CN103160575B - SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断及肝硬化诊断中的应用 - Google Patents

SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断及肝硬化诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SAA1 β/β(1.5/1.5)纯合子基因型在肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断中的应用，以及其在制备肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断试剂中的应用。本发明通过实时荧光定量等位基因特异性PCR检测人SAA1 β/β纯合子基因型和非SAA1 β/β纯合子基因型，从而实现对肝硬化易感人群的检测。

Description

SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断及肝硬化诊断中的应用
技术领域
本发明涉及肝硬化预后诊断及肝硬化诊断，具体地涉及了血清淀粉样蛋白A1(SAA1)SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化的危险因子在肝硬化预后诊断中的应用和作为肝硬化的生物标记物在肝硬化诊断中的应用。 
背景技术
肝硬化(Cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复而作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程；过度纤维化使肝脏萎缩变硬，最终引起肝硬化失代偿或肝功能衰竭而导致患者死亡。 
早在2002年，WHO统计数据即显示全球每年死于肝硬化的人数近8万例。至2010年，肝硬化已经是公认的导致人类死亡的前10大疾病。因此，肝硬化已成为全球性的公共健康问题，发病率之高，危害之重，不容忽视。由于导致肝硬化最常见的病因为乙肝(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染，世界人口总数的约1/3(20亿)感染过或正在感染乙肝病毒，其中有3.5亿人为终身感染者。而我国的HBV感染率已经高达10％。因此，由HBV和HCV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计，我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人，其中近25～30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化，其中5～20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬化的人数高达20万。因此，如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预，则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，降低患者死亡率、减少医疗费用并提高患者的生活质量；同时，肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要科学意义和临床应用价值，这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。 
人类血清淀粉样蛋白A1(Serum Amyloid A1，SAA1)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白。其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAA1是一种急性炎性蛋白，因为在急性炎症中，SAA1可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成，浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外，SAA1在生理状态下可与高密度脂蛋白(HDL)结合，在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其水平升高。但是，近年来大量研究表明：SAA1已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为天然固有免疫的调理素，SAA1可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAA1在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。 
在肝脏疾病发生中，香港大学He博士等发现，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中，SAA1蛋白明显增高。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中，SAA1是否参与上述病变至今未见报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明：SAA1蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系，乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAA1蛋白表达明显受抑，提示SAA1可能与HBV感染和后续病变有关。因此，本发明提出SAA1蛋白与乙肝引起的肝硬化相关、通过SAA1蛋白变化检测或判断肝硬化发病、诊断和干预的新的应用方法。 
基因多态性(Polymorphism)是指在一个生物群体中，同时存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性(Genetic Polymorphism)或基因多态性。基因单核苷酸多态性(Single Nuclear Ploymorphism，SNP)是指基因序列内的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失，插入和置换。人类基因多态性与疾病发生和诊断与治疗有密切的关系，多态性的变化不仅在阐明机体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性和预测转归上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。因此，基因多态性研究已经成为临床医学及预防医学研究的新领域。 
由于基因多态性有明显的种族差异，在不同种族之间可能表现出很大差异。所以，开展我国人群中与肝硬化相关的基因多态性研究具有重要的意义。通过对于肝硬化易感基因多态性研究，建立对易感性生物标志物的分析方法，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，便于采取针对性预防、在HBV感染人群中早期诊断肝硬化、对于接受治疗的肝硬化患者通过多态性分析预测其治疗效果和预后转归等都有重要价值。 
目前已知SAA1有SAA1α、β、γ三种等位基因，可分为α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型(表1)。已有研究表明不同的SAA1基因型在人群中所占的比例存在差异性。近年来，越来越多的研究聚焦在了SAA1基因型与疾病的关系上。众多的研究表明，SAA1基因型和疾病有相关性。例如，Yamada等对321名日本人SAA1基因型的研究发现，α(1.1)、β(1.5)、γ(1.3)这3个等位基因在日本人中的分布频率分别为0.310，0.347，0.330。Ishii等发现，在127例RA患者中，发生淀粉样变者最常见的基因型是(1.3/1.3)。淀粉样沉积物的出现和SAA1γ的基因频率高度相关。且在γ/γ纯合子基因型中，血清中SAA1蛋白的浓度水平，以及SAA1与同为急性期反应蛋白CRP的比值高于其他基因型。而在高加索人中，淀粉样变与SAA1α等位基因的频率呈正相关。在地中海出血热的研究中，有文献报道，SAA1α型的发病率是其他型别的7倍。而在SAA1的SNP分析研究中，也有报道表明不同的基因型在 HDL-C的水平上存在显著差异。但是，有关SAA1基因型与肝硬化的相关性研究至今未见报道。 
基因多态性研究中目前普遍使用的是“限制性内切酶片段长度检测(RFLP)”。该方法步骤极为繁琐、重复性差，不易进行大规模SNP分析。因此，开发一种简便、快速、准确又经济的SAA1基因多态性检测方法，对于疾病的诊断有重要意义.。 
本发明通过设计SAA1等位基因的SNP位点位于下游引物3’端的末端并对其进行硫代磷酸化修饰，采用改进的实时荧光定量等位基因特异性PCR(Real-time and Allele-specific PCR)技术，对SAA1基因型进行分析，并研究SAA1基因型与肝硬化发病的关系。本发明研究结果表明：SAA1基因型在中国人群中的分布与其它人种有很大的差异，而且其基因型的确与肝硬化的发生率有关并可作为生物标记物应用于肝硬化诊断/预后诊断。 
本发明首次提出SAA1β/β纯合子基因型与肝炎和肝硬化有正相关性、SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化生物标志物和肝硬化高危因子，可用于肝硬化诊断与乙肝型肝硬化预后诊断。因此，本发明还对SAA1β/β纯合子基因型发展为肝硬化诊断指标进行了评估。本发明通过改良的实时检测PCR技术，在进行了较大乙肝、肝硬化患者及正常对照人群的临床样本中SAA1基因型检测分析后，首次发现并提出纯合子基因型与肝硬化的显著相关性；提出了 纯合子基因型是肝硬化的危险因子，具有很高的肝硬化预后诊断价值；首次鉴定了 纯合子基因型作为肝硬化的生物标志物，对于非侵入性肝硬化诊断试剂的开发具有重大的意义；并且，本发明所设计的特定引物适用于采用实时荧光定量PCR检测人SAA1SNP，本发明方法能够简便、准确、快速地实现对肝硬化易感人群的检测；并且适用于SAA1SNP与其他相关疾病的研究。 
表1：SAA1基因型相对应的氨基酸变异及位点 
发明内容
本发明提出一种SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化诊断和/或乙型肝炎后肝硬化(乙肝型肝硬化)预后诊断中的应用。 
本发明还提出了SAA1β/β纯合子基因型在制备肝硬化预后诊断试剂和/或肝硬化诊断试剂中的应用。 
本发明依据SAA1α、β、γ三种等位基因的基因序列上的编码构建合成引物，通过实时荧光定量等位基因特异性PCR对待测样品进行扩增，依据CT值及溶解曲线判断PCR扩增产物的基因型属于SAA1β/β纯合子基因型或非SAA1β/β纯合子基因型。当所述PCR扩增产物判断为SAA1β/β纯合子基因型时，则所述待测样品判断为属于肝硬化的易感人群。将本发明SAA1β/β纯合子基因型的判断结果结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值，可大大提高非侵入性肝硬化诊断的准确性。 
本发明中实时荧光定量等位基因特异性PCR是指实时荧光定量PCR结合使用等位基因特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)的方法，对待测样品进行PCR扩增反应。 
其中，实时荧光定量等位基因特异性PCR方法中采用的引物包括： 
1)A3套引物 
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.2)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG； 
2)A2套引物 
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.3)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA； 
3)B3套引物 
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.4)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG； 
4)B2套引物 
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC； 
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.5)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。 
其中，所述引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰。 
其中，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR的反应体系包括所述引物、待测人SAA1α，β，γ等位基因基因组DNA、pfu DNA聚合酶(Pyrococcus furiosus DNA polymerase)、反应缓冲液以及荧光染料。 
其中，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，以含本发明克隆的等位基因基因组DNA片段的质粒作为阳性对照，以空质粒为阴性对照。 
本发明还提出，在肝硬化预后诊断的应用中，所述SAA1β/β纯合子基因型是作为肝硬化的危险因子。 
本发明还提出，在肝硬化诊断的应用中，所述SAA1β/β纯合子基因型是作为肝硬化的生物标记物。 
本发明通过实验研究，首次阐明SAA1β/β纯合子基因型与乙型肝炎及肝硬化的相关性；揭示SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化中的预测诊断临床应用价值；本发明提出将SAA1β/β纯合子基因型作为诊断肝硬化的一个全新的生物指标，提出了SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后及肝硬化诊断中的应用；本发明通过实验研究明确了中国健康汉族人群中SAA1基因型的分布；本发明提出了简便、快速、准确地检测SAA1β/β纯合子基因型的方法并完成临床样本的评估和分析。本发明还为其它蛋白基因多态性的检测方法的建立、与疾病相关性的研究以及其在疾病诊断中的应用价值的评估提供了扎实的研究基础及依据。 
本发明的研究表明，SAA1α、β、γ等位基因在中国汉族人群中的分布与以往报道的日本人群、高加索人群及非洲人群不同。在中国汉族人群中，以β等位基因为主，占46.6％，并且大多数为杂合子基因型；α、γ等位基因所占比例较低，分别为27.4％和26.0％。 
本发明对SAA1基因型与肝硬化的相关性进行了研究，并对其在临床上的诊断意义进行了分析和验证。通过对427例中国正常对照人群及103例乙肝型肝硬化患者的SAA1基因型的测定，首次发现在SAA1基因型中，β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化患者中占89.32％，与乙肝患者中的31.82％相比，呈现了与乙肝型肝硬化的显著正相关性(r＝0.135，P＝0.005)。而在正常对照中国人群中，β/β纯合子基因型仅占即在乙肝型肝硬化患者中，β/β纯合子基因型所占比例为健康对照人群的10.3倍。并且，在SAA1β/β纯合子基因型单因子对肝硬化的诊断价值分析中，ROC曲线下面积达0.79，灵敏度89.32％，特异性68.18％；结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值，ROC曲线下面积可达0.932，灵敏度76.74％，特异性97.01％。进一步通过logistic回归分析，揭示SAA1β/β纯合子基因型对乙肝型肝硬化患者危险度的比值比(Odds Ratio，OR)为17.92(95％可信区间为7.96～40.37)。据此判断，SAA1β/β纯合子基因型为乙肝型肝硬化的危险因子，对于在乙肝人群中的肝硬化预后诊断有极其重大的意义。 
综上，本发明首次发现并提出在中国人群中，SAA1β/β纯合子基因型是乙肝发展成肝硬化的一个高度危险因子，与乙肝型肝硬化高度关联，在该疾病的预测及诊断中，SAA1β/β纯合子基因型具有很高的临床应用价值。 
本发明在SAA1基因型的研究中，建立了一种简便、准确、快速的用于检测人SAA1SNP的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，可应用于SAA1SNP与疾病的相关性研究。 
本发明依据人SAA1α、β、γ三种等位基因SNP基因序列(8052位T、C；8067位T、C)，合成相应引物，将SNP位点设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAA1基因组DNA上的一段保守的内含子核苷酸序列。利用优化的PCR反应体系，通过实时荧光定量PCR反应，对人血液样本提取的基因组DNA进行扩增，并根据CT值及溶解曲线来进行SNP分析。 
本发明中所采用的实时荧光定量等位基因特异性PCR的优化过程包括：pfu DNA聚合酶的运用、合理的引物修饰以及PCR反应体系的优化。 
由于PCR扩增中可能存在的非特异性扩增和引物二聚体，本发明优选地采用pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此，其既能进行DNA合成又可以即时的识别并切除错配核苷酸，极大提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 
本发明优选地通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 
进一步，通过选择更优化的PCR反应条件，如引物浓度范围(0.5-5mM)；引物长度范围(20-30bp)；退火温度(60℃-67℃)；扩增产物长度(120-200bp)；待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)等，进一步提高了PCR扩增效率和扩增产物的专一性。 
本发明中，运用实时荧光定量PCR技术中的染料法，根据A3、A2、B3、B2四套引物间的基因组扩增产物的CT值差异与标准参考样(分别含人SAA1α，β，γ等位基因基因组DNA片段的三种等位基因质粒)的比较，提高了结果的可靠性和准确率。 
本发明利用AS-PCR原理，即引物在3’端末端存在错配时不能延伸，将单核苷酸多态性(SNP)位点设计在实时荧光定量等位基因特异性PCR的3’端末端并进行硫代磷酸化修饰，并结合采用pfu DNA聚合酶等技术手段，提高了PCR扩增效率和扩增产物的专一性。有鉴于此，本发明可准确快速检测人基因组中的SAA1α，β，γ等位基因的SNP位点。另外，本发明所提出的技术原理亦适用于其它基因的SNP检测。 
本发明中提供了一种特殊引物，采用实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，检测人SAA1基因SNP并据此进行SAA1基因型分型。本发明以人SAA1α、β、γ三种等位基因上特异的SNP序列合成四套引物A3、A2、B3、B2，运用pfu DNA聚合酶，通过实时荧光 定量PCR的方法，分析人SAA1α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型，从而甄别待测样品属于SAA1β/β纯合子基因型还是非SAA1β/β纯合子基因型。在此基础上，本发明还采用等位基因特异性-PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)联合限制性内切酶片段长度(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)的方法对样本进行检测，达到与实时荧光定量等位基因特异性PCR互相验证的目的；大量的实验证实本发明的高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的可靠性和可重复性。本发明首次建立了检测SAA1基因型分布的高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法，并分析了中国人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝硬化等患者中SAA1基因分布频率；本发明的实时荧光定量等位基因特异性PCR具有操作简便、准确率高、高通量等特点，适合进行大规模SAA1α、β、γ等位基因基因型的分布检测及其与疾病相关性的研究。 
本发明通过实时荧光定量等位基因特异性PCR方法分析人SAA1α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型，并通过该方法检测SAA1基因型在中国健康人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝硬化等患者中的分布，进而确定特定SAA1β/β纯合子基因型与肝硬化等肝脏疾病的密切相关性。 
本发明联合采用AS-PCR与RFLP的方法，对427例中国汉族健康人群进行SAA1基因型筛查，通过将结果与已有报道的用同样方法获得的其它人种SAA1基因分布进行比对，明确了中国汉族人群中SAA1基因型分布，同时也说明了本发明中高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法的实际应用价值。 
本发明使用上述方法对66例乙型肝炎患者进行SAA1基因型筛查，并统计分析其结果。 
本发明使用上述方法对103例乙肝型肝硬化患者进行SAA1基因型筛查，并统计分析其结果。 
本发明对427例中国汉族健康对照人群、66例慢性乙肝及103例乙肝型肝硬化患者的SAA1六种基因型的分布进行了分析。发现肝硬化患者SAA1β/β纯合子基因型比例高达89.3％。与正常人群相比，该纯合子基因型所占比例提高了10倍左右，与慢性乙肝患者相比，提高了约3倍。对SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化的临床预后诊断价值的评估，进一步发现SAA1β/β纯合子基因型有可能作为肝硬化的高危因子，实现对肝硬化预后诊断，可从乙肝患者中检测出易感人群。 
本发明提出将SAA1β/β纯合子基因型作为全新的肝硬化生物标志物，再结合待测目标的血浆AST/ALT比、TBA和LDL值，大大提高了非侵入性肝硬化诊断的准确性。本发明对SAA1β/β纯合子基因型的检测不仅可用于监测乙肝患者发展为肝硬化的患病几率，还能应用于非侵入性肝硬化诊断试剂的研发。 
本发明还提出了将SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化生物标志物的新型检测方法、检测试剂及试剂盒。 
鉴于SAA1基因型的检测对于相关疾病的预防、筛查及易感人群的早期干预和诊断等方面有重要作用与意义，因此，本发明通过对SAA1基因型的研究不仅为SAA1蛋白参与乙肝型肝硬化的发病机理提供了实验依据，还为甄别SAA1β/β纯合子基因型从而发现肝硬化易感人群建立了高通量的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，为实现早期诊断肝硬化和预测治疗转归奠定了理论与实验基础。对肝硬化易感人群进行早期预防，早期诊断，早期干预，从而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，不仅对患者个人还对整个社会的经济和医疗水平的发展、提高都有不可估量的重大意义。 
附图说明
图1所示为AS-PCR扩增结果示意图。其中，图1A为3％琼脂糖DNA电泳：以含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，B3套引物进行AS-PCR扩增的结果示意图；图1B为3％琼脂糖DNA电泳：以含人SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，B2套引物进行AS-PCR扩增，扩增产物经BanI酶切后的结果示意图。 
图2所示为以含人SAA1β基因型基因组DNA片段的质粒为模板进行实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增结果示意图。其中，图2A为扩增产物的溶解曲线图，图2B为扩增产物荧光扩增曲线，图2C为达到设定荧光值的PCR循环数。 
图3所示为实时荧光定量等位基因特异性PCR检测人SAA1基因型的结果示意图。其中，图3A为检测SAA1α/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图3B为SAA1β/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图3C为SAA1γ/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图。 
图4为SAA1基因型中β/β型及非β/β型在健康对照人群、乙型肝炎患者、乙肝型肝硬化患者和其他肝硬化患者中所占百分比柱状图。 
图5所示为乙肝患者HBV DNA载量在SAA1β/β纯合子基因型及非β/β纯合子基因型中的分布。 
图6所示为SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断中的ROC曲线。 
图7所示为SAA1β/β纯合子基因型、AST/ALT、TBA、LDL联合使用在诊断肝硬中的ROC曲线。 
图8所示为实施例1阳性克隆DNA序列测定结果。 
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。 
实施例1：利用AS-PCR联合RFLP在健康人群中进行SAA1基因型的分布筛查 
以SAA1基因型在健康人群中的筛查分布为例，采用等位基因特异性-PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)联合限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)手段检测在健康人群中的SAA1基因型分布情况。 
RFLP是指基因型之间限制性酶切片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP能对特定基因进行定位和分离，可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种分子水平上的差异，可用于基因型分型和生物多样性的研究。 
本实施例联合使用AS-PCR与RFLP的检测方法，对SAA1基因型在健康人群中的分布进行研究。通过与其他人种的比较，解析乙肝、肝硬化及肝癌等疾病在中国人群中高发的原因。 
依据人SAA1α、β、γ三种等位基因核苷酸序列上的第8067位的差别分别合成两套相应的引物：B2套引物和B3套引物(B2套引物针对等位基因β8067位T；B3套引物针对等位基因α，γ8067位的C)，将8067位点的核苷酸设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAA1基因组上一段内含子DNA的保守核苷酸序列，为B2和B3套的共用引物。通过AS-PCR反应，对从人血液样本中提取的DNA进行扩增，根据B3套引物是否有扩增产物来判断SAA1β等位基因是否存在(B3引物PCR反应后有扩增产物的，判断为是α、γ等位基因阳性；B3套引物PCR反应后无扩增产物，B2套引物PCR反应后有扩增产物的，判断为是SAA1β/β纯合子)。进一步，用针对等位基因组序列上第8052-C位点的限制性内切酶BanI酶切鉴定，根据酶切片段大小判断编码8052-C位点是否存在(等位基因α无此酶切位点)，继而判断SAA1基因型，如表3所示。 
优选地，上述的AS-PCR反应程序包括： 
(a)由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此既能进行DNA合成又可以即时识别并切除错配核苷酸，极大提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 
(b)通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 
(c)通过对引物浓度范围(0.5-5mM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(120-200bp)、待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)、反应体系等更精准的优化及选定，进一步提高了PCR的扩增效率和扩增专一性。 
本实施例利用PCR反应中引物在3’端末端存在错配时不能延伸的特点，将等位基因SNP位点设计在荧光定量PCR引物的3’端的末端，并对其进行合适的修饰，加上pfu DNA聚合酶的应用等手段，另外还对PCR的反应条件如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等一系列条件进行优化，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测，根据有无扩增产物及BanI酶切片段长短而获得可靠、准确的结果。本发明不仅可准确检测人基因组中的SAA1基因型，同时还适用于其它基因突变及SNP检测。 
一.实验方法： 
1.获得待测样品：血液中人基因组DNA的抽提，取人血液500μL，用血液DNA抽提试剂盒抽提，测定260nm OD.值以计算DNA浓度，并将其稀释到10ng/μL浓度。 
2.AS-PCR引物的设计：参照已报道的GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1中人SAA1α、β、γ等位基因序列，分别设计两套AS-PCR引物。下游引物的3’末端为SAA1基因组8067SNP突变位点。本实验中采用的引物：上游引物为通用引物，在全基因7909-8092处；下游引物为针对α、β、γ等位基因的SNP位点的2套引物，分别为B2套引物和B3套引物(B3套引物针对等位基因γ和α在8067位的C，B2套引物针对等位基因β在8067位的T)，见表2。同时对引物3’端的末端进行硫代磷酸化修饰。 
上游端正向通用引物 
aggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagccaattacatcggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgggggtgCctgggctgcagaag
以上为AS-PCR人SAA1基因组序列及引物设计位置。其中，第一个黑框部分为上游端通用引物tcccttctgcctttcctttcctttcc(Seq ID No.1)，灰色标识部分为B套反向引物即B3为TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG(Seq ID No.4)，B2为TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA(Seq ID No.5)，如表2所示。 
表2AS-PCR引物 
表2所示为上游通用引物，B套下游反向引物B2和B3的序列。B2套引物是针对人SAA1基因β，基因组8067位T位点(氨基酸为V57，核苷酸编码为GTC)设计。B3套引物是针对人SAA1α、γ等位基因，基因组8067-C位点(氨基酸为A57，核苷酸编码为GCC)设计。 
采用B3、B2套引物进行PCR的扩增产物长度为186bp。 
本发明构建的引物与基因型的对应关系见表3。 
表3所示为AS-PCR和RFLP联合使用的预测检测结果(+表示有扩增条带；-表示无扩增条带) 
由此判断： 
(1)当采用B2套引物进行PCR时有扩增产物、采用B3套引物进行PCR时无扩增产物的情况下，待测样品为β/β纯合子基因型； 
(2)当采用B2/B3进行PCR均有扩增产物的，则对B2套引物扩增产物进行BanI酶切鉴定，有186bp条带的待测样品为α/β基因型；有142/44bp条带的待测样品为SAA1γ/β基因型； 
(3)当采用B2套引物进行PCR有扩增产物、采用B3套引物进行PCR无扩增产物时，则对B2套引物扩增产物进行BanI酶切鉴定：186bp有条带的待测样品为SAA1α/α基因型，有142/44bp两条带的待测样品为γ/γ基因型；有186/142bp两条带的待测样品为α/γ基因型。 
3.人SAA1α、β、γ三个等位基因基因组DNA片段的克隆及测序： 
3.1.引物设计：分别参照已报道的人SAA1基因组序列(Seq ID No.8)(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)设计引物： 
上游正向引物以基因序列7796为起始，序列(Seq ID No.6)为 
CATGGTATCCAAGGCTGCTATGAT； 
下游反向引物为基因序列以8256为起始，序列(Seq ID No.7)为 
ATGAGGAATCACTCACTCCTACCATC。 
7796： 
atggtatccaaggctgctatgatcacaggctgaaagcttgaagtcagtggaagatttgtccttcctcattcccctctaaggtgttgttggagtctttatgttctcctgatgtcccttctgcctttcctttcctttccaggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagccaattacatcggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgggggtgcctgggctgcagaagtgatcacgtaactggagctcctgggacgttagggctgggtgagcagagcttgcctgccttggacagtcaggagggagacgagctccttgtggagaagttagaggctgcggcccctcctcctcttgccctctctctgcctctgtgctcagtgtgaggtctgagtggatggtaggagtgagtgattcctcat 8256 
3.2.PCR扩增反应：采用以下PCR反应体系。 
在一个200μL微量PCR反应管内加入以下试剂： 
加入去离子灭菌水至终体积50uL。 
PCR反应条件为94℃5分钟，94℃30秒，54℃1分钟，72℃1分钟，40个循环，然后72℃延伸10分钟。 
3.3.PCR产物克隆：扩增出的PCR片段，经PCR产物回收试剂盒回收，然后用T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)补平末端，再经琼脂糖凝胶电泳，将目标片段用胶回收试剂盒回收纯化，然后插入到pBluesecript II SK(+)载体上的EcoRV位点中，方法见文献(Sambrooks，分子克隆手册)，将连接产物转化到DH5α菌株中，用PCR方法筛选阳性克隆。 
3.4.将阳性克隆进行DNA序列测定，其测序结果与基因库序列比较一致，结果如图8所示。 
4.AS-PCR方法： 
4.1取抽提的待测样品人基因组DNA稀释至10ng/μL，分别用B2和B3套引物进行AS-PCR反应，阳性对照为上述3个已克隆测序的人SAA1等位基因基因组DNA片段，阴性对照为水。 
4.2AS-PCR反应条件体系： 
反应条件95℃5min；95℃30秒；62℃30秒s；72℃1分钟；35个循环。 
PCR产物用3％琼脂糖电泳鉴定。 
5.AS_PCR产物的RFLP检测： 
扩增的PCR产物通过凝胶抽提试剂盒纯化收获，并用限制性内切酶BanI在37℃恒温水浴中酶切2小时，酶切后产物用3％琼脂糖电泳鉴定。 
6阳性对照的建立： 
以含SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒(6种排列组合，即：α/α，α/β，α/γ，β/β，β/γ，γ/γ6种基因型)为模板进行AS-PCR反应并联合RFLP检测，用3％琼脂糖DNA电泳分析反应产物。AS-PCR反应条件为：95℃5分钟，62℃30秒；72℃1分钟；35个循环。 
结果如图1所示：图1A为用B3套引物进行AS-PCR的结果；图1B为用B2套引物进行AS-PCR的结果，扩增产物经BanI酶切。 
含SAA1α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒作为待测样品进行实验，测试结果与本发明构建的引物-基因型的对应关系表(表3)中的对应关系一一对应，说明阳性对照符合实验要求。 
二.结果分析： 
1.SAA1基因型在中国汉族人群中的分布(见表4)： 
本发明检测SAA1各基因型在中国汉族人群中的分布百分比如表4。结果显示，在中国汉族人群中，α/β基因型所占百分比最高为41.22％，其次为β/γ基因型34.67％，β/β纯合子基因型占8.67％，γ/γ纯合子基因型为3.98％，α/α纯合子基因型最低为2.11％。 
2.SAA1等位基因在中国人群中的分布频率及与其它人种中的分布频率比较(见表5)： 
分析SAA1各等位基因在中国汉族人群中的分布频率，并将其与已有报道的在高加索人及日本人群中的分布频率比较。如表5所示，在中国汉族人群中，SAA1等位基因β出现频率最高，达46.6％，是高加索人群(18.9％)的2.5倍，也高于日本人群中的分布(30.1％)。而 等位基因α的分布频率为27.4％，大大低于高加索人群中的分布(75.8％)，同时也低于日本人群中的分布(32.5％)。等位基因γ的分布频率为26.0％，则介于高加索人群(5.3％)及日本人群(37.4％)分布频率之间。有研究表明，在日本的RA患者中，发生次生AA型淀粉样变最常见的基因型是γ/γ纯合子基因型，而在高加索人群中地中海热是和α的频率正相关。并且，在乙型肝炎及乙肝型肝硬化中，中国人的发病率显著高于高加索人；乙肝型肝硬化也显著高于日本人。同时又有研究表明，血浆中SAA1蛋白含量在肝癌患者中有显著升高。因此，提示SAA1等位基因多态性可能与中国人群乙肝、肝硬化和肝癌的高发相关。 
表4SAA1基因型在中国汉族人群中的分布 
表5SAA1等位基因在中国，高加索及日本人群中的分布频率 
a：淀粉样蛋白(Amyloid).1998Dec；5(4)：262-5. 
b：人类基因学(Hum Genet)(1999)105：360-366 
实施例2人SAA1β/β纯合子基因型与乙肝型肝硬化的高度相关性及相关应用 
本发明采用实时荧光定量等位基因特异性PCR，筛查乙肝患者和乙肝型肝硬化患者中SAA1β/β纯合子基因型和非SAA1β/β纯合子基因型的分布，提出了SAA1β/β纯合子基因型与上述疾病之间存在相关性，并由此提出了SAA1β/β纯合子基因型适用于在肝硬化的诊断/预后诊断中的应用。 
实时荧光定量PCR技术具有实时监测、定量和高通量等特点，而且操作简便、灵敏度高。 在反应中加入SYBR Green I荧光染料，能特异性地嵌入双链DNA分子中，与DNA分子结合时能发出荧光。而当DNA分子为单链时，染料被释放，荧光减弱。因此在一个反应体系中，荧光的强弱与DNA双链分子含量呈正相关。因此每一个循环，收集荧光信号，即可通过荧光强度变化监测到DNA扩增产物量的变化，从而得到一个荧光扩增的曲线图。最终通过计算可得到单个体系反应时间内的PCR产物扩增量。 
等位基因特异性PCR的原理是基于Taq DNA多聚酶不能修复DNA引物在3′端末端的单个碱基错配。所以，当引物的3′端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增；反之，当引物3′端末端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。因此，通过对PCR产物的检测可确定SAA1基因型。 
本发明采用上述改良的实时荧光定量PCR：实时荧光定量等位基因特异性PCR方法检测SAA1α，β，γ三种等位基因中的两个氨基酸位点V57A、V52A相对应的核苷酸SNP位点，对66名乙肝(尚未转化为肝硬化)和103名乙肝型肝硬化患者进行临床实验，并对其作为肝硬化生物标志物的可能性作出评估。 
本发明以SAA1全基因组中(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)7800到8300之间的核苷酸序列为基础，运用实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法检测SAA1α、β、γ等位基因上的三个SNP位点。 
本发明依据人SAA1α、β、γ三种等位基因的SNP(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)序列(8052位的T或C；8067位的T或C)合成相应的引物，将SNP位点设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAA1基因组上的一段保守的核苷酸序列。通过实时荧光定量等位基因特异性PCR反应，对人血液样本提取的DNA进行扩增，并根据CT值和溶解曲线进行SAA1基因型分析。 
一.实验方法： 
1.获得待测样品：血液中人基因组DNA的抽提，取人血液500uL，用血液DNA抽提试剂盒抽提，测定260nm O.D.值以计算DNA浓度，并将其稀释到10ng/uL浓度。 
2.实时荧光定量等位基因特异性PCR引物的设计：参照已报道的人SAA1α、β、γ等位基因序列，设计四套引物，即A3，B3，A2，B2套引物。引物的3’端末端为SAA1等位基因SNP位点。根据SAA1基因组DNA序列(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)设计引物，其中上游引物为通用引物，在全基因组7907～7933bp(GenBank：NCBI Reference Sequence：NG_021330.1)处。下游引物为针对α、β、γ等位基因的多态性位点的4条引物，其3’端末端在基因组DNA序列的8052位点或8067位点，分别为A3，B3，A2，B2，见表6。 另外，引物3‘端的末端被硫代磷酸化修饰，以期提高检测SAA1α、β、γ等位基因SNP位点的特异性。 
上游端正向通用引物 
aggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagccaattacatcggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgggggtg
A套引物    B套引物 
实时荧光定量PCR所选用人SAA1基因组序列及引物设计位置如上所示。其中，第一个黑框部分为上游端通用引物tcccttctgcctttcctttcctttcc(Seq ID No.1)，第二个黑框部分为A套反向两条引物(即A3，A2，)CctgggctgcagaagCgatcacg taa，灰底标示序列为B套反向引物(即B3，B2)Cgatcacg taactggagc tcctggga，如表6所示。 
表6实时荧光定量等位基因特异性PCR引物 
表6中：引物A、B分别为上游正向A套、B套通用引物序列，引物A2、A3分别为A2套、A3套下游反向引物序列，引物B2、B3分别为B2套、B3套下游反向引物序列。A2套引物是针对人SAA1等位基因α基因组8052位(氨基酸为V52GTC)T多态性位点设计。A3套引物是针对人SAA1等位基因γ、β基因组8052位(氨基酸为A52GCC)C多态性位点设计。B2套引物是针对人SAA1等位基因β基因组8067位(氨基酸为V57GTC)T多态性位点设计。B3套引物是针对人SAA1等位基因α、γ基因组8067位(氨基酸为A57GCC)C多态性位点设计。 
采用A3和A2套引物进行PCR反应的扩增产物为168个核苷酸，采用B3和B2套引物进行PCR反应的扩增产物为184核苷酸。 
本发明构建的引物-基因型的对应关系，如表7所示。 
表7所示为实时荧光定量等位基因特异性PCR的结果(+表示有扩增条带；-表示无扩 增条带) 
3.人SAA1α、β、γ三种等位基因DNA片段的克隆及测序，与实施例1相同。 
4.实时荧光定量等位基因特异性PCR的实施：对人基因组DNA(gDNA，10ng/μL)，进行实时实时荧光定量等位基因特异性PCR反应。阳性对照为本发明克隆并测序鉴定的三种含人SAA1等位基因(α、β、γ)基因组DNA片段的质粒，阴性对照为水。反应体系及条件如下： 
反应条件为95℃，5min；95℃30秒；62℃31秒；72℃45秒；35个循环。 
5.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的评估 
5.1.在阳性对照质粒上的测试： 
以三种含SAA1等位基因组DNA片段的pBluescript II(SK(+)质粒为实时荧光定量等位基因特异性PCR反应的阳性对照，即人SAA1α等位基因质粒、人SAA1β等位基因质粒、人SAA1γ等位基因质粒，对实时荧光定量等位基因特异性PCR体系进行评估，如引物及反应条件；并进一步对反应条件进行优化，对方法的临床应用可行性进行探讨。 
以人SAA1β等位基因质粒为模板为例，反应条件：95℃5分钟，60℃20秒；72℃45秒； 36个循环。根据扩增后所获得的CT值和熔解曲线来进行SAA1基因型分析。 
本实施例中，采用四套引物(通用上游引物/下游反向引物A3，B3，A2，B2)进行PCR扩增反应，实际扩增结果如图2所示。 
图2A结果显示：扩增产物溶解度一致，没有杂峰，因此引物专一性好，该反应条件下没有引物二聚体或其它非特异信号产生； 
图2B、图2C结果显示：采用A3套引物(图2C中的B1组)PCR反应有扩增产物(CT值为26.63)，B2套引物(图2C中的B4组)PCR反应有扩增产物两对引物有扩增产物(CT值为23.93)，而A2套引物(图2C中的B3组)，B3套引物(图2C中的B2组)没有扩增产物，结果证实反应体系DNA模板为SAA1β型质粒。与表7中的预期结果一致，即β/β基因型的PCR结果为：用A3、B2引物时是有扩增产物的，用B3、A2引物时无扩增产物。 
对其它5种基因型(α/α、γ/γ、α/β、α/γ、γ/β)以3种等位基因质粒排列组合为模板进行试验，结果与表7中的预期结果一致。因此，利用本发明提出的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法能够对SAA1基因型进行分型测试。 
5.2.在人SAA1基因型基因组DNA样本上的测试： 
α/β型样本测试结果如图3A所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增环数；其中，扩增结果为A3+，B3+，A2+，B2+，因此判断为人SAA1α/β基因型。 
β/β型样本测试结果如图3B所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增循环数；其中，扩增结果为A3+，B3-，A2-，B3+，因此判断为人SAA1β/β基因型。 
γ/β型样本测试结果如图3C所示，扩增产物的溶解曲线图和PCR产物荧光扩增曲线图中分别显示了采用A3，B3，A2，B2套引物进行PCR扩增的循环数CT值及产物扩增环数；其中，扩增结果为A3+，B3+，A2-，B2+，因此判断为人SAA1γ/β基因型。 
6.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的优化 
6.1由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性，因此其既能进行DNA合成又可以即时的识别并切除错配核苷酸，极大地提高了PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。 
6.2通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。 
6.3通过对引物浓度范围(0.5-5mM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(120-200bp)、扩增基因组DNA浓度范围(5-15ng)、扩增方法等更精准的优化及测评，再进一步提高了PCR扩增的专一性和扩增效率。 
二.实验结果： 
1.本实施例的检测结果，SAA1各基因型在乙型肝炎患者及乙型肝炎后肝硬化(乙肝型肝硬化)患者中的分布，如表8所示，在103例乙肝型肝硬化患者中，SAA1β/β纯合子基因型为92例，占百分比最高，为89.32％。在427例健康对照人群中，SAA1β/β纯合子基因型为37例，占百分比8.67％。比较显示，在乙肝型肝硬化患者中SAA1β/β纯合子基因型比例高达89.32％，是健康对照人群(8.67％)的10.3倍。而在乙肝患者中，SAA1β/β纯合子基因型所占百分比为31.82％，是健康对照人群(8.67％)的3.67倍。由此可见，SAA1β/β纯合子基因型与乙肝型肝硬化和乙肝存在相关性，可能是乙肝型肝硬化和乙肝的生物标志物。 
表8SAA1基因型在健康对照组和乙型肝炎及肝硬化患者组中的检测结果 
*.其它肝硬化：3例原发性胆汁性肝硬化，9例血吸虫性肝硬化 
鉴于SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化患者中的极高频率达89.32％，而非SAA1β/β纯合子基因型仅占10.68％，本发明对其成为乙肝发展为肝硬化的危险因子进行了分析评估。SAA1β/β纯合子基因型及非SAA1β/β纯合子基因型在健康对照人群、乙型肝炎患者、乙肝型肝硬化及非乙肝转化的其他它肝硬化中所占百分比，如图4和表8所示，在健康对照组中(n＝427)，SAA1β/β纯合子基因型仅占8.67％，非SAA1β/β纯合子基因型占91.33％；在乙肝型肝硬化组中(n＝103)，SAA1β/β纯合子基因型所占比例高达89.32％，明显高于健康对照组，而非SAA1β/β纯合子基因型仅占10.68％；在非乙肝转化的其他肝硬化患者中，SAA1β/β纯合子基因型占33.33％，相较于乙肝型肝硬化，该比例低了2.67倍。而非SAA1β/β纯合子基因型占了66.67％；在乙肝患者中(n＝66)，SAA1β/β纯合子基因型所占比例相比在健康对 照中有所升高为31.82％，而非SAA1β/β纯合子基因型相应减少为68.18％。该结果显示在乙肝型肝硬化(可能由乙肝转化的肝硬化)组中，SAA1基因型绝大部分为SAA1β/β纯合子基因型；而在其他类型的肝硬化组中，SAA1β/β纯合子基因型却并没有占到如此大的比例，所占比例与乙型肝炎组类似，为33.33％；在乙型肝炎组和其他类型的肝硬化组中，SAA1β/β纯合子基因型所占比例相较于健康对照人群而言，也有一定程度提高。上述结果表明SAA1β/β纯合子基因型与乙肝型肝硬化高度相关，因此可应用于检测乙肝型肝硬化以及在乙肝患者中筛查肝硬化易感人群。 
实施例3 SAA1β/β纯合子基因型与乙肝病毒(HBV)载量的相关性 
有研究报道，慢性乙肝患者体内乙肝病毒复制活跃的病人，即用PCR方法能够在血清中检测到乙肝病毒DNA(＞105-106copies/mL)或者检测到乙肝e抗原的患者，他们转化持续进展性肝病如肝硬化甚至死亡的危险性会大大增加，属于高危人群。为了进一步验证实施例2中SAA1β/β纯合子基因型和乙肝型肝硬化的高度相关性是由于SAA1β/β纯合子基因型的乙肝患者的乙肝病毒复制活跃所致，本实施例将分析研究SAA1β/β纯合子基因型和乙肝病毒载量的相关性。 
一.方法： 
1.收集乙型肝炎患者血清，使用乙肝病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(care HBV PCR assay，QIAGEN)对病人血清中的乙肝病毒DNA进行检测。该检测采用PCR-荧光探针法，在实时定量PCR仪(LightCycler480，Roche)中进行。该方法检测范围为5×102-5×107拷贝数/mL。 
2.统计分析检测结果，研究乙肝病毒(HBV)载量与SAA1基因型相关性。 
二.SAA1β/β纯合子基因型与乙肝病毒(HBV)载量的相关性分析。 
将乙肝患者根据SAA1基因型分为SAA1β/β纯合子基因型及非SAA1β/β纯合子基因型两组，比较乙肝病毒(HBV)载量。使用t-test对两组的差异进行统计分析。 
结果如图5所示：在乙肝患者中，SAA1β/β纯合子基因型患者(n＝20)的HBV DNA含量高于非SAA1β/β纯合子基因型患者(n＝42)，P值为0.02，表明SAA1β/β纯合子基因型和乙肝病毒载量呈正相关性。 
HBV载量在SAA1β/β纯合子基因型及非SAA1β/β纯合子基因型中的差异提示了或许在乙肝发展为肝硬化的过程中，SAA1β/β纯合子基因型的患者，由于其病毒清除能力较低，从而导致了病毒在体内的持续存在，并不断侵犯肝脏，导致肝细胞长期慢性炎症，引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生直至发展成肝硬化。实施例2也已表明SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化患者中存在很高的比例，显著高于其它类型的肝硬化(非病毒性肝硬化)；其他已报 道的研究也发现，体内乙肝病毒复制活跃的病人，他们转化为肝硬化等持续进展性肝病甚至死亡的危险性会大大增加。 
综上所述，本发明发现SAA1β/β纯合子基因型的乙肝患者相较于非SAA1β/β纯合子基因型的乙肝患者体内乙肝病毒复制更活跃、更易于发展为肝硬化。因此，SAA1β/β纯合子基因型可作为肝硬化的危险因子用于肝硬化预后的诊断。 
实施例4：SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化的危险因子在肝硬化预后诊断中的应用 
以SAA1基因型在中国健康汉族对照人群中的分布及在乙肝和乙肝型肝硬化患者中的分布为例，对SAA1β/β纯合子基因型是否肝硬化危险因子进行分析评估并对其在肝硬化预后诊断中的应用进行临床试验和评估。 
分析方法及结果： 
使用SPSS软件进行logistic回归分析，分别研究乙型肝炎患者及乙肝型肝硬化患者中，SAA1β/β纯合子基因型及各项实验室相关指标在乙肝发展为肝硬化中的独立危险因素(表9)。结果可见，各项实验室指标中，SAA1β/β纯合子基因型的比值比(Odds Ratio，OR)最高，为17.92(P＜0.001)，因此可以判断SAA1β/β纯合子基因型是乙肝型肝硬化的危险因子，即SAA1β/β纯合子基因型的乙肝患者发展为肝硬化的危险程度最高。 
对乙肝患者发展为肝硬化预后的诊断价值分析发现SAA1β/β纯合子基因型ROC曲线下面积可达0.790(P＜0.001)，对于由乙肝发展的肝硬化预后有很高的诊断价值。 
通过SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化预后诊断中的ROC曲线及单因素logistic回归分析可见，在单独危险因素分析中，证实SAA1β/β纯合子基因型为乙肝患者发展为肝硬化的高度危险因素，比值比为17.92(p＜0.001)，与疾病高度关联。并且，与其它因素相比(见表9)，SAA1β/β纯合子基因型在乙肝患者的疾病转化预后中具有最高的诊断价值(AUC＝0.790，p＜0.001)。 
表9：SAA1β/β纯合子基因型为乙肝患者转化为肝硬化的高度危险因素 
实施例5SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化的生物标志物在肝硬化诊断中的应用 
生物标志物是一种生化指标，是生物体受到严重损害之前发出的一种在分子水平、细胞水平或个体水平上异常化的信号指标。可对生理或病理或治疗过程进行检测和评价。通过对生物标志物的检查，对疾病的早期诊断、预防及对治疗过程中的监控具有重大意义。 
通过前述的四个实例可见，SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化中占有非常高的比例(89.32％)，显著高于非乙肝的其他肝硬化(33.33％)。并且通过对乙肝病毒载量与SAA1β/β纯合子基因型相关性的分析可见，SAA1β/β纯合子基因型患者组的乙肝病毒载量显著高于非β/β纯合子基因型患者组，因此极有可能在从乙肝发展为肝硬化的过程中，SAA1β/β纯合子基因型的患者，由于其病毒清除能力较低，从而导致了病毒在体内的持续存在，并不断侵犯肝脏，导致肝细胞长期慢性炎症，引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生直至发展成肝硬化。而在SAA1β/β纯合子基因型作为肝硬化的危险因子在肝硬化预后诊断中的应用评估中可见，在单独危险因素分析中，SAA1β/β纯合子基因型是乙肝患者发展为肝硬化的高度危险因素，比值比为17.92(p＜0.001)，与疾病具有高度关联。因此，SAA1β/β纯合子基因型对于乙肝发展为肝硬化有密切的联系，可作为乙肝型肝硬化的生物标志物，通过对SAA1基因型的检测，实现对疾病的早期诊断和预防。 
使用逐步回归，分析各检测指标在乙肝型肝硬化中的OR值，如表10所示：SAA1β/β纯合子基因型、AST/ALT、SAA1、TBA、LDL在乙肝型肝硬化诊断中意义重大，其中，尤以SAA1β/β纯合子基因型的OR值最高；在拟和公式中，SAA1β/β纯合子基因型的作用最大，OR值达到了1508.152(95％可信区间为20.855～109061.936)，表明SAA1β/β纯合子基因型是乙肝型肝硬化的生物标志物，与该疾病具有极高的关联度。 
进一步通过logistic逐步回归联合ROC曲线分析，在多因素(SAA1β/β纯合子基因型、AST/ALT、TBA、LDL)共同作用下，对于乙肝型肝硬化的非侵入性诊断价值显著升高，ROC曲线下面积可达0.932(P＜0.001)，特异性达97.01％，灵敏度达76.74％(图7)。因此，该几项指标可联合应用于非侵入性乙肝型肝硬化诊断。判断值公式为： 
P＝1/(1+e-(-14.08+1.94AST/ALT+0.026TBA+7.32SAA1genotype-1.29LDL)) 
Cutoff值为0.66。 
即当使用上述预测公式计算所得值大于等于cutoff值0.66时，患者则可能患肝硬化，并且该判定的特异性达97.01％，灵敏度达76.74％。 
综上所述，SAA1基因型在中国汉族人群中的分布与其在高加索人及日本人群中明显不同。其中，等位基因β在中国汉族人群中出现频率最高，达46.6％，是其在高加索人群中分布(18.9％)的2.47倍，也高于其在日本人群中的分布(30.1％)。并且β等位基因与SAA1蛋白浓度显著相关(r＝0.135，p＝0.005，数据未在此发表)。而在乙肝型肝硬化患者中，β/β基因型所占百分比(89.32％)大大高于其在健康对照人群中(8.67％)的比例，在肝炎患者中β/β基因型亦有富集，高于健康对照人群3.67倍，介于肝硬化及健康对照人群之间。其次，通过SAA1β/β纯合子基因型在乙肝型肝硬化预后诊断中的ROC曲线及单因素logistic回归和逐步logistic回归分析可见，在单独危险因素分析中，证实SAA1β/β纯合子基因型为乙肝转化为肝硬化的高度危险因素，比值比为17.92(p＜0.001)，与疾病具有高度关联，是乙肝型肝硬化的生物标志物。并且，SAA1β/β纯合子基因型在乙肝患者的肝硬化预后中具有最高的诊断价值(如图6，AUC＝0.898，p＜0.001)。而在多指标联合应用非侵入性诊断乙肝型肝硬化时，ROC曲线下面积可达0.932(P＜0.001)，特异性达97.01％，灵敏度达76.74％。因此，该几项指标可联合应用于非侵入性乙肝型肝硬化诊断。即当使用上述预测公式计算所得值大于等于cutoff值0.66时，乙肝患者则很可能已发展为肝硬化，并且该判定的特异性达97.01％，灵敏度达76.74％。 
本发明提出了SAA1β/β纯合子基因型可作为乙肝型肝硬化危险因子应用于肝硬化预后诊断；并可作为生物标记物应用于乙肝型肝硬化的诊断；SAA1β/β纯合子基因型适用于乙肝患者中肝硬化的易感人群或高危人群的筛查，从而实现对易感人群的早期预防，早期诊断，早期干预，进而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，提高患者的生活的质量。 
表10. 
实施例6 
本实施例提供了一种实时荧光定量等位基因特异性PCR检测试剂盒，用于检测基因组DNA人血清淀粉样蛋白A1(Serum Amyloid A，SAA1)SAA1等位基因SNP。 
本试剂盒可对人基因组中的SAA1基因的α、β、γ等位基因型进行鉴定检测，适用于人SAA1基因型的分型。 
试剂盒的组成包括： 
反应液试剂A：10×PCR缓冲液+A3套引物 
反应液试剂B：10×PCR缓冲液+B3套引物 
反应液试剂C：10×PCR缓冲液+A2套引物 
反应液试剂D：10×PCR缓冲液+B2套引物 
反应液试剂E：20×SYBR GREEN I荧光染料 
反应液试剂F：20×ROX荧光校正液 
反应液试剂G：pfu DNA聚合酶 
工作标准品1：含人SAA1α等位基因基因组DNA片段的质粒 
工作标准品2：含人SAA1β等位基因基因组DNA片段的质粒 
工作标准品3：含人SAA1γ等位基因基因组DNA片段的质粒 
试剂运输及储存条件：本试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。 
有效期：本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。 
利用本试剂盒采用荧光检测法对人基因组中的SAA1等位基因α、β、γ基因型进行鉴定检测，包括以下步骤： 
1、将抽提的人基因组DNA用核酸稀释缓冲液稀释到10ng/μL。 
2、各取2μL稀释的样品DNA，分别加入4个PCR反应管中。 
3、向上述4个PCR反应管中分别对应加入10μL反应液A、B、C、D。 
4、4个PCR反应管中分别加入1μL反应液E。 
5、4个PCR反应管中分别加入1μL反应液F。 
6、4个PCR反应管中分别加入8μL反应液G。 
7、依照上述同样方法分别处理阴性对照；工作标准品1；工作标准品2；工作标准品3。 
8、将以上制备好的反应液混匀，然后在5000rpm转速下离心3分钟。 
9、将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增反应。 
10、循环参数设定：95℃10min；95℃30秒；62℃31秒；72℃45秒；35个循环。 
采用该试剂盒对427例正常中国汉族人群和103例肝硬化患者的SAA1基因型进行了检测比较，检测结果如以上实施例所述。由此可见，本发明试剂盒不仅可用于正常人群中的SAA1基因型分布的检测，而且可用于SAA1基因型与疾病的相关性研究。例如在上述实施例中可见，在肝硬化患者中，相较于健康对照人群，SAA1β/β纯合子基因型所占比例显著升高，是肝硬化的危险因子。因此，采用本发明的试剂盒可对肝硬化的易感人群或高危人群进行筛查，从而实现对易感人群的早期预防、早期诊断、早期干预，进而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，提高患者的生活质量。 

Claims (1)

1.一种试剂盒，用于肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断中，其特征在于，包括以下：
基因组DNA稀释液
反应液试剂A：10×PCR缓冲液+A3套引物
反应液试剂B：10×PCR缓冲液+B3套引物
反应液试剂C：10×PCR缓冲液+A2套引物
反应液试剂D：10×PCR缓冲液+B2套引物
反应液试剂E：20×SYBR GREEN I荧光染料
反应液试剂F：20×ROX荧光校正液
反应液试剂G：pfu DNA聚合酶
以空质粒作为阴性对照
工作标准品1：含人SAA1α等位基因基因组DNA片段的质粒
工作标准品2：含人SAA1β等位基因基因组DNA片段的质粒
工作标准品3：含人SAA1γ等位基因基因组DNA片段的质粒；
其中，
1)A3套引物
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.2)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG；
2)A2套引物
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.3)为：TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA；
3)B3套引物
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.4)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG；
4)B2套引物
所述上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为：TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC；
所述下游引物5’-3’序列(Seq ID No.5)为：TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA；
其中，所述引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰。
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