、「ＩＶＳ＋ｐ（Ａ）」、「３′ ｕｔ＋ｐ（Ａ）」又は「３′ｕｔ／ｐ（Ａ）」と呼ばれてもよい。自然のあるいは合成のターミネーターは、ターミネーター領域として使用され得る。
用語「ポリアデニル化」、「ポリアデニル化配列」と「ポリアデニル化シグナル」、「ポリＡ」、「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」は、ＲＮＡ転写物に存在する核酸配列を指し、該配列は、ポリアデニルトランスフェラーゼ酵素が存在する場合に転写物がポリアデニル化されるのを可能にする。多くのポリアデニル化シグナルが当該技術分野で周知である。制限しない例は、ヒト変異体成長ホルモン・ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルを含む。
本明細書で使用されるように、用語「スプライス部位」は、切断され、及び／又は対応するスプライス部位に連結されるのに適切であるように、真核細胞のスプライシング（ｓｐｉｃｉｎｇ）機構によって認識され得るポリヌクレオチドを指す。スプライス部位は、プレｍＲＮＡに存在するイントロンの切除を可能にする。典型的には、スプライス部位の５’部分はスプライスドナーと呼ばれ、３’の対応するスプライス部位はアクセプタースプライス部位と呼ばれる。用語「スプライス部位」は、例えば、自然発生のスプライス部位、設計されたスプライス部位、例えば、合成スプライス部位、古典的な又はコンセンサス・スプライス部位、及び／又は、非古典的なスプライス部位、例えば、潜在性 のスプライス部位を含む。
「シグナル配列」はコード配列の前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞と通じて細胞表面へポリペプチドを方向づける、又は培地にポリペプチドを分泌させる、ポリペプチドのＮ末端のシグナルペプチドをコード化し、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞を去る前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に在来の様々なタンパク質に関して見られる。
本明細書に使用されるように、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の存在下で及び適した温度とｐＨで誘導される条件下に置かれたとき、精製した制限消化物でのように自然に生じるか、合成して製造されるかどうかにかかわらず、合成の開始点として働くことができる、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖又は二本鎖であってもよく、誘発剤の存在下で所望する伸長産物の合成を準備するのに十分長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマーのソース及び方法の使用を含む多くの因子に依存する。例えば診断の適用のために、オリゴヌクレオチド・プライマーは、標的配列の複雑度によって、典型的には１５−２５以上のヌクレオチドを含むが、それはより少数のヌクレオチドを含んでもよい。ポリヌクレオチド・プライマーは、例えば、リン酸ジエステル法（Ｎａｒａｎｇ ら， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６８：９０， （１９７９）；米国特許第 ４，３５６，２７０；及び Ｂｒｏｗｎら， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６８：１０９， （１９７９）を参照されたい）のホスホトリエスルのような、任意の適切な方法を使用して調製され得る。
本明細書で使用されるように、用語「制限エンドヌクレアーゼ」と「制限酵素」は細菌の酵素を指し、それぞれ、特異的なヌクレオチド配列で、又はその近傍で、二本鎖ＤＮＡを切断する。制限部位の限定しない例は、以下により詳細に説明される；記載される機能的要求を満たす限り、記載される方法において他の制限部位が使用のために熟考されることもまた理解されよう。
本明細書に使用されるように、用語「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」又は「合成ポリペプチド」は、対応するポリヌクレオチド配列又はその部分、又はアミノ酸配列又はその部分が、同等の自然発生の配列と比較して、設計され、又は新たに合成され、又は修飾された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド又は合成遺伝子は、限定しないが、核酸又はアミノ酸配列の化学合成を含む、当該技術分野において周知の方法によって、調製され得る。合成遺伝子は、アミノ酸又はポリヌクレオチド（あるいは両方）のレベルのいずれかで、自然発生の遺伝子とは典型的に異なり、合成的な発現調節配列の文脈内に典型的に位置する。
テンプレートを操作する方法
本明細書に開示される特定の実施形態は、を抗体遺伝子の単一プライマー増幅において使用するためのニック・ライゲーションを用いて、あらかじめ決められた配列の導入によって操作されたテンプレートを作成する新しい方法を提供する。こうした方法において、例えばＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）などのポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの５’又は３’末端で、あらかじめ決められた配列も導入する第２鎖ｃＤＮＡの合成に使用される。様々な実施形態において、方法は、第１鎖ｃＤＮＡ又は第２鎖ｃＤＮＡのいずれかであるポリヌクレオチドの部分に対して、アニーリングする及び相補的であるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程を含み、ここで、オリゴヌクレオチドは、第２オリゴヌクレオチドにアニーリングするあらかじめ決められた配列を有し、アニーリングされたポリヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼの存在下で連結される。
本明細書に開示される特定の実施形態は、を抗体遺伝子の単一プライマー増幅において使用するためのニック・ライゲーションを用いて、あらかじめ決められた配列の導入によって操作されたテンプレートを作成する新しい方法を提供する。こうした方法において、例えばＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）などのポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの５’又は３’末端で、あらかじめ決められた配列も導入する第２鎖ｃＤＮＡの合成に使用される。様々な実施形態において、方法は、第１鎖ｃＤＮＡ又は第２鎖ｃＤＮＡのいずれかであるポリヌクレオチドの部分に対して、アニーリングする及び相補的であるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程を含み、ここで、オリゴヌクレオチドは、第２オリゴヌクレオチドにアニーリングするあらかじめ決められた配列を有し、アニーリングされたポリヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼの存在下で連結される。
特に有用な実施形態において、操作されたテンプレートからの標的配列は発現ビヒクルにクローン化されて、例えば抗体ライブラリのようなポリペプチド又はタンパク質のライブラリを提供する。
サンプル
本明細書に記載される方法において、使用されるサンプルは、核酸を含むことがある任意の生体材料を含み得る。サンプルは様々なソースに由来することがある。いくつかの実施形態において、ソースは、例えばヒト、ヒトではない哺乳動物、哺乳動物、動物、げっ歯類、両生動物、魚類、爬虫類、微生物、細菌、植物、菌（ｆｕｎｇｕｓ）、酵母菌及び／又はウィルスかもしれない。
本明細書に記載される方法において、使用されるサンプルは、核酸を含むことがある任意の生体材料を含み得る。サンプルは様々なソースに由来することがある。いくつかの実施形態において、ソースは、例えばヒト、ヒトではない哺乳動物、哺乳動物、動物、げっ歯類、両生動物、魚類、爬虫類、微生物、細菌、植物、菌（ｆｕｎｇｕｓ）、酵母菌及び／又はウィルスかもしれない。
いくつかの実施形態では、サンプルは生体サンプルであってもよい。いくつかの実施形態において、生体サンプルは例えば、細胞培養、組織切片、凍結切片、生検標本及び剖検サンプルを含んでもよい。
サンプルはとりわけ、臨床的サンプル、環境サンプル又は研究サンプルであり得る。臨床的サンプルは、中でも鼻咽頭の洗浄液、血液、血漿、無細胞の血漿、バフィーコート、唾液、尿、便通、痰、粘液、創傷綿棒、組織生検、乳、流体吸引液、綿棒（例えば鼻咽頭のスワブ）、及び／又は組織を含み得る。研究サンプルは培養細胞、初代細胞、細菌、芽胞、ウィルス、微小な生物体（ｓｍａｌｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、上にリストされた任意の臨床的サンプルのいずれかを含み得る。サンプルは、診断目的（例えば感染性因子など臨床的分析物の定量的測定）のために、又はモニターする目的（例えば疾患又は障害の経過をモニターすること）のために収集され得る。例えば、ポリヌクレオチドのサンプルは、疾患又は障害を有する、又は疾患又は障害を有するリスクのある、又は疾患又は障害を有することが疑われる被験体から、収集され又は得られてもよい。
本開示において提供される核酸サンプルは、生物体に由来し得る。いくつかの実施形態において、生物体の全体（ｅｎｔｉｒｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ）が使用され得る。いくつかの実施形態において、生物体の部分が使用され得る。例えば、生物体の一部は、臓器、多数の組織を含む１片の組織、単一の組織を含む１片の組織、混合された組織ソースの複数の細胞、単一の組織ソースの複数の細胞、単一の組織ソースの単細胞、混合された組織ソースの複数の細胞からの無細胞の核酸、単一の組織ソースの複数の細胞からの無細胞の核酸、及び単一の組織ソースの単一の細胞からの無細胞の核酸、及び／又は体液を含む。いくつかの実施形態において、生物体の部分は、ミトコンドリア、核、又は本明細書に説明された他の区画などの区画である。いくつかの実施形態において、生物体の部分は、流体において存在する無細胞の核酸（例えば循環する無細胞の核酸）である。
組織はいずれかの胚葉に由来し得る。いくつかの実施形態において、胚葉は神経冠、内胚葉、外胚葉、及び／又は中胚葉であってもよい。胚葉は以下のいずれかの組織、結合組織、骨格筋組織、平滑筋組織、神経系組織、上皮組織、外胚葉性組織、内胚葉組織、中胚葉性組織、内皮組織、心筋組織、脳組織、脊髄組織、脳神経組織、脊髄神経組織、ニューロン組織、皮膚組織、呼吸組織、生殖組織、及び／又は消化組織のいずれかに生じてもよい。いくつかの実施形態において、臓器は任意の胚葉に由来し得る。いくつかの実施形態において、胚葉は、以下の臓器、副腎、肛門、虫垂、膀胱、骨、脳、気管支、耳、食道、目、胆嚢、生殖器、心臓、視床下部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、大腸、リンパ節、髄膜、口、鼻、膵臓、副甲状腺、脳下垂体、直腸、唾液腺、皮膚、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、舌、気管、尿管、及び／又は尿道のいずれかに生じてもよい。いくつかの実施形態において、臓器は新生物を含んでもよい。いくつかの実施形態において、新生物は腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍は癌であってもよい。
細胞はいずれかの組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、外分泌の分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、角質化する上皮細胞、ぬれた重層バリア・上皮細胞（ｗｅｔ ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｂａｒｒｉｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、感覚性伝達細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）、自律神経性のニューロン細胞、感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロン、グリア細胞、水晶体細胞、代謝及び貯蔵細胞（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｅｌｌｓ）、腎細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、血液及び免疫系細胞、生殖細胞、哺育細胞、及び／又は間質細胞を含んでもよい。
体液は、液体における生体の粒子の懸濁液であってもよい。例えば、体液は血液かもしれない。いくつかの実施形態において、血液は、血漿、及び／又は細胞（例えば赤血球、白血球又は循環する珍しい細胞）、及び／又は血小板を含むかもしれない。いくつかの実施形態において、血液サンプルは１以上の細胞型を失った血液を含む。いくつかの実施形態において、血液サンプルは１つ以上の細胞型に富んだ血液を含む。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、不均質か、均質か、又はほぼ均質な細胞を混合したものを含む。体液は例えば、全血、分画された血液、血清、血漿、汗、涙、耳の液（ｅａｒ ｆｌｏｗ）、痰、リンパ、骨髄懸濁液、リンパ、尿、唾液、精液、膣の液（ｖａｇｉｎａｌ ｆｌｏｗ）、便、大腿骨頸部洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、眼房液、皮脂、内リンパ、腹水、胸膜液、耳垢、心外膜の液、及び、呼吸器で腸の及び／又は尿生殖器の管の分泌物を含んでもよい。いくつかの実施形態において、体液が細胞の混合物を含んでいる様々な臓器（例えば肺）に接し得る。
体液は少なくとも１個の細胞を含み得る。細胞は、例えば、悪性の表現型の細胞；胎児細胞（例えば母体の末梢血における胎児細胞）；腫瘍細胞（例えば、腫瘍から血液及び／又は他の体液中へ脱落した腫瘍細胞）；癌性の細胞；不死の細胞；幹細胞；ウィルスに感染した細胞（例えばＨＩＶに感染した細胞）；対象の遺伝子がトランスフェクトされた細胞；自己反応性の障害で苦しむ被験体の末梢血中に存在するＴ細胞及び／又はＢ細胞の異常なサブタイプ、を含んでもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、赤血球、白血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、幹細胞、赤血球系細胞、癌細胞、腫瘍細胞、又は、内胚葉、中胚葉、外胚葉、及び／又は神経冠組織からの任意の組織から単離される細胞のうちの１つであってもよい。細胞は、一次のソースから、及び／又は二次のソース（例えば細胞株）からかもしれない。体液はまた、ポリヌクレオチド（例えば無細胞の胎児のポリヌクレオチド、又は母体の血液において循環するＤＮＡ）を含んでもよい。
サンプル内の核酸は細胞又は細胞内コンパートメントの領域内に位置してもよい。細胞の領域又はコンパートメントは、膜、細胞器官、及び／又は、サイトゾルを含んでもよい。例えば、限定しないが、膜は、核膜、原形質膜、小胞体膜、細胞壁、細胞膜、及び／又はミトコンドリア膜を含んでもよい。膜は、完全な膜又は膜の断片を含んでもよい。例えば、細胞小器官は限定されないが、核小体、核、葉緑体、色素体、小胞体、粗面小胞体、滑面小胞体、中心体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、液胞、先体、オートファゴソーム、中心小体、繊毛、眼点装置、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム 、リソソーム、メラノソーム、紡錘残留体、筋原繊維、パレンテソーム、ペルオキシソーム、プロテアソーム、リボソーム、包嚢、多面小体、クロロソーム、鞭毛、マグネトソーム（ｍａｇｅｎｅｔｏｓｏｍｅ）、核封入体、プラスミド、チラコイド、メソゾーム、細胞骨格、及び／又は小胞を含んでもよい。いくつかの実施形態において、細胞小器官は、完全な膜又は膜の断片を含んでもよい。例えばサイトゾルは、原形質膜、細胞膜、及び／又は細胞壁で閉じ込められてもよい。
サンプルは、タンパク質に結合していない核酸を含んでもよい。核酸は、タンパク質の結合を減少させ、結合したタンパク質を除去し、及び／又は、タンパク質の結合を妨げる薬剤で処理されてもよい。いくつかの実施形態において、薬剤は、化学薬剤、温度変化のソース、音響エネルギーのソース、光学的エネルギーのソース、光エネルギーのソース、及び／又は、熱エネルギーのソースであってもよい。いくつかの実施形態において、化学薬剤は酵素であってもよい。いくつかの実施形態において、酵素はタンパク質のアミノ酸間の結合を切断してもよい。
核酸を含むサンプルは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、消化されたＤＮＡ、断片化されたＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）、及び／又は一本鎖ＲＮＡを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、核酸（例えばゲノムＤＮＡ）が、ウィルス、酵母菌、細菌、動物、及び植物などの種のゲノム全体を含んでもよい。核酸（例えばゲノムＤＮＡ）は、さらに高次の生命形態（例えばヒトのゲノムＤＮＡ）からであってもよい。いくつかの実施形態において、核酸（例えばゲノムＤＮＡ）は、１以上の染色分体繊維（ｃｈｒｏｍａｔｉｄ ｆｉｂｅｒｓ）、又は、種の、又は生物体の、又は細胞の核酸（例えばゲノムＤＮＡ）のうち少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、又は９８％を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、核酸は、抗体の重鎖又は軽鎖又はその断片の核酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、抗体の１以上の重鎖又は軽鎖又はその断片の核酸配列を含んでもよい。例えば抗体は、限定しないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＹ又はＩｇＭの任意のタイプであってもよい。各々の抗体が同じサブタイプである場合、核酸は、１以上の抗体の配列を含んでいてもよい。各々の抗体が異なるサブタイプである場合、核酸は、１以上の抗体の配列を含んでいてもよい。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要な種類の免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、及びそれらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２）に分けることができる。異なる種類の免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なる種類の免疫グロブリンのサブユット構造及び三次元配置は、周知である。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプの１つに、割り当てることができる。
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合性フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗体フラグメント」又は「抗体の機能性フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を持つ抗体の１以上のフラグメントを意味するように、本発明において、互換的に使用される（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ら．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３ （９） １１２６−１１２９ （２００５）を全体的に参照されたい）。限定しないが、抗体の「抗原結合性部分」との用語の中に包含される、抗体フラグメントの限定しない例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により連結した２つの抗原結合性フラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）、抗体の単一アームの ＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成る、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ら．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６） 及び、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は別個の遺伝子によってコードされるが、組み換え法を使用して、それらがＶＬとＶＨの領域が一価分子を形成するように対となる単一タンパク質鎖として作られるのを可能にする合成リンカーによって、それらは連結され得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる； 例えば Ｂｉｒｄ ら． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３ ４２６； 及び Ｈｕｓｔｏｎら． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９ ５８８３； 及びＯｓｂｏｕｒｎら． （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：７７８を参照されたい）。こうした単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」との用語の中に包含されるように意図される。特異的なｓｃＦｖの任意のＶＨとＶＬの配列は、完全なＩｇＧ分子又は他のアイソタイプをコード化する発現ベクターを作製するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノムの配列に連結され得る。ＶＨ及びＶＬは、タンパク質化学又は組み換えＤＮＡ技術のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖ又は免疫グロブリンの他のフラグメントの生成において使用することもできる。二重特異性抗体など単鎖抗体の他の形体も包含される。
「Ｆ（ａｂ'）２」及び「Ｆａｂ」部分は、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼで免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を処理することによって製造されることがあり、２つのＨ鎖の各々のヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の近くの免疫グロブリンの消化により作製された抗体フラグメントを含み得る。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ（Ｌ鎖可変部）及びＣＬ（Ｌ鎖定常部）から構成されるＬ鎖と、ＶＨ（Ｈ鎖可変部）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常部におけるγ１領域）から構成されるＨ鎖フラグメントとが、ジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で接続される、２つの相同な抗体フラグメントを作製する。これらの２つの相同な抗体フラグメントの各々はＦａｂ'と呼ばれる。ペプシンはまた、２つのＨ鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、２つの前述のＦａｂ' がヒンジ領域で接続される抗体フラグメントよりわずかに大きな抗体フラグメントを作製する。この抗体フラグメントは「Ｆ（ａｂ'）２」と呼ばれる。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン、及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの、１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での、少数の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ'のための本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ'）２抗体フラグメントは、もともと、間にヒンジ・システインを有するフラグメントであるＦａｂ'フラグメントの対として製造される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、タイトな（ｔｉｇｈｔ）非共有結合における、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。可変ドメインの３つの超可変領域それぞれが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する（ｄｅｆｉｎｅ）のは、この配置においてである。総じて、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変性のドメイン（又は、抗原に特異的なわずか３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有するが、親和性は結合部位全体よりも低い。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」の抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬのドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓＦｖが抗原結合に関して所望される構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの評価については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ， Ｅｄｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９ ３１５ （１９９４）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、核酸が抗体の一部を含んでもよい。例えば、抗体の一部は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、ａｂフラグメント（Ｆａｂ）又は結晶化可能断片（Ｆｃ）かもしれない。
ポリヌクレオチドを調製する方法
本明細書で提供される開示において、核酸はポリヌクレオチドを得るために少なくとも１つのサンプルから単離されてもよい。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、消化されたＤＮＡ、フラグメント化したＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）及び／又は一本鎖ＲＮＡを、サンプルから単離する標準分析法は、当業者に周知であり、本明細書中のポリヌクレオチドを得るための方法と共に使用されてもよい。好ましい実施形態において、全ＲＮＡは、サンプルから単離され、当業者に周知の方法（例えば逆転写）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ変換されて、第１の又は第２鎖ｃＤＮＡを作成する。
本明細書で提供される開示において、核酸はポリヌクレオチドを得るために少なくとも１つのサンプルから単離されてもよい。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、消化されたＤＮＡ、フラグメント化したＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）及び／又は一本鎖ＲＮＡを、サンプルから単離する標準分析法は、当業者に周知であり、本明細書中のポリヌクレオチドを得るための方法と共に使用されてもよい。好ましい実施形態において、全ＲＮＡは、サンプルから単離され、当業者に周知の方法（例えば逆転写）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ変換されて、第１の又は第２鎖ｃＤＮＡを作成する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは１つの部分を有することがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは１以上の部分を有することがある。例えば、ポリヌクレオチドは、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の部分を有することがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの任意の部分がポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの任意の部分がポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの任意の部分がポリヌクレオチドの中央（ｍｏｄｄｌｅ）の近くで配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の部分がポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の部分がポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の部分がポリヌクレオチドの中央の近くで配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第２の部分がポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第２の部分がポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第２の部分がポリヌクレオチドの中央の近くで配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第３の部分がポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第３の部分がポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置されることがある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの第３の部分がポリヌクレオチドの中間の近くで配置されることがある。
ライブラリ
本明細書で使用されるように、「ライブラリ」は、複数のポリヌクレオチド、タンパク質、又は、２又は２以上の異なるが関連するメンバーの収集物を含む細胞を指す。「合成ライブラリ」は、複数の合成ポリヌクレオチド、又は、前述の複数の合成ポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。「半合成のライブラリ（ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ）」は、複数の半合成のポリヌクレオチド、又は、前述の複数の半合成のポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。
本明細書で使用されるように、「ライブラリ」は、複数のポリヌクレオチド、タンパク質、又は、２又は２以上の異なるが関連するメンバーの収集物を含む細胞を指す。「合成ライブラリ」は、複数の合成ポリヌクレオチド、又は、前述の複数の合成ポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。「半合成のライブラリ（ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ）」は、複数の半合成のポリヌクレオチド、又は、前述の複数の半合成のポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。
静的なライブラリ（Ｓｔａｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）は、典型的にそれらのサイズと範囲において限定される。例えばファージディスプレイライブラリは１０１２ものメンバーを表示することができ、リボソームのライブラリは、潜在的に~１０１６メンバーを含んで構築された。細菌と哺乳動物細胞の表面上で提示されるライブラリは通常このコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ）ではなく、典型的には１０９未満のメンバーを有する。加えて、頑強なライブラリ構築と選択は、ライブラリが何倍かの重複を含むライブラリを通常必要とし、それはさらにこの理論的な複雑性を制限し、全ライブラリをスクリーニングするのを遅らせ、割高にし、いくつかの場合において実用的なものにする。
複雑性のこれらのレベルにもかかわらず、そのような静的なライブラリは、可能な配列スペース、（すなわち対象のポリヌクレオチド領域内のありえる順列の潜在的な数）のごく一部分のみを探索することができる。例えば、重鎖ＩｇＧ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３相補性領域の内の３０を超えるアミノ酸を含むことがあり、この単鎖に２０３０を超えうる順列を与え、最大の潜在的な静的ライブラリでさえ矮小化する。この制限のために、研究者は、蛋白質配列とライブラリを発展させるための方法を探索した。
本明細書で提供される開示において、サンプルのライブラリは、ファージディスプレイ、細菌発現、及び哺乳類発現に関して、限定しないが、ＸｂａＩ、ＢｓｐＥＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、及びＡｇｅＩを含む操作された制限部位において、単一プライマーにより増幅される抗体フラグメントを、適切なベクターにクローン化することにより、作製されてもよい。他の制限部位は下記に述べられ、本明細書に記載される方法のために使用が考慮される。
このライブラリには以下の性質がありえる：ｉ）特にテンプレートの調製が混合プライマーと共に多重化される場合、ライブラリの構築が容易である。ｉｉ）ライブラリは潜在的に、従来のＰＣＲ法を使用して作られたものと比較して、１０１０から１０１２までのバイアスのない抗体レパートリーをより広くカバーする。従来のＰＣＲ増幅は、最適化するのにしばしば問題になる、異なったアニーリング温度を有する２つの遺伝子特異的なプライマーを必要とする。
これは、バイアスのある増幅、及び非特異性の増幅をもたらし、構築されたライブラリにおける不十分な品質を結果として生じる。ｉｉｉ）例において示されるように潜在的な多様性がより高いので、複数の抗原を使用して１つのマウスを免疫化することができ、単一のライブラリを使用して各抗原に対する抗体の大きなパネル（ｌａｒｇｅ ｐａｎｅｌ）を分離することができる。
これは、バイアスのある増幅、及び非特異性の増幅をもたらし、構築されたライブラリにおける不十分な品質を結果として生じる。ｉｉｉ）例において示されるように潜在的な多様性がより高いので、複数の抗原を使用して１つのマウスを免疫化することができ、単一のライブラリを使用して各抗原に対する抗体の大きなパネル（ｌａｒｇｅ ｐａｎｅｌ）を分離することができる。
いくつかの実施形態において、ライブラリのタイプは、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ニワトリ、サメ、ラマ、馬、サル、ヤギ、カエル、魚、等の抗体のＦａｂ， Ｆ（ａｂ'）２， ｓｃＦｖのフラグメントを含んでもよい。
細胞ベースの発現系は、任意の適切な原核生物のシステム又は真核生物の発現システムを含む。特定の実施形態では、好ましい細胞ベースの発現系は、容易に確かに育てることができ、合理的に速い成長速度を有し、十分に特徴化した発現系を有し、容易に及び効率的に形質転換しトランスフェクトすることができるものである。
ファージディスプレイ
「ファージディスプレイ」は、異なる（ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチドが、ファージ（例えば繊維状ファージ、粒子状物質）の表面上の外殻タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として、提示される（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大きなライブラリを、高親和性で標的分子と結合する配列に関して迅速に効率的に選別することができる、という事実にある。ファージ上へのペプチド及びタンパク質のライブラリの提示は、特異的な結合特性を備えるポリペプチドに関して何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用された。多価のファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を通じて、小さいランダムなペプチドと小さいタンパク質を提示するために使用されてきた。Ｗｅｌｌｓ 及び Ｌｏｗｍａｎ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．， ３：３５５−３６２ （１９９２）、及びそこに引用された参考文献を参照されたい。１価のファージディスプレイにおいて、タンパク質又はペプチドライブラリが遺伝子ＩＩＩ又はその部分を融合し、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現し、その結果、ファージ粒子は融合タンパク質の１又は０コピーを提示する。結合力の効果は多価のファージに関連して減少し、その結果、ソーティングは内因性のリガンドの親和性に基づいており、ファージミド・ベクターが使用され、それはＤＮＡ操作を単純化する。Ｌｏｗｍａｎ 及び Ｗｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３：２０５−０２１６ （１９９１）を参照されたい。
「ファージディスプレイ」は、異なる（ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチドが、ファージ（例えば繊維状ファージ、粒子状物質）の表面上の外殻タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として、提示される（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大きなライブラリを、高親和性で標的分子と結合する配列に関して迅速に効率的に選別することができる、という事実にある。ファージ上へのペプチド及びタンパク質のライブラリの提示は、特異的な結合特性を備えるポリペプチドに関して何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用された。多価のファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を通じて、小さいランダムなペプチドと小さいタンパク質を提示するために使用されてきた。Ｗｅｌｌｓ 及び Ｌｏｗｍａｎ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．， ３：３５５−３６２ （１９９２）、及びそこに引用された参考文献を参照されたい。１価のファージディスプレイにおいて、タンパク質又はペプチドライブラリが遺伝子ＩＩＩ又はその部分を融合し、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現し、その結果、ファージ粒子は融合タンパク質の１又は０コピーを提示する。結合力の効果は多価のファージに関連して減少し、その結果、ソーティングは内因性のリガンドの親和性に基づいており、ファージミド・ベクターが使用され、それはＤＮＡ操作を単純化する。Ｌｏｗｍａｎ 及び Ｗｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３：２０５−０２１６ （１９９１）を参照されたい。
「ファージミド」は、細菌の複製起点（例えばＣｏ１Ｅ１）、及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムドイド・バクテリオファージ（ｌａｍｂｄｏｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を含む、任意の既知のバクテリオファージ上で使用されてもよい。一般に、プラスミドはまた、抗生物質耐性に関して選択可能なマーカーを含む。これらベクターへクローン化されるＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増やすことができる。ベクターを抱える細胞にファージ粒子の製造に必要なすべての遺伝子が提供される場合、プラスミドの複製のモードはローリングサークル複製に変わって、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーを作成し、ファージ粒子をパッケージングする（ｐａｃｋａｇｅ）。ファージミドは伝染性又は無感染のファージ粒子を形成してもよい。この用語はファージミドを含み、それは異種性のポリペプチドがファージ粒子の表面に提示されるように、遺伝子融合として異種性のポリペプチド遺伝子に連結されるファージ外殻タンパク質遺伝子又はそのフラグメントを含んでいる。
用語「ファージ・ベクター」は、異種性の及び複製可能な遺伝子を含むバクテリオファージの２本鎖複製型を意味する。ファージ・ベクターは、ファージ複製及びファージ粒子形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、好ましくは Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ又はその誘導体など糸状バクテリオファージ、又はラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４等、又はその誘導体などのラムドイドファージである。
用語「外殻タンパク質」はタンパク質を意味し、その少なくとも一部はウイルス粒子の表面に存在する。機能的な観点から、外殻タンパク質は任意のタンパク質であり、それは宿主細胞においてウイルスの組み立てプロセスの間にウイルス粒子と会合し、別の宿主細胞を感染させるまで、組み立てられたウィルスに引き続き会合している。外殻タンパク質は主要な外殻タンパク質かもしれないし、又はマイナーな外殻タンパク質かもしれない。「主要な」外殻タンパク質は一般に、ウィルス外殻にある外殻タンパク質であって、好ましくは少なくとも約５コピー、より好ましくは少なくとも約７コピー、さらに好ましくは少なくとも約１０コピー、又はそれ以上のたんぱく質である。主要な外殻タンパク質は、１つのビリオン当たり、何十、何百又は更に何千ものコピーにおいて存在してもよい。主要な外殻タンパク質の一例は、繊維状ファージのｐ８タンパク質である。
原核生物の発現系
これらの一般的ガイドラインでは、有用な微生物宿主は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属，（Ｅ． ｃｏｌｉなど）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｅｒｗｉｎｉａ，、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの様々な菌株（例えばＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ＮＯ．３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ＮＯ．５３３３８））からの細菌を含む。
これらの一般的ガイドラインでは、有用な微生物宿主は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属，（Ｅ． ｃｏｌｉなど）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｅｒｗｉｎｉａ，、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの様々な菌株（例えばＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ＮＯ．３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ＮＯ．５３３３８））からの細菌を含む。
真核生物発現システム
酵母菌
当業者に周知の酵母菌の多くの菌株もまた、ａｎｓｅｎｕｌａ属， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃｈｉａ， Ｒｈｉｎｏ−ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， および Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及び他の菌類からのものを含むポリペプチドの発現のための宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母菌は例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ 及び Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
酵母菌
当業者に周知の酵母菌の多くの菌株もまた、ａｎｓｅｎｕｌａ属， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃｈｉａ， Ｒｈｉｎｏ−ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， および Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及び他の菌類からのものを含むポリペプチドの発現のための宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母菌は例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ 及び Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
昆虫細胞
さらに、所望すれば、昆虫細胞システムを本発明の方法において利用することができる。こうしたシステムは例えば、Ｋｉｔｔｓ ら．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４：８１０−８１７ （１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４：５６４−５７２ （１９９３）；及び Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７：４５６６−４５７９ （１９９３）．によって記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）を含む。
さらに、所望すれば、昆虫細胞システムを本発明の方法において利用することができる。こうしたシステムは例えば、Ｋｉｔｔｓ ら．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４：８１０−８１７ （１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４：５６４−５７２ （１９９３）；及び Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７：４５６６−４５７９ （１９９３）．によって記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）を含む。
哺乳類の発現系
また、多くの適切な哺乳類宿主細胞は当該技術分野で周知であり、また、多数が、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209）から入手可能である。例は、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：４２１６−４２２０ （１９８０））、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞を含む。形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物産生と精製に適切な哺乳類宿主細胞及び方法の選択は、当該技術分野において周知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、及び、ＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらに典型的な哺乳類宿主細胞は、形質転換細胞株を含む霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株を含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロの培養物に由来する細胞株、同様に一次の外植体もまた適している。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型で不完全であり得るし、又は優勢に働く選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株は、限定されないが、マウス神経芽腫Ｎ２Ａ細胞、ヒーラ細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、ＢＡＬＢ／ｃ、又はＮＩＨマウ由来の３Ｔ３細胞株、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株を含み、これはＡＴＣＣから入手可能である。これらの細胞株の各々は知られており、タンパク質発現に利用可能である。
また、多くの適切な哺乳類宿主細胞は当該技術分野で周知であり、また、多数が、米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209）から入手可能である。例は、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：４２１６−４２２０ （１９８０））、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞を含む。形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物産生と精製に適切な哺乳類宿主細胞及び方法の選択は、当該技術分野において周知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、及び、ＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらに典型的な哺乳類宿主細胞は、形質転換細胞株を含む霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株を含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロの培養物に由来する細胞株、同様に一次の外植体もまた適している。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型で不完全であり得るし、又は優勢に働く選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株は、限定されないが、マウス神経芽腫Ｎ２Ａ細胞、ヒーラ細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、ＢＡＬＢ／ｃ、又はＮＩＨマウ由来の３Ｔ３細胞株、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株を含み、これはＡＴＣＣから入手可能である。これらの細胞株の各々は知られており、タンパク質発現に利用可能である。
リンパか、Ｂリンパ球前駆細胞の起原の細胞株などの、リンパ球に由来する細胞株もまた対象である。具体例は制限なしに、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１），１８−８１、 （Ｊａｃｋ ら．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ （１９８８） ８５ １５８１−１５８５）、 Ｒａｊｉ 細胞， （ＣＣＬ−８６）、 及びそれらの誘導体を含む。
代表的な市販で入手可能なウイルス発現ベクターは、限定されないが、Ｃｒｕｃｅｌｌ社から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６システム、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのレンチウイルスベースのｐＬＰ１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのレトロウイルス・ベクターであるｐＦＢ−ＥＲＶとｐＣＦＢ−ＥＧＳＨを含む。
本明細書に記載されるライブラリの発現に適しているエピゾームの発現ベクターは、宿主細胞において複製可能であり、適切な選択圧の存在下において、宿主細胞内の染色体外のエピソームとして存続する。（例えばＣｏｎｅｓｅ ら．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１ １７３５−１７４２ （２００４）を参照されたい）。代表的な市販で入手可能なエピゾームの発現ベクターは、限定されないが、 エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピゾームのプラスミドを含み、具体例はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７を含む。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのベクターｐｃＤＮＡ３．１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＢＫ−ＣＭＶは、制限しない例として、Ｔ抗原及びＳＶ４０複製起点をＥＢＮＡ１とｏｒｉＰの代わりに使用するエピゾームのベクターを示す。
オリゴヌクレオチド
本明細書に記載される方法において使用されるオリゴヌクレオチドは普遍的な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）テンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１つのオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１以上のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。例えば、普遍的なテンプレートを調製するために、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１０以上のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、及び／又は第１０のオリゴヌクレオチドが、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアダプター・オリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングする前に、アダプター・オリゴヌクレオチドは共に、ポリヌクレオチドへアニーリングしてもよい。いくつかの実施形態において、アダプター・オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへ連結する前に、アダプター・オリゴヌクレオチドは共に、ポリヌクレオチドへアニーリングしてもよい。
本明細書に記載される方法において使用されるオリゴヌクレオチドは普遍的な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）テンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１つのオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１以上のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。例えば、普遍的なテンプレートを調製するために、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１０以上のオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、及び／又は第１０のオリゴヌクレオチドが、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアダプター・オリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングする前に、アダプター・オリゴヌクレオチドは共に、ポリヌクレオチドへアニーリングしてもよい。いくつかの実施形態において、アダプター・オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへ連結する前に、アダプター・オリゴヌクレオチドは共に、ポリヌクレオチドへアニーリングしてもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５ 又は１００ ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５より多い、又は１００より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５ より少ない、又は１００より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは所望の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１つより多い所望の配列を含んでいてもよい。例えば、希望の配列は、制限エンドヌクレアーゼ制限部位、所定の配列、相補的配列、既知の配列、プライマー結合配列、普遍的な配列又は検出配列であってもよい。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列は普遍的な配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドを使用して、ポリヌクレオチドに１つより多い所望の配列を加えて、操作されたテンプレートを作ってもよい。いくつかの実施形態において、所望の配列はあらかじめ決められた配列であってもよい。例えば、あらかじめ決められた配列は、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０のあらかじめ決められた配列であってもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内の任意のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内の任意のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内の任意のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの中央の近くで配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３のあらかじめ決められた配列がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されるかもしれない。
いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列及び第２のあらかじめ決められた配列は、第１の又は第２のポリヌクレオチドの内の任意の配列に実質的に類似しない。
いくつかの実施形態において、所望の配列は、オリゴヌクレオチドの長さ未満の任意の長さのヌクレオチドであってもよい。例えば、所望の配列は １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は ９９ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０，より多い、又は９５より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、所望の配列は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０未満、又は９５未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。
オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド内の任意の部位に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’末端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端に実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’末端は、オリゴヌクレオチドの中央から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの中央にあってもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さ未満の任意のヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０，より多い、又は ９５より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０ 未満、９５未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意の部位に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端にあってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端にあるかもしれない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’末端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの５’末端の実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’末端は、オリゴヌクレオチドの中央から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの中央であってもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１つの部分を有することがある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１より多い部分を有することがある。例えば、オリゴヌクレオチドは、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の部分を有することがある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの任意の部分がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの任意の部分がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの任意の部分がオリゴヌクレオチドの中央の近くで配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１部分がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１部分がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１部分がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２部分がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２部分がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第２部分がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３部分がオリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３部分がオリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第３部分がオリゴヌクレオチドの中央の近くに配置されてもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、所望の配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触してもよい。いくつかの実施形態でオリゴヌクレオチドは、限定しないが、ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、アニーリングし、又は連結してもよい。例えば、所望の配列（例えばあらかじめ決められた配列）を備えたオリゴヌクレオチドは、酵素を使用してポリヌクレオチドに連結されてもよい。例えば、酵素はリガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ）であってもよい。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列を含むオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に連結されるかもしれない。いくつかの実施形態において、１より多いあらかじめ決められた配列がポリヌクレオチドに連結されてもよい。例えば、第１のあらかじめ決められた配列は、ポリヌクレオチドの１つの端に連結されてもよく、第２のあらかじめ決められた配列は、ポリヌクレオチドの他の端に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に相補的であってもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に逆相補的であってもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に相補的でなくてもよい。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列をポリヌクレオチドへ追加して、テンプレート（例えば操作されたテンプレート）を作成してもよい。例えば、テンプレートはテンプレート内のポリヌクレオチドを増幅するように設計された任意の方法において使用されてもよい。あらかじめ決められた配列は、ポリヌクレオチドのプライマー増幅において使用されてもよい。いくつかの実施形態では、単一のプライマーは、ポリヌクレオチド上に位置する少なくとも１つのあらかじめ決められた配列にアニーリングしてもよい。他の実施形態では、１より多いプライマーは、ポリヌクレオチド上に位置する少なくとも１つのあらかじめ決められた配列にアニーリングしてもよい。
いくつかの実施形態において、制限エンドヌクレアーゼの制限部位はオリゴヌクレオチド内に位置してもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼの制限部位は、オリゴヌクレオチド内の制限エンドヌクレアーゼ制限部位がポリヌクレオチドに固有の制限エンドヌクレアーゼ制限部位である場合、制限エンドヌクレアーゼによって認識される任意の部位であってもよい。例えば、以下の制限エンドヌクレアーゼのうちのいずれか１つによって認識される部位は、以下に制限しないが、使用されてもよい；Ａａｒ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、ＢｓｅＧ Ｉ、ＢｓｐＰ Ｉ、Ｃｆｒ Ｉ、ＥｃｏＮ Ｉ、Ｈｓｐ９２ ＩＩ、Ｎｌａ ＩＶ、Ｒｓａ Ｉ、Ｔａｉ Ｉ、Ａａｓ Ｉ、Ｂｂｓ Ｉ、ＢｓｅＪ Ｉ、ＢｓｐＴ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、ＥｃｏＯ１０９ Ｉ、Ｉ−Ｐｐｏ Ｉ、ＮｍｕＣ Ｉ、Ｒｓｒ ＩＩ、Ｔａｑａ Ｉ、Ａａｔ ＩＩ、Ｂｂｕ Ｉ、ＢｓｅＬ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、Ｃｐｏ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｋａｓ Ｉ，Ｎｏｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ａｃｃ６５ Ｉ、ＢｂｖＣ Ｉ、ＢｓｅＭ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、Ｃｓｐ４５ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｋｐｎ２ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｔａｓ Ｉ、ＡｃｃＢ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、ＢｓｅＭ ＩＩ、ＢｓｒＦ Ｉ、Ｃｓｐ６ Ｉ、Ｅｈｅ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｎｓｂ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｔａｔ Ｉ、Ａｃｃ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、ＢｓｅＮ Ｉ、ＢｓｒＧ Ｉ，Ｃｓｐ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、ＫｓｐＡ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、Ｔａｕ Ｉ、Ａｃｃ ＩＩＩ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｌｗｅ Ｉ、Ｎｓｐ Ｉ、Ｓａｔ Ｉ、Ｔｆｉ Ｉ、Ａｃｉ Ｉ、Ｂｃｉ ＶＩ、ＢｓｅＳ Ｉ、ＢｓｒＳ Ｉ，Ｄｐｎ Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ Ｉ、Ｍｂｉ Ｉ、Ｏｌｉ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｔｌｉ Ｉ、Ａｃｌ Ｉ、Ｂｃｌ Ｉ、ＢｓｅＸ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、Ｄｐｎ ＩＩ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｍｂｏ Ｉ、Ｐａｃ Ｉ、Ｓａｕ９６ Ｉ、Ｔｒｕ１ Ｉ、Ａｄｅ Ｉ、Ｂｃｎ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、ＢｓｓＫ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、Ｆｓｅ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｐａｅ Ｉ、Ｓｂｆ Ｉ、Ｔｒｕ９ Ｉ、Ａｆｅ Ｉ，Ｂｃｕ Ｉ、Ｂｓｇ Ｉ、ＢｓｓＳ Ｉ、Ｄｒａ ＩＩＩ、ＦｓｐＡ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＰａｅＲ７ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、Ｔｓｅ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩ、Ｂｆａ Ｉ、Ｂｓｈ１２３６ Ｉ、Ｂｓｔ１１０７ Ｉ、Ｄｒｄ Ｉ、Ｆｓｐ Ｉ、Ｍｌｓ Ｉ、Ｐａｇ Ｉ、Ｓｃｈ Ｉ、Ｔｓｐ４５ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｓｈ１２８５ Ｉ、Ｂｓｔ９８ Ｉ、Ｅａｅ Ｉ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｐａｕ Ｉ，ＳｃｒＦ Ｉ、Ｔｓｐ５０９ Ｉ、Ａｇｅ Ｉ、Ｂｆｍ Ｉ、ＢｓｈＮ Ｉ、ＢｓｔＡＰ Ｉ、Ｅａｇ Ｉ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｐｃｉ Ｉ、Ｓｄａ Ｉ、ＴｓｐＲ Ｉ、Ａｈｄ Ｉ、ＢｆｒＢ Ｉ、ＢｓｈＴ Ｉ、ＢｓｔＢ Ｉ、Ｅａｍ１１０４ Ｉ、Ｈａｅ ＩＩＩ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｐｄｉ Ｉ，Ｓｄｕ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ Ｉ、Ａｌｅ Ｉ、ＢｆｕＡ Ｉ、ＢｓｉＥ Ｉ、ＢｓｔＥ ＩＩ、Ｅａｍ１１０５ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｄｍ Ｉ、ＳｅｘＡ Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｅ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、ＢｆｕＣ Ｉ、ＢｓｉＨＫＡ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｅａｒ Ｉ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍｐｈ１１０３ Ｉ、Ｐｆｌ２３ ＩＩ、ＳｆａＮ Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｒ Ｉ、Ａｌｕ Ｉ、Ｂｆｕ Ｉ、ＢｓｉＷ Ｉ、ＢｓｔＮ Ｉ、Ｅｃｉ Ｉ，Ｈｉｎ１ Ｉ、Ｍｓｃ Ｉ、ＰｆｌＦ Ｉ、Ｓｆｃ Ｉ、Ｖａｎ９１ Ｉ、Ａｌｗ２１ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ、Ｂｓｌ Ｉ、ＢｓｔＯ Ｉ、Ｅｃｌ１３６ ＩＩ、Ｈｉｎ４ Ｉ、Ｍｓｅ Ｉ、ＰｆｌＭ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｖｓｐ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｔＵ Ｉ、ＥｃｌＨＫ Ｉ、Ｈｉｎ６ Ｉ、Ｍｓｌ Ｉ、Ｐｆｏ Ｉ、Ｓｆｏ Ｉ、Ｘａｇ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ｂｌｐ Ｉ，ＢｓｍＢ Ｉ、ＢｓｔＸ Ｉ、Ｅｃｏ１０５ Ｉ、Ｈｉｎｃ ＩＩ、ＭｓｐＡ１ Ｉ、Ｐｌｅ Ｉ、Ｓｇｆ Ｉ、Ｘａｐ Ｉ、Ａｌｗ Ｉ、Ｂｍｅ１３９０ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、ＢｓｔＹ Ｉ、Ｅｃｏ１３０ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｐｍｅ Ｉ、ＳｇｒＡ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、ＡｌｗＮ Ｉ、Ｂｏｘ Ｉ，Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｔＺ Ｉ、Ｅｃｏ１４７ Ｉ、Ｈｉｎｆ Ｉ、Ｍｓｓ Ｉ、Ｐｍｌ Ｉ、Ｓｉｎ Ｉ、Ｘｃｅ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ｂｐｉ Ｉ、ＢｓｏＢ Ｉ、Ｂｓｕ１５ Ｉ、Ｅｃｏ２４ Ｉ、ＨｉｎＰ１ Ｉ、Ｍｕｎ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｘｃｍ Ｉ、ＡｐａＬ Ｉ、Ｂｐｌ Ｉ、Ｂｓｐ１１９ Ｉ、Ｂｓｕ３６ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ、Ｍｖａ１２６９ Ｉ、ＰｐｕＭ Ｉ、Ｓｍｉ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ａｐｏ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、Ｂｓｐ１２０ Ｉ、ＢｓｕＲ Ｉ、Ｅｃｏ３２ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｍｖａ Ｉ、ＰｓｈＡ Ｉ、Ｓｍｌ Ｉ、Ｘｈｏ ＩＩ、Ａｓｃ Ｉ、Ｂｐｕ１１０２ Ｉ、Ｂｓｐ１２８６ Ｉ、Ｂｔｇ Ｉ、Ｅｃｏ４７ Ｉ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｍｗｏ Ｉ、Ｐｓｉ Ｉ、Ｓｍｕ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ａｓｅ Ｉ、ＢｓａＡ Ｉ、Ｂｓｐ１４０７ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｅｃｏ４７ ＩＩＩ、Ｈｐｙ１８８ Ｉ，Ｎａｅ Ｉ、Ｐｓｐ１４０６ Ｉ、ＳｎａＢ Ｉ、ＸｍａＪ Ｉ、ＡｓｉＳ Ｉ、ＢｓａＢ Ｉ、Ｂｓｐ１４３ Ｉ、Ｂｖｅ Ｉ、Ｅｃｏ５２ Ｉ、Ｈｐｙ１８８ ＩＩＩ、Ｎａｒ Ｉ、Ｐｓｐ５ ＩＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｍｉ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、ＢｓａＨ Ｉ、Ｂｓｐ１４３ ＩＩ、Ｃａｃ８ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｈｐｙ８ Ｉ，Ｎｃｉ Ｉ、ＰｓｐＧ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｘｍｎ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、Ｂｓａ Ｉ、Ｂｓｐ６８ Ｉ、Ｃａｉ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｈｐｙ９９ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、ＰｓｐＯＭ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ａｖｒ ＩＩ、ＢｓａＪ Ｉ、ＢｓｐＤ Ｉ、Ｃｆｏ Ｉ、Ｅｃｏ７２ Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ ＩＩＩ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、ＢｓａＭ Ｉ、ＢｓｐＥ Ｉ、Ｃｆｒ１０ Ｉ Ｅｃｏ８１ Ｉ ＨｐｙＣＨ４ ＩＶ，Ｎｄｅ ＩＩ、Ｐｓｕ Ｉ、ＳｔｙＤ４ Ｉ、Ｂａｌ Ｉ、ＢｓａＷ Ｉ、ＢｓｐＨ Ｉ、Ｃｆｒ１３ Ｉ、Ｅｃｏ８８ Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ Ｖ、ＮｇｏＭ ＩＶ、Ｐｓｙ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、ＢｓｐＬ Ｉ、Ｃｆｒ４２ Ｉ、Ｅｃｏ９１ Ｉ、ＨｐｙＦ１０ ＶＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｂａｎ Ｉ、ＢｓｅＤ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、Ｃｆｒ９ Ｉ、ＥｃｏＩＣＲ Ｉ、Ｈｓｐ９２ Ｉ、Ｎｌａ ＩＩＩ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｔａａ Ｉ、Ｂｌｎ Ｉ、及びＰｓｐＸ Ｉ。
いくつかの実施形態において、制限部位は１つの制限エンドヌクレアーゼに特有であってもよい。いくつかの実施形態において、制限部位は１より多い制限エンドヌクレアーゼによって認識されてもよい。いくつかの実施形態において、制限部位は平滑切断の（ｂｌｕｎｔ−ｃｕｔ）の制限エンドヌクレアーゼによって認識されてもよい。いくつかの実施形態において、制限部位は突出切断（ｓｔｉｃｋｙ−ｃｕｔ）の制限エンドヌクレアーゼによって認識されてもよい。
プライマー
本明細書で提供される開示において、少なくとも１つのプライマーは普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１つのプライマーが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１以上のプライマーが使用されてもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のプライマーは、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１０を超えるプライマーが使用されてもよい。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、及び／又は第１０のプライマーが、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１セットのプライマーが使用されてもよい。
本明細書で提供される開示において、少なくとも１つのプライマーは普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１つのプライマーが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１以上のプライマーが使用されてもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のプライマーは、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１０を超えるプライマーが使用されてもよい。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、及び／又は第１０のプライマーが、普遍的なテンプレートを調製するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、普遍的なテンプレートを調製するために１セットのプライマーが使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、プライマーは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。例えばプライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５より多い、又は１００より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５ より少ない、又は１００より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、プライマーは所望の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは１つより多い所望の配列を含んでいてもよい。例えば、所望の配列は、あらかじめ決められた配列、相補的配列、既知の配列、結合配列、普遍的な配列、又は検知配列であってもよい。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列は普遍的な配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、所望の配列は、プライマーの長さ未満の任意の長さヌクレオチドであってもよい。例えば、所望の配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０より多い、又は９５より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、所望の配列は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０未満、又は９５未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。
プライマーは、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマー内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドが、プライマー内の任意の部位に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの３’末端にあってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの５’末端にあるかもしれない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの３’末端に実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’末端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはプライマーの５’末端の実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’末端は、プライマーの中央から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはプライマーの中央にあってもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの長さ未満の任意のヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０より多い、又は９５より多いヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０未満、又は９５未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。
プライマー内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマー内の任意の部位に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの３’末端にあってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの５’末端にあるかもしれない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドがプライマーの３’末端に実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’末端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはプライマーの５’末端の実質的に近くてもよい。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’末端は、プライマーの中央から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドはプライマーの中央であってもよい。
いくつかの実施形態において、所望の配列を含む少なくとも１つのプライマーとポリヌクレオチドが接触してもよい。いくつかの実施形態でプライマーは、限定しないが、ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、又はアニーリングしてもよい。例えば、所望の配列（例えばあらかじめ決められた配列）を備えたプライマーは、酵素を使用してポリヌクレオチドを増幅してもよい。例えば、酵素はポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）であってもよい。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列を含むプライマーは、ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端にアニーリング又はハイブリダイズされてもよい。いくつかの実施形態において、１より多いあらかじめ決められた配列がポリヌクレオチドにアニーリング又はハイブリダイズされてもよい。例えば、第１のあらかじめ決められた配列は、ポリヌクレオチドの１つの端にアニーリング又はハイブリダイズされてもよく、第２のあらかじめ決められた配列は、ポリヌクレオチドの他の端にアニーリング又はハイブリダイズされてもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に相補的であってもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に逆相補的であってもよい。いくつかの実施形態において、第１のあらかじめ決められた配列が第２のあらかじめ決められた配列に相補的でなくてもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのプライマーを使用して、ポリヌクレオチドが１より多いあらかじめ決められた配列を含むようにポリヌクレオチドからテンプレートを作ってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのみを使用して、ポリヌクレオチドが１より多いあらかじめ決められた配列を含むようにポリヌクレオチドからテンプレートを作ってもよい。いくつかの実施形態では、プライマーのみを使用して、ポリヌクレオチドが１より多いあらかじめ決められた配列を含むようにポリヌクレオチドからテンプレートを作ってもよい。
効率と精度
本明細書に記載される方法は、ポリヌクレオチドから操作されたテンプレートを作ることに関して正確であり、それにより、操作されたテンプレートのポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチドが由来することがあるサンプル中には存在しない付加的ヌクレオチドを含まない（例えば図１Ａ、１Ｂ、３Ａ及び３Ｂにおけるホワイトボックス）。１つの例外は、図２Ａと２Ｂにおいて示される方法を含み：ここで制限消化の後、及びアダプター・オリゴヌクレオチドのニック・ライゲーションの前にポリメラーゼが使用されるので、ポリメラーゼは３’末端に余分なアデノシンを加えることがある。いくつかの実施形態において、精度は、限定しないが、フレームシフト、少なくとも１つのヌクレオチドの欠損、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は少なくとも１つのヌクレオチドの置換を指す。典型的な実施形態において、本明細書中に記述される方法の使用は、任意の合成された鎖（例えば第２鎖ｃＤＮＡ）の末端に、追加のアデノシン・ヌクレオチドを加えない。例えば、制限消化に続いて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアダプター・オリゴヌクレオチドをリガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ）と組み合わせて使用して、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列をポリヌクレオチドに付加すると、もとのポリヌクレオチドに対してより正確な操作されたテンプレートが結果として生じることがある。本明細書に記載されている方法の使用によって作られる、操作されたテンプレートのポリヌクレオチドに対する精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを作製する他の方法より高い。いくつかの実施形態において精度は、本明細書に記載される方法の使用より、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０．５、４．０、４．５、５．０、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０倍高い。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．５倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも２．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも５．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１０．０倍高くてもよい。
本明細書に記載される方法は、ポリヌクレオチドから操作されたテンプレートを作ることに関して正確であり、それにより、操作されたテンプレートのポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチドが由来することがあるサンプル中には存在しない付加的ヌクレオチドを含まない（例えば図１Ａ、１Ｂ、３Ａ及び３Ｂにおけるホワイトボックス）。１つの例外は、図２Ａと２Ｂにおいて示される方法を含み：ここで制限消化の後、及びアダプター・オリゴヌクレオチドのニック・ライゲーションの前にポリメラーゼが使用されるので、ポリメラーゼは３’末端に余分なアデノシンを加えることがある。いくつかの実施形態において、精度は、限定しないが、フレームシフト、少なくとも１つのヌクレオチドの欠損、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は少なくとも１つのヌクレオチドの置換を指す。典型的な実施形態において、本明細書中に記述される方法の使用は、任意の合成された鎖（例えば第２鎖ｃＤＮＡ）の末端に、追加のアデノシン・ヌクレオチドを加えない。例えば、制限消化に続いて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアダプター・オリゴヌクレオチドをリガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ）と組み合わせて使用して、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列をポリヌクレオチドに付加すると、もとのポリヌクレオチドに対してより正確な操作されたテンプレートが結果として生じることがある。本明細書に記載されている方法の使用によって作られる、操作されたテンプレートのポリヌクレオチドに対する精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを作製する他の方法より高い。いくつかの実施形態において精度は、本明細書に記載される方法の使用より、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０．５、４．０、４．５、５．０、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０倍高い。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．５倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも２．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも５．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、精度は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１０．０倍高くてもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの単一のサンプルから操作されたテンプレートを作成するための精度は、任意の鎖、又は任意のフラグメントの任意の配列に対して同じである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの単一のサンプルから操作されたテンプレートの作成するための精度は、任意の鎖、又は任意のフラグメントの任意の配列に対して異なっている。
本明細書に記載される方法は、操作されたテンプレートのポリヌクレオチド部分が、ポリヌクレオチドが由来することがあるサンプル中には存在しない付加的ヌクレオチドを含まないように、ポリヌクレオチドから操作されたテンプレートを作ることに関して効率的である（例えば図１Ａ−３Ｂにおけるホワイトボックス）。いくつかの実施形態において、効率は、限定しないが、フレームシフト、少なくとも１つのヌクレオチドの欠損、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は少なくとも１つのヌクレオチドの置換を指す。典型的な実施形態において、本明細書中に記述される方法の使用は、任意の合成された鎖（例えば第２鎖ｃＤＮＡ）の末端に、追加のアデノシン・ヌクレオチドを加えない。例えば、制限消化に続いて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアダプター・オリゴヌクレオチドをリガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ）と組み合わせて使用して、少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を付加すると、もとのポリヌクレオチドに対してより正確な操作されたテンプレートが、上述のように結果として生じることがある。本明細書に記載されている方法の使用によって作られる、操作されたテンプレートのポリヌクレオチドに対する効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを作製する他の方法より高い。いくつかの実施形態において効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを作製する方法より、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０．５、４．０、４．５、５．０、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０倍高い。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．５倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１．７倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも２．０倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも２．１０倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも５倍高くてもよい。特定の実施形態において、効率は、リガーゼを使用しないで操作されたテンプレートを生じさせる他の方法より少なくとも１０倍高くてもよい。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの単一のサンプルから操作されたテンプレートの作成するための効率は、任意の鎖、又は任意のフラグメントの任意の配列に対して同じである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの単一のサンプルから操作されたテンプレートの作成するための効率は、任意の鎖、又は任意のフラグメントの任意の配列に対して異なっている。
典型的な方法
記載方法に記載される操作されたテンプレートは、操作されたテンプレートを作るための本明細書に記載される方法の典型的な適用として役立つよう意図されている。これらの典型的な方法における操作されたテンプレートは、第１部分における第１のあらかじめ決められた配列、及び、第２部分における第１のあらかじめ決められた配列に逆相補的な第２のあらかじめ決められた配列を含んでいる。本明細書中で作成された、操作されたテンプレートは、単一プライマー増幅反応において利用されてもよい。典型的な実施形態において、単一プライマー増幅反応は、あらかじめ決められた配列の少なくとも１つの部分、又は本明細書中に記述されるあらかじめ決められた配列の全配列を含むプライマーを使用してもよい。
記載方法に記載される操作されたテンプレートは、操作されたテンプレートを作るための本明細書に記載される方法の典型的な適用として役立つよう意図されている。これらの典型的な方法における操作されたテンプレートは、第１部分における第１のあらかじめ決められた配列、及び、第２部分における第１のあらかじめ決められた配列に逆相補的な第２のあらかじめ決められた配列を含んでいる。本明細書中で作成された、操作されたテンプレートは、単一プライマー増幅反応において利用されてもよい。典型的な実施形態において、単一プライマー増幅反応は、あらかじめ決められた配列の少なくとも１つの部分、又は本明細書中に記述されるあらかじめ決められた配列の全配列を含むプライマーを使用してもよい。
方法１
第１鎖ｃＤＮＡに少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を付けることによる単一プライマー増幅のための遺伝子特異的なテンプレートの調製。
第１鎖ｃＤＮＡに少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を付けることによる単一プライマー増幅のための遺伝子特異的なテンプレートの調製。
本明細書は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は、：制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングする工程で、第１アダプター・オリゴヌクレオチドは、切断されたポリヌクレオチドの５’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、第２アダプター・オリゴヌクレオチドは第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを、切断されたポリヌクレオチドの５’末端へ連結し、それにより第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程；操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程で、該プライマーは第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、プライマーのセットの少なくとも１つのプライマーである工程；及び（ｇ）操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するような、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
いくつかの実施形態において本明細書は、抗体遺伝子の単一プライマー増幅で使用される操作されたテンプレートを作る方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は：（ａ）制限部位を含むことがあるＤＮＡの二本鎖部分を）ｃＤＮＡが形成するように、オリゴヌクレオチドへの第１鎖ｃＤＮＡを合成しハイブリダイズする工程；（ｂ）第１鎖ｃＤＮＡの５’末端に相補的な第１オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程；（ｃ）あらかじめ決められた配列（図１Ａ）を含むことがある第２のオリゴヌクレオチドへの第１オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、又は代わりに、（ｃ）、ｃＤＮＡの末端への第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、第３オリゴヌクレオチドへ第２オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、連結反応が両末端（図１Ｂ）上で実行されることがあるコンパティブルな突出部を形成する工程；（ｄ）ＤＮＡリガーゼの存在下において、アニーリングされるポリヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを（例えばニック連結反応により）連結する工程、及び；（ｅ）操作されたテンプレートへプライマーをアニーリングする工程を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーは、あらかじめ決められた配列を備える第１部分、及び第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングすることがある第２部分部分を有してもよく、第２鎖ｃＤＮＡを合成するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、１より多いプライマーが使用される。例えば、１セットのプライマーが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、合成される第２鎖ｃＤＮＡは、第１部分において第１のあらかじめ決められた配列を含んでもよく、第２のあらかじめ決められた配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２のあらかじめ決められた配列は、第１のあらかじめ決められた配列に対して逆相補的であってもよい。合成された第２鎖ｃＤＮＡは単一プライマー増幅反応のテンプレートであってもよい。例えば、増幅反応において単一プライマーは、第１のあらかじめ決められた配列の部分、又は全体の配列を含むことがある。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列は普遍的な配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが少なくとも１つのポリヌクレオチドから作製されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが単一の合成反応と組み合わせられることがある。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つのプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、１より多いプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。例えば、操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に相補的なあらかじめ決められた配列逆を備えた、少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅するために使用される１より多いプライマーは、異なっていてもよい。
いくつかの他の実施形態において、本明細書は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを、工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的にアニーリングし、第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；第２アダプター・オリゴヌクレオチドを、切断されたポリヌクレオチドの５’末端へ連結し、それによりあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程；操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程で、該プライマーは第２のあらかじめ決められた配列を有する、プライマーのセットの少なくとも１つのプライマーである工程；及び、操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するような、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
例えば図１Ａは本開示により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；
（３）２つのアダプター・オリゴヌクレオチドは消化されたｃＤＮＡに加えられてもよい。
第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは、消化されたｃＤＮＡにアニーリングする部分、及び第２のアダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングし得るもう一つの部分を有することがある；
第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは、消化されたｃＤＮＡにアニーリングする部分、及び第２のアダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングし得るもう一つの部分を有することがある；
（４）消化されたｃＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼの存在下において、第２のアダプター・オリゴヌクレオチドに連結されてもよい；及び
（５）プライマーは連結されたｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２ｃのＤＮＡ鎖が合成されてもよい。
いくつかの他の実施形態において、本明細書は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成し、工程（ｃ）の切断を含む工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングし、ここで第１アダプター・オリゴヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分、及び第２のあらかじめ決められた配列を含む第２アダプター・オリゴヌクレオチドを有し、第２ポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それによって、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
いくつかの実施形態において、１つを超える操作されたテンプレートが少なくとも１つのポリヌクレオチドから作製されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが単一の合成反応と組み合わせられることがある。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つのプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、１つより多いプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。例えば、操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に相補的なあらかじめ決められた配列逆を備えた、少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅するために使用される１より多いプライマーは、異なっていてもよい。
例えば図１Ｂは本明細書により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；
（３）３つのアダプター・オリゴヌクレオチドは消化されたｃＤＮＡに加えられ得る。
第１アダプター・オリゴヌクレオチドは消化されたｃＤＮＡにアニーリングしてもよく、第２及び第３アダプター・オリゴヌクレオチドは互いにアニーリングしてもよい；
第１アダプター・オリゴヌクレオチドは消化されたｃＤＮＡにアニーリングしてもよく、第２及び第３アダプター・オリゴヌクレオチドは互いにアニーリングしてもよい；
（４）第１アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングされる消化されたｃＤＮＡは、他の２つのアダプター・オリゴヌクレオチドにより作られる突出部とコンパティブルな突出部を形成してもよい。これらのフラグメントはＤＮＡリガーゼの存在下において連結されてもよい；
及び
（５）プライマーは連結されたｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２鎖ｃＤＮＡが合成されてもよい。
及び
（５）プライマーは連結されたｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２鎖ｃＤＮＡが合成されてもよい。
方法２
第２鎖ｃＤＮＡに少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を付けることによる、単一プライマー増幅のための遺伝子特異的なテンプレートの調製。
第２鎖ｃＤＮＡに少なくとも１つのあらかじめ決められた配列を付けることによる、単一プライマー増幅のための遺伝子特異的なテンプレートの調製。
本開示は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングする工程で、第１アダプター・オリゴヌクレオチドは、切断されたポリヌクレオチドの５’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、第２アダプター・オリゴヌクレオチドは第１のあらかじめ決められた配列含む。第２アダプター・オリゴヌクレオチドを、切断されたポリヌクレオチドの５’末端へ連結し、それにより第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程；操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程で、該プライマーは第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、プライマーのセットの少なくとも１つのプライマーである工程；及び、操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するような、操作されたテンプレートを合成する工程を含む。
いくつかの実施形態において本開示はは、抗体遺伝子の単一プライマー増幅で使用される操作されたテンプレートを作る方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は：（ａ）第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドの存在下において制限エンドヌクレアーゼで第１鎖ｃＤＮＡを消化する工程であって、該オリゴヌクレオチドは、２本鎖部分が制限部位を含むように第１鎖ｃＤＮＡを備えたＤＮＡの２本鎖部分を形成する、工程；（ｂ）消化されたｃＤＮＡへプライマーをアニーリングさせ、該プライマーを用いて第２鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、前記プライマーは、あらかじめ決められた配列を備えた第１部分及び第１鎖ｃＤＮＡ（ｆｉｒｓｔ ｓｔａｎｄ ｃＤＮＡ）にアニーリングする第２部分を有する、工程；（ｃ）合成された第２鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的であってもよい第１のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングする（図２Ａ）あらかじめ決められた配列を有し；代替的に、前記第１のオリゴヌクレオチドがｃＤＮＡの末端にハイブリダイズしてもよく、前記第２のオリゴヌクレオチドが第３のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして両末端について連結のためのコンパティブルな突出部を形成してもよい（図２Ｂ）、工程；（ｄ）アニーリングされるポリヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを、リガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ）で連結する工程を含む。いくつかの実施形態において、連結される第２鎖ｃＤＮＡは、第１部分におけるあらかじめ決められた配列、及び配列の末端に第１部分に逆相補的かもしれない第２のあらかじめ決められた配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去し、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を備える第２の部分を含む、工程；（ｅ）工程（ｃ）の切断を含む５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程、；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする工程であって、該第１アダプター・オリゴヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それによって、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作されたテンプレートを作成する工程、を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーは、あらかじめ決められた配列を備える第１部分、及び第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングすることがある第２部分を有してもよく、第２鎖ｃＤＮＡを合成するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、１より多いプライマーが使用されてもよい。例えば、１セットのプライマーが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、合成される第２鎖ｃＤＮＡは、第１部分において第１のあらかじめ決められた配列を含んでもよく、第２のあらかじめ決められた配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２のあらかじめ決められた配列は、第１のあらかじめ決められた配列に対して逆相補的であってもよい。合成された第２鎖ｃＤＮＡは単一プライマー増幅反応のテンプレートであってもよい。例えば、増幅反応において単一プライマーは、第１の又は第１のあらかじめ決められた配列の部分、又は全体の配列を含むことがある。いくつかの実施形態において、所望の配列はあらかじめ決められた配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、１より多い操作されたテンプレートが少なくとも１つのポリヌクレオチドから作製されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが単一の合成反応と組み合わせられることがある。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つのプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、１つより多いプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。例えば、操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に相補的なあらかじめ決められた配列逆を備えた、少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅するために使用される１より多いプライマーは、異なっていてもよい。
例えば図２Ａは本明細書により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；
（３）２つのアダプター・オリゴヌクレオチドが合成された第１鎖ｃＤＮＡに加えられてもよく、第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは、合成された第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする部分、及び第２のアダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする別の部分を有する。
（４）第一のｃＤＮＡ鎖は、ＤＮＡリガーゼの存在下において、第２のアダプター・オリゴヌクレオチドに連結されてもよい；及び
（５）プライマーは連結されたｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２ｃＤＮＡ鎖が合成されてもよい。
いくつかの他の実施形態において、本明細書は、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法を提供し、該方法は：（ａ）制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングして、制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作成する工程；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まず、それによって５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成するように、工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片を除去する工程；（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｅ）５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成し、工程（ｃ）の切断を含む工程；（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的にアニーリングし、第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を、第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び（ｈ）第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが少なくとも１つのポリヌクレオチドから作製されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが単一の合成反応と組み合わせられることがある。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つのプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、１より多いプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。例えば、操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に相補的なあらかじめ決められた配列逆を備えた、少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅するために使用される１より多いプライマーは、異なっていてもよい。
例えば図２Ｂは本明細書により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；及び
（３）プライマーは消化されたｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２ｃＤＮＡ鎖が合成されてもよい。
（４）３つのアダプター・オリゴヌクレオチドが合成された第２鎖ｃＤＮＡに加えられてもよく、第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは合成された第２鎖ｃＤＮＡとアニーリングしてもよく、第２及び第３のアダプター・オリゴヌクレオチドは互いにアニーリングしてもよい；
（５）第２鎖ｃＤＮＡが第１のアダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、他の２つのアダプター・オリゴヌクレオチドによって作られることがあるコンパティブルな突出部を形成してもよい；及び、
（６）これらのフラグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下において連結されてもよい。
方法３
方法３
第２鎖ｃＤＮＡの制限消化による単一プライマー増幅のための遺伝子特異的なテンプレートの調製。
いくつかの実施形態において本開示は、抗体遺伝子の単一プライマー増幅で使用される操作されたテンプレートを作る方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は：１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーは第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する第２ポリヌクレオチドを合成する；制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、第２ポリヌクレオチドへアニーリングして、少なくとも二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作成し、二本鎖部分は制限部位を含む、工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２のポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去し、それにより３’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端に アニーリングし、ここで第１アダプター・オリゴヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分、及び第２のあらかじめ決められた配列を含む第２アダプター・オリゴヌクレオチドを有し、切断されたポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それによって、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程、を含む方法。
いくつかの実施形態において本開示は、抗体遺伝子の単一プライマー増幅で使用される操作されたテンプレートを作る方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は：１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーは第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する第２ポリヌクレオチドを合成する；制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、第２ポリヌクレオチドへアニーリングして、少なくとも二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作成し、二本鎖部分は制限部位を含む、工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２のポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去し、それにより３’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングし、ここで第１アダプター・オリゴヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分、及び第２のあらかじめ決められた配列を含む第２アダプター・オリゴヌクレオチドを有し、切断されたポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それによって、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーは、あらかじめ決められた配列を備える第１部分、及び第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングすることがある第２部分部分を有してもよく、第２鎖ｃＤＮＡを合成するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、１より多いプライマーが使用される。例えば、１セットのプライマーが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、合成される第２鎖ｃＤＮＡは、第１部分において第１のあらかじめ決められた配列を含んでもよく、第２のあらかじめ決められた配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２のあらかじめ決められた配列は、第１のあらかじめ決められた配列に対して逆相補的であってもよい。合成された第２鎖ｃＤＮＡは単一プライマー増幅反応のテンプレートであってもよい。例えば、増幅反応において単一プライマーは、第１の又は第１のあらかじめ決められた配列の部分、又は全体の配列を含むことがある。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた配列は普遍的な配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが少なくとも１つのポリヌクレオチドから作製されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレートが単一の合成反応と組み合わせられることがある。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは同一であってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたテンプレートは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、同一であってもよい。いくつかの実施形態において、１つより多い操作されたテンプレート内にある少なくとも１つのあらかじめ決められた配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、１つのプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、１つより多いプライマーを使用して、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅してもよい。例えば、操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に相補的なあらかじめ決められた配列逆を備えた、少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅してもよい。いくつかの実施形態において、単一の合成反応内の少なくとも１つの操作されたテンプレートを増幅するために使用される１より多いプライマーは、異なっていてもよい。
例えば図３Ａは本明細書により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）プライマーは連結された第一のｃＤＮＡ鎖とアニーリングされてもよく、第２鎖ｃＤＮＡが合成されてもよい。
（３）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；
（４）２つのアダプター・オリゴヌクレオチドが消化された第２鎖ｃＤＮＡに加えられてもよく、第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは、消化された第２鎖ｃＤＮＡにアニーリングする部分、及び第２のアダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする別の部分を有していてもよい。及び
（５）第２鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼの存在下において、第２のアダプター・オリゴヌクレオチドに連結されてもよい；
単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作成する方法であり、該方法は、：１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングし、該プライマーは第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する第２ポリヌクレオチドを合成する；制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、第２ポリヌクレオチドへアニーリングして、少なくとも二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作成し、二本鎖部分は制限部位を含む、工程；制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２のポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；切断されたポリヌクレオチドが任意の二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去し、それにより３’末端が切断されたポリヌクレオチドを作成する工程；第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ、実質的に相補的にアニーリングし、第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；切断したポリヌクレオチドの３’末端を、第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結して、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作成する工程；及び、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去して、第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作成する工程を含む。
例えば図３Ｂは本明細書により提供される方法の例示的な実施形態であり、ここでアダプター・オリゴヌクレオチド、及び一連のアニーリング及び連結の工程を使用して、単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートが作られる。具体的には以下のものである。
（１）第１鎖ｃＤＮＡはランダムプライマー（例えばオリゴ ｄＴ）を使用して逆転写酵素で合成されてもよい；
（２）プライマーは連結された第１鎖ｃＤＮＡとアニーリングされてもよく、第２鎖ｃＤＮＡが合成されてもよい。
（３）オリゴヌクレオチドは合成されたｃＤＮＡにアニーリングされ、制限エンドヌクレアーゼで消化されてもよい；
（４）３つのアダプター・オリゴヌクレオチドが消化された第２鎖ｃＤＮＡに加えられてもよく、第１のアダプター・オリゴヌクレオチドは消化された第２鎖ｃＤＮＡとアニーリングしてもよく、第２及び第３のアダプター・オリゴヌクレオチドは互いにアニーリングしてもよい；
（５）第２鎖ｃＤＮＡの第１のアダプター・オリゴヌクレオチドへのアニーリングが、他の２つのアダプター・オリゴヌクレオチドによって作られることがあるコンパティブルな突出部を形成してもよい；及び、
（６）これらのフラグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下において連結されてもよい。
本明細書において範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値まで、示され得る。こうした範囲が示される場合、別の実施形態は、１つの特定の値及び／又は他の特定の値を含む。同様に、値が前の「約」の使用によって近似値として示される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。範囲の各々のエンドポイントが、別のエンドポイントに関して、および別のエンドポイントとは独立に、有意であることはさらに理解されよう。本明細書に使用されるように、用語「約」は、特定の使用の文脈内で、定められた数値からプラス又はマイナス１５％の範囲を指す。例えば、約１０は８．５から１１．５までの範囲を含む。
実施例１：ＣＤ８０とＣＤ８６に対して免疫化されたマウスの脾臓由来のポリヌクレオチドから、カッパー軽鎖とＩｇＧ１のための操作されたテンプレートの作製
表１において以下に示されるように、２つのＢＡＬＢ／ｃマウスを、組み換え型のＣＤ８０／Ｆｃ及びＣＤ８６／Ｆｃによって免疫化した。脾臓を、５７日目に取り出し、５ ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）でホモジナイズした。
表１において以下に示されるように、２つのＢＡＬＢ／ｃマウスを、組み換え型のＣＤ８０／Ｆｃ及びＣＤ８６／Ｆｃによって免疫化した。脾臓を、５７日目に取り出し、５ ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）でホモジナイズした。
血清タイターを試験するＥＬＩＳＡ。
マイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬのＣＤ８０／Ｆｃ、ＣＤ８６／Ｆｃ、又はＨＥＲ２／Ｆｃの５０μＬにより、４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳで3回洗浄し、１００μＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッカー（Ｂｌｏｃｋｅｒ）を捨て、ＰＢＳ中に連続希釈したマウス血清５０μＬとを用いて、ウェルを３７℃で１．５時間インキュベートした。
マイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬのＣＤ８０／Ｆｃ、ＣＤ８６／Ｆｃ、又はＨＥＲ２／Ｆｃの５０μＬにより、４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳで3回洗浄し、１００μＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッカー（Ｂｌｏｃｋｅｒ）を捨て、ＰＢＳ中に連続希釈したマウス血清５０μＬとを用いて、ウェルを３７℃で１．５時間インキュベートした。
ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、結合した抗体を、ペルオキシダーゼが接合したヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）２抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ ３１４３６）（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：５０００）により３７℃１時間で検知した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質混合物（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４０２１）で発展させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。反応を５０μＬの２Ｎ硫酸で止め、シグナルを４５０ｎｍ（図４）で読み取った。ＣＤ８０及びＣＤ８６に対するマウス血清のＥＬＩＳＡ反応性。免疫化されたマウスからの血清（５０日）を、対応する抗原へのそれらの反応性に関してＥＬＩＳＡで試験した。両方のマウスはＣＤ８０／Ｆｃ及びＣＤ８６／Ｆｃに強い反応性を示したが、対照抗原Ｈｅｒ２／Ｆｃには示さなかった。
ＴＲＩ試薬中での脾臓細胞からの全ＲＮＡの単離。
メーカーのプロトコルを利用した市販で入手可能なキットを使用する従来の方法に従って、全ＲＮＡをホモジナイズした脾臓から単離した。
メーカーのプロトコルを利用した市販で入手可能なキットを使用する従来の方法に従って、全ＲＮＡをホモジナイズした脾臓から単離した。
相分離。
溶解されたサンプルを解凍し、室温に５分間置いて、核タンパク複合体の完全な解離を可能にした。次に、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．１ｍｌのＢＣＰ（ブロモクロロプロパン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を溶解産物に補い、サンプルにきっちりとふたをし、１５秒間勢いよく振盪した。結果として生じる混合物を、２から５分間室温に置き、４℃で１５分間１２，０００ｇで遠心分離した。
溶解されたサンプルを解凍し、室温に５分間置いて、核タンパク複合体の完全な解離を可能にした。次に、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．１ｍｌのＢＣＰ（ブロモクロロプロパン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を溶解産物に補い、サンプルにきっちりとふたをし、１５秒間勢いよく振盪した。結果として生じる混合物を、２から５分間室温に置き、４℃で１５分間１２，０００ｇで遠心分離した。
ＲＮＡ析出
水相を新たなチューブに移した。ＲＮＡをイソプロパノールと混ぜることによって水相から沈殿させた。最初の溶解に使用した１ｍｌのＴｒｉ試薬につき０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。サンプルを５−１０分間で室温に置き、４℃で８分間１２，０００ｇで遠心分離した。
水相を新たなチューブに移した。ＲＮＡをイソプロパノールと混ぜることによって水相から沈殿させた。最初の溶解に使用した１ｍｌのＴｒｉ試薬につき０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。サンプルを５−１０分間で室温に置き、４℃で８分間１２，０００ｇで遠心分離した。
ＲＮＡの洗浄。
上清を取り除いて、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき１ｍｌの７５％エタノールを加えた。ＲＮＡ懸濁液を２５℃で５分間７，５００ｇで遠心分離した。上清をデカントし、簡単に再度遠心した。残りの上清を、完全にＲＮＡペレットから吸引した。
上清を取り除いて、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき１ｍｌの７５％エタノールを加えた。ＲＮＡ懸濁液を２５℃で５分間７，５００ｇで遠心分離した。上清をデカントし、簡単に再度遠心した。残りの上清を、完全にＲＮＡペレットから吸引した。
ＲＮＡ可溶化。
ＲＮＡペレットを、５分間簡単に風乾させた。溶液をピペットチップに通過させ、１５分間５５℃でインキュベートすることにより、ＲＮＡを２５０のμｌのリボヌクレアーゼを含まない水に溶かした。１μＬの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で電気泳動した（図５）。
ＲＮＡペレットを、５分間簡単に風乾させた。溶液をピペットチップに通過させ、１５分間５５℃でインキュベートすることにより、ＲＮＡを２５０のμｌのリボヌクレアーゼを含まない水に溶かした。１μＬの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で電気泳動した（図５）。
メッセンジャーＲＮＡ（ポリＡ＋）精製。
メーカーのマニュアルに従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ｍＲＮＡを精製した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液をウォーターバスにおいて３７℃に加熱し、ボルテックスにより混合し、室温に置いた。バッファーＯＢＢを、３７℃のウォーターバスにおいて再度溶かし、室温に置いた。リボヌクレアーゼを含まない水（キットに含まれていた）を５００μＬ（〜１ｍｇの全ＲＮＡ）まで加えた。５００μＬのバッファーＯＢＢ及び５５μＬのＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を加え、チューブを指ではじく（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）ことにより混合した。混合物を加熱ブロックから除去して、７０℃で３分間インキュベートし、室温で１０分間置いた。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡ複合体を、最大速度で２分間遠心分離することでペレットにして、ピペットで移すこと（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）により、上澄を注意深く除去した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡペレットを、ボルテックスにより４００μＬのバッファーＯＷ２中に再懸濁して、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に据えられた小さいスピンカラム上にピペットで移して、１分間最大速度で遠心分離した。スピンカラムを、リボヌクレアーゼを含まない新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、４００μＬのバッファーＯＷ２をカラムに加え、１分間最高速度で遠心分離し、通過画分を捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを加熱ブロックに置かれたカラム上にピペットで移し、上下にピペッティングしてレジンを再懸濁し、１分間最大速度で遠心分離した。別の５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを、加熱ブロック上に置かれたカラムに加え、レジンを完全に再懸濁し、１分間最高速度で遠心分離した。
メーカーのマニュアルに従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ｍＲＮＡを精製した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液をウォーターバスにおいて３７℃に加熱し、ボルテックスにより混合し、室温に置いた。バッファーＯＢＢを、３７℃のウォーターバスにおいて再度溶かし、室温に置いた。リボヌクレアーゼを含まない水（キットに含まれていた）を５００μＬ（〜１ｍｇの全ＲＮＡ）まで加えた。５００μＬのバッファーＯＢＢ及び５５μＬのＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を加え、チューブを指ではじく（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）ことにより混合した。混合物を加熱ブロックから除去して、７０℃で３分間インキュベートし、室温で１０分間置いた。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡ複合体を、最大速度で２分間遠心分離することでペレットにして、ピペットで移すこと（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）により、上澄を注意深く除去した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡペレットを、ボルテックスにより４００μＬのバッファーＯＷ２中に再懸濁して、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に据えられた小さいスピンカラム上にピペットで移して、１分間最大速度で遠心分離した。スピンカラムを、リボヌクレアーゼを含まない新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、４００μＬのバッファーＯＷ２をカラムに加え、１分間最高速度で遠心分離し、通過画分を捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを加熱ブロックに置かれたカラム上にピペットで移し、上下にピペッティングしてレジンを再懸濁し、１分間最大速度で遠心分離した。別の５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを、加熱ブロック上に置かれたカラムに加え、レジンを完全に再懸濁し、１分間最高速度で遠心分離した。
第１鎖ｃＤＮＡの合成。
メーカーのプロトコルに従って第１鎖ｃＤＮＡを合成した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ）。５００ｎｇのｍＲＮＡを ５μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）及び５μＬのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（配列番号：１）と混合し、水を５０μＬまで加えた。６５℃で５分間混合物をインキュベートし、１分より長い間、氷上に直ちに移した。１０μＬの１０ＸＲＴバッファーを、２０μＬの２５ｍＭＭｇＣｌ２、１０μＬの０．１ＭＤＴＴ、５μＬの ＲＮａｓｅ ＯＵＴ阻害剤、及び５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ＩＩＩを反応物に加え、５０℃で５０分間、８５℃で１５分間インキュベートし、４℃に冷却した。その後、５μＬのＲＮＡ分解酵素Ｈを加え、３７℃で１分間、９５℃で２０分間インキュベートした。
メーカーのプロトコルに従って第１鎖ｃＤＮＡを合成した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ）。５００ｎｇのｍＲＮＡを ５μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）及び５μＬのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（配列番号：１）と混合し、水を５０μＬまで加えた。６５℃で５分間混合物をインキュベートし、１分より長い間、氷上に直ちに移した。１０μＬの１０ＸＲＴバッファーを、２０μＬの２５ｍＭＭｇＣｌ２、１０μＬの０．１ＭＤＴＴ、５μＬの ＲＮａｓｅ ＯＵＴ阻害剤、及び５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ＩＩＩを反応物に加え、５０℃で５０分間、８５℃で１５分間インキュベートし、４℃に冷却した。その後、５μＬのＲＮＡ分解酵素Ｈを加え、３７℃で１分間、９５℃で２０分間インキュベートした。
単一プライマー増幅のためのテンプレートの調製。
制限オリゴヌクレオチドを備える第１鎖ｃＤＮＡの消化。１７μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、１μＬの制限オリゴヌクレオチド（２０μＭ）（下記の表を参照）（Ｏｐｅｒｏｎ， ＨＰＬＣで精製された）（最終１μＭ）及び２μＬの１０ＸＮＥＢｕｆｆｅｒ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ） と混合し、９５℃で２分間、６４℃で２分間インキュベートし、３７℃に冷却した。その後、制限エンドヌクレアーゼ（下記の表を参照）を加え、３７℃で１時間、６５℃で２０分間インキュベートし、３７℃に冷却した。
制限オリゴヌクレオチドを備える第１鎖ｃＤＮＡの消化。１７μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、１μＬの制限オリゴヌクレオチド（２０μＭ）（下記の表を参照）（Ｏｐｅｒｏｎ， ＨＰＬＣで精製された）（最終１μＭ）及び２μＬの１０ＸＮＥＢｕｆｆｅｒ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ） と混合し、９５℃で２分間、６４℃で２分間インキュベートし、３７℃に冷却した。その後、制限エンドヌクレアーゼ（下記の表を参照）を加え、３７℃で１時間、６５℃で２０分間インキュベートし、３７℃に冷却した。
アダプター・オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びニック・ライゲーション。
２０μＬの消化された第１鎖ｃＤＮＡを、２２．５μＬの水、１μＬのアダプター・オリゴ１（２０μＭ）、１μＬのアダプター・オリゴ２（２０μＭ）、５μＬの１０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、及び０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０ Ｕ／μＬ）と混合し、９５℃で２分間、６５℃で２分間、及び４５℃で１時間インキュベートした。
２０μＬの消化された第１鎖ｃＤＮＡを、２２．５μＬの水、１μＬのアダプター・オリゴ１（２０μＭ）、１μＬのアダプター・オリゴ２（２０μＭ）、５μＬの１０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、及び０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０ Ｕ／μＬ）と混合し、９５℃で２分間、６５℃で２分間、及び４５℃で１時間インキュベートした。
第２鎖ｃＤＮＡの合成。
カッパー軽鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、３３．５μＬの連結されたｃＤＮＡを、５３６μＬの水、６７μＬの１０ｘ反応バッファー、１３．４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ ｍＭ）、６．７μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に加え、混合した。４９μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの１３ウェルに加え、１μＬの各５’ＴＭＸ２４ｍＶＫプライマーを別々に加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５分間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
カッパー軽鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、３３．５μＬの連結されたｃＤＮＡを、５３６μＬの水、６７μＬの１０ｘ反応バッファー、１３．４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ ｍＭ）、６．７μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に加え、混合した。４９μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの１３ウェルに加え、１μＬの各５’ＴＭＸ２４ｍＶＫプライマーを別々に加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５分間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
ＩｇＧ１重鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、３３．５μＬの連結されたｃＤＮＡを、５３６μＬの水、６７μＬの１０ｘ反応バッファー、１３．４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ ｍＭ）、６．７μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に加え、混合した。４９μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの１３ウェルに加え、１μＬの各５’ＴＭＸ２４ｍＶＨプライマーを別々に加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５秒間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
第２鎖ｃＤＮＡを浄化する。
第２鎖ｃＤＮＡを浄化し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｃｏｒｅ キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて浄化した。各ｃＤＮＡ反応物に、２５０μＬのバッファーＰＢ（ｘ５容積）及び７．５μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２（バッファーＰＢの添加の後の１：４０の容積）を加え、８チャネルの多チャンネルピペッターで３回混合した。
第２鎖ｃＤＮＡを浄化し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｃｏｒｅ キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて浄化した。各ｃＤＮＡ反応物に、２５０μＬのバッファーＰＢ（ｘ５容積）及び７．５μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２（バッファーＰＢの添加の後の１：４０の容積）を加え、８チャネルの多チャンネルピペッターで３回混合した。
その後、混合物を８ウェル・カラムに加え、−２００〜−４００ｍｂａｒで減圧し、排出した。カラムを１０００μＬのバッファーＰＥで洗浄し、２分間室温で静置し（ｓｉｔ）、最大圧力で減圧した。カラムを別の１０００μＬバッファーＰＥで洗い、最大圧力で減圧した。カラムを取り出し、ペーパータオル上で乾燥させた。不用のトレーを空にし、カラムを戻し、１０分間最大圧力で減圧した。ｃＤＮＡを１００μＬのバッファーＥＢで溶出し、室温（ＲＴ）で1分間静置し、各々カラムを最大圧力で1分間減圧して、マイクロプレート上に集めた。
単一プライマー増幅。
単一プライマー増幅（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックス， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によるカッパー軽鎖の増幅のために、２０９４．４μＬの水、２８０μＬの１０ｘバッファー、５６μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３３．６μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び５６μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物（ｍａｓｔｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を最初に作った。２７の９０μＬのアリコートを作り、１０μＬの各第２鎖ｃＤＮＡを加え（各々２本の反応チューブ）、又は１０μＬの水をブランクの対照チューブへ加えた。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
単一プライマー増幅（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックス， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によるカッパー軽鎖の増幅のために、２０９４．４μＬの水、２８０μＬの１０ｘバッファー、５６μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３３．６μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び５６μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物（ｍａｓｔｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を最初に作った。２７の９０μＬのアリコートを作り、１０μＬの各第２鎖ｃＤＮＡを加え（各々２本の反応チューブ）、又は１０μＬの水をブランクの対照チューブへ加えた。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
単一プライマー増幅によるＩｇＧ重鎖の増幅のために、２０９４．４μＬの水、２８０μＬの１０ｘバッファー、５６μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３３．６μＬのＴＭＸ２４ｍＨプライマー（１００μＭ）、及び５６μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物をまず作った。２７の９０μＬのアリコートを作り、１０μＬの各第２鎖ｃＤＮＡを加え（各々２本の反応チューブ）、又は１０μＬの水をブランクの対照チューブへ加えた。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
５μＬの増幅産物を、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動して、１μｇの１００ｂｐラダーマーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）でチェックした。単一プライマー増幅の産物を表す図６を参照されたい。
実施例２−２つの特有のペプチドに対して免疫化されたマウスの脾臓由来のポリヌクレオチドからの、カッパー軽鎖とＩｇＧ１のための操作されたテンプレートの作製
２つのＢＡＬＢ／ｃマウスが、ペプチド１（ｃＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲＷ）（配列番号：３４）又はペプチド２（ｃＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡ）（配列番号：３５）で免疫化され、ここでｐはリン酸化された部位を示し、ｃは遊離したシステインを示す。
２つのＢＡＬＢ／ｃマウスが、ペプチド１（ｃＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲＷ）（配列番号：３４）又はペプチド２（ｃＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡ）（配列番号：３５）で免疫化され、ここでｐはリン酸化された部位を示し、ｃは遊離したシステインを示す。
抗原調製（水中での再構成）。
抗原１：８６８２８＃１遊離したペプチド（ｃＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲＷ）（配列番号：３４）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原１Ｎ：８６８２８＃１Ｎ遊離したペプチド（ＨＴＧＦＬＴＥＹＶＡＴＲＷ）（配列番号： ３６）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原２：８６８２８＃２遊離したペプチド（ｃＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡ）（配列番号： ３５）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原２Ｎ：８６８２８＃２Ｎ 遊離したペプチド（ＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬＴＥＹＶＡ）（配列番号： ３７）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。−２０℃で保存された各々２０μＬのアリコート。
抗原１：８６８２８＃１遊離したペプチド（ｃＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲＷ）（配列番号：３４）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原１Ｎ：８６８２８＃１Ｎ遊離したペプチド（ＨＴＧＦＬＴＥＹＶＡＴＲＷ）（配列番号： ３６）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原２：８６８２８＃２遊離したペプチド（ｃＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡ）（配列番号： ３５）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。抗原２Ｎ：８６８２８＃２Ｎ 遊離したペプチド（ＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬＴＥＹＶＡ）（配列番号： ３７）４．０ｍｇ／１ｍＬ Ｈ２Ｏ。−２０℃で保存された各々２０μＬのアリコート。
マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの各ペプチドの５０μＬにより、４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロッキングした。５０μＬの連続希釈した血清（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００、１：６２５００）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＨＲＰ ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） 交差吸収（Ｃｒｏｓｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ）２次抗体、ＨＲＰ接合 （Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１４６２） （１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：５，０００ ）により３７℃１時間で検知した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質混合物（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４０２１）で発展させた。５０μＬの２Ｎ硫酸を加えて４５０ｎｍで読み取った。
ペプチド結合曲線を表す図７Ａ及び７Ｂを参照されたい。
脾臓細胞からの全ＲＮＡの単離。
脾臓細胞を、８ｍＬのＴＲＩ試薬（５０−１００ ｍｇの組織当たり１ｍＬ）においてホモジナイズした。ＴＲＩ試薬におけるメーカーのプロトコルに従って、ホモジナイズした脾臓から全ＲＮＡを単離した。
脾臓細胞を、８ｍＬのＴＲＩ試薬（５０−１００ ｍｇの組織当たり１ｍＬ）においてホモジナイズした。ＴＲＩ試薬におけるメーカーのプロトコルに従って、ホモジナイズした脾臓から全ＲＮＡを単離した。
相分離。
溶解されたサンプル（ＥＲＫ＃１マウス２及びＥＲＫ＃２マウス２）を解凍し、室温に５分間置いて、核タンパク複合体の完全な解離を可能にした。次に、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．１ｍｌのＢＣＰを溶解産物に追加し、サンプルにきっちりとふたをし、１５秒間勢いよく振盪した。結果として生じる混合物を、２から５分間室温に置き、４°Ｃ１２，０００ｇで１５分間、遠心分離機にかけた。
溶解されたサンプル（ＥＲＫ＃１マウス２及びＥＲＫ＃２マウス２）を解凍し、室温に５分間置いて、核タンパク複合体の完全な解離を可能にした。次に、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．１ｍｌのＢＣＰを溶解産物に追加し、サンプルにきっちりとふたをし、１５秒間勢いよく振盪した。結果として生じる混合物を、２から５分間室温に置き、４°Ｃ１２，０００ｇで１５分間、遠心分離機にかけた。
ＲＮＡ析出。
水相を新たなチューブに移した。ＲＮＡをイソプロパノールと混ぜることによって水相から沈殿させた。最初の溶解に使用した１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。サンプルを５−１０分間で室温に置き、４°Ｃで８分間１２，０００ｇで遠心分離した。
水相を新たなチューブに移した。ＲＮＡをイソプロパノールと混ぜることによって水相から沈殿させた。最初の溶解に使用した１ｍｌのＴＲＩ試薬につき０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた。サンプルを５−１０分間で室温に置き、４°Ｃで８分間１２，０００ｇで遠心分離した。
ＲＮＡの洗浄。
上清を取り除いて、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき１ｍｌの７５％エタノールを加えた。ＲＮＡ懸濁液を２５℃で５分間７，５００ｇで遠心分離した。上清をデカントし簡単に再度遠心した。残りの上清を、完全にＲＮＡペレットから吸引した。
上清を取り除いて、１ｍｌのＴＲＩ試薬につき１ｍｌの７５％エタノールを加えた。ＲＮＡ懸濁液を２５℃で５分間７，５００ｇで遠心分離した。上清をデカントし簡単に再度遠心した。残りの上清を、完全にＲＮＡペレットから吸引した。
ＲＮＡ可溶化。
ＲＮＡペレットを、５分間簡単に風乾させた。溶液をピペットチップに通過させ、１５分間５５℃でインキュベートすることにより、ＲＮＡを２５０のμｌのリボヌクレアーゼを含まない水に溶かした。１μＬの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
ＲＮＡペレットを、５分間簡単に風乾させた。溶液をピペットチップに通過させ、１５分間５５℃でインキュベートすることにより、ＲＮＡを２５０のμｌのリボヌクレアーゼを含まない水に溶かした。１μＬの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
図８は、以下の可溶化を達成するＲＮＡ純度を示す。
メッセンジャーＲＮＡ（ポリＡ＋）精製。
メーカーのマニュアルに従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ｍＲＮＡを精製した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液をウォーターバスにおいて３７°Ｃに加熱し、ボルテックスにより混合し、室温に置いた。バッファーＯＢＢを、３７°Ｃのウォーターバスにおいて再度溶かし、室温に置いた。リボヌクレアーゼを含まない水（キットに含まれていた）を５００μＬ（〜１ｍｇの全ＲＮＡ）まで加えた。５００μＬのバッファーＯＢＢ及び５５μＬのＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を加え、チューブを指ではじく（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）ことにより混合した。混合物を加熱ブロックから除去して、７０°Ｃで３分間インキュベートし、室温で１０分間置いた。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡ複合体を、最大速度で２分間遠心分離することでペレットにして、ピペットで移すこと（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）により、上澄を注意深く除去した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡペレットを、ボルテックスにより４００μＬのバッファーＯＷ２中に再懸濁して、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に据えられた小さいスピンカラム上にピペットで移して、１分間最大速度で遠心分離した。
スピンカラムを、リボヌクレアーゼを含まない新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、４００μＬのバッファーＯＷ２をカラムに加え、１分間最高速度で遠心分離し、通過画分を捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを加熱ブロックに置かれたカラム上にピペットで移し、上下にピペッティングしてレジンを再懸濁し、１分間最大速度で遠心分離した。別の５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを、加熱ブロック上に置かれたカラムに加え、レジンを完全に再懸濁し、１分間最高速度で遠心分離した。
メーカーのマニュアルに従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ｍＲＮＡを精製した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液をウォーターバスにおいて３７°Ｃに加熱し、ボルテックスにより混合し、室温に置いた。バッファーＯＢＢを、３７°Ｃのウォーターバスにおいて再度溶かし、室温に置いた。リボヌクレアーゼを含まない水（キットに含まれていた）を５００μＬ（〜１ｍｇの全ＲＮＡ）まで加えた。５００μＬのバッファーＯＢＢ及び５５μＬのＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を加え、チューブを指ではじく（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）ことにより混合した。混合物を加熱ブロックから除去して、７０°Ｃで３分間インキュベートし、室温で１０分間置いた。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡ複合体を、最大速度で２分間遠心分離することでペレットにして、ピペットで移すこと（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）により、上澄を注意深く除去した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ＲＮＡペレットを、ボルテックスにより４００μＬのバッファーＯＷ２中に再懸濁して、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に据えられた小さいスピンカラム上にピペットで移して、１分間最大速度で遠心分離した。
スピンカラムを、リボヌクレアーゼを含まない新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、４００μＬのバッファーＯＷ２をカラムに加え、１分間最高速度で遠心分離し、通過画分を捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを加熱ブロックに置かれたカラム上にピペットで移し、上下にピペッティングしてレジンを再懸濁し、１分間最大速度で遠心分離した。別の５０μＬの熱い（７０℃）バッファーＯＥＢを、加熱ブロック上に置かれたカラムに加え、レジンを完全に再懸濁し、１分間最高速度で遠心分離した。
第１鎖ｃＤＮＡの合成。
メーカーのプロトコル（ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｅ６５６０Ｌ）に従って第１鎖ｃＤＮＡを合成した。２５０ｎｇのｍＲＮＡを５μＬのｄ（Ｔ）２３ ＶＮと混合し、水を２０μＬまで加えた。６５°Ｃで５分間混合物をインキュベートし、１分より長い間、氷上に直ちに移した。２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ反応ミックス（２ｘ）及び５μＬのＰｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ酵素ミックス（１０ｘ）を反応物に加え、４２℃で６０分間、８０℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
メーカーのプロトコル（ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｅ６５６０Ｌ）に従って第１鎖ｃＤＮＡを合成した。２５０ｎｇのｍＲＮＡを５μＬのｄ（Ｔ）２３ ＶＮと混合し、水を２０μＬまで加えた。６５°Ｃで５分間混合物をインキュベートし、１分より長い間、氷上に直ちに移した。２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ反応ミックス（２ｘ）及び５μＬのＰｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ酵素ミックス（１０ｘ）を反応物に加え、４２℃で６０分間、８０℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
単一プライマー増幅のためのテンプレートの調製。
制限オリゴヌクレオチドを備える第１鎖ｃＤＮＡの消化。１７μＬのカッパーｃＤＮＡの消化に関して、１７μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、１μＬの制限オリゴヌクレオチドｒＫＲｅ（２０μＭ）（下記の表を参照）（Ｏｐｅｒｏｎ， ＨＰＬＣで精製された）（最終１μＭ）及び２μＬの１０ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔ バッファー （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と混合し、９５℃で２分間、６４℃で２分間インキュベートし、３７℃まで冷却した。その後、１μＬの制限エンドヌクレアーゼＤｄｅＩ（１０Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｒ０１７５Ｓ） を加え、３７℃で１時間、６５℃で２０分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
制限オリゴヌクレオチドを備える第１鎖ｃＤＮＡの消化。１７μＬのカッパーｃＤＮＡの消化に関して、１７μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、１μＬの制限オリゴヌクレオチドｒＫＲｅ（２０μＭ）（下記の表を参照）（Ｏｐｅｒｏｎ， ＨＰＬＣで精製された）（最終１μＭ）及び２μＬの１０ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔ バッファー （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と混合し、９５℃で２分間、６４℃で２分間インキュベートし、３７℃まで冷却した。その後、１μＬの制限エンドヌクレアーゼＤｄｅＩ（１０Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｒ０１７５Ｓ） を加え、３７℃で１時間、６５℃で２０分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
ＩｇＧのｃＤＮＡの消化に関して、１７μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、１μＬの制限オリゴヌクレオチドｒＣＧＲｅ（２０μＭ）（下記の表を参照）（Ｏｐｅｒｏｎ， ＨＰＬＣで精製された）（最終１μＭ）及び２μＬの１０ｘ ＮＥＢ３．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ） と混合し、９５℃で２分間インキュベートし、６５℃まで冷却した。その後、１μＬの制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＩ（５Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｒ０５２７Ｓ）を加え、６５℃で１時間、８０℃で２０分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
アダプター・オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びニック・ライゲーション。
ＤｄｅＩに消化された２０μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、２２．５μＬの水、１μＬのアダプター・オリゴ１（２０μＭ）、２μＬのｒＣＫアダプター・オリゴ・ミックス（２０μＭ）、５μＬの１０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、及び０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μＬ）と混合し、９５℃で２分間、６５℃で２分間、及び４５℃で１時間インキュベートした。
ＤｄｅＩに消化された２０μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、２２．５μＬの水、１μＬのアダプター・オリゴ１（２０μＭ）、２μＬのｒＣＫアダプター・オリゴ・ミックス（２０μＭ）、５μＬの１０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、及び０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μＬ）と混合し、９５℃で２分間、６５℃で２分間、及び４５℃で１時間インキュベートした。
ＢｓｒＩに消化された２０μＬの第１鎖ｃＤＮＡを、２２．５μＬの水、２μＬのｒＣＧアダプター・オリゴミックス（２０μＭ）、５μＬの１０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、及び０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０ Ｕ／μＬ）と混合し、９５℃で２分間、６５℃で２分間、及び４５℃で１時間インキュベートした。
第２鎖ｃＤＮＡの合成。
カッパー軽鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、２０μＬの連結されたｃＤＮＡを、３２０μＬの水、４０μＬの１０ｘ反応バッファー、８μＬのｄＮＴＰ（各々１０ ｍＭ）、８μＬのＴＭＸｒＶＫ プライマー・ミックス（２０ μＭ）、４μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に加え、混合した。
１００μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの４ウェルに加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５秒間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
カッパー軽鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、２０μＬの連結されたｃＤＮＡを、３２０μＬの水、４０μＬの１０ｘ反応バッファー、８μＬのｄＮＴＰ（各々１０ ｍＭ）、８μＬのＴＭＸｒＶＫ プライマー・ミックス（２０ μＭ）、４μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に加え、混合した。
１００μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの４ウェルに加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５秒間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
ＩｇＧ重鎖についての第２鎖ｃＤＮＡの合成にのために、２０μＬの連結されたｃＤＮＡを、３２０μＬの水、４０μＬの１０ｘ反応バッファー、８μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、８μＬのＴＭＸｒＶＫ プライマー・ミックス （２０ μＭ）、４μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に加え、混合した。１００μＬの混合物をＰＣＲ反応チューブの４ウェルに加えた。反応物を９４℃で最初の１分間変性させ、９４℃５秒間の変性、５６℃１０秒間のアニーリング、及び６８℃２分間の伸長の２０サイクルにより、第２鎖の合成を実行した。
ＰＣＲ精製カラムを使用して第２鎖ｃＤＮＡを浄化する。
第２鎖ｃＤＮＡ、２つのＰＣＲ精製カラムを使用して浄化した。ｃＤＮＡ反応物を貯留し（４００ ｍＬ）、２ｍＬのバッファーＰＢ（ｘ５容量）及び６０μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ ５．２（バッファーＰＢの添加の後の１：４０容量）を加えて、ピペッティングにより混合した。その後、混合物を２つのＰＣＲカラムに加え、−２００〜−４００ｍｂａｒで減圧し、排出した。カラムを７００μＬのバッファーＰＥで洗浄し、２分間室温で静置し、最大圧力で減圧した。カラムを別の７００μＬのバッファーＰＥで洗浄し、最大圧力で減圧した。カラムを最高速度で２．５分間回転させて、残留したバッファーを吸引した。１００μＬのバッファーＥＢでＤＮＡを溶出し、室温で１分間静置し、カラムを最大速度で１．５分間遠心分離した。
第２鎖ｃＤＮＡ、２つのＰＣＲ精製カラムを使用して浄化した。ｃＤＮＡ反応物を貯留し（４００ ｍＬ）、２ｍＬのバッファーＰＢ（ｘ５容量）及び６０μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ ５．２（バッファーＰＢの添加の後の１：４０容量）を加えて、ピペッティングにより混合した。その後、混合物を２つのＰＣＲカラムに加え、−２００〜−４００ｍｂａｒで減圧し、排出した。カラムを７００μＬのバッファーＰＥで洗浄し、２分間室温で静置し、最大圧力で減圧した。カラムを別の７００μＬのバッファーＰＥで洗浄し、最大圧力で減圧した。カラムを最高速度で２．５分間回転させて、残留したバッファーを吸引した。１００μＬのバッファーＥＢでＤＮＡを溶出し、室温で１分間静置し、カラムを最大速度で１．５分間遠心分離した。
単一プライマー増幅。
単一プライマー増幅（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックス，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるカッパー軽鎖の増幅のために、９８７．６μＬの水、１２０μＬの１０ｘバッファー、２４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３０μＬの第２鎖ｃＤＮＡ、１４．４μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び２４μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物をまず作った。１００μＬの反応物の１２アリコートを作った。８５．８μＬの水、１０μＬの１０ｘバッファー、２μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、１．２μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び２μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、ブランクの対照を、別にセットした。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
単一プライマー増幅（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックス，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるカッパー軽鎖の増幅のために、９８７．６μＬの水、１２０μＬの１０ｘバッファー、２４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３０μＬの第２鎖ｃＤＮＡ、１４．４μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び２４μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物をまず作った。１００μＬの反応物の１２アリコートを作った。８５．８μＬの水、１０μＬの１０ｘバッファー、２μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、１．２μＬのＴＭＸ２４ｍＫプライマー（１００μＭ）、及び２μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、ブランクの対照を、別にセットした。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
単一プライマー増幅によるＩｇＧ重鎖の増幅のために、９８７．６μＬの水、１２０μＬの１０ｘバッファー、２４μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、３０μＬの第２鎖ｃＤＮＡ、１４．４μＬのＴＭＸ２４ｍＨプライマー（１００μＭ）、及び２４μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、マスター反応混合物をまず作った。１００μＬの反応物の１２アリコートを作った。８５．８μＬの水、１０μＬの１０ｘバッファー、２μＬのｄＮＴＰ（各々１０ｍＭ）、１．２μＬのＴＭＸ２４ｍＨプライマー（１００μＭ）、及び２μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ・ミックスを混合することにより、ブランクの対照を、別にセットした。反応物を９５℃で最初の１分間変性させ、９５℃５分間の変性、７２℃３０秒間のアニーリング及び伸長の３０サイクルと、それに続く最終伸長７２℃３分間により、単一プライマー増幅を実行した。
１０μＬの増幅産物を、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動して、１μｇの１００ｂｐラダーマーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）でチェックした。図９を参照されたい。
実施例３：記載される方法において使用されることがある追加の配列
マウス
制限エンドヌクレアーゼ消化のためのオリゴヌクレオチド
マウス
制限エンドヌクレアーゼ消化のためのオリゴヌクレオチド
カッパー・フレームワーク１特異的プライマー：（Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ）
重鎖フレームワーク１特異的プライマー：（Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ）
アダプターオリゴヌクレオチド
単一プライマー増幅のためのプライマー
ウサギ
カッパー鎖の制限消化のためのオリゴヌクレオチド
カッパー鎖の制限消化のためのオリゴヌクレオチド
重鎖の制限消化のためのオリゴヌクレオチド
カッパー鎖のニック・ライゲーションのためのオリゴヌクレオチド
重鎖のニック・ライゲーションのためのオリゴヌクレオチド
ウサギ・カッパー鎖・フレームワーク１特異的プライマー（Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ）
ウサギ重鎖・フレームワーク１特異的プライマー（Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ）
単一プライマー増幅のためのプライマー
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造がそれによって包含されることが、意図される。
Claims (43)
- 少なくとも１つの切断部位、第１部分、および第２部分を備えたポリヌクレオチドを含む操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）切断部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を作製する工程；
（ｂ）切断部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；
（ｃ）第１オリゴヌクレオチドの第１部分をポリヌクレオチドの第１部分にアニーリングし、第１オリゴヌクレオチドの第２部分を第２オリゴヌクレオチドの第１部分にアニーリングする工程であって、該第２オリゴヌクレオチドは第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｄ）第１のあらかじめ決められた配列を備えた操作される前のテンプレートを作製するために、ポリヌクレオチドの第１部分を第２オリゴヌクレオチドの第２部分へ連結する工程；
（ｅ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該１セットのプライマーの少なくとも１つのプライマーが、工程（ｄ）の操作される前のテンプレート内のポリヌクレオチドの第１部分に実質的に相補的であってもよい第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、工程；及び、
（ｆ）操作されたテンプレートが、１つの末端で第１のあらかじめ決められた配列を、及び、異なる末端で第２のあらかじめ決められた配列を含むように、操作されたテンプレートを合成する工程を含む
ことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングする工程；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；
（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片をポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｄ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングする工程であって、該第１アダプター・オリゴヌクレオチドが、切断されたポリヌクレオチドの５’末端にアニーリングする第１部分、及び該第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列含む、工程；
（ｅ）切断されたポリヌクレオチドの５’末端を第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結する工程であって、それにより第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作製する、工程；
（ｆ）操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；
（ｇ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該１セットのプライマーの少なくとも１つのプライマーが第２のあらかじめ決められた配列を含む部分を有する、工程；及び、
（ｈ）操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するように、操作されたテンプレートを合成する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングする工程；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；
（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片をポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｄ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを、工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドの５’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第３アダプター・オリゴヌクレオチドに実質的に相補的であり、該第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｅ）切断されたポリヌクレオチドの５’末端を第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結する工程であって、それにより第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作製する、工程；
（ｆ）操作される前のテンプレートから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程；
（ｇ）１セットのプライマーを操作される前のテンプレートへアニーリングする工程であって、該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーが第２のあらかじめ決められた配列を有する、工程；及び、
（ｈ）操作されたテンプレートが、５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有し、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を有するように、操作されたテンプレートを合成する工程を含む
ことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングする工程；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；
（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片をポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を備える第２の部分を含む、工程；
（ｅ）工程（ｃ）の切断を含む５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程；
（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする工程であって、該第１アダプター・オリゴヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結しする工程であって、それにより、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び、
（ｈ）第第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作されたテンプレートを作製するために、２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程、を含む
ことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）制限部位を含む二本鎖部分を備えるポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドへアニーリングする工程；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位でポリヌクレオチドの二本鎖部分を切断する工程；
（ｃ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ａ）のオリゴヌクレオチドの断片をポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより５’末端が切断されたポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｄ）プライマーの第一部分を工程（ｃ）の切断されたポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を備える第２の部分を含む、工程；
（ｅ）工程（ｃ）の切断を含む５’末端又はその近傍及び３’末端又はその近傍に、第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程、；
（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第３アダプター・オリゴヌクレオチドに実質的に相補的であり、該第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第１のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を、第３アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結する工程であって、それにより第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作製する、工程；及び、
（ｈ）第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作される前のテンプレートを作製するために、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程を含む
ことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーセットが第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；
（ｂ）５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程；
（ｃ）少なくとも１つの二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドを第２ポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該２本鎖部分が制限部位を含む、工程；
（ｄ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２ポリヌクレオチドの２本鎖部分を切断する工程；
（ｅ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより３’末端が切断された第２ポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする工程であって、該第１アダプター・オリゴヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする第１部分、及び第２アダプター・オリゴヌクレオチドにアニーリングする第２部分を有し、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第２のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｇ）切断されたポリヌクレオチドの３’末端を第２アダプター・オリゴヌクレオチドへ連結する工程であって、それにより、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に備える、操作される前のテンプレートを作製する、工程；及び、
（ｈ）第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作されたテンプレートを作製するために、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する、工程を含む
ことを特徴とする方法。 - 単一プライマー増幅のための操作されたテンプレートを作製する方法であって、該方法は：
（ａ）１セットのプライマーを第１ポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該プライマーが第１のあらかじめ決められた配列を含む工程；
（ｂ）５’末端又はその近傍に第１のあらかじめ決められた配列を有する第２ポリヌクレオチドを合成する工程；
（ｃ）少なくとも１つの二本鎖部分を備える第２ポリヌクレオチドを作製するために、制限部位を含むオリゴヌクレオチドを第２ポリヌクレオチドへアニーリングする工程であって、該２本鎖部分が制限部位を含む、工程；
（ｄ）制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限部位で第２ポリヌクレオチドの２本鎖部分を切断する工程；
（ｅ）切断されたポリヌクレオチドが二本鎖部分を含まないように工程（ｃ）のオリゴヌクレオチドの断片を第２ポリヌクレオチドから除去する工程であって、それにより３’末端が切断された第２ポリヌクレオチドを作製する、工程；
（ｆ）第１アダプター・オリゴヌクレオチドを工程（ｅ）の第２ポリヌクレオチドの３’末端へアニーリングし、第２アダプター・オリゴヌクレオチドを第３アダプター・オリゴヌクレオチドへアニーリングし、該第２アダプター・オリゴヌクレオチドが第３アダプター・オリゴヌクレオチドに実質的に相補的であり、該第３アダプター・オリゴヌクレオチドが第2のあらかじめ決められた配列を含む、工程；
（ｇ）第２ポリヌクレオチドの３’末端を第２のアダプター・オリゴヌクレオチドへ連結し、それにより、３’末端又はその近傍に第２のあらかじめ決められた配列を備える操作される前のテンプレートを作る、工程；及び
（ｈ）第１のあらかじめ決められた配列を５’末端又はその近傍に有し、第２のあらかじめ決められた配列を３’末端又はその近傍に有する、操作されたテンプレートを作製するために、第２ポリヌクレオチドから第１アダプター・オリゴヌクレオチドを除去する工程、を含む
ことを特徴とする方法。 - 第１のあらかじめ決められた配列が、普遍的な配列を有する１セットのプライマーに逆相補的である、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第２のあらかじめ決められた配列が、普遍的な配列を有する１セットのプライマーに逆相補的である、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 操作されたテンプレートから第２ポリヌクレオチドを合成する工程（ｇ）を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 操作されたテンプレートから第２ポリヌクレオチドを合成する工程（ｉ）を更に含む、ことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
- 第２ポリヌクレオチドが第２鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、ことを特徴とする請求項４−７の何れか１つに記載の方法。
- 少なくとも操作されたテンプレートと、少なくとも異なる操作されたテンプレートが、単一の合成反応物中に組み合わされる、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 操作されたテンプレートが異なっていること、を特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 操作されたテンプレートが合成反応物において使用される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に逆相補的なあらかじめ決められた配列を備えた少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅する工程（ｇ）を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 操作されたテンプレートの少なくとも１つのあらかじめ決められた配列に逆相補的なあらかじめ決められた配列を備えた少なくとも１つのプライマーを使用して、操作されたテンプレートを増幅する工程（ｉ）を更に含む、ことを特徴とする請求項２−７の何れか１つに記載の方法。
- あらかじめ決められた配列を備える１つのプライマーのみが使用されること、を特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 第１ポリヌクレオチドが第１鎖ｃＤＮA又第２鎖ｃＤＮAである、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 連結する工程がＤＮＡリガーゼを更に含む、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 連結する工程がニック・ライゲーションを更に含む、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 工程（ａ）−（ｄ）がポリメラーゼを含まない、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）−（ｅ）がポリメラーゼを含まない、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 工程（ａ）−（ｅ）がポリメラーゼを含まない、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 工程（ｆ）−（ｈ）がポリメラーゼを含まない、ことを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
- 工程（ｃ）−（ｈ）がポリメラーゼを含まない、ことを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。
- ２本鎖ポリヌクレオチド内で制限酵素によって認識される任意の部位で切断が生じる、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- ポリメラーゼがない状態において少なくとも１．５倍以上効率的である、ことを特徴とする請求項２２−２６の何れか１つに記載の方法。
- ポリメラーゼがない状態において少なくとも２倍以上効率的である、ことを特徴とする請求項２２−２６の何れか１つに記載の方法。
- 操作されたテンプレートは、ポリメラーゼにより導入されるアデノシンを含まず、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列によってコード化されない、ことを特徴とする請求項１−３、６および７の何れか１つに記載の方法。
- プライマーが普遍的な配列を有する、ことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼが任意の制限エンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項２−７の何れか１つに記載の方法。
- 第１アダプター・オリゴヌクレオチドの第１部分が、第１のアダプター・オリゴヌクレオチドの５’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- ポリヌクレオチドの第１部分が、ポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第１アダプター・オリゴヌクレオチドの第２部分が、第１アダプター・オリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第２アダプター・オリゴヌクレオチドの第１部分が、第１アダプター・オリゴヌクレオチドの３’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- ポリヌクレオチドの第２部分が、ポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第１のあらかじめ決められた配列と第２のあらかじめ決められた配列が逆相補的である、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第１のあらかじめ決められた配列がポリヌクレオチドの５’末端近傍に配置され、第２のあらかじめ決められた配列がポリヌクレオチドの３’末端近傍に配置される、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- アダプター・オリゴヌクレオチドは、アダプター・オリゴヌクレオチドを切断されたポリヌクレオチドへアニーリングする前に、共にアニーリングされる、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- 第１のあらかじめ決められた配列及び第２のあらかじめ決められた配列は、第１または第２ポリヌクレオチド内の任意の配列に実質的に類似しない、ことを特徴とする請求項１−７の何れか１つに記載の方法。
- プライマーの第１部分は操作される前のテンプレートの３’末端にアニーリングする、ことを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
- プライマーの第１部分が第２ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする、ことを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。
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