CN101294222A - 用于检测血清淀粉状蛋白a1(saa1)的基因型的核苷酸引物组和核苷酸探针 - Google Patents
用于检测血清淀粉状蛋白a1(saa1)的基因型的核苷酸引物组和核苷酸探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于检测SAA1基因单核苷酸多态性C－13T、C2995T和T3010C的基因型的LAMP－扩增核苷酸引物组。还提供了用于检测以本发明的引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。还提供了通过使用本发明的引物组而检测SAA1基因单核苷酸多态性C－13T、C2995T和T3010C的基因型的方法。
Description
发明背景
本发明涉及用于检测血清淀粉状蛋白A1(SAA1)基因中单核苷酸多态性的基因型的核苷酸引物组和检测探针。
淀粉状蛋白病是涉及引起各个器官功能障碍的称作淀粉状蛋白的纤维状异常蛋白在体内累积的疾病。这是一种高死亡率疾病，对其没有已建立的基本疗法。近来的研究表明有可能通过检查血清淀粉状蛋白A1(SAA1)基因上游区中C-13T的多态性以及外显子3区中C2995T和T3010C的多态性而预测发生淀粉状蛋白病的倾向。还有可能通过确定SAA1基因的基因型而实施对相应患者制定的药物施用及治疗。
单核苷酸多态性通常通过用聚合酶链反应(PCR)方法扩增靶核苷酸并用特异性探针检测野生型扩增产物及变异型扩增产物而进行检测(见参考文献“Jain K.K.，Amplicip CYP450的应用，Mol Diagn.9，119-27(2005)”)。然而，PCR方法具有缺点，如包括核苷酸提取在内的复杂的预处理操作、需要复杂的温度调节装置如热循环仪以及2小时或更多小时的较长反应时间。PCR方法的扩增产物是双链，并且因此存在当互补链在检测期间作为探针的竞争物发挥作用时，互补链降低检测敏感性的问题。已经研究了将扩增产物转化成单链的多种方法，例如通过使用酶或磁珠使互补链分解或分离，但这些方法也有操作复杂和昂贵的问题。
发明简述
根据本发明的一个方面，提供了用于LAMP扩增的核苷酸引物组，其用于检测SAA1基因的单核苷酸多态性C-13T的基因型，其中当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且当存在这样的核苷酸引物时，其中所述的核苷酸引物包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物，其中该引物组包含：选自表2中所示引物组1-7中的FIP引物和BIP引物；与自靶核苷酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合的F3引物；和与自靶核苷酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合的B3引物。
表2中所示的引物组1-7是下列引物组：
引物组1：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.2的BIP引物，
引物组2：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.3的BIP引物，
引物组3：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.5的BIP引物，
引物组4：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.6的BIP引物，
引物组5：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.7的BIP引物，
引物组6：SEQ ID No.1的FIP引物和SEQ ID No.10的BIP引物，和
引物组7：SEQ ID No.13的FIP引物和SEQ ID No.3的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于LAMP扩增的核苷酸引物组，用于检测SAA1基因的单核苷酸多态性C2995T和/或T3010C的基因型，其中该引物组包含：选自表3中所示引物组1-4中的FIP引物和BIP引物；与自靶核苷酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合的F3引物；和与自靶核苷酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合的B3引物。
表3中所示的引物组1-4如下：
引物组1：SEQ ID No.19的FIP引物和SEQ ID No.20的BIP引物，
引物组2：SEQ ID No.21的FIP引物和SEQ ID No.20的BIP引物，
引物组3：SEQ ID No.22的FIP引物和SEQ ID No.20的BIP引物，和
引物组4：SEQ ID No.23的FIP引物和SEQ ID No.20的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了检测SAA1基因单核苷酸多态性C-13T、C2995T或T3010C的基因型的方法，包括步骤：通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸而得到扩增产物；并且测定和比较在扩增产物中含有的野生型扩增产物及变异型扩增产物的量。
本发明的另一个方面提供了用于检测由使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到的扩增产物的核苷酸探针，其包含：选自野生型核苷酸探针和变异型核苷酸探针的核苷酸探针。
在一个方面，野生型核苷酸探针是与野生型扩增产物互补的并具有Tm值63-77℃；变异型核苷酸探针是与变异型扩增产物互补的并具有Tm值63-74℃；并且单核苷酸多态性C-13T位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
在另一个方面，野生型核苷酸探针具有Tm值63-74℃；变异型核苷酸探针具有Tm值61-74℃；并且单核苷酸多态性C2995T位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
在又一个方面，野生型核苷酸探针具有Tm值55-70℃；变异型核苷酸探针具有Tm值55-71℃；并且单核苷酸多态性T3010C位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
本发明的另一个方面提供了用于同时检测SAA1基因的单核苷酸多态性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的方法。
本发明提供用于检测SAA1基因的单核苷酸多态性的基因型的核苷酸引物和检测探针。因此有可能容易地且有成本效率地检测SAA1基因单核苷酸多态性位点C-13T、C2995T和T3010C的基因型。
对附图的数个图的简要描述
图1是显示LAMP方法的示意图；
图2是显示LAMP方法的中间产物和内引物(FIP或BIP)的复性位点的示意性略图；
图3是显示环引物位置的示意图；
图4是显示LAMP方法的中间产物和环引物(LFc或LBc)复性位点的示意性略图；
图5是显示扩增产物的检测位置的示意图；
图6是固定有探针的支持物的一个实施方案的示意性平面图；
图7是固定有探针的支持物的一个实施方案的示意性平面图；
图8是显示BIP引物位置的示意图；
图9是通过使用引物组得到的扩增产物的电泳图谱；
图10显示包括非特异扩增产物在内的扩增产物的电泳图谱；
图11显示了说明通过使用检测C-13T的探针所得到试验结果1的图；
图12显示了说明通过使用检测C-13T的探针所得到试验结果2的图；
图13A显示了说明通过使用检测C-13T的探针所得到试验结果3(野生型)的图；
图13B显示了说明通过使用检测C-13T的探针所得到试验结果3(变异型)的图；
图13C显示了说明通过使用检测C-13T的探针所得到试验结果3(杂合型)的图；
图14显示了说明通过使用检测C2995T的探针所得到试验结果1的图；
图15显示了说明通过使用检测C2995T的探针所得到试验结果2的图；
图16显示了说明通过使用检测T3010C的探针所得到试验结果的图；和
图17显示了说明同时检测C-13T、C2995T和T3010C的结果的图。
发明详述
PCR方法已经经常用于单核苷酸多态性的检测，但是PCR方法具有上文所述的缺点。因此在本发明中，单核苷酸多态性通过替代PCR方法的环介导的等温扩增(LAMP)方法进行检测。在LAMP方法中，核苷酸在等温条件下在60-65℃扩增。LAMP方法具备有可能在更短时间内得到比PCR方法量更多的扩增产物的优点。还报道了该反应更少地受样品中杂质影响。因此有可能通过LAMP方法容易地扩增靶核苷酸。
在本发明的实施方案中，靶核苷酸通过LAMP方法扩增，并且分别确定野生型扩增产物和变异型扩增产物在所得扩增产物中的量。当存在许多野生型扩增产物时，可以判断受检测靶核苷酸的基因型是野生纯合型的(wild-type homo)。相反，当存在很多变异型扩增产物时，可以判断该靶核苷酸是变异纯合型的(variant homo)。备选地，当存在几乎相同量的野生型扩增产物与变异型扩增产物时，可以判断靶核苷酸是杂合型的。
扩增产物的量可以例如通过使用核苷酸探针予以确定。核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的一种核苷酸探针和与变异型扩增产物互补的一种核苷酸探针。允许扩增产物与分别的核苷酸探针相互杂交，并且确定与分别的核苷酸探针结合的扩增产物的量。有可能通过比较与野生型核苷酸探针结合的扩增产物的量和与变异型核苷酸探针结合的扩增产物的量而确定靶核苷酸的基因型。
<LAMP方法概述>
下文将简要描述LAMP方法。在本说明书中，接受单核苷酸多态性检测的核苷酸(包括基因组DNA等)将称作分析物核苷酸(analytenucleotide)。SAA1基因中由LAMP方法扩增的区域将称作靶核苷酸。通过LAMP方法得到的产物将称作扩增产物。含有人基因组DNA的溶液将称作样品溶液。
在LAMP方法中，靶核苷酸设定为从5’端依次具有F3区、F2区和F1区及从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区。靶核苷酸通过使用图1中所示的四种引物扩增。F1c、F2c、F3c、B1、B2和B3区是分别与F1、F2、F3、B1c、B2c和B3c对应的互补链区域。
在LAMP方法中用于扩增核苷酸的四种引物是(1)具有在3’端侧与F2区相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物；(2)具有与F3区序列相同的序列的F3引物；(3)具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物；和(4)具有与B3c区互补的序列的B3引物。通常，FIP和BIP引物叫做内引物，而F3和B3引物叫做外引物。
使用四种引物的LAMP扩增产生具有图2中所示哑铃结构的中间产物。FIP和BIP引物与单链环中的F2c区和B2c区结合，并且延伸反应从每种引物的3’端和中间产物自身的3’端进行。详见日本专利第3313358号。
在LAMP方法中，任选地有可能通过使用叫做环引物的引物缩短扩增时间。在这种情况下，如图3中所示，设定LF区处在F2区至F1区的区域中并且设定LBc区处在B2c区至B1c区的区域。这些区域叫做环引物区。除了四种引物外，使用具有与LF区互补的序列的环引物LFc和具有与LBc区相同的序列的环引物LBc。详见WO2002/024902。这些环引物LFc和LBc可以同时使用，或备选地仅使用它们中的一种。环引物与这样的环复性，其中所述的环不同于与FIT和BIP引物复性的环，如图4中所示，产生额外的合成起点并且因此促进扩增。
<LAMP扩增产物的检测；核苷酸探针>
对于检测单核苷酸多态性，待检测的多态性位点位于图5中所示的FP区或BPc区中。备选地，不同的多态性可以分别位于FP区和BPc区中。如图5中所示，从F2区至F1区的区域是扩增产物中变成单链的部分。与此类似，从B2c区至B1c区的区域也是扩增产物中变成单链的部分。有可能通过使待检测的多态性位点位于单链部分中而使得借助核苷酸探针的检测更容易。
设计核苷酸探针与含有多态性位点的FP区或BPc区结合。因此，核苷酸探针具有与在FP区或BPc区中的含有多态性位点的区域互补的序列。
与FP区互补的FPc区和与BPc区互补的BP区也存在于扩增产物中，因此，有可能使用FPc区和BP区用于检测。
在本说明书中，含有与野生型扩增产物的序列互补的序列的核苷酸探针叫做野生型核苷酸探针，而含有与变异型扩增产物的序列互补的序列的核苷酸探针叫做变异型核苷酸探针。
核苷酸探针可以由(但不限于)DNA、RNA、PNA、LNA、具有磷酸甲酯骨架的核苷酸或其它合成的核苷酸链组成。为了固定在支持物上，其末端可以用反应性官能团如氨基、羧基、羟基、巯基或磺酰基进行修饰。可以在官能团与核苷酸间导入间隔区。间隔区可以具有例如烷基骨架、乙二醇骨架等。
<固定有核苷酸探针的支持物>
核苷酸探针可以例如在其固定在支持物上时加以使用。固定有核苷酸探针的支持物可以在已知装置如所谓DNA芯片和DNA微阵列中使用。
固定有探针的支持物的实施方案在图6中显示。探针固定在支持物1的固定区2内。支持物1可以用硅基材制备，但是不限于此。探针可以通过任意的已知方法进行固定。可以在支持物上仅固定一种探针，或在支持物上固定不同种类的探针，探针的位置和数目可以根据需要由本领域技术人员调节。如下文描述，本实施方案的固定有探针的支持物可以用于探针的荧光检测。
另一个实施方案中的固定有探针的支持物的示意图在图7中显示。在该实施方案中，电极12在支持物11上形成。探针固定在电极12上。每个电极12与提取电信息的垫片13连接。支持物11可以例如从硅基材中制备，但是不限于此。电极的产生和探针的固定可以通过任意的已知方法进行。电极可以由任何材料制成，其中所述材料包括但不限于单种金属如金、金合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓和钨、其合金、碳如石墨和玻璃化炭黑及其氧化物或化合物。
图7中所示的固定支持物具有10个电极，但是在单种支持物上所形成电极的数目不限于此并且可以任选地进行调整。电极的位置模式也不限于该图中显示的模式，并且可以根据需要由本领域技术人员调节。参考电极和对电极可以根据需要在支持物1上形成。如下文描述，根据该实施方案的固定有探针的支持物可以用于电化学检测。
<核苷酸探针与扩增产物的杂交>
扩增产物在合适条件下与核苷酸探针杂交。合适条件根据扩增产物的种类和结构、待检测序列中所含核苷酸的种类以及核苷酸探针的种类变化。具体而言，杂交在离子强度0.01-5以及pH 5-10的缓冲液中进行。作为杂交促进剂的硫酸葡聚糖、鲑精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性剂等可以添加至反应液中。反应温度是例如10-90℃，并且可以搅拌或振摇反应混合物以改善反应效率。在反应后，缓冲液，例如具有离子强度0.01-5和pH 5-10的缓冲液，可以用于洗涤。
<检测方法>
在固定在支持物上的探针与扩增产物间的杂交产生双链核苷酸。双链核苷酸可以以电化学方式或通过荧光加以检测。
(a)电流检测系统
双链核苷酸的电化学检测将描述如下。该方法使用特异性地识别双链核苷酸的双链识别性化合物。双链识别性化合物的实例包括，但不限于Hoechst 33258、吖啶橙、喹吖因、道诺霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂如双吖啶、三嵌入剂和聚嵌入剂。这些物质可以用电化学活性的金属络合物如二茂铁或viologen进行修饰。
双链识别性化合物的浓度可以根据该化合物种类变化，但通常它以1ng/mL-1mg/mL浓度使用。此时，优选地使用离子强度0.001-5和pH 5-10的缓冲液。
双链识别性化合物在杂交反应期间或之后添加至反应液中。若杂交形成双链核苷酸，则双链识别性化合物与双链核苷酸结合。例如，有可能通过施加这样的电势而测定源自双链识别性化合物的反应电流，其中所述电势比引起双链识别性化合物的电化学反应的电势高。此时可以恒定速率施加电势，或以脉冲形状或以恒定电压施加。电流和电压可以在测定期间通过使用一种设备如恒电位仪、数字式多量程测定仪表或函数发生器加以控制。例如，优选使用在JP-A 10-146183(KOKAI)中公开的已知电化学检测方法。
(b)荧光检测方法
通过荧光检测双链核苷酸的方法将描述如下。引物事先用荧光活性物质标记。备选地，以经荧光活性物质标记的第二探针进行检测。可以使用带多重标记的第二探针。荧光活性物质的实例包括，但不限于荧光色料如FITC、Cy3、Cy5和罗丹明。荧光材料例如用荧光检测仪检测。适用于标记物种类的检测仪用来检测标记的待检测序列或第二探针。
<核苷酸引物的选择>
图8是显示核苷酸引物的示意图，此时单核苷酸多态性C-13T位于B1c与B2c之间的区域即BPc区域中。FIP引物具有如B1c区那样的相同序列以及与F2区序列互补的序列。可以设计多种引物，只要B2c区和B1c区处在它们之间包含C-13T的位置。
然而，本发明人的研究已经揭示LAMP方法的扩增效率根据引物的种类而变化。例如，扩增通过使用图8中所示四种引物中的一种引物以及共有的3种引物(BIP、F3和B3引物)进行。作为结果，用引物1的样品甚至在足够长的时间后(例如2小时后)未得到扩增。用引物2的样品在约1小时后得到扩增，但是引物的非特异扩增发生。用引物3的样品未引起引物的非特异扩增，但是需要扩增时间1.5-2小时。用引物4的样品没有引起引物的非特异扩增并且在1小时内完成扩增。在这种情况下，优选用于扩增的引物是引物3和4，并且最佳引物是引物4。正是极优异引物在扩增效率上才较高，在短时间期间允许扩增，并且不引起非特异扩增。
对于用核苷酸探针检测扩增产物，扩增产物优选地以高效率与核苷酸探针杂交。因此，扩增产物的杂交效率也在评价引物时进行考虑。
此外，人SAA1基因是与人SAA2、SAA3和SAA4基因高度同源的。因此为了SAA1的特异性扩增，用于内引物的任何一个或多个区域即F2、F1、B1c和B2c区应当设计位于其中SAA1基因序列与上述三种基因序列不同的区域中。此外，内引物、外引物和环引物优选地不位于其中报道有突变的位点处。若引物不得不在突变位置中任选地进行设计，则优选导入混合碱基或通用碱基如脱氧肌苷(dI)。
内部无单核苷酸多态性的另一种内引物优选地位于这样的区域中，该区域具有从F2至B2的450bp或更少、更优选350bp或更少的长度。此外，优选地设计两种内引物以产生100bp或更少、更优选70bp或更少的单链环长度。
引物之间的非特异扩增是在LAMP反应中经常存在的现象。含有F1c区和F2区的FIP引物经常是长链核苷酸。类似地，含有B1c区和B2区的BIP引物经常是长链核苷酸。因此，在FIP引物间、BIP引物间、或FIP引物与BIP引物可能相互绞缠，经常导致其中引物作为模板的扩增。非特异性反应的可能性在LAMP反应中比在PCR反应中更高，因为反应液含有F3引物和B3引物并且在一些情况下还含有LFc引物和LBc引物。这种非特异性反应导致想要的LAMP产物的量减少，其中所述想要的LAMP产物通过使用分析物核苷酸作为模板得到。
若非特异性反应在不含有添加的分析物核苷酸的阴性对照反应液中出现，则不可能确定随扩增进行而释放的焦磷酸与Mg的白色沉淀是否由非特异扩增或由污染引起。因此，重要的是消除可能引起非特异扩增的引物。
因此，本发明人已经实施试验以选择最优选用于扩增SAA1基因的单核苷酸多态性C-13T的核苷酸引物，以及也最优选用于扩增单核苷酸多态性C2995T和T3010C的核苷酸引物。
[试验1：用于C-13T的引物]
扩增反应通过使用含有在FP区中的SAA1 C-13T多态性位点的12种核苷酸引物组在63℃进行1小时或2小时。反应液的组分在表1中显示。所用模板DNA是人基因组。为检验污染及非特异扩增的存在或不存在，在全部引物组中制备含有替代人基因组的灭菌超纯水的阴性对照。在扩增反应后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所用的核苷酸引物组在表2中显示。
表1 LAMP反应组分
Bst DNA聚合酶 1μl
2×缓冲液 12.5μL
Tris·HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
吐温20 0.2％
甜菜碱 1.6M
dNTP 2.8mM
F3引物(10μM) 0.5μL
B3引物(10μM) 0.5μL
FIP引物(40μM) 1μL
BIP引物(40μM) 1μL
LFc引物(20μM) 1μL
人基因组(30ng/μL) 1μL
灭菌超纯水 6.5μL
总计 25μL
F3引物具有用于引物组1-6和8-10的SEQ ID No.14的序列，具有用于引物组11和12的SEQ ID No.15的序列，以及具有用于引物组7的SEQID No.16的序列。B3引物具有用于引物组1-5、7、8、11和12的SEQ IDNo.17的序列，以及具有用于引物组6、9和10的SEQ ID No.18的序列。
[试验1：结果]
将通过使用表2中所示12种引物组得到的扩增产物进行电泳。结果总结于图9中。用引物组9，在扩增2小时后未得到扩增产物。用引物组5，在反应1小时后不存在扩增产物，但是充足量的扩增产物在反应2小时后得到。用引物组2，充足量的扩增产物在扩增1小时后得到。相似试验用其它引物组实施。作为结果，在1小时扩增后，充足量的扩增产物用引物组1、2、3、4和6得到。在2小时扩增后，充足量的扩增产物用引物组1、2、3、4、5、6、7和8得到。用引物组9、10、11和12，存在很少的扩增产物或扩增得不到证实。如图10中所示，非特异扩增随引物组8出现。上述结果表明引物组1、2、3、4、5、6和7是优选的，并且最优选引物组1、2、3、4和6。结果在表2中总结。
[试验2：用于C2995T和T3010C的引物]
在检测邻近的单核苷酸多态性如C2995T和T3010中，有可能在同一单链环区中安置两种单核苷酸多态性。因此，有可能用单个扩增产物检测两种单核苷酸多态性，与分别制备两种扩增产物的情况相比，这简化检测方法并降低其成本。
扩增反应通过使用含有在FP和FPc区中的SAA1 C2995T和T3010C多态性位点的4种核苷酸引物组在63℃进行1小时或2小时。反应液的组分在表1中显示。所用模板DNA是人基因组。为检验污染及非特异扩增的存在或不存在，在全部引物组中制备含有替代人基因组的灭菌超纯水的阴性对照。在扩增反应后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所用的核苷酸引物组在表3中显示。
F3引物具有SEQ ID No.24的序列，并且B3引物具有SEQ ID No.25的序列；而且这两种引物共同在全部引物组中使用。
[试验2：结果]
将通过使用表3中所示的4种引物组得到的扩增产物进行电泳。在扩增1小时后，全部引物组产生充足量的扩增产物。类似地，在扩增后2小时，全部引物组产生充足量的扩增产物。在任意引物组中均未观察到非特异扩增。上述结果表明引物组1、2、3和4是优选的。结果在表3中总结。
由本发明提供的优选内引物通过以上试验确定。如对本领域技术人员显而易见的是在LAMP反应中最重要的引物是内引物。内引物对该扩增反应是必需的，而外引物和环引物则否。添加外引物和环引物至扩增反应液可以导致扩增效率的增加，但是所述引物的位置变化比内引物的位置变化对扩增效率影响小。因此，外引物(F3和B3引物)可以任选地进行设计。例如，外引物优选地位于自F2区的5’端起60个碱基范围内的区域和自B2c区的3’端起60个碱基范围内的区域中。因此，具有如F3引物那样的相同序列的F3区优选地位于自F2区的5’端起60个碱基范围内的区域中，并且具有与B3引物互补的序列的B3c区优选地位于自B2c区的3’端起60个碱基范围内的区域中。优选设计环引物以与结合内引物的环不同的环结合，并且该环引物不位于内引物区内。
<核苷酸探针的选择>
核苷酸探针链既不太长，也不过短。通常，链长度的增加引起结合力增加，尽管结合力根据碱基种类存在一些差异。核苷酸探针的过小链长度导致核苷酸探针与扩增产物间的杂交效率变低。另一方面，核苷酸探针的过长链长度导致野生型核苷酸探针与变异型核苷酸探针间的单碱基差异减少。因此，野生型扩增产物与变异型核苷酸探针间的非特异性键合增加以及变异型扩增产物与野生型核苷酸探针间的非特异性键合也增加。因此，优选使用具有适宜链长度(例如10-35个碱基)的核苷酸探针用于单核苷酸多态性的检测。
结合力可以由双链核苷酸的解链温度Tm显示。Tm值例如通过最近相邻方法(nearest neighbor method)、Wallance方法或GC％方法计算。在本发明中，使用最近相邻方法(Breslauer等，Proc.Natl.Acad.Sct.USA，第83卷，第3746-3750页，1986年7月；Freier等，Proc.Natl.Acad.Sct.USA，第83卷，第9373-9377页，1986年12月；Schildkraut等，BIOPOLYMERS，第3卷，第195-208页，1965年)。在本发明中，Tm值在Na+浓度50mM和核苷酸探针(寡核苷酸)浓度0.5μM的条件下计算。
在下文将描述用于选择适用于检测根据本发明所得到扩增产物的核苷酸探针的试验。
[试验3-1：用于检测C-13T的探针]
LAMP扩增通过使用人基因组作为模板以及还使用用于检测C-13T的引物组2在63℃进行1小时，其中所述的人基因组由聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析确定是杂合型的。用于检测C-13T的引物组2是在以上试验1中确定为最佳引物的引物组。所得的扩增产物在电流检测DNA芯片上进行检测。
核苷酸探针：
所测试核苷酸探针的核苷酸序列在表4中总结。所用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’端受巯基修饰以固定在电极上。阴性对照探针是具有与SAA1基因完全不相关的序列的核苷酸。
固定有核苷酸探针的支持物：
在DNA芯片上制备金电极，并且将核苷酸探针固定在金电极上。固定通过使用巯基与金之间的强键合力而进行。将含有带巯基修饰末端的核苷酸探针的探针溶液点样在金电极上，并且在1小时后，将DNA芯片浸泡在1mM巯基己醇溶液中，并且随后用0.2×SSC溶液洗。相同探针在两个电极上点样。在洗涤后，将芯片用超纯水洗涤并经空气干燥以产生固定有核苷酸探针的支持物。
核苷酸探针分别固定在下列电极上：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.26)，
电极3-4：野生型核苷酸探针14mer(SEQ ID No.27)，
电极5-6：野生型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.28)，
电极7-8：野生型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.29)，
电极9-10：野生型核苷酸探针18mer(SEQ ID No.30)，
电极11-12：野生型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.31)，
电极13-14：变异型核苷酸探针15mer(SEQ ID No.32)，
电极15-16：变异型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.33)，
电极17-18：变异型核苷酸探针18mer(SEQ ID No.34)，
电极19-20：变异型核苷酸探针19mer(SEQ ID No.35)，和
电极21-22：变异型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.36)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及对杂交的检测：
向通过扩增得到的扩增产物添加盐，终浓度是2×SSC，并且使混合物与固定在电极上的核苷酸探针杂交。反应温度是35、45、50、55和60℃，并且反应时间是60分钟。随后，DNA芯片温和地用超纯水洗涤。DNA芯片在含有50μM嵌入剂Hoechst 33258的磷酸盐缓冲液中浸泡10分钟并进行洗涤，并且随后测定Hoechst 33258分子的氧化性电流应答。
[试验3-1：结果]
结果在图11中总结。信号随反应温度增加而增加，表明反应温度的增加引起杂交效率的增加。在反应温度55℃和60℃的试验产生几乎相同的结果。
[试验3-2：用于检测C-13T的探针]
随后，杂交以与试验3-1相似的方式进行，除了反应温度是55℃并且反应时间是10、20、40、60和120分钟之外。
[试验3-2：结果]
结果在图12中总结。在反应时间10分钟和120分钟上的试验产生几乎相同的结果，表明杂交反应在10分钟后已经处于饱和状态。
链长度相对较短的野生型核苷酸探针(14C：SEQ ID No.27)和变异型核苷酸探针(15T：SEQ ID No.32)产生强度相对较弱的信号。野生型核苷酸探针(16C：SEQ ID No.28、17C：SEQ ID No.29、18C：SEQ ID No.30、和20C：SEQ ID No.31)和变异型核苷酸探针(17T：SEQ ID No.33、18T：SEQID No.34、19T：SEQ ID No.35、和20T：SEQ ID No.36)产生强度几乎相同的信号。
[试验3-3：用于检测C-13T的探针]
随后，杂交以与试验3-1相似的方式在反应温度55℃上进行20分钟。随后，将固定有核苷酸探针的支持物在40、45或50℃于0.2×SSC洗涤缓冲液中浸泡20分钟。本试验中用于扩增的分析物核苷酸是3种人基因组，其由PCR-RFLP分析确定分别是野生纯合型、变异纯合型和杂合型的。
[试验3-3：结果]
结果在图13A-13C中总结，在DNA芯片未进行洗涤(仅用超纯水温和地洗涤)时，存在由变异型核苷酸探针检测到的野生型扩增产物并且还存在由野生型核苷酸探针检测到的变异型扩增产物，表明存在非特异性杂交。在洗涤温度40℃时的结果几乎与未洗涤的那些结果相同。
在洗涤温度45℃时，野生型扩增产物由野生型核苷酸探针(16C、17C和18C)以高信号强度检测到，但是几乎没有信号由变异型核苷酸探针(17T、18T和19T)检测到。类似地，变异型扩增产物由变异型核苷酸探针(17T、18T和19T)以高信号强度检测到，但是野生型核苷酸探针(16C、17C和18C)几乎没有检测到信号，表明由非特异性杂交形成的键通过在45℃洗涤受到破坏。备选地，杂合型扩增产物均由野生型核苷酸探针(16C、17C和18C)和变异型核苷酸探针(17T、18T和19T)以高信号强度检测到。
在洗涤温度50℃时，检测到的电流较低，表明扩增产物通过洗涤而与核苷酸探针分开。在洗涤温度50℃时，若扩增产物是野生型，虽然由野生型核苷酸探针产生的信号下降，但是由变异型核苷酸探针(20T)产生的信号仍是高的。类似地，如果扩增产物是变异型，虽然由变异型核苷酸探针产生的信号下降，但由野生型核苷酸探针(20C)产生的信号仍是高的，表明尽管特异性信号减少，但是仍存在一些非特异性结合。
结果显示野生型核苷酸探针(16C、17C和18C)和变异型核苷酸探针(17T、18T和19T)产生了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(16C：SEQ ID No.28、17C：SEQ IDNo.29、和18C：SEQ ID No.30)和变异型核苷酸探针(17T：SEQ ID No.33、18T：SEQ ID No.34、和19T：SEQ ID No.35)。
试验中所用核苷酸探针的Tm值也在表4中总结。如从表4中显而易见，本发明中优选使用的核苷酸探针是具有Tm值63-77℃、优选70-74℃的野生型核苷酸探针和具有Tm值63-74℃、优选68-74℃的变异型核苷酸探针。
[试验4-1：用于检测C2995T的探针]
LAMP扩增通过使用人基因组作为模板以及还使用用于检测C2995T和T3010C的引物组3在63℃进行1小时，其中所述的人基因组由PCR-RFLP分析确定是杂合型。用于检测C2995T和T3010C的引物组3是在以上试验2中确定为最佳的引物组。所得的扩增产物在电流检测DNA芯片上进行检测。
核苷酸探针：
测试的核苷酸探针的核苷酸序列总结在表5中。所用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’端受巯基修饰以固定在电极上。阴性对照探针是具有与SAA1基因序列完全不相关的序列的核苷酸。
固定有核苷酸探针的支持物：
固定有核苷酸探针的支持物以与试验3-1相似的方式进行制备。
核苷酸探针分别固定在下列电极上：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.26)，
电极3-4：野生型核苷酸探针13mer(SEQ ID No.37)，
电极5-6：野生型核苷酸探针14mer(SEQ ID No.38)，
电极7-8：野生型核苷酸探针15mer(SEQ ID No.39)，
电极9-10：野生型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.40)，
电极11-12：野生型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.41)，
电极13-14：变异型核苷酸探针14mer(SEQ ID No.42)，
电极15-16：变异型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.43)，
电极17-18：变异型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.44)，
电极19-20：变异型核苷酸探针18mer(SEQ ID No.45)，和
电极21-22：变异型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.46)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及对杂交的检测：
向通过扩增得到的扩增产物添加盐，终浓度是2×SSC，并且使混合物与固定在电极上的核苷酸探针杂交。反应温度是35、45、50、55和60℃，并且反应时间是20分钟。随后，DNA芯片温和地用超纯水洗涤。DNA芯片在含有50μM嵌入剂Hoechst 33258的磷酸盐缓冲液中浸泡10分钟并进行洗涤，并且随后测定Hoechst 33258分子的氧化性电流应答。
[试验4-1：结果]
结果在图14中总结。信号随反应温度增加而增加，表明反应温度的增加引起杂交效率的增加。在反应温度55℃和60℃的试验产生几乎相同的结果。
[试验4-2：用于检测C2995T的探针]
随后，使用用引物组3扩增的产物进行杂交，杂交以与试验3-3相似的方式在反应温度55℃进行20分钟。随后，将固定有核苷酸探针的支持物在45℃于0.2×SSC洗涤缓冲液中浸泡20分钟洗涤。本试验中用于扩增的分析物核苷酸是3种人基因组，其由PCR-RFLP分析确定分别是野生纯合型、变异纯合型和杂合型。本试验中所用的核苷酸探针和检测方法与用于试验4-1的那些核苷酸探针和检测方法是相同的。
[试验4-2：结果]
结果在图15中总结。野生型扩增产物由野生型核苷酸探针(14C、15C和16C)以高信号强度检测到，而几乎没有信号由变异型核苷酸探针(16T、17T和18T)检测到。类似地，变异型扩增产物由变异型核苷酸探针(16T、17T和18T)以高信号强度检测到，而野生型核苷酸探针(14C、15C和16C)几乎没有检测到信号。此外，杂合型扩增产物均由野生型核苷酸探针(14C、15C和16C)和变异型核苷酸探针(16T、17T和18T)以高信号强度检测到。
结果显示野生型核苷酸探针(14C、15C和16C)和变异型核苷酸探针(16T、17T和18T)产生了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(14C：SEQ ID No.38、15C：SEQ IDNo.39、和16C：SEQ ID No.40)和变异型核苷酸探针(16T：SEQ ID No.43、17T：SEQ ID No.44、和18T：SEQ ID No.45)。
试验中所用核苷酸探针的Tm值也在表5中总结。如从表5中显而易见，本发明中优选使用的核苷酸探针是具有Tm值63-74℃、优选67-71℃的野生型核苷酸探针和具有Tm值61-74℃、优选66-70℃的变异型核苷酸探针。
[试验5：用于检测T3010C的探针]
LAMP扩增通过使用人基因组作为模板以及还使用用于检测C2995T和T3010C的引物组3在63℃进行1小时，其中所述的人基因组由PCR-RFLP分析确定是野生纯合型、变异纯合型和杂合型。用于检测C2995T和T3010C的引物组3是在以上试验2中确定为最佳的引物组。所得的扩增产物在电流检测DNA芯片上进行检测。
核苷酸探针：
测试的核苷酸探针的核苷酸序列在表6中总结。所用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’端受巯基修饰以固定在电极上。阴性对照探针是具有与SAA1基因序列完全不相关的序列的核苷酸。
固定有核苷酸探针的支持物：
固定有核苷酸探针的支持物以与试验3-1相似的方式进行制备。
核苷酸探针分别固定在下列电极上：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.26)，
电极3-4：野生型核苷酸探针19mer(SEQ ID No.47)，
电极5-6：野生型核苷酸探针21mer(SEQ ID No.48)，
电极7-8：野生型核苷酸探针22mer(SEQ ID No.49)，
电极9-10：野生型核苷酸探针23mer(SEQ ID No.50)，
电极11-12：野生型核苷酸探针26mer(SEQ ID No.51)，
电极13-14：变异型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.52)，
电极15-16：变异型核苷酸探针19mer(SEQ ID No.53)，
电极17-18：变异型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.54)，
电极19-20：变异型核苷酸探针21mer(SEQ ID No.55)，
电极21-22：变异型核苷酸探针22mer(SEQ ID No.56)，和
电极23-24：变异型核苷酸探针25mer(SEQ ID No.57)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及对杂交的检测：
向通过扩增得到的扩增产物添加盐，终浓度是2×SSC，并且使混合物与固定在电极上的核苷酸探针杂交。反应温度是55℃，并且反应时间是20分钟。随后，该芯片在45℃洗涤20分钟。电极在含有50μM嵌入剂Hoechst33258的磷酸盐缓冲液中浸泡10分钟并进行洗涤，并且随后测定Hoechst33258分子的氧化性电流应答。
[试验5：结果]
结果在图16中总结。用于检测野生型的核苷酸探针(21T、22T和23T)和用于检测变异型的核苷酸探针(19C、20C、21C和22C)显示理想的检测模式。野生型扩增产物由野生型核苷酸探针(21T、22T和23T)以高的信号增加而检测到，在变异型核苷酸探针(19C、20C、21C和22C)的情况下，由于非特异性杂交受到破坏，几乎没有检测到信号增加。类似地，变异型扩增产物由变异型核苷酸探针(19C、20C、21C和22C)以高的信号增加被检测到，在野生型核苷酸探针(21T、22T和23T)的情况下，由于非特异性杂交受到破坏，几乎没有检测到信号增加。此外，杂合型扩增产物均由野生型核苷酸探针(21T、22T和23T)和变异型核苷酸探针(19C、20C、21C和22C)以高的信号增加被检测到。
结果显示根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针s(21T：SEQ ID No.48、22T：SEQ ID No.49、和23T：SEQ ID No.50)以及变异型核苷酸探针(19C：SEQ ID No.53、20C：SEQ ID No.54、21C：SEQID No.55、和22C：SEQ ID No.56)。
试验中所用核苷酸探针的Tm值也在表6中总结。如从表6中的结果显而易见，本发明中优选使用的核苷酸探针是具有Tm值55-70℃、优选59-64℃的野生型核苷酸探针和具有Tm值55-71℃、优选60-67℃的变异型核苷酸探针。
<分析物样品>
对接受本发明处理的分析物样品不作具体限制，并且可以例如是人血液、血清、白细胞、发根或口粘膜。核苷酸成分从分析物样品提取，以便制备用于进行检测靶核苷酸试验的样品溶液。对提取方法不作具体限制，并且例如可商业获得的核苷酸提取工具如QIAamp(由QIAGEN制造)或Sumai试验(Sumitomo Metal Industries，Ltd.)可以使用。
<试剂盒>
本发明的另一方面提供了试剂盒，包括上文对LAMP方法所述的在本发明检测方法中使用的引物组。试剂盒可以任选地含有例如链置换性DNA聚合酶、合成底物和缓冲液。
在另一方面，本发明提供了用于检测以本发明引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。本发明还提供了固定有核苷酸探针的支持物，其中本发明的核苷酸探针在所述支持物上固定。优选地将DNA芯片或DNA微阵列提供作为固定有探针的支持物。
本发明的试剂盒也可以额外地包括核苷酸探针或固定有核苷酸探针的支持物。
在本发明的另一个方面，提供了同时检测SAA1的单核苷酸多态性C-13T、C2995T和T3010C的方法。在这个方面，C-13T、C2995T和T3010C如上所述分别进行扩增，并且随后混合扩增产物以制备液体混合物。液体混合物如上文所述进行检测。在这个方面，有可能同时检测到C-13T、C2995T和T3010C的基因型。
实施例
[C-13T、C2995T和T3010C的同时检测]
进行了用于同时检测C-13T、C2995T和T3010C的试验。人基因组通过使用用于检测C-13T的核苷酸引物组2(试验1)和用于检测C2995T和T3010C的核苷酸引物组3(试验2)在63℃持续1小时分别进行扩增。所用的人基因组是由PCR-RFLP分析确定分别是野生纯合型、变异纯合型和杂合型这3种人基因组。在扩增反应后，混合两种扩增产物以制备混合的反应液。
<通过导入环引物而缩短扩增时间>
向用于在25μl反应液中检测C-13T的核苷酸引物组2添加40pmolSEQ ID No.58的LFc环引物。向用于在25μl反应液中检测C2995T和T3010C的核苷酸引物组3添加40pmol SEQ ID No.59的LBc环引物。随后，分别扩增混合物。作为结果，达到饱和所需要的扩增时间在这两种情况下从60分钟缩短至约30分钟。将用于C-13T检测的LAMP扩增产物和用于检测C2995T和T3010C的LAMP扩增产物混合，并且对混合物开展C-13T、C2995T和T3010C的同时检测。
核苷酸探针：
将混合的反应液用C-13T的核苷酸探针、C2995的核苷酸探针和T3010C的核苷酸探针进行检测。
核苷酸探针如下：
C-13T野生型核苷酸探针(SEQ ID No.28)，变异型核苷酸探针SEQ IDNo.33)；
C2995T野生型核苷酸探针(SEQ ID No.38)，变异型核苷酸探针(SEQID No.43)；和
T3010C野生型核苷酸探针(SEQ ID No.50)，变异型核苷酸探针(SEQID No.55)。
用于C-13T和C2995T的核苷酸探针是正链探针，而用于T3010C的核苷酸探针是负链探针。全部核苷酸探针的3’端是经巯基修饰的。
固定有探针核苷酸的电极的制备：
固定有探针核苷酸的电极以与上文试验3-1相似的方法进行制备。
核苷酸探针分别固定在下列电极上：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.26)，
电极3-4：C-13T野生型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.28)，
电极5-6：C-13T变异型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.33)，
电极7-8：C2995T野生型核苷酸探针14mer(SEQ ID No.38)，
电极9-10：C2995T变异型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.43)，
电极11-12：T3010C变异型核苷酸探针23mer(SEQ ID No.50)，和
电极13-14：T3010C变异型核苷酸探针21mer(SEQ ID No.55)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及对杂交的检测：
杂交以类似于试验3的方式在55℃进行20分钟并45℃清洗20分钟，并且随后，将DNA芯片用超纯水温和地清洗。电极在含有50μM的Hoechst33258作为嵌入剂的磷酸盐缓冲液中浸泡10分钟并且随后测定Hoechst33258分子的氧化性电流应答。
[结果]
结果在图17中总结。对C-13T、C2995T和T3010C观察到理想的检测模式。结果显示有可能使用DNA芯片同时检测C-13T、C2995T和T3010C。
其它的优点和修改对本领域技术人员而言是易于产生的。因此，本发明在其更广泛的方面不限于本文中显示和描述的具体细节及代表性实施方案。因此，可以做出多种修改而不脱离如由所附加权利要求书及其等效物定义的一般发明性概念的精神和范围。
序列表
<110>株式会社 东芝
<120>用于检测血清淀粉状蛋白A1(SAA1)的基因型的核苷酸引物组和核苷酸探针
<130>07S1161
<140>
<141>
<150>JP 2007-117346
<151>2007-04-26
<160>59
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-1引物
<400>1
cagtggtttc ttcatcccgc aggcacatct tgttccctc 39
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-1引物
<400>2
ggaaggctca gtataaatag catagctgag ctgcgggtcc ct 42
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-2引物
<400>3
ggaaggctca gtataaatag cagtgctgta gctgagctgc gg 42
<210>4
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-3引物
<400>4
ggaaggctca gtataaatag caacctgatc tgtgctgtag ctg 43
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-4引物
<400>5
ggaaggctca gtataaattg tagctgagct gcgggtcc 38
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-5引物
<400>6
ggaaggctca gtataaatgt gctgtagctg agctgcgg 38
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-6引物
<400>7
ggaaggctca gtataaatac ctgatctgtg ctgtagctg 39
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-7引物
<400>8
ggaaggctca gtataaatag cactcctcac ctgatctgtg c 41
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-8引物
<400>9
ggaaggctca gtataaatag cacttggtgt gctcctcacc 40
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-9引物
<400>10
ggaaggctca gtataaatag caaaaatcac tccttggtgt gc 42
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-2引物
<400>11
ctgtcagggc aggagacctc cgcagcctca gc 32
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-3引物
<400>12
gctgtcaggg caggagaccc cgcagcctca gcc 33
<210>13
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-4引物
<400>13
ctgcaggtca tttcccctac atccaggaac ttgtcttaga ccgt 44
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F3-1引物
<400>14
gtctcctgcc ctgacagc 18
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F3-2引物
<400>15
tcaggagctg gcttcaaag 19
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<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F3-3引物
<400>16
caggcacatc ttgttccctc 20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>B3-1引物
<400>17
actccttggt gtgctcctc 19
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>B3-2引物
<400>18
aatgataatc ttgttgggaa agag 24
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-1引物
<400>19
cgtcccagga gctctgctcg ggggaactat ga 32
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BIP-1引物
<400>20
ctgttcatcc agcctagggg gatgaaaaca ctgggcacc 39
<210>21
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-2引物
<400>21
cgtcccagga gctcctgctc gggggaacta tga 33
<210>22
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-3引物
<400>22
cgtcccagga gctcagggga cctggggg 28
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FIP-4引物
<400>23
cgtcccagga gctccagggg acctggggg 29
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F3引物
<400>24
ccaattacat cggctcagac 20
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>B3引物
<400>25
tgagcaatag cccaccc 17
<210>26
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>阴性对照探针
<400>26
gtgctgcagg tgcg 14
<210>27
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<223>C-13T野生型探针
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<223>C2995T野生型探针
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<223>C2995T变异型探针
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ctgggggtgt ctgggc 16
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<223>C2995T变异型探针
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cctgggggtg tctgggc 17
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ggacctgggg gtgtctgggc 20
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<223>T3010C野生型探针
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<223>T3010C野生型探针
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cagttacctg atcacttctg c 21
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<212>DNA
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<223>T3010C野生型探针
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ccagttacct gatcacttct gc 22
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<212>DNA
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<223>T3010C野生型探针
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tccagttacc tgatcacttc tgc 23
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<223>T3010C野生型探针
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tccagttacc tgatcacttc tgcrgc 26
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<223>T3010C变异型探针
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ttacctgatc gcttctg 17
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<220>
<223>T3010C变异型探针
<400>53
gttacctgat cgcttctgc 19
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<211>20
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<213>人工的
<220>
<223>T3010C变异型探针
<400>54
agttacctga tcgcttctgc 20
<210>55
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T3010C变异型探针
<400>55
cagttacctg atcgcttctgc 21
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T3010C变异型探针
<400>56
ccagttacct gatcgcttct gc 22
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<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T3010C变异型探针
<400>57
tccagttacc tgatcgcttc tgcrg 25
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<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>LFc引物
<400>58
gtcatttatc ccagttgtgc aacc 24
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>LBc引物
<400>59
agcctggctg aatggg 16
Claims (31)
1.用于LAMP扩增的核苷酸引物组，其用于检测SAA1基因单核苷酸多态性C-13T的基因型，其特征在于
当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区及从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当存在这样的核苷酸引物时，其中所述的核苷酸引物包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物，
引物组包含：
选自表2中所示引物组1-7中的FIP引物和BIP引物；
与自靶核酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合的F3引物；和
与自靶核酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合的B3引物。
2.根据权利要求1所述的核苷酸引物组，其特征在于FIP和BIP引物选自表2中所示的引物组1、2、3、4和6。
3.根据权利要求1所述的核苷酸引物组，其特征在于FIP和BIP引物是表2中所示引物组2的引物。
4.检测SAA1基因单核苷酸多态性C-13T的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求1所述的核苷酸引物组扩增靶核酸而获得扩增产物；和
测定并比较在扩增产物中含有的野生型扩增产物和变异型扩增产物的量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于
通过固定在支持物(1，11)上的核苷酸探针与扩增产物的杂交及随后确定与核苷酸探针结合的扩增产物的量来测定扩增产物，并且
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与变异型扩增产物互补的变异型核苷酸探针。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值63-77℃，变异型核苷酸探针具有Tm值63-74℃，并且单核苷酸多态性C-13T位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值70-74℃并且变异型核苷酸探针具有Tm值68-74℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.28、29或30的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.33、34或35的序列或与其互补的序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.28的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQID No.33的序列或与其互补的序列。
10.用于从扩增产物中检测SAA1基因单核苷酸多态性C-13T的基因型的核苷酸探针，所述的扩增产物通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸而得到，
所述核苷酸探针的特征在于包含：
选自野生型核苷酸探针和变异型核苷酸探针的核苷酸探针，
其中
野生型核苷酸探针是与野生型扩增产物互补的并具有Tm值63-77℃，以及单核苷酸多态性C-13T位点位于自该野生型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且
变异型核苷酸探针是与变异型扩增产物互补的并具有Tm值63-74℃，以及单核苷酸多态性C-13T位点位于自该变异型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且其中
当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区及从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，
当核苷酸引物组包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表2中所示的引物组1-7；
F3引物与自靶核酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合；以及
B3引物与自靶核酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合。
11.根据权利要求10所述的核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.28、29或30的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.33、34或35的序列或与其互补的序列。
12.根据权利要求10所述的核苷酸探针，其特征在于探针固定在支持物(1，11)上。
13.用于LAMP扩增的核苷酸引物组，其用于检测SAA1基因单核苷酸多态性C2995T和/或T3010C的基因型，其特征在于
当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区及从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当存在这样的核苷酸引物时，其中所述的核苷酸引物包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、和具有与B3c区互补的序列的B3引物，
引物组包含：
选自表3中所示引物组1-4中的FIP引物和BIP引物；
与自靶核酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合的F3引物；和
与自靶核酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合的B3引物。
14.根据权利要求13所述的核苷酸引物组，其特征在于FIP和BIP引物是表3中所示引物组3的引物。
15.检测SAA1基因单核苷酸多态性C2995T或T3010C的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求13所述的核苷酸引物组扩增靶核酸而得到扩增产物；和
测定并比较在扩增产物中含有的野生型扩增产物和变异型扩增产物的量。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于
通过固定在支持物(1，11)上的核苷酸探针与扩增产物的杂交及随后确定与核苷酸探针结合的扩增产物的量来测定扩增产物，并且
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针以及与变异型扩增产物互补的变异型核苷酸探针。
17.根据权利要求16所述的用于检测单核苷酸多态性C2995T的基因型的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值63-74℃，变异型核苷酸探针具有Tm值61-74℃，并且单核苷酸多态性C2995T位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值67-71℃，并且变异型核苷酸探针具有Tm值66-70℃。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.38、39或40的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.43、44或45的序列或与其互补的序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.38的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQID No.43的序列或与其互补的序列。
21.根据权利要求16所述的用于检测单核苷酸多态性T3010C的基因型的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值55-70℃，变异型核苷酸探针具有Tm值55-71℃，并且单核苷酸多态性T3010C位点位于自分别的核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有Tm值59-64℃，并且变异型核苷酸探针具有Tm值60-67℃。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.48、49或50的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.53、54、55或56的序列或与其互补的序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.50的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQID No.55的序列或与其互补的序列。
25.用于从扩增产物中检测SAA1基因单核苷酸多态性C2995T的基因型的核苷酸探针，所述的扩增产物通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸而得到，所述核苷酸探针的特征在于包含：
选自野生型核苷酸探针和变异型核苷酸探针的核苷酸探针，
其中
野生型核苷酸探针是与野生型扩增产物互补的并具有Tm值63-74℃，且单核苷酸多态性C2995T位点位于自该野生型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且
变异型核苷酸探针是与变异型扩增产物互补的并具有Tm值61-74℃，且单核苷酸多态性C2995T位点位于自该变异型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且其中
当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区及从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，
当核苷酸引物组包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表3中所示的引物组1-4；
F3引物与自靶核酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合；以及
B3引物与自靶核酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合。
26.根据权利要求25所述的核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.38、39或40的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.43、44或45的序列或与其互补的序列。
27.根据权利要求25所述的核苷酸探针，其特征在于探针固定在支持物(1，11)上。
28.用于从扩增产物中检测SAA1基因单核苷酸多态性T3010C的基因型的核苷酸探针，所述的扩增产物通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸而得到，所述核苷酸探针的特征在于包含：
选自野生型核苷酸探针和变异型核苷酸探针的核苷酸探针，
其中：
野生型核苷酸探针是与野生型扩增产物互补的并具有Tm值55-70℃，且单核苷酸多态性C3010T位点位于自该野生型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且
变异型核苷酸探针是与变异型扩增产物互补的并具有Tm值55-71℃，且单核苷酸多态性C3010T位点位于自该变异型核苷酸探针的末端起3个或多个碱基的内侧；并且其中
当靶核苷酸从5’端依次具有F3区、F2区和F1区且从3’端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，
当核苷酸引物组包括具有在3’端侧与F2区序列相同的序列和在5’端侧与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区序列相同的序列的F3引物、具有在3’端侧与B2c区互补的序列和在5’端侧与B1c区序列相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表3中所示的引物组1-4；
F3引物与自靶核酸的F2区5’端起60个碱基范围内的区域结合；以及
B3引物与自靶核酸的B2c区3’端起60个碱基范围内的区域结合。
29.根据权利要求28所述的核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.48、49或50的序列或与其互补的序列，并且变异型核苷酸探针具有SEQ ID No.53、54、55或56的序列或与其互补的序列。
30.根据权利要求28所述的核苷酸探针，其特征在于探针固定在支持物(1，11)上。
31.同时检测SAA1基因单核苷酸多态性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用表2中所示的引物组2扩增靶核酸而得到扩增产物；
通过使用表3中所示的引物组3扩增靶核酸而得到扩增产物；
将扩增产物混合以制备液体混合物；
通过使液体混合物与固定有核苷酸探针的支持物接触而使扩增产物与核苷酸探针杂交，其中所述支持物携带下列核苷酸探针：用于C-13T的野生型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.28的序列或与该序列互补的序列；用于C-13T的变异型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.33的序列或与该序列互补的序列；用于C2995T的野生型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.38的序列或与该序列互补的序列；用于C2995T的变异型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.43的序列或与该序列互补的序列；用于T3010C的野生型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.50的序列或与该序列互补的序列；用于T3010C的变异型核苷酸探针，其具有SEQ ID No.55的序列或与该序列互补的序列；
测定与分别的核苷酸探针结合的扩增产物的量；
比较与用于C-13T的野生型核苷酸探针及与用于C-13T的变异型核苷酸探针分别结合的扩增产物的量；
比较与用于C2995T的野生型核苷酸探针及与用于C2995T的变异型核苷酸探针分别结合的扩增产物的量；以及
比较与用于T3010C的野生型核苷酸探针及与用于T3010C的变异型核苷酸探针分别结合的扩增产物的量。
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