AT502823B1 - Polynukleotid-amplifikation - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der spezifischen Polynukleotid-Amplifizierung.

Um die Kausalitäten für die unterschiedlichen Zustände zu verstehen, in denen sich Leben darstellt, muss man die Faktoren und Prozesse finden, die zu Leben führen. Ein zentrales Ele-5 ment bei diesem Unterfangen ist das Genom, in dem Informationen auf solche Weise gespeichert sind, dass sie über Generationen hinweg in einer hoch konservierten Weise weitergegeben werden können. Bei der Ausführung der Informationen, die im Genom enthalten sind, wird DNA in RNA transkribiert und ferner in Protein translatiert. Die Erforschung des Genoms (DNA), des Transkriptoms (RNA) und des Proteoms (Protein) hat in den letzten Jahren einen wertvollen io Beitrag zu unserem Verständnis der molekularen Grundlage von Leben geleistet.

Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, um RNA-Proben in vitro zu vergleichen. Ein früher Ansatz ist das Verfahren der differentiellen Hybridisierung oder des differentiellen Screenings (Rebagliati et al., 1985). Dazu gehört das zufällige Auswählen von Klonen (oder Sequenzen) aus cDNA-15 Bibliotheken und das Überprüfen, ob sie in RNA-Proben in unterschiedlicher Konzentration vorhanden sind. Es müssen enorme Anstrengungen unternommen werden, um ein einzelnes, differentiell exprimiertes Transkript zu identifizieren, da man annimmt, dass ihre Population unter 1 % liegt. Subtrahierende Hybridisierung wurde vorgeschlagen, um dieses Problem zu beseitigen, indem vor dem Screening eine Anreicherung für differentiell exprimierte Transkripte 20 durchgeführt wurde. Ein anderer Weg, das Abundanzproblem zu lösen, wurde durch das Einführen von Mikro-Arrays mit hoher Dichte eingeschlagen. Durch die Verwendung der Mikro-Array-Technologie werden 100e bis 1000e cDNAS, welche mRNAs der Gene, die von Interesse sind, entsprechen, auf eine Oberfläche aufgetragen (gespottet) und mit ihr verbunden. Sie werden normalerweise aus sequenzierten EST-Bibliotheken gewonnen und können - wenn sie 25 nicht redundant sind - so viele Transkripte abdecken wie Spots auf die Membran passen. Kurzum, mRNA, die aus Zellen oder Geweben, die von Interesse sind, extrahiert wurden, werden markiert, z.B. während der reversen Transkription, und mit diesen Mikro-Arrays hybridisiert. Die Signalintensität von entsprechenden Spots zwischen zwei oder mehr RNA-Präparationen kann dann verglichen werden. Obwohl diese Technologie Massen an Daten produziert hat, gibt 30 es zwei wesentliche Nachteile in Zusammenhang mit all diesen Hybridisierungstechniken. Einer dieser Nachteile ist die Kreuzhybridisierung. Das bedeutet, dass zwei DNA-Moleküle nicht über ihre gesamte Sequenz hinweg komplementär sein müssen, um zu hybridisieren. Dadurch entsteht eine Mehrdeutigkeit in Bezug auf die Identität des Moleküls, das an den Spot hybridisiert (bindet). Außerdem können nur Moleküle verglichen werden, die als Spot aufgetragen werden, 35 wodurch die Suche auf Sequenzen beschränkt wird, die in der Bibliothek vorhanden sind, die für die Erzeugung des Arrays verwendet wird. 1992 wurde ein alternativer Ansatz eingeführt (Liang et al., 1992; Welsh et al., 1992), der heutzutage allgemein als „Differential Display“ (DD) bekannt ist. Bei dem DD wird die gesamte 40 mRNA-Population einer Probe zuerst während der reversen Transkription (RT) in definierte Pools von cDNS unterteilt. Dies wird bewirkt, indem die RT mit einem, zwei oder x basenverankerten Oligo-dT-Primern geprimt wird und die Proben in 3, 12 oder 3x4x'1 Fraktionen unterteilt werden. Diese Verankerungsbasen hybridisieren mit den Basen unmittelbar stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz. Es sollen daher mRNA-Moleküle für die reverse Transkription selektiert 45 werden, deren Basen unmittelbar stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz komplementär zu den Verankerungsbasen des Primers sind. In einer anschließenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden willkürliche Primer und verankerte Primer zum Amplifizieren definierter Pools von cDNA verwendet. Entsprechende Pools werden nebeneinander auf einem Gel laufen gelassen, das sie der Größe nach trennt. Die Unterschiede der Expressionspegel spiegeln sich in den so Unterschieden der Bandenintensität wider. Banden, die von Interesse sind, werden aus dem Gel ausgeschnitten, erneut amplifiziert und sequenziert. Ein Nachteil des ursprünglichen DD ist, dass es willkürliche Primer für die Amplifizierung verwendet. Ein derartiger Schrotschussansatz kann nur dadurch eine vollständige Transkriptomabdeckung erreichen, dass das Transkriptom statistisch mehrfach abgedeckt wird. Daher werden einige RNA-Moleküle zwangsläufig mehr-55 fach im Display wiedergegeben, und andere werden möglicherweise gar nicht wiedergegeben. 3 AT 502 823 B1

In neuerer Zeit sind Verfahren eingeführt worden, die Pools von RNA in systematischerer Weise amplifizieren (Prashar et al., 1996; Prashar et al., 1999). Prinzipiell sind drei weitere Schritte beteiligt. Nach der Erststrang-cDNA-Synthese wird die Zweitstrangsynthese durchgeführt, um doppelsträngige DNA zu erhalten, die mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden kann. In 5 einem dritten Schritt wird ein Adapter an die 5-Enden der Fragmente ligiert. Diese Fragmente werden danach mit einem Primer, der zu der 5’-Adaptersequenz komplementär ist, und einem Verankerungsprimer, der für RT verwendet wurde, PCR-amplifiziert. Die Autoren schätzten, dass jedes 6-basig schneidende Restriktionsenzym 8 % der cDNAs an einer Position zwischen 60 und 400 Basen von dem 3-Poly-A-Schwanz der mRNA schneidet. Daher sind mehr als io 12 Restriktionsenzyme erforderlich, um eine vollständige Abdeckung des Transkriptoms zu erhalten. Eine etwas elegantere Variante dieses Verfahrens wurde von Matz et al. (1997) mit der Einführung des „Ordered Differential Display“ beschrieben, die den PCR-Unterdrückung-seffekt ausnutzt. 15 Abgesehen davon, dass sie das Transkriptom nur statistisch auf einer Ebene oder der anderen abdecken, weisen alle zuvor genannten DD-Verfahren einen weiteren Nachteil auf. Sie liefern dem Forscher nur einen Teil der mRNA-Sequenz, die differentiell exprimiert wird. Stromabwärts von diesen DD-Technologien muss man trotzdem noch immer entweder die cDNA-Bibliotheken oder, sofern solche verfügbar sind, Online-Sequenz-Bibliotheken auf Volllängenklone screenen 20 oder Methodologien anwenden, welche 5'- und 3'-Sequenzen aus einer teilweise bekannten mRNA-Sequenz, beispielsweise RACE (Frohman et al., 1988), entdecken können. Doch selbst durch die Identifikation solcher Volllängentranskripte wird noch immer keine Gewissheit, zumindest bei Eukaryoten, geboten, dass die gefundene mRNA jene mRNA ist, die das Signal erzeugt hat, da in Eukaryoten ein Hauptfaktor für die Genomkomplexität das Spleißen ist. Daher 25 kann die im Display gefundene Sequenz mehreren Spleißvarianten gemeinsam sein. Ferner können unterschiedliche Spleißvarianten eines Gens unterschiedliche Funktionen aufweisen, wodurch es äußerst wünschenswert wird, die korrekte Spleißvariante zu kennen, welche das Signal erzeugte. 30 Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, das definierte Subpopulationen von Transkripten in ihrer gesamten Länge mit vollständiger Abdeckung aller mRNA-Moleküle, die in der Probe vorhanden sind, amplifizieren (anreichern) kann.

Die vorliegende Erfindung stellt nun ein Verfahren zur Amplifizierung eines Pools von Poly-35 nukleotidmolekülen in einer Probe bereit, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist: a) Bereitstellen einer RNA-Probe und reversen Transkription von ganzen RNA-Molekülen, wodurch eine Volllängen-cDNA erzeugt wird, oder Bereitstellen einer Probe einer Volllängen-cDNA, 40 b) Anhängen eines Schwanzes an das 3'-Ende der transkribierten cDNA in Form eines Polynukleotid-Schwanzes nach dem 3'-Ende, c) Amplifizierung der cDNA unter Verwendung von Primern, wobei ein erster (3') Primer für das 5'-Ende der cDNA spezifisch ist und ein zweiter (5') Primer für den stromaufwärtigen Abschnitt des Polynukleotid-Schwanzes und die nächsten 1 bis 10 Nukleotide, vorzugsweise 1 bis 45 5 Nukleotide, noch bevorzugter 3 bis 5 Nukleotide, stromaufwärts von dem 3'-Polynukleotid-

Schwanz der cDNA spezifisch ist.

Eine Volllängen-cDNA kann durch ein unten beschriebenes Verfahren der reversen Transkription, z.B. durch Verwendung von speziellen Primern, die für bestimmte Sequenzen selektieren so können und somit die Polynukleotide der Probe in spezifische Volllängen-cDNA-Pools unterteilen, oder durch gemäß des Standes der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden. Verfahren zum Erzeugen von Volllängen-cDNA sind Fachleuten hinlänglich bekannt, z.B. werden sie in den Patentschriften US 5,962,271 und US 5,962,272 offenbart. Derartige erzeugte cDNA kann auch als Ausgangsmaterial verwendet werden, um Volllängen-cDNA in unterschiedliche 55 Fraktionen zu poolen. Diese Verfahren verwenden die Matrizenwechselfähigkeit der reversen 4 AT 502 823 B1

Transkriptase, um eine definierte Sequenz zu dem 5'-Primer-Ende der cDNA in einer Capabhängigen Weise hinzuzufügen. Der Primer, der in der anschließenden Amplifizierung benötigt wird, wird daher einen Abschnitt aufweisen, der zu dem so erzeugten 3'-Ende der cDNA komplementär ist, und wird definieren, welche Fraktion der cDNA durch mehrere, z.B. 1 bis 10, 5 zusätzliche Basen amplifiziert wird, welche durch das 5-Ende der amplifizierten mRNA-Moleküle definiert werden.

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, steht der Begriff „reverse Transkriptase“ für jede Polymerase, die eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist und verwendet werden kann, um io cDNA aus RNA zu synthetisieren.

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, steht der Begriff „Volllängen-cDNA“ für DNA, die eine Sequenz enthält, die zu der mRNA-Sequenz von der ersten Base nach dem Cap, z.B. dem RNA-7-Methylguanosin-Cap oder RNA-m7G-Cap, bis zur letzten Base vor dem Poly-A-15 Schwanz der als Matrize verwendeten mRNA komplementär ist.

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, steht der Begriff „Volllängen-Amplifizierungs-produkf für DNA, die eine Sequenz enthält, die zu der mRNA-Sequenz von der ersten Base nach dem Cap bis zur letzten Base vor dem Poly-(A)-Schwanz der als Matrize verwendeten 20 mRNA komplementär ist.

Das zentrale Element dieser Erfindung ist die Tatsache, dass Volllängen-mRNA-Moleküle in Subpopulationen repräsentiert werden können, die durch ihr 5'- und/oder 3'-Ende definiert sind. Im Prinzip bedeutet dies, dass nach der Erzeugung der Volllängen-cDNA durch irgendein auf 25 dem Fachgebiet bekanntes Mittel, die 5'- und/oder 3-Sequenz verwendet werden kann, um einen Satz an Primer-Kombinationen zu formulieren, der folgende Qualität aufweist. 1) Jede cDNA wird nur durch ein Primer-Paar in Abwesenheit von Mispriming (falsche Primer-Anlagerung) amplifiziert. Daher kann eine vollständige Transkriptomabdeckung ohne Redun- 30 danz erreicht werden. 2) Jede cDNA-Sequenz innerhalb eines solchen definierten Pools wird die vollständige Aminosäurensequenz des Proteins codieren, das von der entsprechenden RNA translatiert wurde und auch 35 3) deren Transkriptionsstartstelle auf ihrem Gen definieren (es könnte unterschiedliche Nachrichten geben, die von demselben Gen transkribiert werden und die unterschiedliche Transkriptionsstartstellen aufweisen können). 40 Wenn man die Qualität (1) mit dem ursprünglichen DD vergleicht, lässt sich feststellen, dass darin die willkürlichen Primer die Eigenschaft aufweisen, entweder nicht komplementär zu einer bestimmten cDNA zu sein, einmal komplementär zu sein oder mehr als einmal komplementär zu sein. Daher kann jede cDNA entweder überhaupt nicht oder einmal oder mehrmals repräsentiert werden. Wenn alternative Methodologien verwendet werden, die ein Restriktionsenzym 45 enthalten, wird jedes Restriktionsenzym eine spezifische cDNA entweder überhaupt nicht oder einmal oder mehrmals schneiden. Daher kann eine wahrhaft vollständige Transkriptomabdeckung nie erreicht werden. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass mRNAs mindestens einmal in dem Display wiedergegeben werden, muss die Redundanz erhöht werden. so Die Qualitäten (2) und (3) können ebenfalls nicht durch differentielle Display-Techniken erreicht werden, die bis zum heutigen Tage verwendet wurden, ohne Stromabwärts-Technologien, wie z.B. RACE, zu verwenden.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Amplifizierung und Analyse des Transkriptoms 55 durch qualitatives und quantitatives Detektieren von differentiell exprimierten RNA-Molekülen 5 AT 502 823 B1 bereit. Die Technik gemäß der Erfindung ist ein organisiertes Volllängen-Expressionsdisplay.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung einen Primer, der für den 3'-Poly-A-Schwanz der RNA oder mRNA und die nächsten 1 bis 10 Nukleo-5 tide, vorzugsweise 1 bis 5 Nukleotide, noch bevorzugter 3 bis 5 Nukleotide stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz spezifisch ist, und für die reverse Transkription verwendet wird, und/oder ein Amplifizierungs-Primer, der für einen 5'-Poly-T-Abschnitt der cDNA, der zu dem 3'-Poly-A-Schwanz der RNA oder mRNA komplementär ist, und den nächsten 1 bis 10 Nukleotiden, vorzugsweise 1 bis 5 Nukleotiden, noch bevorzugter 3 bis 5 Nukleotiden, stromabwärts von io dem 5'-Poly-T-Abschnitt spezifisch ist. Demzufolge kann zusätzlich zu dem oben beschriebenen selektiven 3'-Primer ein selektiver 5'-Primer verwendet werden, um die selektive Kraft des Primer-Paares zu steigern und somit die Anzahl an cDNA-Pools zu erhöhen, die durch die spezifischen Nukleotide neben den Endsequenzankern definiert werden. 15 Vorzugsweise besteht der Primer für die reverse Transkription aus Desoxynukleotiden.

Im Allgemeinen können die Primer, die in der vorliegenden Patentanmeldung genannt werden, aus beliebigen Nukleotiden bestehen, z.B. aus Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden. Obwohl Desoxynukleotide in den meisten Fällen bevorzugt werden, sind auch Ribonukleo-20 tidprimer verwendbar. Daher kann ein Desoxyribonukleotid in einem bestimmten Primer, wie in einem der unten angeführten Beispiele, durch eines seiner Ribonukleotidanaloga (z.B. dG durch G, dA durch A, dC durch C, dT durch T oder U) oder ein anderes Nukleotidanalogon ersetzt werden. 25 Vorzugweise erfolgt das Versehen des 3'-Endes mit einem Schwanz unter Verwendung von terminaler Transferase. Die terminale Transferase kann eine bestimmte Anzahl von Nukleotiden hinzufügen, die vorzugsweise gleichmäßig aus einem Nukleotidtyp selektiert werden. Jedes andere Mittel zum Tailing, zum Hinzufügen einer Schwanzsequenz, kann ebenso verwendet werden, z.B. durch Nutzen der Matrizenwechselfähigkeit der reversen Transkriptase oder durch 30 Ligieren der Schwanzsequenz, welche einheitlich aus einem Typ von Nukleotiden oder aus unterschiedlichen Nukleotiden bestehen kann. Ein solcher Schwanz ist vorzugsweise eine Sequenz im Bereich zwischen 5 und 500 Nukleotiden, bevorzugter weniger als 400, weniger als 300, weniger als 200, weniger als 100, weniger als 50 oder weniger als 30 Nukleotiden. 35 In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amplifizierung der cDNA-Sequenzen unter Verwendung eines selektiven Primer-Paares durch PCR ausgeführt. PCR oder Polymerase-Kettenreaktion ist eine weit verbreitete, auf dem Fachgebiet wohl bekannte Technik, zum Ampli-fizieren von Polynukleotiden unter Verwendung einer Polymerase, von Nukleotidtriphosphaten, Primern, Puffersubstanzen und Kofaktoren, wie Mg-Ionen, und eines Temperaturprotokolls für 40 die Hybridisierung, Polymerisation und Schmelzen oder Strangtrennung.

Vorzugsweise besteht der erste Primer und/oder zweite Primer für die Amplifizierung aus Desoxynukleotiden. 45 In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung einen zusätzlichen Schritt des Trennens der Amplifizierungsprodukte gemäß ihrer Länge. Die Trennung der erzeugten Polynukleotide ermöglicht eine Charakterisierung, Isolierung und Sequenzbestimmung für jeden Pool nach der selektiven Polymerisation, wodurch sich in der Praxis ein bedeutender Vorteil für diese bevorzugte Ausführungsform ergibt. 50

Vorzugsweise erfolgt die Trennung durch Gel-Elektrophorese, vorzugsweise Agarose-Gel-Elektrophorese, Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese oder Kapillar-Elektrophorese.

Noch bevorzugter umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung einen zusätzlichen Schritt zum 55 Bestimmen der Identität oder Sequenz der Amplifizierungsprodukte. Die Sequenzbestimmung 6 AT 502 823 B1 kann zum Beispiel durch Gel-Sequenzierung, z.B. PCR mit Didesoxynukleotiden, oder in einem Sequenzierungsautomaten erfolgen.

Vorzugsweise erfolgt der Schritt des Bestimmens der Identität oder Sequenz der Amplifizie-5 rungsprodukte durch einen automatisierten Vorgang auf einem Chip.

Die Probe, die für die reverse Transkription verwendet wird, enthält vorzugsweise Gesamt-RNA-oder Gesamt-mRNA, vorzugsweise gereinigte RNA oder gereinigte mRNA, aus einer Probe (Specimen). Die Gesamt-RNA oder Gesamt-mRNA gibt alle einzelnen mRNA-Sequenzen wie-io der, die in einer Probe, z.B. einer Gewebeprobe oder in Zellen aus einer Zellkultur, gefunden werden, um eine vollständige Transkriptomabdeckung innerhalb des Umfangs des Verfahrens zu ermöglichen.

Diese RNA-Moleküle werden vorzugsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung 15 einer Oligo-dT-Zellulose-Säule gereinigt. Somit wird mRNA mit einem Poly-A-Schwanz vorselektiert.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt, dass die reverse Transkription unter hoch-stringenten Bedingungen ausgeführt wird, um die Selektivität der verankerten Primer zu 20 erhöhen, die als Pool von verankerten Primern in einer Polymerisationsreaktion und als getrennte Primer für unterschiedliche Polymerisationsreaktionen verwendet werden können. In der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Formulierungen „stringente Hybridisierungsbedingungen“ oder „stringente Bedingungen“ auf Bedingungen, unter denen ein Primer der Erfindung mit seiner Zielsequenz hybridisieren wird, aber mit einer minimalen Anzahl an anderen Sequenzen. 25 Hohe Stringenz kann zum Beispiel durch Verwendung einer hohen Annealing-Temperatur (Anlagerungstemperatur) alleine oder in Kombination mit einem chemischen Zusatzmittel, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) und Tetramethylammoniumoxalat (TMAO) (Kovarova et al. 2000), erreicht werden. Beispiele für hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labo-30 ratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley and Sons, N.Y. 1994, angeführt. Unter den Standard-PCR-Bedingungen wird oft eine Annealing-Temperatur ausgewählt, die ungefähr 5 Grad Celsius unter der Schmelztemperatur des Primers liegt. Werden die Reaktionsbedingungen konstant gehalten, hängt die Schmelztemperatur hingegen vorrangig von der 35 Länge und dem GC-Gehalt der Oligonukleotide ab, die durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel berechnet werden können. Unter stringenteren Bedingungen wird die Annealing-Temperatur über die Temperatur angehoben, die unter Standardbedingungen verwendet wird, um die Wahrscheinlichkeit von Mispriming zu reduzieren. Die Annealing-Temperatur kann auf eine Temperatur erhöht werden, die noch immer genug Priming-Ereignisse zulässt, damit die 40 Amplifizierung stattfindet. Zum Beispiel würde - wenn ein Primer eine Schmelztemperatur von 50°C aufweist und eine Annealing-Temperatur von 45°C unter Standardbedingungen gewählt würde - eine Annealing-Temperatur von 50°C folglich stringenter sein als eine von 45°C. Zum Beispiel können Primer des Typs dT16VN zu starkem Mispriming unter normalen RT-Bedingungen führen und daher die Spezifität der synthetisierten cDNA-Pools verringern (Mizu-45 no et al., 1999). Analoge Ergebnisse wurden in Zusammenhang mit AMV und HIV-1 reverser Transkriptase berichtet. Die Primer-Promiskuität kann durch Erhöhen der Temperatur während des Annealing-Vorgangs und der reversen Transkription verringert werden. Zu diesem Zweck können thermostabile Enzyme verwendet werden, welche eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweisen, oder es können Reverse-Transkriptase-Enzyme thermogeschützt werden, indem so Thermoschutzmittel, wie Trehalose, zur Reaktion hinzugefügt werden (Carninci et al., 1998). Ein weiterer Vorteil in Zusammenhang mit der Verwendung von Trehalose liegt darin, dass die Menge von Volllängen-cDNA zunimmt (Carninci et al., 1998). Diese Eigenschaft wurde auch von Spiess et al. (2002) beschrieben. Zudem zeigte Spiess, dass Betain auch die Menge an Volllängen-cDNA erhöhen kann und dass eine Kombination aus Betain und Trehalose das 55 beste Ergebnis ergab (Spiess et al., 2002). Eine solche RT kann aus dem Moloney-Murine- 7 AT 502 823 B1

Leukemia-Virus (M-MLV) (US 4,943,531 A) oder in einer bevorzugteren Ausführungsform aus M-MLV gewonnen werden, das keine RNAse-H-Aktivität aufweist (US 5,405,776 A). Eine andere Möglichkeit zur Erhöhung der Primer-Spezifität besteht darin, kompetitive Oligo-Nukleotid-Blocker, wie von Mizuno et al. (1999) beschrieben, zu verwenden. Daher umfasst die vorliegen-5 de Erfindung auch ein Verfahren, in dem hoch-stringente Bedingungen für die Verfahren der reversen Transkription und/oder Amplifizierung verwendet werden.

Vorzugsweise wird in dem Verfahren gemäß der Erfindung die Selektivität der reversen Transkription und/oder Polymerase-Kettenreaktion durch die Verwendung von Trehalose, Be-io tain, Tetramethylammoniumchlorid, Tetramethylammoniumoxalat, Formamid und Oligo-Blo-ckern oder durch die Verwendung von Dimethylsulfoxid während der Polymerase-Kettenreaktion erhöht, um das Auftreten von Mispriming zu verringern und die Menge der Volllängen-cDNA zu erhöhen. 15 Da alle reversen Transkriptasen eine hohe Fehlerrate aufweisen, wird vorzugsweise eine Proofreading-Aktivität (Korrekturaktivität) in die Reaktion eingeschlossen. Enzyme, die eine solche Aktivität durch ihre 3' --> 5'-Exonukleasefunktion aufweisen, sind z.B. Polymerasen wie PFU, Ultma, Vent, Deep Vent, PWO und Tli oder E.coli-Exonuklease-Ill. Zusätzlich zur Reduktion von Fehlern, die während der RT in eine cDNA eingeführt werden, kann das Aufnehmen 20 einer Korrektur-Aktivität auch die Volllängen-cDNA-Synthese verstärken (Hawkins, 2003).

Ferner wird bevorzugt, dass eine solche Korrektur-Aktivität auch in den PCR-Schritt des Verfahrens aufgenommen wird. Einerseits wird dies die Fehler verringern, die in die Sequenz während der PCR eingeführt werden, aber auch die Größe von cDNA-Molekülen erweitern, die amplifi-25 ziert werden können (Barnes, 1994). Da eine solche 3' --> 5'-Exonuklease-Aktivität die Primer abbauen kann, die in der Reaktion verwendet werden, wird bevorzugt, die Primer vor dem Abbau zu schützen, zum Beispiel durch Einführen einer Phosphorthioat-Bindung an dem 3'-Terminal des Primers (Skerra, 1992; Di Giusto, 2004). 30 Es wird bevorzugt, dass während der reversen Transkription und/oder PCR, Enzyme oder Enzymkombinationen verwendet werden, die eine hohe Verarbeitungsfähigkeit oder Verlässlichkeit aufweisen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur vollständigen Transkriptom-Abdeckung ohne 35 Redundanz, zumindest im Prinzip, bereit. Dennoch können methodologische Eigenschaften wie Mispriming und Polymerasestopp das Ergebnis beeinflussen. Die Abdeckung von langen mRNAs hängt daher von den verwendeten Enzymen ab. Proofreading-Enzyme (Korrektur-Enzyme), die für lange PCR-Verfahren verwendet werden, vergrößern den Umfang der Transkriptom-Abdeckung auf mindestens 99 % unter idealen Bedingungen für die jeweiligen Enzyme 40 und Verfahrensparameter (z.B. lange Extensionszeiten). Unspezifische Anlagerung (Misannea-ling), die z.B. durch Stringenz und Korrektur-Aktivitäten verringert werden kann, kann zu einer beschränkten Redundanz des abgedeckten Transkriptoms führen, die viel geringer als in herkömmlichen Display-Techniken ist - wie dem Schrotschussansatz, bei dem eine unspezifische Anlagerung sogar erwünscht ist. 45

Die maximale Länge eines RNA-Moleküls, das dargestellt werden kann, hängt insbesondere von der Qualität der reversen Transkription und der Amplifizierungsreaktion, z.B. PCR, ab. Im Prinzip kann eine lange PCR DNA bis zu mindestens 35 kb (Barnes, 1994) und RT-PCR bis mindestens 20 kb (Thiel et al., 1997) amplifizieren, wodurch mindestens 99,9 % aller Transkrip-50 te dargestellt werden können. Es gibt jedoch außergewöhnlich lange RNA-Moleküle, wie Titin (NCBI-Zugriffsnummer X90568), die eine Länge von ungefähr 80 kb aufweisen, und obwohl dies theoretisch darstellbar ist, wird man aus praktischen Gründen das Display wahrscheinlich nicht auf solche Transkripte einstellen. 55 Vorzugsweise wird die reverse Transkription durch eine reverse Transkriptase (RT) ausgeführt, 8 AT 502 823 B1 die aus dem Moloney-Murine-Leukemia-Virus, AMV, HIV-1, HIV-2 gewonnen wurde, wobei die RNase-H-Aktivität dieser RTs vorhanden oder nicht vorhanden oder reduziert ist. Die reverse Transkription kann durch ein beliebiges Enzym durchgeführt werden, das eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist, z.B. Tth-DNA-Polymerase, welche eine Reverse-Transkriptase-5 Aktivität in der Gegenwart von Mn2+ aufweist. Zusätzlich kann die RNA nach dem Schritt der reversen Transkription abgebaut werden, zum Beispiel durch ein RNA-abbauendes Enzym, wie RNase, um eine lange PCR zu erleichtern.

Ferner wird bevorzugt, dass Primer, die für die reverse Transkription verwendet werden, in einer io oder zwei Basen an deren 3'-Ende, ein Wobble aufweisen, vorzugsweise zwischen Position 2 bis 4 stromaufwärts von dem letzten dT des terminalen dT-Abschnitts, um die Spezifität weiter zu erhöhen.

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, bezieht sich der Begriff „Primer“ auf eine Mi-15 schung aus Oligonukleotiden, welche dieselbe Sequenz aufweisen.

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, bezieht sich der Begriff „Wobble-Primer“ auf eine Mischung aus Oligonukleotiden, welche dieselbe Sequenz aufweisen, mit Ausnahme der Base oder der Basen, die Teil des „Wobble“ sind. 20

So wie im vorliegenden Dokument verwendet, bezieht sich der Begriff „Wobble“ auf eine Base innerhalb eines Primer-Pools, die als Mischung von zwei oder drei oder vier unterschiedlichen Nukleotiden vorhanden ist. 25 Zum Beispiel kann ein Wobble-Primer aus Oligonukleotiden der Sequenz ACACACN bestehen, wobei N für das Wobble steht und N gleich A oder C oder T oder G ist. Dieser Wobble-Primer würde dann aus einer Mischung von Nukleotiden der Sequenz ACACACA, ACACACC, ACACACT und ACACACG bestehen. 30 Wenn N-Nukleotide als Mischung (N ist eine Mischung aus dA, dC, dG und dT) in Wobble-Primern verwendet werden, können stattdessen Nukleotide mit universellen Basen verwendet werden, zum Beispiel Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol-2'-desoxynucleosid und 5-Nitroindol-2'-desoxynucleosid. Universelle Basen werden mit jedem beliebigen Nukleotid (dA, dC, dG, dT) ein Basenpaar bilden. 35

Daher weisen gemäß der Erfindung die Primer, die für die reverse Transkription oder Amplifizie-rung verwendet werden, vorzugsweise eine Wobble-Substitution auf, z.B. kann dT durch dG, dA, dC und umgekehrt in einer oder zwei Basen an deren 3'-Ende substituiert werden, vorzugsweise zwischen Position 2 und 4 stromaufwärts von dem letzten Nukleotid, das vorzugs-40 weise dT bei einem 5'-RT-Primer (für 5' --> 3'-Strangsynthese) und einem 3'-Amplifizierungs-Primer und dA bei einem 5'-Amplifizierungs-Primer ist. In dem PCR-Schritt des Verfahrens können solche „Wobble“-Primer verwendet werden, um die Spezifität sowohl für das 5'- als auch das 3'-Ende der zu amplifizierenden cDNA zu erhöhen. 45 Wobbles können auch verwendet werden, um den Primer, der zu dem Poly-A-Schwanz der ursprünglichen RNAs komplementär ist, an die Basen zu verankern, die sich unmittelbar stromaufwärts des Schwanzes befinden. In diesem Fall kann die Selektion in unterschiedliche Pools durch Primer erzielt werden, die zu Basen selektiv sind, welche Basen nach dem Cap der ursprünglichen RNA entsprechen. Dieselbe Vorgangsweise kann auf das 3'-Ende der cDNA so angewendet werden, wo Wobbles einen Primer an die Basen verankern können, welche den Basen stromabwärts von dem Cap der ursprünglichen RNA entsprechen. Daher würde die Selektion in unterschiedliche Pools durch Primer erfolgen, welche für Basen selektieren, die Basen entsprechen, die sich unmittelbar stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz der ursprünglichen RNAs befinden. 55 9 AT 502 823 B1

Noch bevorzugter ist ein Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem die Wobble-Base eine Substitution durch universelle Basen wiedergibt, vorzugsweise Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol-2'-desoxynucleosid oder 5-Nitroindol-2'-desoxynucleosid, die mit jeder regulären Nukleobase, wie dA, dT, dG oder dC, ein Basenpaar bilden können. 5

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Spezifität der amplifizierten cDNAs durch Verwendung einer Kombination eines Primers mit einer Phosphorthioat-Modifizierung an dem 3’-Ende des Primers mit einer 3' --> 5'-Exonukleasefunktion verstärkt werden, wobei eine solche Aktivität eine Eigenschaft der Pfu-DNA-Polymerase ist. Dadurch wird ein « Off Switch » für die io Amplifizierung bereitgestellt, wenn ein einzelner Mismatch (= Fehlpaarung) oder wenn mehrere Mismatches in den ersten 8 Basen von dem 3'-Ende des Primers auftreten. (Yang et al., 2005). Da die Basen an dem 3’-Prime-Ende der Primer jene sind, welche die cDNA-Pools in den in dieser Erfindung dargestellten Methodologien unterscheiden, wird bevorzugt, dass ein solcher „Off Switch“ aufgenommen wird, um die Amplifizierung von Primern zu stoppen, welche eine 15 Fehlpaarung (Mismatch) zu einer cDNA aufweisen, wodurch die Spezifität weiter verstärkt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der für die reverse Transkription verwendete Primer aus einem Oligo-dT-Abschnitt ohne einen Anker. Da die Selektion von spezifischen mRNAs auf der cDNA-Ebene über den oben beschriebenen Amplifizierungsschritt erfolgt, ist die 20 Spezifität (des Ankers) auf der RT-Ebene keine Notwendigkeit. Natürlich sollte Mispriming vermieden werden, insbesondere dort, wo sich der Oligo-T-Primer mit der Sequenz stromaufwärts von dem Poly-A-Abschnitt der mRNA ausrichtet. Mispriming kann vermieden werden, indem stringente Bedingungen angewendet und/oder ein Enzym mit Proofreading-Eigenschaf-ten verwendet wird. Vorzugsweise liegt die Annealing-Temperatur während des RT-Verfahrens 25 im Bereich von 30 bis 50°C, in Abhängigkeit von der Schmelztemperatur des verwendeten Primers.

Obwohl die Verwendung von stringenten Bedingungen, wie der Anwendung von höheren An-nealing-Temperaturen, Wobble-Primern und Oligo-Blockern die Mispriming-Ereignisse während 30 der reversen Transkription (RT) verringern können, besteht eine bevorzugte Lösung darin, während der RT keine Unterteilung in unterschiedliche Pools durchzuführen. Da die Reverse-Transkriptase-Reaktion eine Verlängerung von mehr Sequenzen mit falscher Primeranlagerung (Mispriming) ermöglicht als die Amplifizierungsreaktion (z.B. PCR-Reaktion), wird am meisten bevorzugt, dass die Unterteilung in Pools während der Amplifizierungsreaktion erfolgt. Dadurch 35 werden auch die nötigen RT-Reaktionen auf eine pro Probe verringert, die dargestellt werden soll.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Erzeugung einer Volllängen-cDNA weiter verstärkt werden. Unter nicht optimalen Bedingungen könnte die reverse Transkriptase die Poly-40 merisation stoppen und/oder von dem mRNA-Strang abfallen, bevor sie das 5'-Ende des RNA-Moleküls erreicht. Im Allgemeinen wird dies auf eine Sekundärstruktur zurückgeführt, die nicht geschmolzen ist, und die die Polymerase nicht traversieren kann. Daher werden auch partielle cDNAs erzeugt. Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass solche Transkripte die anschließende (PCR) Amplifizierung beeinträchtigen, kann man die intrinsische Fähigkeit der reversen 45 Transkriptase nutzen, einige (Mn2+ und Mg2+ abhängige 1-6-Nukleotide, Schmidt et al., 1999) dC hinzuzufügen, sobald sie das 5'-Cap-Ende des mRNA-Moleküls (Clark, 1988) erreicht. Die Cap-Struktur (Furuichi et al., 1975) führt zu einer deutlichen Steigerung der nicht-matrizen-abhängigen Nukleotid-Hinzufügungsfähigkeit von RT im Vergleich zu mRNAs, die keine Cap-Struktur aufweisen. Dies kann verwendet werden, um weiter für Volllängen-cDNAs anzurei-50 ehern. In einer anschließenden PCR-Reaktion können cDNAs selektiert werden, welche diese Cs aufweisen, indem dG-Nukleotide in den S'-Primer an der komplementären Position eingefügt werden. In einem solchen Fall kann das Schwanzhinzufügen mit einem beliebigen Nukleotid erfolgen, mit Ausnahme von dC, vorzugsweise mit dT oder dA. Die allgemeine Struktur eines 5'-PCR-Primers, der für cDNAs selektieren würde, die drei Cs an ihrem 5’-Ende hinzugefügt 55 aufweisen, wäre dann dTxdGdGdGHNy oder dAxdGdGdGHNy oder dCxdGdGdGHNy; H kann 10 AT 502 823 B1 entweder dA oder dC oder dT sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung die Erzeugung von cDNA mit einer 3-Sequenz von Oligo-dC, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 6 dC-Nukleotiden, während der reversen Transkription, in Abhängigkeit von einem 5'-Cap der

Matrizen-RNA oder -mRNA.

Vorzugsweise wird die Fähigkeit einer reversen Transkriptase zur Erzeugung der 3’-Sequenz von Oligo-dC durch die Zugabe von Mn2+-lonen während des Vorgangs der reversen Transkrip-io tion erhöht. Die Menge der zugeführten Nukleotide kann erhöht werden, indem Mn-Ionen in die RT-Reaktion aufgenommen werden, wie in Schmidt et al., 1999, beschrieben. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform Mn-Ionen in die RT-Reaktion aufgenommen, um ein nichtmatrizenabhängiges Anhängen von dC an das 3'-Ende von cDNA in einer Cap-abhängigen Weise quantitativ zu erhöhen. Anschließendes Hinzufügen eines Schwanzes erfolgt mit einem 15 beliebigen Nukleotid - ausgenommen dC - um die Selektion des Cap-abhängigen dC zu ermöglichen. Die Selektion von hinzugefügten Nukleotiden während des Schwanzhinzufügens kann erfolgen, indem nur das gewünschte Nukleotid während dieses Vorgangs bereitgestellt wird. Ein Primer, der für (PCR) Amplifizierung verwendet wird, kann daher die allgemeine Formel dPxdGyHNz aufweisen, wobei Px Nukleotide darstellt, die zum Schwanz komplementär sind; dG 20 Desoxyguanylat ist und y eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 1 und 5, bevorzugter zwischen 3 und 5; H kann entweder dA oder dC oder dT sein; und N ist eine Sequenz von Nukleotiden, wobei ihre Mitglieder unabhängig ausgewählt werden aus dA, dC, dG, dT; z ist eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 0 und 5. 25 In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Cap-abhängige 3'-Sequenz von Oligo-dC verwendet, um vollständig transkribierte cDNA durch Verwendung eines zweiten Primers während der Amplifizierung zu isolieren, der für die Oligo-dC-Sequenz spezifisch ist. Dies kann durch Verwendung eines Primers, so wie oben beschrieben, erfolgen. 30 Vorzugsweise erfolgt das Schwanzhinzufügen zum 3’-Ende der cDNA mit einer Polynukleotidsequenz, die durch die Abwesenheit von dC gekennzeichnet ist.

Noch bevorzugter ist die DNA-Polymerase, die für die Amplifizierungsreaktion verwendet wird, Taq-DNA-Polymerase, Tfl-DNA-Polymerase, aTaq-DNA-Polymerase, Sequenase oder Klentaq. 35

In speziellen Ausführungsformen wird ein Enzym mit Proofreading-Aktivität (Korrekturaktivität), vorzugsweise ausgewählt aus PFU, Ultma, Vent, Deep Vent, PWO und Tli-Polymerasen und E.coli-Exonuklease III, während der Amplifizierungsreaktion verwendet. Ein solches Enzym kann zusätzlich zu einer Polymerase verwendet werden, vorzugsweise in geringeren Konzent-40 rationen als die Polymerase, oder - wenn es selbst eine Polymerase ist - anstatt der Polymerase. Polymerasen mit Proofreading-Aktivität verhindern Stopps während der DNA-Polymerisation und gewährleisten lange Transkripte mit deutlich weniger Fehlern. Vorzugsweise wird eine Kombination eines solchen Enzyms mit Proofreading-Aktivität gemeinsam mit einer Polymerase, wie oben angeführt, verwendet. 45

In einer bevorzugteren Ausführungsform ist ein Primer, der für die Amplifizierungsreaktion verwendet wird, die vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion ist, durch die allgemeine Formel dPxdGyHNz gekennzeichnet, wobei Px Nukleotide darstellt, die zu dem Schwanz komplementär sind, der zum 3'-Ende der cDNA hinzugefügt wurde, z.B. durch die terminale Trans-50 ferase oder durch die Matrizenwechseleigenschaft der reversen Transkriptase oder durch jegliches andere Mittel, dG Desoxyguanylat und y eine ganze Zahl ist, einschließlich 0, vorzugsweise zwischen 2 und 5, wobei H entweder dT oder dA oder dC ist, N eine Sequenz von Nukleotiden mit einer Länge z ist, wobei ihre Mitgliedsnukleotide unabhängig ausgewählt werden aus dA, dC, dG und dT, und z eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 0 und 5 55 ist. 1 1 AT 502 823 B1

Das 5'-Ende von Primern, die für RT und PCR verwendet werden, kann auch an eine beliebige Sequenz verankert werden, die eine Ausführung von RT und PCR ermöglicht. 5'- und 3-PCR-Primer können unterschiedliche Schmelztemperaturen aufweisen, und die PCR-Bedingungen können optimiert werden, indem die Schmelztemperaturen von Primer-Paaren durch das Anhängen eines Ankers an einen oder beide Primer ausgeglichen wird. Für bestimmte stromab-wärtige Anwendungen kann es nützlich sein, eine spezifische Sequenz anzuhängen, z.B. einen Promotor, der eine RNA-Polymerasetranskription (z.B. T7 oder T3) starten kann, oder eine Restriktionsstelle einzuschließen.

In einer am bevorzugtesten Ausführungsform wird die Amplifizierung durch PCR ausgeführt, und die PCR-Primer enthalten Verankerungssequenzen, welche ein ordnungsgemäßes Platzieren an dem Ende des 3'- oder 5'-Oligonukleotid-Endabschnitts der cDNA ermöglichen.

Vorzugsweise enthält ein Amplifizierungsprimer oder ein Reverse-Transkriptions-Primer einen Promotor für RNA-Polymerasen. Dieses optionale Merkmal erlaubt die Transkription der cDNA und ihrer PCR-Produkte.

Vorzugsweise verstärkt der Promotor die Transkription durch die T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase.

Primer sowie PCR-Produkte können durch eine Reporter-Gruppe markiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt ist und deren Detektion ermöglicht. Beispiele von Reporter-Gruppen sind u.a. fluoreszente Marker, chemilumineszente Marker oder Radioisotope und andere auf dem Fachgebiet bekannte. Es kann jede beliebige Reporter-Gruppe verwendet werden, die durch Techniken wie Fluoreszenzmessung, Lichtemissionsmessung, Szintillationszählung und andere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel detektiert werden kann.

Infolgedessen werden die Amplifizierungsprimer und/oder die Amplifizierungsprodukte (cDNA) in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch eine Reportergruppe markiert, vorzugsweise durch Fluoreszenz-Marker, Chemilumineszenz-Marker oder Radioisotope. Vorzugsweise werden diese Reporter-Gruppen verwendet, um die cDNA zu detektieren.

In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass während der Transkription zumindest einige Eukaryoten, wie Arabidopsis (Jin et al., 2004) willkürliche Nukleotide zu RNA-Molekülen an deren 3’-Ende hinzufügen können, unmittelbar vor dem Poly-A-Schwanz, in den meisten Fällen eines oder zwei. Und selbst innerhalb eines bestimmten Gens können solche Nukleotid-Hinzufügungen heterogen sein. Daher wird bei Verwendung eines Satzes von Primern, die für die erste und/oder zweite Base stromaufwärts von dem Poly A während der reversen Transkription unterscheiden, das beabsichtigte Pooling einer mRNA-Spezies in einen bestimmten Pool von cDNA bei bestimmten Transkripten fehlschlagen. Es kann jedoch ein höherer Grad von Pooling erreicht werden, indem Nukleotide stromaufwärts dieser willkürlich hinzugefügten Nukleotide für die Primer verwendet werden, welche die Fraktionen definieren. Bei einem bevorzugten Primer für die reverse Transkription und PCR-Amplifizierung, die zum Poly-A-Schwanz komplementär ist und für die oben genannten Basen selektiert, weisen diese Hinzufügungen folgende allgemeine Struktur auf: dTxVNyMz, wobei dT für Desoxythymidylat mit x Wiederholungen steht; V und N sind Wobble-Basen, wobei V entweder dA, dC oder dG ist; N ist eine Sequenz von dA, dC, dG, dT, unabhängig ausgewählt für jedes Mitglied; y ist eine ganze Zahl gleich oder größer 0, vorzugsweise zwischen 1 und 5, und M ist entweder dA, dC, dG oder dT; z ist eine ganze Zahl über 1, vorzugsweise zwischen 1 und 10. In einem solchen Primer wird Mz den zu amplifi-zierenden cDNA-Pool spezifizieren. Da die Anzahl von Nukleotiden, welche zu den RNA-Molekülen vor der Polyadenylierung hinzugefügt werden, selbst für ein spezifisches Transkript unterschiedlich sein können, kann ein Primer eine Mischung von Oligonukleotiden sein, wo die Menge von y in N unterschiedlich ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass - damit die Polymerase die Kette erweitern kann - der Druck für die korrekte Hybridisierung von Basen nach dem Wobble stark zunehmen wird, wodurch ein Mispriming (falsche Primer-Anlagerung) der 12 AT 502 823 B1

Basen verringert wird, welche die Fraktionen definieren, die amplifiziert werden; dadurch wird die Spezifität erhöht.

In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung werden willkürliche Nukleotide, 5 vorzugsweise ein bis drei Nukleotide, zu dem 3'-Ende der RNA oder mRNA nach der Transkription aber vor dem Anhängen eines Poly-A-Schwanzes hinzugefügt, und die Primer für die re-verse Transkription und/oder PCR enthalten eine Sequenz mit einem Wobble, das der willkürlichen Sequenz entspricht. io Eine vereinfachte Ausführungsform der Erfindung, die nicht spezifisch für Volllängen-cDNA selektieren wird, kann dadurch formuliert werden, dass die 3' (dC) nicht-matrizenabhängige Anhängefunktion des RT-Enzyms nicht verwendet wird. Es wird weiterhin einen Anteil von Volllängen-cDNAs geben, bei denen unter normalen RT-Bedingungen kein dC angehängt ist. Das Anhängen eines Schwanzes und die PCR können so wie beschrieben verwendet werden, 15 um Pools von cDNA selektiv zu amplifizieren. Jede cDNA wird dann noch immer in genau einem Pool vorhanden sein. Jedoch wird das Ausmaß, in dem PCR-Produkte vorhanden sind, die den Volllängen-RNA-Molekülen entsprechen, allein durch die Qualität der RT-Reaktion bestimmt. Da in der PCR-Reaktion, die folgt, kein Selektieren für Volllängen-cDNA-Kopien durchgeführt wird, kann mehr als ein cDNA-Molekül zu PCR-Produkten führen, welche ein einzelnes 20 mRNA-Molekül darstellen, wodurch Redundanz eingeführt wird. Dennoch wird weiterhin jedes RNA-Molekül mindestens einmal vertreten sein. Die Redundanz kann minimiert werden, indem Verfahren zum Einsatz kommen, welche die Volllängen-Reverse-Transkription begünstigen, zum Beispiel die Zugabe von Trehalose und/oder Betain und/oder das Erhöhen der Temperatur, so wie oben offenbart. Obwohl die Redundanz in dieser Ausführungsform nicht abgeschafft 25 werden mag, wird dennoch weiterhin jedes RNA-Molekül mindestens einmal vorhanden sein. Dies ist eine Verbesserung im Vergleich zu anderen DD-Techniken, die eine Darstellung für ein bestimmtes mRNA-Molekül nur statistisch erzielen können.

Ferner gibt es auch Spezien von RNA-Molekülen, die keinen Poly-A-Schwanz und keine Cap-30 Struktur aufweisen. Solche RNA-Moleküle werden jedoch auch 5'- und 3'-Prime-Enden aufweisen, die während anschließender Amplifizierung verwendet werden können, um für definierte Fraktionen anzureichern, wie von dieser Erfindung beabsichtigt.

In Prokaryoten weist die mRNA keinen Poly-A-Schwanz auf. Es wurden Verfahren entwickelt 35 (Amara et al., 1997), welche Volllängen-cDNA aus solchen Molekülen hersteilen können, z.B. das Anhängen eines synthetischen Poly-A-Schwanzes. Die Anwendung solcher Verfahren auf diese Moleküle liegt ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.

Vorzugsweise werden in einem Verfahren gemäß der Erfindung RNA- oder mRNA-Proben 40 verwendet, die keinen Poly-A-Schwanz aufweisen, und ein Poly-A-Schwanz wird vor der rever-sen Transkription synthetisch hinzugefügt.

Um die Menge an RNA zu verringern, die notwendig ist, um das Display durchzuführen, kann ein Voramplifizierungsschritt vor der Amplifizierungsreaktion eingeführt werden, z.B. PCR. 45 Ungeachtet dessen, ob eine Trennung in Pools in dem Schritt der reversen Transkription (RT) durchgeführt wurde, muss der Voramplifizierungsschritt so gestaltet werden, dass die gesamte cDNA, die in definierte Pools im Amplifizierungsschritt (PCR) getrennt werden soll, amplifiziert wird. Der Voramplifizierungsschritt kann vor dem Hinzufügen eines Schwanzes oder danach, vor der Hauptamplifizierung mit den spezifischen Primern eingeführt werden. 50

Zum Beispiel kann ein Promotor, wie eine T7-RNA-Polymerase, zu dem 5'-Ende des Primers hinzugefügt werden, der für das Priming der RT-Reaktion verwendet wird. Nach der RT und vor der Amplifizierung (PCR) kann RNA durch eine RNA-Polymerase synthetisiert werden, die für den Promotor spezifisch ist, zum Beispiel T7-RNA-Polymerase. Eine auf diese Weise erhaltene 55 amplifizierte RNA muss wieder revers transkribiert werden und in Abhängigkeit davon, ob eine 1 3 AT 502 823 B1

Sequenz stromabwärts von der cDNA-Base vorhanden ist oder nicht, die zu der ersten Base der RNA komplementär ist und die verwendet werden kann, um die Amplifizierungsreaktion (PCR) an diesem Ende zu primen, muss eine solche Sequenz hinzugefügt werden, zum Beispiel durch die Matrizenwechselfähigkeit der reversen Transkriptase oder durch Hinzufügen 5 eines Schwanzes mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase.

Ein weiteres Beispiel für einen Voramplifizierungsschritt ist die Verwendung einer Voramplifizie-rungs-PCR. Im Fall einer durch eine terminale Desoxynukleotidyltransferase mit einem Schwanz versehenen cDNA, muss ein Primer für den so hinzugefügten Schwanz spezifisch io sein. Zum Beispiel wird eine cDNA, die mit einem Poly-T-Schwanz versehen wurde, einen Primer benötigen, wie dAx, und einen Primer, der zu dem Poly-A-Schwanz der ursprünglichen RNA komplementär ist, z.B. dTx. Vorzugsweise kann nur eine Volllängen-cDNA voramplifiziert werden, indem unterschiedliche Mengen an G aufgenommen werden, vorzugsweise zwischen 1 und 5, um dem Primer zu ermöglichen, nur an cDNA zu binden, die vollständig revers transkri-15 biert wurde und somit dort, wo die reverse Transkriptase Cs durch ihre nicht-matrizenabhängige Nukleotidhinzufügungsfähigkeit in einer Cap-abhängigen Weise hinzugefügt hat. Zusätzlich kann der Primer, der an die Sequenz hybridisieren kann, die zu dem ursprünglichen RNA-Poly-A-Schwanz komplementär ist, an das 5'-Ende des Poly-A-Schwanzes verankert werden, indem eines oder mehr Wobbles hinzugefügt werden. Das wird helfen, die Länge der erhaltenen 20 Amplifizierungsprodukte (PCR) zu erhöhen, indem lange Abschnitte des Poly-A-Schwanzes nicht unnötiger Weise amplifiziert werden. Ein solcher Primer weist die allgemeine Formel dTxVNy auf (wobei x die Menge von dT ist, V entweder G, C oder A und N ein beliebiges Nukleotid). 25 Die Unterscheidung der cDNA in unterschiedliche Pools kann auch durch Verwendung von mehr als einem Amplifizierungsschritt (PCR) erfolgen. Jeder Amplifizierungsschritt (PCR) wäre für den zu amplifizierenden Pool spezifischer. Zum Beispiel könnte in einer ersten Amplifizie-rung (PCR) ein Primer wie dTx verwendet werden, um an cDNA auf der Seite zu hybridisieren, die zu der Poly-A-Schwanz-Seite der RNA komplementär ist. Dieser Primer wäre nicht unter-30 scheidend. In einem nächsten Schritt könnten 3 Reaktionen verwendet werden, wobei eine mit dTxG, eine mit dTxA und eine mit dTxC geprimt wird. Somit werden 3 Pools geschaffen. In einem weiteren PCR-Schritt können die Pools weiter aufgeteilt werden. Zum Beispiel kann der dTxG-Pool in 4 Pools durch Priming mit dTxGA, dTxGC, dTxGG und dTxGT aufgeteilt werden. Dadurch werden insgesamt 12 Pools erzeugt. Dieselbe Vorgangsweise kann auf das andere 35 Ende der cDNA angewendet werden, und das Pooling beider Seiten kann, falls dies gewünscht wird, kombiniert werden. Ein derartiges sequentielles Pooling kann einerseits die Menge des Startmaterials (RNA), das benötigt wird weiter verringern oder helfen ein Pooling zu erhalten, das auf die Komplexität der zu untersuchenden Probe oder die Tiefe, welche der Forscher abdecken möchte, abgestimmt ist. 40

Es liegt innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung, dass zwei oder mehr Proben von RNA, die durch Verfahren kombiniert werden, welche eine Normalisierung oder Subtraktion zwischen solcher RNA oder ihren abgeleiteten cDNA- oder PCR-Produkten ergeben, auch gemäß den offenbarten Verfahren dargestellt werden können. Zum Beispiel kann RNA 45 durch Reduzierung von RNA-Spezien in hohen Konzentrationen (vor)behandelt werden.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren, bei dem die RNA in der Probe oder in der cDNA voramplifiziert wird, vorzugsweise durch PCR, oder bei dem RNA-Proben normalisiert oder subtrahiert werden. Diese (Vor)Behandlungsschritte werden vorzugsweise vor der so Haupt-(unterscheidenden) Amplifizierung c) eingeführt.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird der Schritt der Fraktionierung des Amplifizierungsproduktes durch Gel-Elektrophorese, Pulsfeld-Elektrophorese, Agarose-Gel-Elektrophorese, PAGE, Kapillar-Elektrophorese oder Pulsfeld-Kapillar-Elektro-55 phorese ausgeführt. Die Fraktionierung und der Vergleich von Proben, die während der PCR 14 AT 502 823 B1 erzeugt werden, können durch ein beliebiges Verfahren erfolgen, das es ermöglicht, DNA-Moleküle gemäß spezifischen Eigenschaften zu unterscheiden, z.B. nach Sequenz oder Größe. Zu diesen Methodologien gehören z.B. Gel-Elektrophorese, wie Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE). Besonders geeignet ist die Kapillar-Gel-Elektrophorese, aufgrund ihrer hohen 5 Auflösungskraft und deshalb, weil viele Proben auf einfache Weise parallel analysiert werden können (Behr et al., 1999). Standardmäßige Maschinen der Kapillar-Elektrophorese können heute in einem Lauf 384 Proben verarbeiten. Durch die Verwendung von geeigneten Protokollen kann die erforderliche Auflösungskraft über eine große Bandbreite von Größen hinweg erzielt werden. Besonders lange Fragmente können ausreichend mit Pulsfeld-Kapillar-Elektro-io phorese aufgelöst werden (Heller et al., 2001; Morris et al., 2001). Es wurden auch Verfahren entwickelt, um Fraktionen der in einer Kapillare getrennten Moleküle zu sammeln (Irie et al., 2000; Magnusdottir et al., 2001). Solche Fraktionen, die Transkripte darstellen, die von Interesse sind (z.B. differentiell exprimierte Gene), können danach weiteren Analysen unterzogen werden, z.B. einer Sequenzierung, um die Identität des Moleküls festzustellen. 15

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Detektieren von Unterschieden zwischen zwei cDNA-Pools in den PCR-Schritt des Verfahrens aufgenommen werden. Diese Methodologien, die DNA-Werte und/oder die Änderung solcher Werte während der PCR messen können, werden im Allgemeinen als „Echtzeit-PCR“ (z.B. Wittwer et al., 1997a, Wittwer et al., 1997b) be-20 zeichnet. Ein anwendbares Verfahren misst die Fluoreszenz aus SYBR-Grün-I-Farbstoff, der zu der PCR-Reaktion hinzugefügt wurde. Dieser Farbstoff wird einen starken Anstieg in Fluoreszenz zeigen, wenn es zu einer Interkalierung mit Doppelstrang-DNA kommt. Je mehr DNA in der Reaktion vorhanden ist, desto stärker die Fluoreszenz. Dadurch wird das Mittel zum Berechnen der Menge von DNA bereitgestellt, die in der Reaktion vorhanden ist. Die Messung 25 erfolgt für gewöhnlich am Ende des Polymerisierungsschrittes, da die Produkte doppelstrangig sein werden. Mit Zunahme der Menge der DNA während anschließender Zyklen, nimmt auch die Fluoreszenz zu. Diese Daten können z.B. durch Blotting auf einer Kurve verglichen und die Kurven zwischen unterschiedlichen Proben verglichen werden. Wenn es nur eine amplifizierte cDNA gibt, weist die Kurve eine exponentielle Phase auf. Durch Vergleichen des Starts der 30 exponentiellen Phase zwischen Proben können die relativen Mengen der DNA berechnet werden. Wenn zwei oder mehr Produkte in einer bestimmten Probe vorhanden sind, werden die Kurven zusammen gelegt und zu einer Änderung der Steilheit führen. Dennoch können diese Daten zwischen unterschiedlichen Proben verglichen werden, wenn der amplifizierte cDNA-Pool nicht zu komplex ist. Es wird bevorzugt, dass die Menge an amplifizierten cDNAs in einer PCR-35 Reaktion derart reduziert wird, dass Unterschiede bei der Amplifizierung der einzelnen Produkte weiterhin detektiert werden können. Eine andere Möglichkeit zur Analyse einer Probe bei Verwendung von Echtzeit-PCR besteht darin, eine Schmelzkurve der vorhandenen DNA am Ende jedes Zyklus zu berechnen. Jedes PCR-Produkt, das in der Reaktion vorhanden ist, wird bei einer spezifischen Temperatur schmelzen, welche durch die Sequenz definiert wird. Wenn ein 40 Produkt in seine einzelnen Stränge schmilzt, kommt es zu keiner Interkalierung des Farbstoffes mit der DNA mehr, woraus ein Abfall der Fluoreszenz resultiert. Produkte, die bei unterschiedlichen Temperaturen schmelzen, werden als Zunahme und danach als Abnahme der Steilheit in unterschiedlichen Bereichen der Schmelzkurve dargestellt. Durch das Vergleichen von Kurven zwischen Zyklen und unterschiedlichen Proben desselben zu amplifizierenden cDNA-Pools 45 können Proben mit einem unterschiedlichen Profil identifiziert werden. Eine Schmelzkurvenanalyse kann auch nur am Ende der PCR durchgeführt werden - in einem solchen Fall könnte es jedoch sein, dass Unterschiede bei Produkten, die ein Plateau erreicht haben, nicht detektiert werden. so Mit Hilfe der Verwendung solcher Analyseverfahren, vorzugsweise in einem automatisierten Verfahren, kann schnell nach Proben gesucht werden, die während oder am Ende der PCR Unterschiede aufweisen, und dadurch besteht keine Notwendigkeit mehr, alle von ihnen im Rahmen von Fraktionierungsverfahren, wie z.B. im Rahmen einer Gel-Elektrophorese - zu analysieren. 55 1 5 AT 502 823 B1

Natürlich können die in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren in einen teilweise oder vollständig automatisierten Prozess eingebaut werden. Zum Beispiel können die Größenfraktionierung, der Vergleich von unterschiedlichen Proben, das Sammeln von Fraktionen und die Sequenzierung alle auf einem Chip ausgeführt werden. Die Technologien wurden bereits im Prin-5 zip erläutert (Xie et al., 2001).

Infolgedessen werden in einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung die Schritte der reversen Transkription und der Amplifizierung in einem Schritt ausgeführt. io Fachleuten ist klar, dass andere Möglichkeiten bestehen, um für Volllängen-cDNA anzureichern. Solche Verfahren können einfach angepasst werden, um anschließend Pools von Volllängen-cDNA zu amplifizieren, die durch Nukleotide definiert sind, die zu dem 5'-Ende und/oder Nukleotiden an dem 3'-Ende stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz komplementär sind. 15 Zum Beispiel kann das CapSelect-Verfahren (Schmidt et al., 1999) verwendet werden, um die Schritte der reversen Transkription und des Hinzufügens eines Schwanzes an das 3'-Ende der cDNA zu ersetzen. Dieses Verfahren verwendet auch das nicht-matrizenabhängigen Anhängen von C-Nukleotiden der reversen Transkriptase und das Anhängen eines Poly-N-Schwanzes, vorzugsweise eines Poly-A-Schwanzes. Der Poly-A-Schwanz besteht jedoch aus Ribonukleoti-20 den anstatt aus Desoxyribonukleotiden, da angenommen wird, dass terminale Transferase vorzugsweise nur 3 bis 4 Ribonukleotide anhängt, im Vergleich zu einer nicht spezifizierten Menge von Desoxyribonukleotiden. Das ist wichtig für das Verfahren, da in einem nächsten Schritt ein Adapter spezifisch mit dem 3'-Ende der cDNA verbunden wird, welche für 3'-AAACCC-5' selektiert. Durch die Verwendung eines Primers, der zu diesem Adapter kom-25 plementär ist, und eines Primers, der zum Poly-A-Schwanz komplementär ist, soll die Volllängen-cDNA amplifiziert werden. Anstatt universelle Primer zu verwenden, um alle cDNAs zu amplifizieren, kann man Sätze von Primern verwenden, die für die 5'- und/oder 3'-Nukleotide selektieren und Pools von cDNAs amplifizieren. Die Primer-Struktur für das Hybridisieren an den Poly-A-Schwanz und das Selektieren für x Menge an Basen vor dem Poly-A-Schwanz ist 30 so wie beschrieben. Für das Amplifizieren des 5'-Endes der mRNAs kann man die Adaptersequenz verwenden, gefolgt von 3 bis 4 Ts und 3 bis 4 Gs und einer x Menge von Basen, welche der 5'-Sequenz der RNA-Transkripte entsprechen. Durch die Erhöhung von x wird die Anzahl an Transkripten verringert, die durch einen solchen Primer amplifiziert werden. 35 Vorzugsweise besteht der durch die terminale Transferase angehängte Polynukleotid-Schwanz aus Ribonukleotiden, vorzugsweise 2 bis 6 Ribonukleotiden, vorzugsweise Adenosin oder Thymidin, nach einer 3-Sequenz von Oligo-dC, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 6 dC-Nukleotiden, welche während der reversen Transkription erzeugt wird, abhängig von einem 5'-Cap einer Matrizen-RNA oder mRNA, wobei der zweite Amplifizierungs-Primer (5'-Primer) 40 Nukleotide umfasst, die zu den Ribonukleotiden und Oligo-dCs und 1 bis 10 Nukleotiden stromaufwärts von der Oligo-dC-Sequenz komplementär sind.

Das Verfahren zur Amplifizierung bestimmter cDNAs, gewonnen aus mRNA, kann auch verwendet werden, um den Expressionspegel von einzelnen mRNAs zu bestimmen. Vorzugweise 45 wird zum Messen des Expressionspegels von Messenger-RNA ein Verfahren gemäß der Erfindung verwendet, einschließlich der Trennung und/oder Identifizierung von Amplifizierungser-gebnissen. Wie bei gewöhnlichen DD können die Ergebnisse bestimmter Zelllinien für eine bessere Visualisierung von unterschiedlichen Expressionen verglichen werden. so Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Kit für ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, das eine DNA-Polymerase umfasst, vorzugsweise eine Taq-Polymerase, eine re-verse Transkriptase oder Mischungen aus unterschiedlichen Polymerasen, Kofaktoren oder Salzen von Metallionen, vorzugsweise Mg2+ und Mn2+, die durch eine Polymerase gefordert werden, Primer und optional eine terminale Transferase und zusätzliche Puffersubstanzen. Mit 55 diesem Kit kann ein Displayverfahren gemäß der Erfindung einfach und schnell durchgeführt 16 AT 502 823 B1 werden. Vorzugsweise sind auch Anweisungen für die Durchführung des Verfahrens enthalten.

Die vorliegende Erfindung wird ferner durch folgende Beispiele und Figuren dargelegt, ohne darauf beschränkt zu sein. 5

Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung eines Verfahrens, welches die Prinzipien der vorliegenden Erfindung nutzt, um Volllängen-cDNA in definierte Subpopulationen zu amplifizieren. Die Oligo-T- und Oligo-G-Abschnitte, die in den Primern dargestellt werden, sind terminale Anker der Primer, und N, NN und NNy stehen für Nukleotide, die aus A, T, G, C für die Definition der io Subpopulationen ausgewählt werden.

Fig. 2: Gel-Elektrophorese-Produkt eines Displays eines Pools von künstlichen mRNA-Molekülen gemäß Beispiel 2: In Spuren 1-7 wurde der Primer Nr. 8 gemeinsam mit den Primern Nr. 1-7 verwendet. In Spuren 8-13 wurde der Primer Nr. 1 gemeinsam mit den Primern 9-14 15 verwendet.

Fig. 3: Gel-Elektrophorese-Produkt eines organisierten Volllängen-Expressionsdisplays von Mausleber-RNA gemäß Beispiel 3. 20 Fig. 4: Gel-Elektrophorese-Produkt eines organisierten Volllängen-Expressionsdisplays von Mausleber-RNA gemäß Beispiel 4 mit PCR-Voramplifizierung.

Fig. 5: NCBI-Nukleotid-Datenbank-Screening für nicht-redundante Volllängen-Maus-cDNA-Klone. 99 % der 16854 Klone, die in der Datenbank vorhanden sind, weisen eine Länge zwi-25 sehen 200 und 6000 Basen auf, wobei 99,9 % unter 7500 Basen und kein Klon über 9500 Basen lag.

Beispiele 30 Beispiel 1: Verfahrensprinzip

Ein Überblick über ein Beispiel eines Polynukleotidamplifizierungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird in Fig. 1 angeführt. Verankerte Primer für die reverse Transkription können der Formel dTxV oder dTxVNy folgen (wobei x eine Wiederholung von Desoxythymidylat 35 („dT“) definiert, die in Kombination mit dem V- oder VNy-Teil eine ausreichend hohe Spezifität und Schmelztemperatur aufweist, um die RT-Reaktion erfolgreich zu primen; V ist entweder Desoxyguanylat („dG“), Desoxyadenylat („dA“) oder Desoxycytidylat („dC“); N ist eine Sequenz von y Nukleotiden, die unabhängig aus dA, dC, dG oder dT ausgewählt sind; wenn mehr als eine Base für verankerte Primer verwendet wird, definiert y deren Anzahl; ein Erhöhen von y 40 wird die Subpopulationen von reversen Transkripten erhöhen. Das Anhängen eines Schwanzes an das 3'-Ende dieser synthetisierten cDNA in Form eines Poly-N-Schwanzes kann unter Verwendung von terminaler Transferase erfolgen - N steht für eine Sequenz aus Nukleotiden, die gleichmäßig aus dT, dA, dC oder dG ausgewählt sind, unabhängig von dem „N“, das in den reversen Transkriptions-Primern dargestellt wird. Die Amplifizierung der cDNA-Pools, optional 45 vorselektiert durch die VNy-Abschnitte, definiert durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wird mit Hilfe von Primern durchgeführt, welche an das 5'- und 3'-Ende der cDNA hybridisieren, durch Selektieren für terminale Sequenzen, wie die Nukleotide, die durch die terminale Transferase angehängt werden (3' der cDNA; entsprechend dem 5-Ende der ursprünglichen mRNA) und den Poly-T-Abschnitt (5' der cDNA; komplementär zu dem 3-Poly-A-Schwanz der ur-50 sprünglichen mRNA) und Selektieren für eine Oligo-dNy-Sequenz, wobei N ein Abschnitt von mehreren Nukleotiden ist, die wiederum unabhängig aus dT, dA, dC oder dG ausgewählt werden, und verschiedene mRNA-Populationen durch y Basen definiert, die unmittelbar zu den Schwänzen benachbart sind. 55 Beispiel 2: Amplifizierung aller RNA-Moleküle, die in einer Probe vorhanden sind. 1 7 AT 502 823 B1

Da nicht alle mRNA-Moleküle, die in einer Probe vorhanden sind, bekannt sind, selbst nicht in gut charakterisierten Geweben wie der Leber eines Menschen oder einer Maus, und da ihre Anzahl in die Tausende gehen kann, wurde ein Ansatz gewählt, bei dem ein Pool von 14 künstlich hergestellten mRNA-Molekülen verwendet wird, um zu zeigen, dass alle RNA-Moleküle 5 detektiert werden, die in dieser Probe vorhanden sind. Zu diesem Zweck wurden Abschnitte mit unterschiedlichen Längen genomischer DNA aus dem Maus-GAPDH-Gen (GenBank-Zugriffs-nummer:NC_000072) durch Standard-PCR amplifiziert. Es wurden 5'-Primer verwendet, die einen verankerten T7-Polymerase-Promotor aufWiesen. Nach dem Promotor wurde eine Kombination aus 4 Basen aufgenommen, welche jede mRNA an ihrem 5'-Ende definieren würde. Zu io den Primern, die für das 3'-Ende ausgewählt wurden, zählten - nach der GAPDH-spezifischen Sequenz, eine Kombination von 4 Basen, welche diese Moleküle stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz definieren würden. Nach diesen 4 Basen wurden 21 dT oder in einer der RNAs 22 dT für den Poly-A-Schwanz aufgenommen. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden gelgereinigt und einer standardmäßigen T7-RNA-Transkription unterzogen, welche 7-Methyl-Guanosin 15 (das Cap) enthielt. Diese T7-Reaktionsprodukte wurden wiederum gelgereinigt. Eine Mischung solcher erhaltenen synthetischen mRNA-Moleküle wurde als Ausgangsmaterial für die reverse Transkription (RT) verwendet. Um zu zeigen, dass die offenbarten Verfahren sowohl für das 5'-als auch das 3-Ende der mRNA-Moleküle spezifisch sind, wiesen 7 der 14 Moleküle eine fixe Sequenz an dem 5'-Ende auf und eine variable an dem 3'-Ende, und 7 Moleküle wiesen eine 20 fixe Sequenz an dem 3'-Ende und eine variable an dem 5'-Ende auf. Bezüglich der Sequenz der resultierenden künstlichen mRNA-Moleküle wird auf Tabelle 1 verwiesen.

Die reverse Transkription wurde in einer 25 pl Reaktion durchgeführt, die aus 50 mM Tris-HCI (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCI2, 10 mM DTT, 0,6 M Trehalose, 2M Betain, 0,5 mM dATP, 25 0,5 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 40 nM Primer (oligo dT(2i)) bestand. Die Mischung aus künstlicher mRNA wurde in einer Menge von ungefähr 4 ng/μΙ Reaktionsvolumen hinzugefügt. Die Reaktion (ohne die RT) wurde 20 Sekunden lang auf 70°C und 2 Minuten lang auf 32°C erhitzt. Danach wurde die Molony-Murine-Leukemia-Virus-Reverse-Transkriptase, welche keine RNase-H-Aktivität aufwies (M-MLV RT (-H)), in einer Konzentration von 4 bis 8 Einhei-30 ten/μΙ Reaktionsvolumen hinzugefügt, und die Reaktion zwei Minuten lang bei 32°C fortgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 0,5 U von Pfu-Polymerase hinzugefügt. Vier Zyklen bei 50°C über einen Zeitraum von 10 Minuten und bei 60°C über einen Zeitraum von 10 Sekunden wurden verwendet, um die RNA vollständig revers zu transkribieren; danach wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt. 35

Tabelle 1: Darzustellende Sequenzen von künstlichen RNAs 40 45 50 RNA- Nr. 5'-Sequenz 3-Sequenz Länge der RNA Vorhergesehene Länge des PCR-Produkts 1 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...CTG TGG GCA AGG TC TC A<21) 1515 1531 2 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...TGT CCC TTT TGG TC CC A(21) 1333 1348 3 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...TTG TGG AAG GGC TC GC A<21) 1243 1258 4 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...CGA TGC CCC CAT TC AC A<21) 1112 1128 5 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...CAC CAC CAT GGA TC TG A(21) 942 958 6 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...CAA CGG GAA GCC TC TA A<21) 843 859 7 m7G AT AT CCG CCC TGT GCT... ...ACG ACC CCT TCA TC TTA<21) 736 753 8 m7G AT AT GAT GCG CAA AGG... ...TCC TGC GGC CCA TC TC A<21) 687 703 55 18 AT 502 823 B1 RNA- Nr. 5-Sequenz 3'-Sequenz Länge der RNA Vorhergesehene Länge des PCR-Produkts 9 m7G AC AT GGC CTA AGC AAG.. ...TCC TGC GGC CCA TC TC A<21) 786 802 10 m7G AG AT GAG CAC GGA AGC. ....TCC TGC GGC CCA TC TC A(21) 880 896 11 m7G AA AT CCG CTT TGA TTT.... .TCC TGC GGC CCA TC TC A^j 994 1010 12 m7G GT AT CAG CTC CCC ATC... ...TCC TGC GGC CCA TC TC A<21) 1070 1086 13 m7G CT AT GGG CCT GGG TCA.. ....TCC TGC GGC CCA TC TC A<21) 1178 1194 14 m7G TT AT GGG CGG AGT GGA.. ....TCC TGC GGC CCA TC TC A<21) 1287 1303

Die cDNA wurde Phenol-/Chloroform-extrahiert, Ethanol-präzipitiert und in 10 pl H20 aufgelöst. Das Anhängen eines Poly-T-Schwanzes erfolgte in einer 20-pl-Reaktion, welche 0,2 mM dTTP, 20 1 00 mM Cacodylatpuffer (pH 6,8), 1 mM CoCI2, 0,1 mM DTT und 15 Einheiten terminaler Deso- xynukleotidyltransferase enthielt, über einen Zeitraum von 15 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wurde Phenol-/Chloroform-extrahiert, Ethanol-präzipitiert und in 100 pl H20 aufgelöst. PCR wurde in einer 10 μΙ Reaktion durchgeführt, die 2,5 μΙ mit einem Schwanz versehene 25 cDNA, 50 mM Tris (pH 8,8), 14 mM (NH4)2S04, 4 mM MgCI2, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,2 μΜ von jedem Primer (Tabelle 2, Fig. 2), 0,5 Einheiten Taq-Polymerase und 0,03 Einheiten Pfu-Polymerase enthielt. Die Proben wurden 30 Sekunden lang bei 93°C denaturiert und folgender Zyklus 21 mal wiederholt: 10 Sekunden lang bei 93°C, 30 Sekunden lang bei 55°C, 10 Minuten lang bei 72°C. Die anfängliche Anlagerungstemperatur (Annealing-Temperatur) von 55°C wurde 30 bei jedem Zyklus um 0,5°C Min. verringert. Danach folgten 19 Zyklen bei 93°C für 10 Sekunden, 49°C für 30 Sekunden, 72°C für 10 Minuten, mit einem letzten Extensionsschritt bei 72°C für 2 Minuten.

Tabelle 2: PCR-Primer: 35 40 45 50

Primer-Nr. Sequenz 1 AGA GAT I I I TTT TTT TTT TT GA 2 AGA GAT ΓΤΤ TTT TTT T f Γ T GG 3 AGA GAT ITT TTT TTT Ί Γ Γ T GC 4 AGA GAT ΙΓΙ IN III I I Γ TT GT 5 AGA GAT I TT TTT TTT TTT TT CA 6 AGA GAT TTT I I I TTT TTT TT AG 7 AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT AA 8 AAA AAA AAA AAA AAA GGG ATA 9 AAA AAA AAA AAA AAA GGG ACA 10 AAA AAA AAA AAA AAA GGG AGA 11 AAA AAA AAA AAA AAA GGG AAA 55 5 1 9 AT 502 823 B1

Primer-Nr. Sequenz 12 AAA AAA AAA AAA AAA GGG GTA 13 AAA AAA AAA AAA AAA GGG CTA 14 AAA AAA AAA AAA AAA GGG TTA 2,5 μΙ des Reaktionsproduktes wurden zu 2,5 μΙ 100 % Formamid-Ladepuffer hinzugefügt und io 2 Minuten lang bei 96°C denaturiert und auf Eis gekühlt, auf ein 3,5 % Acrylamid, 7M Harnstoffgel geladen und 2 Stunden lang bei 180V laufen gelassen und danach silbergefärbt.

Die Ergebnisse sind in Figur 2 zu sehen. In den Spuren 1-7 wurde der Primer Nr. 8 gemeinsam mit den Primern Nr. 1-7 verwendet. In den Spuren 8-13 wurde der Primer Nr. 1 gemeinsam mit 15 den Primern 9-14 verwendet. In jeder Spur amplifizierte die PCR das spezifische Produkt, da die vorausgesagte Länge der PCR-Produkte, die in Tabelle 1 gezeigt werden, genau den Längen der Produkte auf dem Gel entsprechen.

Die Primer-Kombination in Spur 1 amplifiziert die zwei spezifischen Produkte, welche der dar-20 zustellenden RNA entsprechen. Die Reaktion, die in Spur 1 ausgeführt wird, ist die anspruchsvollste Reaktion des Satzes, da zwei Produkte amplifiziert werden müssen, nämliche jene, welche die RNA 1 und 8 darstellen. Darüber hinaus, wie in Tabelle 1 zu sehen, wurden die RNA-Moleküle derart gestaltet, dass sie die falsche Primeranlagerung (Mispriming) der in Spur 1 dargestellten PCR-Reaktion verstärken. Alle RNA-Moleküle (mit Ausnahme der RNA Nr. 6) 25 weisen an der Position 3 und 4 vor dem T-Schwanz dieselben Basen auf wie auf Position 1 und 2 der RNA-Nummern 1 und 8. Da der Primer Nr. 1 seine zwei letzten Basen verwendet, um die zu amplifizierende cDNA zu selektieren, kann er potentiell mit jeder der anderen cDNA, die in der Probe vorhanden ist, eine falsche Primeranlagerung (Mispriming) eingehen. Und da die cDNA-Moleküle 1-8 dieselben Basen an ihrem anderen Ende aufweisen, selektieren nur die 30 zwei letzten Basen des Primers 1, zwischen diesen 8 Molekülen in Reaktion 1. Es werden jedoch nur die zwei zu amplifizierenden RNAs dargestellt, was die große Spezifität verdeutlicht, die in einem solchen Display erreicht werden kann.

Spur 2 zeigt die Grenzen dieser Reaktion. Zusätzlich zu der zu amplifizierenden Bande wurde 35 eine schwache Bande, die der RNA Nr. 4 entspricht, amplifiziert. Die zu amplifizierende Bande ist jedoch um ein Mehrfaches intensiver als die Bande, die aus dem Mispriming-Ereignis resultierten. Obwohl ein Touch-Down-Protokoll für den thermischen Zyklus verwendet wurde, wurde dasselbe Profil für alle unterschiedlichen Primer-Kombinationen eingesetzt. Um zu zeigen, dass die Reaktion im Prinzip für einen spezifischen Primer-Satz optimiert werden kann, wurde eine 40 andere Reaktion ausgeführt, die 1,203 M Betain und 1,3 % DMSO enthielt. Das Produkt wird in Spur 14 gezeigt, wobei nur die korrekte Bande dargestellt wird.

Beispiel 3: Amplifizierung der Gesamt-RNA aus Mausleber. 45 Die Gesamt-RNA (13 pg) aus Mausleber wurde revers transkribiert, mit einem Schwanz versehen und unter denselben Bedingungen PCR-amplifiziert wie dies bei dem gesamten künstlichen RNA-Satz in Beispiel 2 erfolgte.

Es wurden dieselben Bedingungen für RT, das Anhängen eines Schwanzes und PCR ange-50 wendet, um zu zeigen, dass es möglich ist, RNA-Moleküle aus einer komplexen Mischung unter denselben stringenten Bedingungen darzustellen, wie dies bei künstlicher RNA möglich ist. Die PCR-Produkte wurden auf einem 0,7%-Agarose-Gel laufen gelassen, um längere Moleküle aufzulösen. Wie in Figur 3 zu sehen ist, amplifiziert jede Primer-Kombination ein einzigartiges Profil. 55 20 AT 502 823 B1

Die Längenverteilung der RNA-Moleküle, die in Figur 3 dargestellt wird, entspricht sehr gut der Längenverteilung der cDNA in der NCBI-Nukleotid-Datenbank, durchsucht nach nicht-redundanten Volllängen-Maus-cDNA-Klonen (Fig. 5). 5 Im Durchschnitt sind ungefähr 10 bis 15 Banden auf jeder Spur zu sehen, wobei der vollständige Satz der 768 Primer-Kombinationen (3x44) ungefähr 7680 - 11520 PCR-Produkte darstellt, welche Volllängen-RNA-Moleküle wiedergeben, die in Leber exprimiert wurden. Die Tatsache, dass eine Auflösung dieser Profile auf einem einfachen 0,7 % Agarose-Gel möglich ist, zeigt die Stärke des Verfahrens und die Leichtigkeit, mit welcher es im Labor durchgeführt werden kann. 10

Beispiel 4: Durchführung des PCR-Voramplifizierungsschrittes

Voramplifizierung wurde in einer 10 pl Reaktion durchgeführt, die 2,5 μΙ gereinigte, mit einem Schwanz versehene cDNA, die in Beispiel 3 erzeugt wurde, 50 mM Tris (pH 8,8), 14 mM 15 (NH4)2S04, 4 mM MgCI2, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,2 μΜ von jedem Primer dT(21), 0,2 μΜ von

Primer dA(21), 0,5 Einheiten Taq-Polymerase und 0,03 Einheiten Pfu-Polymerase enthielt. Die Proben wurden 30 Sekunden lang bei 93°C denaturiert und folgender Zyklus 11 mal wiederholt: 10 Sekunden lang bei 93°C, 30 Sekunden lang bei 42°C, 11 Minuten lang bei 72°C, mit einem letzten Extensionsschritt von 2 Minuten bei 72°C. Diese Reaktion wurde durch Zugabe von 20 990 μΙ H20 auf 1 ml verdünnt. 2,5 μΙ dieser Verdünnung wurden bei der folgenden PCR unter

Verwendung derselben PCR-Bedingungen wie in Beispiel 3 verwendet, wobei jedoch die letzten zwei Zyklen ausgelassen wurden. Wie in Figur 4 dargestellt, ist ein markantes Bandenmuster für jede Primer-Kombination zu sehen. Der Voramplifizierungsschritt, der in dem Beispiel angewendet wurde, zeigt, dass 500 ng Gesamt-RNA ausreichend sind, um Material selbst für ein 25 großes Display mit 768 Reaktionen pro RNA-Probe bereitzustellen, so wie dies notwendig sein mag, um hoch komplexe RNA-Mischungen aus Geweben, wie dem Hirn, aufzulösen. Die Menge der verwendeten RNA kann leicht durch Erhöhung der Anzahl der Zyklen während der Voramplifizierung reduziert werden. Daher sollte die Empfindlichkeit des Displays selbst den anspruchsvollsten Anwendungen gerecht werden, wo nur begrenzte Mengen an RNA verfügbar 30 sind. Ferner hat die Menge an Banden pro Primer-Paar im Vergleich zu Beispiel 3 zugenommen. Da die hohen Anlagerungstemperaturen (Annealing-Temperaturen), die sowohl in Beispiel 3 als auch in Beispiel 4 bei dem unterscheidenden PCR-Schritt angewendet wurden, eine extrem hohe Stringenz ausüben, könnten einige Transkripte mit niedriger Konzentration gerade unter der Detektionsgrenze liegen, wenn kein Voramplifizierungsschritt durchgeführt wird. 35

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Claims (36)

1. 28 AT 502 823 B1 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 aaaaaaaaaa aaaaagggct a <210> 34 <211 > 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 aaaaaaaaaa aaaaagggtt a Patentansprüche: 1. Verfahren zum Amplifizieren eines Pools von Polynukleotid-Molekülen in einer Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen einer RNA-Probe und reversen Transkription von ganzen RNA-Molekülen, wodurch eine Volllängen-cDNA erzeugt wird, oder Bereitstellen einer Probe einer Volllängen-cDNA, b) Anhängen eines Schwanzes an das 3'-Ende der transkribierten cDNA in Form eines Polynukleotid-Schwanzes nach dem 3'-Ende, c) Amplifizierung der cDNA unter Verwendung von Primern, wobei ein erster (3’) Primer für das 5-Ende der cDNA und ein zweiter (5') Primer für den stromaufwärtigen Abschnitt des Polynukleotid-Schwanzes und die nächsten 1 bis 10 Nukleotide, vorzugsweise 1 bis 5 Nukleotide, noch bevorzugter 3 bis 5 Nukleotide, stromaufwärts von dem 3'-Polynuk-leotid-Schwanz der cDNA spezifisch ist.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Primer, der für den 3’-Poly-A-Schwanz der RNA oder mRNA und die nächsten 1 bis 10 Nukleotide stromaufwärts von dem Poly-A-Schwanz spezifisch ist, für die reverse Transkription verwendet wird, und/oder ein erster Amplifizierungs-Primer für einen S'-Poly-T-Abschnitt der cDNA spezifisch ist, der zu dem 3-Poly-A-Schwanz der RNA oder mRNA und den nächsten 1 bis 10 Nukleotiden stromabwärts des 5'-Poly-T-Abschnittes komplementär ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Primer für die reverse Transkription aus Desoxynukleotiden besteht.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Versehen des 3'-Endes mit einem Schwanz mit Hilfe terminaler Transferase erfolgt.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifizierung durch PCR erfolgt.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste 29 AT 502 823 B1 Primer und/oder zweite Primer für die Amplifizierung aus Desoxynukleotiden besteht.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das einen zusätzlichen Schritt des Trennens der Amplifizierungsprodukte gemäß ihrer Länge umfasst. 5
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Trennung durch Gel-Elektrophorese, vorzugsweise durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, oder Kapillar-Elektrophorese erfolgt.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches einen zusätzlichen Schritt des io Bestimmens der Sequenz, vorzugsweise der Identität, der Amplifizierungsprodukte um fasst.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Bestimmens der Sequenz, vorzugsweise der Identiät, der Amplifizierungsprodukte durch ein automatisiertes Verfahren auf einem 15 Chip erfolgt.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe Gesamt-RNA oder mRNA, vorzugsweise gereinigte RNA oder mRNA, aus einer Probe enthält.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die RNA-Moleküle durch Affini tätschromatographie unter Verwendung einer Oligo-dT-Zellulose-Säule gereinigt werden.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei hochstringente Bedingungen für die Verfahren der reversen Transkription und/oder der Amplifizierung angewendet werden. 25
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Selektivität der reversen Transkription und/oder Polymerase-Kettenreaktion durch die Verwendung von Trehalose, Betain, Tetramethylammoniumchlorid, Tetramethylammoniumoxalat, Formamid und Oligo-Blockern oder durch die Verwendung von Dimethylsulfoxid während der Polymerase- 30 Kettenreaktion erhöht wird, um das Auftreten von Mispriming zu verringern.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die reverse Transkription mit Hilfe einer reversen Transkriptase (RT) durchgeführt wird, die aus dem Moloney-Murine-Leukemia-Virus, AMV, HIV-1, HIV-2 gewonnen wird, wobei die RNase-H-Aktivität dieser 35 RTs vorhanden, verringert oder nicht vorhanden ist.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei Primer, die für die reverse Transkription oder Amplifizierung verwendet werden, eine Wobble-Substitution aufweisen, vorzugsweise wird dT durch dG, dA oder dC oder umgekehrt substituiert, in einer oder zwei Basen 40 an seinem 3-Ende, vorzugsweise zwischen der Position 2 und 4 stromaufwärts von dem letzten Nukleotid.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Wobble-Base eine Substitution durch universelle Basen darstellt, vorzugsweise Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol-2'-desoxynucleosid oder 5-Nitro- 45 indol-2'-desoxynucleosid, die mit jeder regulären Nukleobase, wie dA, dT, dG oder dC, ein Basenpaar bilden können.
18. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei cDNA mit einer 3'-Sequenz von Oligo-dC, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 6 dC-Nukleotiden, während der reversen so Transkription erzeugt wird, in Abhängigkeit von einem 5'-Cap der Matrizen-RNA oder -mRNA.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Fähigkeit einer reversen Transkriptase, die 3’-Sequenz von Oligo-dC zu erzeugen, durch die Zugabe von Mn2+-lonen während des 55 Vorgangs der reversen Transkription erhöht wird. 30 AT502 823B1
20. 20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Cap-abhängige 3'-Sequenz von Oligo-dC verwendet wird, um vollständig transkribierte cDNA durch Verwendung eines zweiten Primers während der Amplifizierung zu isolieren, der für die Oligo-dC-Sequenz spezifisch ist.
21. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das Schwanzhinzufügen zum 3'-Ende der cDNA mit einer Polynukleotidsequenz erfolgt, die durch die Abwesenheit von dC gekennzeichnet ist.
22. 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die DNA-Polymerase, die für die io Amplifizierungsreaktion verwendet wird, Taq-DNA-Polymerase, Tfl-DNA-Polymerase, aTaq-DNA-Polymerase, Sequenase oder Klentaq ist.
23. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei während der Amplifizierungsreaktion ein Enzym mit Proofreading-Aktivität verwendet wird. 15
24. 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die RNA in der Probe oder die cDNA voramplifiziert wird, vorzugsweise durch PCR, oder wobei RNA-Proben normalisiert oder subtrahiert werden.
25. 25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei ein Primer, der für die Amplifizie rungsreaktion verwendet wird, durch die allgemeine Formel dPxdGyHNz gekennzeichnet ist, wobei Px Nukleotide darstellt, die zu der Sequenz komplementär sind, die zum 3'-Ende der cDNA hinzugefügt wurde, dG Desoxyguanylat und y eine ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 2 und 5, ist, H entweder dT oder dA oder dC ist, N eine Sequenz von Nukleotiden 25 mit einer Länge z ist, wobei ihre Mitgliedsnukleotide unabhängig ausgewählt werden aus dA, dC, dG und dT, und z eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 0 und 5, ist.
26. 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Amplifizierung durch PCR ausge- 30 führt wird und die PCR-Primer Verankerungssequenzen enthalten, welche eine ordnungs gemäße Platzierung an dem Ende des 3'- oder 5'-Oligonukleotid-Endabschnitts der cDNA ermöglichen.
27. 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei ein Amplifizierungs-Primer oder ein 35 Reverse-Transkriptions-Primer einen Promotor für RNA-Polymerasen enthält.
28. 28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Promotor die Transkription durch die T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase verstärkt.
29. 29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Amplifizierungs-Primer und/oder die Amplifizierungsprodukte (cDNA) durch eine Reporter-Gruppe markiert werden, vorzugsweise durch fluoreszente Marker, chemilumineszente Marker oder Radioisotope.
30. 30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Reporter-Gruppen verwendet werden, um die 45 cDNA zu detektieren.
31. 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei willkürliche Nukleotide, vorzugsweise ein bis drei Nukleotide, zu dem 3-Ende der RNA oder mRNA nach der Transkription aber vor dem Anhängen eines Poly-A-Schwanzes hinzugefügt werden und die Primer für die re- 50 verse Transkription und/oder PCR eine Sequenz mit einem Wobble enthalten, das der will kürlichen Sequenz entspricht.
32. 32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei RNA- oder mRNA-Proben verwendet werden, die keinen Poly-A-Schwanz aufweisen, und ein Poly-A-Schwanz vor der reversen 55 Transkription synthetisch hinzugefügt wird. 31 AT 502 823 B1
33. 33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, wobei der Schritt der Fraktionierung des Amplifizierungsproduktes durch Gel-Elektrophorese, Pulsfeld-Elektrophorese, Agarose-Gel-Elektrophorese, PAGE, Kapillar-Elektrophorese oder Pulsfeld-Kapillar-Elektrophorese ausgeführt wird. 5
34. 34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei die Schritte der reversen Transkription und der Amplifizierung in einem Schritt ausgeführt werden.
35. 35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei der durch die terminale Transferase io angehängte Polynukleotid-Schwanz aus Ribonukleotiden, vorzugsweise 2 bis 6 Ribonukle- otiden, vorzugsweise Adenosin oder Thymidin, nach einer 3-Sequenz von Oligo-dC, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 6 dC-Nukleotiden, welche während der reversen Transkription erzeugt wird, abhängig von einem 5'-Cap einer Matrizen-RNA oder mRNA, besteht, wobei der zweite Amplifizierungs-Primer (5'-Primer) Nukleotide umfasst, die zu 15 den Ribonukleotiden und Oligo-dCs und 1 bis 10 Nukleotiden stromaufwärts von der Oligo-dC-Sequenz komplementär sind.
36. 36. Verfahren zum Messen des Expressionspegels von Messenger-RNA, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 35, einschließlich 20 der Trennung und/oder Identifizierung der Amplifizierungsergebnisse. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 25 30 35 40 45 50 55