CN110093411B - Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 - Google Patents
Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110093411B CN110093411B CN201810096023.5A CN201810096023A CN110093411B CN 110093411 B CN110093411 B CN 110093411B CN 201810096023 A CN201810096023 A CN 201810096023A CN 110093411 B CN110093411 B CN 110093411B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saa1
- primer
- saa
- cirrhosis
- copy number
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于医学分子生物学技术领域,公开了SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后检测,SAA CNVs(copy number variations,CNVs)与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的显著相关性,并且评估了其成为乙肝后肝硬化生物标志物的可能性。本发明基于SAA CNVs与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的相关性,建立了SAA基因拷贝数变异的检测方法,首次提出SAA CNVs在乙肝后肝硬化的发病、诊断和干预中的临床价值及应用。本发明通过对SAACNVs的研究,提出SAA基因拷贝数变异是乙肝后肝硬化危险因子,在慢性乙肝及乙肝后肝硬化的预后监测及诊断中具有重要价值和重大临床意义,对于实现肝硬化早期诊断、预后转归,指导治疗等奠定了坚实基础。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学技术领域,涉及SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用。
背景技术
肝硬化(Cirrhosis)是临床常见的慢性进行性疾病,是肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程,由一种或多种病因长期或反复作用而形成的弥漫性肝损害。
早在2002年,WHO统计数据即显示全球每年死于肝硬化的人数近8万例。至2010年,肝硬化已经是公认的导致人类死亡的前10大疾病。因此,肝硬化已成为全球性的公共健康问题,发病率之高,危害之重,不容忽视。在中国导致肝硬化最常见的病因为乙肝(HBV)感染,世界人口总数的约1/3(20亿)感染过或正在感染乙肝病毒,其中有3.5亿人为终身感染者。而我国的HBV感染率已经高达10%。因此,由HBV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计,我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人,其中近25~30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化,其中5~20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬化的人数高达20万。并且研究表明,早期肝硬化可以通过治疗干预进行逆转。因此,如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预,则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率,降低患者死亡率、减少医疗费用并提高患者的生活质量;同时,肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要科学意义和临床应用价值,这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。
人类血清淀粉样蛋白A(Serum AmyloidA,SAA)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白,其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa,其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAA是一种急性炎性蛋白,因为在急性炎症中,SAA可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成,浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外,SAA可替代载脂蛋白A1(ApoA1)与高密度脂蛋白(HDL)结合,从而降低胆固醇的转运效率,并在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其抗炎作用转变为促炎作用,并进而引起肝脏损伤。近年来大量研究表明:SAA已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白,而是作为一种天然固有免疫的调理素。SAA可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用,参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAA在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。近来,在蛋白组学的研究中发现,SAA作为最重要的血清学标志物之一,与肝癌的发生发展密切相关。并且,在组化研究中,酒精性肝硬化的肝细胞腺瘤和结节中,同样发现了SAA的存在,预示其有可能是肝硬化的潜在标志物。另外,SAA蛋白氨基端的50-76个氨基酸片段可形成不可溶性的纤维,在肝脏沉积后可能会促进肝纤维化。除此之外,香港大学He博士等发现,在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中,SAA蛋白明显增高。众所周知,乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现,其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中,SAA是否参与上述病变至今未见明确报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明:SAA蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系,乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAA蛋白表达明显受抑,提示SAA可能与HBV感染和后续病变有关。
存在于自然群体中基因片段的拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是基因组结构性差异的常见形式,它在人群中普遍存在,随着实验技术的进步,越来越多的CNVs与疾病的相关性被陆续报道。人类CNVs与疾病发生和诊断与治疗有密切的关系,已有研究报道,CNVs与肝癌、脂肪肝、克隆氏病以及肺癌等的发生发展有关。但是SAA的基因拷贝数变异与肝硬化的相关性研究目前尚未见报道。
发明内容
本发明首先提出SAA CNVs与慢性乙型肝炎(以下简称慢性乙肝)及乙肝后肝硬化显著相关,并且评估了其成为乙肝后肝硬化生物标志物的可能性。本发明建立了一种SAA基因拷贝数变异的检测方法,首次提出SAA基因拷贝数变异在乙肝后肝硬化的发病、诊断和干预中的临床价值及应用。
本发明通过对于SAA CNVs的研究,建立乙肝后肝硬化生物标志物的拷贝数变异分析方法以及相关高特异性试剂盒,对于实现肝硬化早期诊断、预后转归,指导治疗等奠定了坚实基础。
本发明提出了一种检测SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异的试剂在制备对慢性乙型肝炎进行预后诊断、对慢性乙型肝炎发展为乙肝后肝硬化进行早期诊断及预后判断的产品中的应用。
本发明还提出了一种检测SAA基因拷贝数变异的试剂在制备确定血中SAA蛋白水平的产品中的应用。
本发明还提出了一种SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异在作为对慢性乙型肝炎和/或乙肝后肝硬化进行预测、诊断、预后判断的生物标志物中的应用。
本发明通过设计SAA(SAA1及SAA2)的高效特异性引物,采用改进的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术,建立乙肝后肝硬化生物标志物的拷贝数变异分析方法以及相关试剂盒,并对SAA基因拷贝数进行分析,并研究SAA基因拷贝数与慢性乙型肝炎以及乙肝后肝硬化发病的关系。本发明研究结果表明:SAA基因拷贝数变异在中国人群的健康对照组,慢性乙型肝炎组及肝硬化组中的确存在显著性差异,而且其与肝硬化的发生发展显著相关,可作为潜在的生物标记物应用于肝硬化诊断/预后诊断。
本发明还提出了一种SAA1特异性引物,
上游引物:5’-3’TGGAGAAGTTAGAGGCTGCGGC;
下游引物:5’-3’GGATGAAAACACTGGGCACCACC。
本发明还提出了一种SAA2特异性引物,
上游引物:5’-3’CTGTGGTCCCTCCTCTTCTTGCC;
下游引物:5’-3’GGAGTGAAAACACTGACCCTGCCT。
本发明还提出了一种内参引物,
上游引物:5’-3’TCAGGCCCATGGGGCTCATT;
下游引物:5’-3’GGGTCTGGAGAGGCCGACTTG。
本发明还提出了如上所述的SAA1特异性引物,SAA2特异性引物和内参引物在制备检测SAA的基因拷贝数变异的产品中的应用。
本发明还提出了一种试剂盒,所述试剂盒包括:如上所述的SAA1特异性引物,SAA2特异性引物,内参引物,其中,引物浓度范围为(0.1-4.0μM),引物长度范围为(20-30bp),热启动Taq酶以及2x PCR Master Mix,阴性质控品,阳性质控品。
本发明还提出了所述试剂盒在制备检测SAA的基因拷贝数变异的产品中的应用。
本发明还提出了一种测定SAA的基因拷贝数变异的实时荧光定量PCR分析方法,在10μL微量PCR反应孔内加入以下试剂:
加入去离子灭菌水至终体积10uL;
其中,所述引物包括如上所述的SAA1特异性引物,SAA2特异性引物和内参引物,
所述实时荧光定量PCR的反应条件为:
第一阶段 | 95℃10分钟 | 1循环 | |
第二阶段 | 95℃15秒,65℃45秒 | 40循环 | 65℃收集荧光 |
第三阶段 | 60℃1分钟,95℃10秒 | 1循环 | 收集融解曲线 |
第四阶段 | 40℃10秒 | 1循环 |
扩增结果的循环数按照公式2进行相对定量计算,即可分别得到SAA1及SAA2在待测样本中的拷贝数:
Copies=36/2^(CT SAA1/SAA2-CT Ref)
Copies:拷贝数
CT SAA1/SAA2:SAA1或SAA2的扩增循环数
CT Ref:相应内参基因的扩增循环数。
(公式2)。
本发明首次提出SAA(SAA1/SAA2)CNVs与肝炎和肝硬化有显著正相关性。并且,本发明还对SAA CNVs是否是乙肝后肝硬化的危险因子进行了进一步的评估。本发明通过改良的实时检测PCR技术,建立乙肝后肝硬化生物标志物的拷贝数变异分析方法以及检测SAA拷贝数变异试剂盒,并对中国人群慢性乙肝、乙肝后肝硬化患者及正常对照人群的临床样本中SAA CNVs进行检测、分析、统计后,首次发现,SAA基因拷贝数在研究的疾病组及对照组中的分布显著不同,其中,SAA1基因拷贝数在慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化中显著升高,但SAA2拷贝数仅在乙肝后肝硬化中显著升高,并且相关性分析发现SAA1与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化都显著相关,但SAA2与乙肝后肝硬化显著相关。
另一方面,本发明首次提出,在慢性乙肝患者中,SAA基因拷贝数会随着HBV病毒载量的增加而增加,即SAA基因拷贝数与乙肝病毒的复制呈显著正相关,并且外周血中SAA蛋白水平同样随着SAA基因拷贝数的增加而增加,即与之呈显著正相关,而SAA蛋白水平与HBV病毒清除有关,提示SAA拷贝数的增加有可能通过SAA蛋白以及其介导的炎性因子(IL-6、IL-1、TNF-a)等在慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的发生发展中发挥了一定作用。
在logistic逐步危险因素分析中,本发明首次发现,SAA CNVs是慢性乙肝患者发展为肝硬化的高度危险因素,并独立于肝硬化的已有危险因子:年龄、男性、ALT、AST、GGT等,与疾病呈高度关联,可作为乙肝后肝硬化的生物标志物。有助于预测慢性乙肝患者预后及乙肝后肝硬化的早期诊断,从而使通过对SAA基因拷贝数变异的检测,实现对疾病的早期诊断和防治成为可能。
因此,本发明建立了能够特异性区分人SAA1及SAA2,并分别检测其基因拷贝数变异的试剂盒,首次鉴定了SAA(SAA1/SAA2)CNVs作为乙肝后肝硬化的生物标志物,对于非侵入性肝硬化诊断试剂的开发具有重大的意义;并且,本发明所设计的特定引物适用于采用实时荧光定量PCR检测人SAA CNVs,本发明建立的SAA CNVs试剂盒能够简便、准确、快速地实现对肝硬化易感人群的检测;并且适用于SAA CNVs与其他相关疾病的研究。
附图说明
图1.SAA1、SAA2引物扩增区域。其中用于区分SAA1与SAA2的不同核苷酸用斜体字体表示。
图2.SAA1及SAA2扩增曲线及引物扩增的特异性。A为SAA1特异性引物,只特异性扩增SAA1基因片段,而不扩增SAA2基因片段;B为SAA2特异性引物,只特异性扩增SAA2基因片段,而不扩增SAA1基因。其中,A图和B图中左边小窗为其分别的融解曲线,可见均为单一峰,无非特异性扩增。
图3.SAA CNVs检测试剂盒阴阳性质控品扩增曲线。A为阴性质控品扩增曲线;B为SAA1阳性质控品扩增曲线;C为SAA2阳性质控品扩增曲线;D为内参基因阳性质控品扩增曲线。
图4.SAA1、SAA2以及内参基因扩增标准曲线及效率。A为SAA1扩增的标准曲线;B为SAA2扩增的标准曲线;C为内参扩增的标准曲线;
图5.SAA基因拷贝数在健康对照(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)及乙肝后肝硬化(HBVcirrhosis)中的分布。A为SAA1拷贝数在三组中的分布;B为SAA2拷贝数在三组中的分布。图中差异统计分析使用unpaired-t test,P值小于0.05计为有统计学差异,标记为*,P值小于0.01标记为**,P值小于0.001标记为***。
图6.SAA1及SAA2基因拷贝数显著相关于HBV DNA拷贝数及SAA蛋白含量。其中横坐标为SAA拷贝数三分位数分组,左纵坐标为HBV DNA含量,右纵坐标为SAA蛋白含量;A为SAA1拷贝数与HBV DNA及SAA蛋白含量显著相关;B为SAA2拷贝数与HBV DNA及SAA蛋白含量显著相关;图中百分比为HBV DNA>105的病人在每组中所占百分比。图中差异统计分析使用unpaired-t test,P值小于0.05计为有统计学差异,标记为*,P值小于0.01标记为**,P值小于0.001标记为***。
图7.SAA1CNV诊断乙肝后肝硬化的ROC曲线。
图8.SAA2CNV诊断乙肝后肝硬化的ROC曲线。
图9.SAA1CNV联合SAA2CNV诊断乙肝后肝硬化的ROC曲线。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
实施例1:利用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)技术,建立SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异的检测方法,并优化反应系统,建立SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异的检测试剂盒。
本实施例使用Realtime-PCR的检测方法,设计特殊引物,建立SAA拷贝数检测方法,并通过建立阴阳性质控品、内部参考物质(以下简称内参)以及完善整个反应体系,建立SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异的检测试剂盒。
SAA蛋白主要包括SAA1及SAA2,且其两者有93%的氨基酸序列相同,本实施例依据NCBI中SAA1及SAA2的基因序列(SAA1Gene ID:6288,SAA2Gene ID:6289),并通过AlignX软件比对分析,发现SAA1及SAA2特异性区段如图1所示。针对两者的特异性区段设计了特殊引物,使其可以针对性的对血液样本中抽提的DNA进行特异性扩增SAA1及SAA2,对扩增产物进行了克隆测序鉴定,确认为其产物分别为人SAA1及SAA2基因序列。并同时设计相应的内参基因引物,在扩增SAA1和SAA2的同时对内参基因进行扩增,进一步建立计算公式,通过对SAA1及SAA2基因及内参基因的扩增循环数的计算,即可分别测算出SAA1及SAA2基因拷贝数。同时进一步完善反应体系,优化了反应条件,构建阳性质控品及阴性质控品,建立了SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异的检测试剂盒。
Real time-PCR具有实时监测、定量和高通量等特点,而且操作简便、灵敏度高。在反应中加入SYBR Green I荧光染料,能特异性地嵌入双链DNA分子中,与DNA分子结合时能发出荧光。而当DNA分子为单链时,染料被释放,荧光减弱。因此在一个反应体系中,荧光的强弱与DNA双链分子含量呈正相关。因此每一个循环,收集荧光信号,即可通过荧光强度变化监测到DNA扩增产物量的变化,从而得到一个荧光扩增的曲线图。最终通过计算可得到单个体系反应时间内的PCR产物扩增量。
本发明试剂盒采用上述改良的实时荧光定量PCR技术,使用本发明设计的SAA1及SAA2特异性引物,对血液样本中抽提的DNA进行特异性扩增SAA1及SAA2,并同时对内参基因进行扩增,通过对SAA1及SAA2基因及内参基因的扩增循环数的计算,测定SAA1及SAA2基因拷贝数,同时使用试剂盒内的阴阳性质控品确定每次测定的有效性。上述的Real time-PCR反应程序及SAA1、SAA2基因拷贝数检测试剂盒包括:
(a)引物序列
由于SAA1及SAA2具有高度相似的氨基酸序列(93%),因此,本发明对两者的引物序列进行了精准的设计及优选,确保其能够精准区分并特异性扩增SAA1及SAA2基因序列;
(b)热启动Taq酶
由于Real time-PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在,优选使用热启动Taq酶,增强了PCR扩增的特异性,并降低引物二聚体的产生;
(c)扩增条件
通过对引物浓度范围(0.1-4μM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(100-200bp)、待测基因组DNA浓度范围(0.1-50ng)、反应体系等更精准的优化及选定,进一步提高了Real time-PCR的扩增效率和扩增专一性。
(d)建立的内参系统
对不同的内参基因序列进行优选,在75-150bp扩增子大小之内进行选择,选定含有36重扩增子的序列,该扩增子与单拷贝相比,具有准确性高、均一、稳定的优势,作为内参基因,使用该扩增子作为内参,可以更准确、稳定的计算目的基因的拷贝数。
(e)建立的阴性质控品和阳性质控品
为了对整个实验系统进行质控,本发明试剂盒建立了阴、阳性质控品。利用人基因组模板使用Taq酶扩增SAA1、SAA2及内参序列,PCR扩增32轮后进行PCR产物回收,将回收产物进行TA克隆,蓝白斑筛选得到的阳性克隆分别送交测序,与标准序列完全匹配的作为阳性克隆保留;同时送交一个蓝斑阴性克隆送交测序,与标准载体序列对比正确后作为阴性对照。得到的阴性对照、阳性对照分别菌液放大后抽提DNA备用。
本实施例利用特殊设计的特异性引物,并对使用的聚合酶种类以及引物的末端修饰进行一系列优化,使其具有更高的特异性,以精准区分SAA1和SAA2,并减少引物二聚体的产生;另外还对PCR的反应条件如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等一系列条件进行优化,通过控制目的基因及内参基因的扩增效率,并将目的基因与内参基因循环数进行比较及计算,从而获得可靠、准确的拷贝数结果。本发明不仅可准确检测人基因组中的SAA基因拷贝数变异,同时还适用于开发其它基因拷贝数变异的检测。
一.实验方法:
1.建立Real time-PCR法检测SAA基因拷贝数变异的方法以及检测试剂盒
1.1获得待测样品:
血液中人基因组DNA的抽提,取人血液500μL,用血液DNA抽提试剂盒抽提,测定260nm OD.值以计算DNA浓度,并将其稀释到10ng/μL浓度。
1.2 Realtime-PCR引物的设计:
参照已报道的人SAA1、SAA2基因序列,并用比对软件进行分析比对,其比对结果如图1所示,针对其特异性序列,分别设计若干套引物,引物长度范围(20-30bp),并从中进行优选。
本实施例中采用的引物见表1,其扩增位置如图1所示,其中用于区分SAA1与SAA2的不同核苷酸用斜体字体表示。
表1.Realtime-PCR引物序列
1.3Realtime-PCR扩增反应:
通过对引物浓度范围(0.1-4μM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(100-200bp)、待测基因组DNA浓度范围(0.1-50ng)、反应体系等更精准的优化及选定,进一步提高Real time-PCR的扩增效率和扩增专一性。本实施例采用以下PCR反应体系。
在10μL微量PCR反应孔内加入以下试剂:
加入去离子灭菌水至终体积10uL。
Realtime-PCR反应条件如表2所示:
表2.Realtime-PCR反应条件
第一阶段 | 95℃10分钟 | 1循环 | |
第二阶段 | 95℃15秒,65℃45秒 | 40循环 | 65℃收集荧光 |
第三阶段 | 60℃1分钟,95℃10秒 | 1循环 | 收集融解曲线 |
第四阶段 | 40℃10秒 | 1循环 |
1.4建立内参系统:
为了校正上样量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。使相对定量的结果更为可信。本发明对不同的内参基因序列进行优选,在75-150bp扩增子大小之内进行选择,本实施例选定含有36重扩增子的序列(序列如表3),该扩增子与单拷贝相比,具有准确性高、均一、稳定的优势,作为内参基因,使用该扩增子可以更准确、稳定的计算目的基因的拷贝数。
表3.Realtime-PCR内参引物序列
1.5建立阴阳性质控品:
按照上述1.3体系配制SAA1、SAA2及内参PCR反应,并以表2的条件(循环数为32)扩增后,用PCR产物回收试剂盒(DNAClean-up Kit,CW2301,康为世纪)纯化后克隆进T载体(T-VectorpMDTM 19(Simple),TAKARA),测序验证确认,并作为阳性质控品待用;并挑选其中的蓝斑克隆测序,作为阴性质控品待用。实验有效性判定标准:按照本发明所述的引物及扩增条件,将阴阳性质控品与样品一同进行扩增,扩增结束后,阴性质控品循环数需大于等于40;阳性质控品循环数需小于25,即判为本次实验有效。
1.6扩增效率判定:
用SAA1、SAA2、内参(Ref)标准品质粒10倍梯度稀释后扩增进行扩增效率判定。首先使用起始模板浓度作为X轴,扩增Ct值作为Y轴进行标准曲线的绘制,然后进行线性拟合,并计算相关系数(r)及扩增效率。扩增效率(E)的计算公式如下(公式1)。其中相关系数r2需大于0.98,扩增效率E需在90%~110%之间,即证明扩增效率良好。
E=power(10,-1/slope)-1…………………公式1.
1.7拷贝数的检测及计算:
使用本发明所述的引物及扩增条件,对所抽提待测样本的DNA进行Real time-PCR扩增,将扩增结果的循环数按照公式2进行相对定量计算,即可分别得到SAA1及SAA2在待测样本中的拷贝数。
Copies=36/2^(CT SAA1/SAA2-CT Ref)…………………公式2.
Copies:拷贝数
CT SAA1/SAA2:SAA1或SAA2的扩增循环数
CT Ref:相应内参基因的扩增循环数
二.实验结果:
1.使用本发明建立的试剂盒对SAA(SAA1及SAA2)基因拷贝数进行检测:
样本按照上述1.1中所述方法进行DNA抽提,并分别进行SAA1及SAA2基因拷贝数的检测,如图2A、2B扩增曲线所示,本发明所设计的高特异性引物,可以特异性区分SAA1及SAA2,并分别对其进行特异性扩增。即SAA1特异性引物只会特异性扩增SAA1基因片段,而不扩增SAA2基因片段(图2A),而SAA2特异性引物只会特异性扩增SAA2基因片段,而不扩增SAA1基因片段(图2B)。图2A和图2B分别为SAA1及SAA2的扩增曲线和融解曲线,同时展现了其引物特异性。图2A及2B中左边的小窗为扩增的融解曲线,图中可见,融解曲线都分别仅有一个单一峰,表明该扩增为特异性扩增,无其它非特异性扩增及引物二聚体。
2.实验质控:
本实施例中,阴性质控品无任何特异性扩增,Ct值大于40.0(图3A);阳性质控品SAA1(图3B)、SAA2(图3C)、内参(Ref)(图3D)均扩增良好,SAA1、SAA2、Ref阳性质控品的Ct值分别为:22.5、22.2、22.6,均小于25,符合上述(实验方法1.5)质控要求,本次实验结果有效。
3.扩增效率判定:
用SAA1、SAA2、内参(Ref)标准品质粒10倍梯度稀释后扩增,按照前述方法(实验方法1.6)进行扩增效率判定。如图4所示,SAA1的扩增效率为103.7%(斜率为-3.24),相关系数r2为0.999(图4A);SAA2的扩增效率为108.4%(斜率为-3.14),相关系数r2为0.999(图4B);内参扩增效率为100.0%(斜率为-3.32),相关系数r2为0.999(图4C)。即SAA1、SAA2以及内参基因均扩增良好,且扩增效率基本一致。
综上,本发明建立了能够特异性区分人SAA1及SAA2,并能够准确有效地检测SAA1及SAA2基因拷贝数变异的试剂盒,该试剂盒的建立为后续进行SAA基因拷贝数变异与相关疾病的研究奠定了基础,也为其它基因同类方法的建立提供了参考。
实施例2:利用本发明通过Real time-PCR的方法建立的SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数检测试剂盒,对健康人群、慢性乙肝以及乙肝后肝硬化患者中进行SAA(SAA1/SAA2)拷贝数的检测,并比较其分布状况。
本实施例使用Real time-PCR的检测方法,设计特殊引物,通过本发明建立的SAA拷贝数检测方法及试剂盒,对SAA基因拷贝数在健康人群、慢性乙肝及乙肝后肝硬化组中的分布进行研究。通过比较及统计分析,解析SAA基因拷贝数变异是否与乙肝、肝硬化等疾病相关。
一.实验方法:
本发明采用实施例1改良的实时荧光定量PCR,对健康对照组(HC)血液样本273例、慢性乙型肝炎组(CHB)血液样本146例、乙肝后肝硬化组(HBV cirrhosis)血液样本169例进行SAA基因拷贝数检测,并对其与慢性乙肝型肝炎及乙肝后肝硬化的相关性作出评估。
1.临床样本和相关临床信息的收集:
分别收集健康对照组血液样本273例、慢性乙型肝炎组血液样本146例、乙肝后肝硬化组血液样本169例。健康对照组为体检健康人群,肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和直间接胆红素等)均处于正常生理值范围,乙肝两对半呈阴性,且无炎症反应和肝肾疾病史;慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化组中均为临床确诊的患者。
2.SAA基因拷贝数的检测:
将三组研究样本按照实施例1中1.1所述方法进行DNA抽提,并分别进行SAA1及SAA2基因拷贝数的检测,并比较三组中SAA1及SAA2拷贝数的分布差异,并对该差异使用统计软件SPSS10.0进行统计学分析。
二.结果分析:
1.SAA1及SAA2拷贝数在健康对照人群、慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化中的分布如图5所示:
如图5A所示,在本发明中,SAA1拷贝数在健康对照组、慢性乙型肝炎组及乙肝后肝硬化组中逐渐升高,分别为:4.1±0.1,4.7±0.1及5.0±0.1拷贝。经进一步统计学分析(t-test),相较于健康对照组,SAA1拷贝数在慢性乙型肝炎组(P<0.01)、乙肝后肝硬化组中显著升高(P<0.0001)。虽然SAA1拷贝数在乙肝后肝硬化组高于慢性乙型肝炎组但并无统计学意义。
对于SAA2(图5B),在健康对照组、慢性乙型肝炎组及乙肝后肝硬化组中拷贝数分别为:2.5±0.1,2.5±0.1,3.3±0.1拷贝,经进一步统计学分析(t-test),相较于健康对照组及慢性乙型肝炎组,SAA2拷贝数在乙肝后肝硬化组中显著升高(P<0.0001);而健康对照组及慢性乙型肝炎组中SAA2拷贝数无显著差异。
因此,SAA1拷贝数与SAA2拷贝数均在乙肝后肝硬化组中显著升高,但同时,它们在健康对照组、慢性乙型肝炎组及乙肝后肝硬化组中分布又有所不同。SAA1拷贝数在健康对照组中最低,在慢性乙型肝炎中显著升高,在乙肝后肝硬化组中最高;而SAA2拷贝数在健康对照组及慢性乙型肝炎组中并无差别,仅在乙肝后肝硬化组中显著升高。结果提示,SAA1和SAA2在慢性乙型肝炎以及肝硬化的进展中发挥着不同的作用。SAA1可能参与了疾病的初期阶段即慢性乙型肝炎阶段的病理过程,而SAA2则在疾病后期即乙肝后肝硬化的阶段与SAA1共同参与了疾病发展的病理过程。经过进一步的SPSS 10.0的相关性(spearmancorrelation)统计分析证明(表4),SAA1确实不仅和慢性乙型肝炎显著相关,相关系数(correlation coefficient,r)为0.19(P<0.001),并且和乙肝后肝硬化同样显著相关(r=0.285,P<0.001);而SAA2仅与乙肝后肝硬化显著相关(r=0.285,P<0.001)。证实SAA1/SAA2基因拷贝数变异有可能与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的疾病发展有关,并且在此过程中发挥不同的作用。
虽然SAA1和SAA2有90%以上的序列相同,但据文献报道SAA1和SAA2在许多疾病的进展中都有发挥不同的作用,其两者在不同的组织或者细胞系中,表达的模式也有所不同。在卵巢癌细胞、间充质干细胞和骨肉瘤细胞系中,SAA1的表达占优势,而在肝癌细胞系中,则是SAA2的表达占优势。本发明的结果也证实,SAA1及SAA2在不同疾病阶段基因拷贝数不同,前者在慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化中显著升高,但SAA2仅在乙肝后肝硬化中显著升高,并且SAA1与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化都显著相关,但SAA2仅与乙肝后肝硬化显著相关。进一步提示,SAA1和SAA2有可能在慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化中参与了不同的疾病进展阶段,发挥了不同的作用,有可能是乙肝后肝硬化疾病进展的危险因子。
表4.SAA1/SAA2CNVs与CHB和HBV cirrhosis相关性
实施例3:SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数与乙肝病毒(HBV)的复制及SAA蛋白水平的相关性研究。
有研究报道,慢性乙肝患者体内乙肝病毒复制活跃的病人,即用PCR方法能够在血清中检测到乙肝病毒DNA(>105copies/mL)的患者,他们转化持续进展性肝病如肝硬化甚至死亡的危险性会大大增加,属于高危人群。为了进一步验证实施例2中SAA基因拷贝数与乙肝后肝硬化的高度相关性是否与SAA高拷贝的乙肝患者的乙肝病毒复制更加活跃有关,本实施例将分析研究SAA基因拷贝数和乙肝病毒载量的相关性。另外,有研究表明:SAA蛋白与HBV病毒的感染有着密切的关系。在小鼠模型中,乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)可明显抑制肝组织中SAA蛋白的表达,提示SAA可能与HBV感染和后续病变有关。并且,SAA蛋白参与调节机体的固有免疫和获得性免疫,其蛋白水平与HBV病毒清除相关,因此,本实施例将进一步分析SAA基因拷贝数与SAA蛋白水平的相关性,以进一步验证实施例1中SAA基因拷贝数是否通过SAA蛋白水平与乙肝后肝硬化高度相关。
一.实验方法:
1.收集慢性乙肝患者血清,使用乙肝病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(care HBVPCR assay,QIAGEN)对病人血清中的乙肝病毒DNA进行检测。该检测采用PCR-荧光探针法,在实时定量PCR仪(LightCycler 480,Roche)中进行。该方法检测范围为5×102—5×107拷贝数/mL。
2.统计分析检测结果,研究HBV载量及外周血SAA蛋白水平与SAA基因拷贝数的相关性。
2.1SAA基因拷贝数与乙肝病毒(HBV)载量的相关性分析。
将慢性乙肝患者的SAA1及SAA2基因拷贝数分别按从小到大排列,并根据其SAA1及SAA2基因拷贝数的三分位数将其分为t1、t2、t3组,并分别比较三组的乙肝病毒(HBV)载量。并对其差异以及其相关性进行统计分析。
2.2SAA基因拷贝数与外周血SAA蛋白水平的相关性分析。
同样将慢性乙肝患者分别根据其SAA1及SAA2基因拷贝数的三分位数将其分为t1、t2、t3组,并分别比较三组的SAA蛋白水平。并对其差异以及其相关性进行统计分析。
二.结果分析:
结果如图6所示:在慢性乙肝患者中,随着SAA1/SAA2基因拷贝数的增加,HBV病毒载量也逐渐显著增加。其中,SAA1的t1组中HBV DNA为3.4±0.2 log10copies/mL,SAA2的t1组中HBV DNA为3.1±0.1log10copies/mL;t2组中SAA1:3.7±0.2log10copies/mL,SAA2:3.9±0.2log10copies/mL;t3组中SAA1:4.0±0.2 log10copies/mL,SAA2:4.3±0.2log10copies/mL。并且由于乙肝病毒DNA大于5.0 log10copies/mL的患者,他们转化持续进展性肝病如肝硬化甚至死亡的危险性会大大增加,属于高危人群。而结果显示,随着SAA1/SAA2基因拷贝数的增加,HBVDNA大于5.0log10copies/mL的患者比例也显著增加:对于SAA1,该比例由t1组中的14%增至t3组中的27%;对于SAA2,该比例由t1组中的6%增至t3组中的27%。经过进一步的SPSS 10.0的相关性(spearman correlation)统计分析证明(表5),SAA1/SAA2拷贝数确实与HBV病毒载量显著正相关(SAA1:r=0.246,P<0.01;SAA2:r=0.441,P<0.001)。即具有较高SAA拷贝数的慢性乙肝患者,也具有较活跃的乙肝病毒复制,而病毒在体内的持续存在,并不断侵犯肝脏,导致肝细胞长期慢性炎症,从而引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生直至发展成肝硬化。
表5.SAA基因拷贝数与HBV及SAA蛋白的相关性
另一方面,因为有研究报道SAA蛋白与HBV病毒的感染有着密切的关系,乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAA蛋白表达明显受抑,提示SAA可能与HBV感染和后续病变有关。本发明为了进一步研究SAA拷贝数与HBV病毒复制的高度相关性是否与SAA蛋白有关,同样将慢性乙肝患者分别根据其SAA1及SAA2基因拷贝数的三分位数将其分为t1、t2、t3组,并分别比较三组的SAA蛋白水平。结果显示(图6),在慢性乙肝患者中,随着SAA1/SAA2基因拷贝数的增加,外周血SAA蛋白水平也逐渐显著增加。其中,SAA1t1组中SAA蛋白水平为0.65±0.08mg/L,SAA2t1组SAA蛋白水平为0.65±0.09mg/L;t2组中SAA1:0.70±0.10mg/L,SAA2:0.66±0.05mg/L;t3组中SAA1:0.82±0.09mg/L,SAA2:0.87±0.13mg/L。经过进一步的SPSS 10.0的相关性(spearman correlation)统计分析证明(表5),SAA1/SAA2拷贝数确实与SAA蛋白水平显著正相关(SAA1:r=0.306,P<0.001;SAA2:r=0.383,P<0.001)。因此,结果提示,对于具有较高SAA基因拷贝数的慢性乙肝患者,由于也具有相对较高的SAA蛋白水平,而SAA作为参与调节机体固有免疫和获得性免疫的调理素,可能与患者HBV的病毒清除有关,并且触发及介导了炎性因子的级联反应,导致肝细胞长期慢性炎症,引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生并最终发展为肝硬化,从而参与了慢性乙肝及乙肝后肝硬化的发生发展过程。
综上,通过本发明建立的SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数检测试剂盒,首次发现SAA1/SAA2与乙肝病毒复制及外周血SAA蛋白水平显著正相关。即具有较高SAA1/SAA2拷贝数的慢性乙肝患者,具有相对升高的SAA蛋白水平,可能致其HBV病毒清除能力降低,从而导致其乙肝病毒复制更活跃、更易于发展为肝硬化。另一方面,升高的SAA蛋白水平触发并介导了炎性因子(IL-6,IL-1,TNF-a)等的级联反应,导致肝细胞长期慢性炎症,引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生并更易发展为肝硬化,因此,SAA基因拷贝数变异是潜在的乙肝后肝硬化危险因子,在慢性乙肝及肝硬化的预后监测中具有重大意义。
实施例4:SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异在乙肝后肝硬化中危险度评估及其在潜在风险预测价值和早期诊断的临床应用。
一.实验方法:
以SAA基因拷贝数在健康对照人群以及在慢性乙肝和乙肝后肝硬化患者中的分布为例,对SAA基因型拷贝数变异是否为乙肝后肝硬化危险因子,以及其在肝硬化预后诊断中的临床应用价值进行评估。
1.使用SPSS10.0软件进行logistic回归分析,分别研究了慢性乙肝后肝硬化患者中,SAA1及SAA2基因拷贝数及调整各项实验室相关指标后,通过比值比(Odds Ratio,OR)比较分析SAA1及SAA2基因拷贝数在慢性乙肝发展为乙肝后肝硬化中的危险因素及危险程度。
2.进一步,对于SAA1及SAA2基因拷贝数诊断价值进行了评估。使用SPSS10.0软件,分别对于SAA1及SAA2基因拷贝数在乙肝后肝硬化组中的分布,进行受试者工作曲线(ROC)绘制,通过对ROC曲线下面积(AUC)的分析,评估其诊断价值,并分别计算其诊断中的灵敏度及特异性。
二.结果分析:
结果可见(表6),在没有校正其他因子的条件下,SAA1基因拷贝数在乙肝后肝硬化的比值比(Odds Ratio,OR)为1.47,95%的置信区间为1.28~1.68(P<0.0001),而SAA2基因拷贝数的比值比(Odds Ratio,OR)为1.98,95%的置信区间为1.63~2.40(P<0.0001),表明SAA1及SAA2基因拷贝数确实是乙肝后肝硬化的危险因子。在分别校正其他相关危险因子后(age、male gender、AST、ALT和GGT),SAA1及SAA2基因拷贝数的比值比OR仍不受影响,在同时校正male gender、AST、ALT和GGT四个因子条件下,SAA1的比值比OR为1.24,95%的置信区间为1.01~1.53(P<0.05),SAA2的比值比OR为1.72,95%的置信区间为1.31~2.28(P<0.001),表明较高的SAA1及SAA2基因拷贝数可独立于其它已知的危险因素,使慢性乙肝患者发展为乙肝后肝硬化的危险程度增高,是乙肝后肝硬化的新的独立危险因子。
表6.SAA CNVs在乙肝后肝硬化中的危险度分析
此外,进一步采用ROC曲线分析SAA1及SAA2基因拷贝数在乙肝后肝硬化的诊断价值。如图7所示,SAA1基因拷贝数的ROC曲线下面积AUC为0.67,P<0.0001,灵敏度为90%,特异性为36%。SAA2基因拷贝数的ROC曲线下面积AUC为0.70,P<0.0001,灵敏度为80%,特异性为52%(图8)。将SAA1及SAA2进行综合因素logistic回归及ROC曲线分析后可见,两者综合的AUC为0.71(图9),比单独的SAA1或SAA2略高,特异性增至55%,灵敏度78%。结果表明,SAA1及SAA2基因拷贝数对乙肝后肝硬化具有较高的诊断价值。
综上所述,通过本发明建立的SAA1/SAA2基因拷贝数检测试剂盒,首次发现SAA1/SAA2基因拷贝数变异与乙肝后肝硬化具有很高的相关性,是乙肝后肝硬化新的独立危险因子,预示具有较高SAA1/SAA2基因拷贝数的慢性乙肝患者,更易发展为乙肝后肝硬化。在进一步进行的ROC曲线分析中,本发明首次发现SAA1/SAA2基因拷贝数对于乙肝后肝硬化具有较高的诊断价值,两者综合应用后,AUC达0.71,诊断灵敏度为78%,特异性为55%。因此,本发明首次提出了SAA1/SAA2基因拷贝数可作为乙肝后肝硬化的危险因子,应用于慢性乙肝及乙肝后肝硬化的预后诊断;并且SAA1/SAA2基因拷贝数适用于慢性乙肝患者中发展至肝硬化的易感人群或高危人群的筛查,从而实现对易感人群的早期预防,早期诊断,早期干预,进而大大降低乙肝后肝硬化乃至肝癌的发病率,提高患者的生活的质量。
本发明建立了SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数检测试剂盒,并基于该试剂盒,对慢性乙肝及乙肝后肝硬化与SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数进行了相关性研究,首次提出SAA基因拷贝数与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化显著相关,并且是乙肝后肝硬化新的独立危险因子,在乙肝后肝硬化中具有较高的诊断价值。并且其中,SAA1和SAA2有可能在慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化中参与了不同的疾病进展阶段,发挥了不同的作用;同时,本发明首次发现SAA1/SAA2与乙肝病毒复制及外周血SAA蛋白水平显著正相关。即具有较高SAA1/SAA2拷贝数的慢性乙肝患者,具有相对升高的SAA蛋白水平,可能致其HBV病毒清除能力降低,从而导致其乙肝病毒复制更活跃、更易于发展为肝硬化。另一方面,升高的SAA蛋白水平触发并介导了炎性因子(IL-6,IL-1,TNF-a)等的级联反应,导致肝细胞长期慢性炎症,引起细胞死亡、肝脏纤维组织增生并更易发展为肝硬化。这可能是造成SAA(SAA1/SAA2)基因拷贝数变异成为乙肝后肝硬化危险因子的原因。
因此,SAA基因拷贝数变异是乙肝后肝硬化危险因子,在慢性乙肝及乙肝后肝硬化的预后监测及诊断中具有重要价值和重大临床意义。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
序列表
<110> 德赛诊断系统(上海)有限公司
<120> SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后检测及诊断中的
应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggagaagtt agaggctgcg gc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatgaaaac actgggcacc acc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgtggtccc tcctcttctt gcc 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggagtgaaaa cactgaccct gcct 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcaggcccat ggggctcatt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggtctggag aggccgactt g
21
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggagaagtt agaggctgcg gcccctcctc ctcttgcc 38
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtggtgccc ag 12
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgttttcatc cc 12
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggagaagtt agaggctgtg gtccctcctc ttcttgcc 38
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcagtgccc aggcagggtc agtgttttca ctcc 34
Claims (2)
1.检测SAA1和SAA2基因拷贝数变异的试剂在制备对慢性乙型肝炎进行预后诊断、对慢性乙型肝炎发展为乙肝后肝硬化进行早期诊断及预后判断的产品中的应用,其特征在于,所述检测SAA1和SAA2基因拷贝数变异的试剂为SAA1特异性引物、SAA2特异性引物及内参引物,所述SAA1特异性引物的引物序列如下:
上游引物:5’-3’ TGGAGAAGTTAGAGGCTGCGGC;
下游引物:5’-3’ GGATGAAAACACTGGGCACCACC;
所述SAA2特异性引物的引物序列如下:
上游引物:5’-3’ CTGTGGTCCCTCCTCTTCTTGCC;
下游引物:5’-3’ GGAGTGAAAACACTGACCCTGCCT;
所述内参引物的引物序列如下:
上游引物:5’-3’ TCAGGCCCATGGGGCTCATT;
下游引物:5’-3’ GGGTCTGGAGAGGCCGACTTG。
2.一种非疾病诊断目的的测定SAA的基因拷贝数变异的实时荧光定量PCR分析方法,其特征在于,
在10μL微量PCR反应孔内加入以下试剂:
2X PCR Master Mix 5μL
模板基因组DNA 0.1~50ng
上下游引物至终浓度 0.1~4.00μM
热启动Taq聚合酶 0.2~1.0U
SYBR Green至终浓度 0.4x~1x
加入去离子灭菌水至终体积10uL;
其中,所述引物包括SAA1特异性引物,SAA2特异性引物,内参引物,
所述SAA1特异性引物为,
上游引物:5’-3’ TGGAGAAGTTAGAGGCTGCGGC;
下游引物:5’-3’ GGATGAAAACACTGGGCACCACC;
所述SAA2特异性引物为,
上游引物:5’-3’ CTGTGGTCCCTCCTCTTCTTGCC;
下游引物:5’-3’ GGAGTGAAAACACTGACCCTGCCT;
所述内参引物为,
上游引物:5’-3’ TCAGGCCCATGGGGCTCATT;
下游引物:5’-3’ GGGTCTGGAGAGGCCGACTTG;
所述实时荧光定量PCR的反应条件为:
第一阶段:95℃ 10分钟,1个循环;第二阶段:95℃15秒,65℃45秒,40个循环,其中65℃收集荧光;第三阶段:60℃1分钟,95℃10秒,1个循环,该阶段收集融解曲线;第四阶段:40℃10秒,1个循环;
扩增结果的循环数按照以下公式进行相对定量计算,即可分别得到SAA1及SAA2在待测样本中的拷贝数:
Copies=36/2^(CT SAA1/SAA2 -CT Ref )
Copies: 拷贝数
CT SAA1/SAA2 :SAA1或SAA2的扩增循环数
CT Ref :相应内参基因的扩增循环数。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810096023.5A CN110093411B (zh) | 2018-01-31 | 2018-01-31 | Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810096023.5A CN110093411B (zh) | 2018-01-31 | 2018-01-31 | Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110093411A CN110093411A (zh) | 2019-08-06 |
CN110093411B true CN110093411B (zh) | 2022-12-06 |
Family
ID=67442885
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810096023.5A Active CN110093411B (zh) | 2018-01-31 | 2018-01-31 | Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110093411B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101294222A (zh) * | 2007-04-26 | 2008-10-29 | 株式会社东芝 | 用于检测血清淀粉状蛋白a1(saa1)的基因型的核苷酸引物组和核苷酸探针 |
CN103160576A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 德赛诊断系统(上海)有限公司 | 基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法 |
-
2018
- 2018-01-31 CN CN201810096023.5A patent/CN110093411B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101294222A (zh) * | 2007-04-26 | 2008-10-29 | 株式会社东芝 | 用于检测血清淀粉状蛋白a1(saa1)的基因型的核苷酸引物组和核苷酸探针 |
CN103160576A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 德赛诊断系统(上海)有限公司 | 基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Copy Number Variations In Serum Amyloid A Play a Role in the Determination of its Baseline Concentrations;JunHan等;《Clinical Chemistry》;20171018;第64卷(第2期);摘要、第402-403页 * |
Gene:SAA1 ENSG00000173432;无;《Ensembl database》;20171231;全文 * |
Gene:SAA2 ENSG00000134339;无;《Ensembl database》;20171231;全文 * |
JunHan等.Copy Number Variations In Serum Amyloid A Play a Role in the Determination of its Baseline Concentrations.《Clinical Chemistry》.2017,第64卷(第2期),摘要、第402-403页. * |
无.Gene:SAA1 ENSG00000173432.《Ensembl database》.2017,全文. * |
无.Gene:SAA2 ENSG00000134339.《Ensembl database》.2017,全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110093411A (zh) | 2019-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110904225B (zh) | 用于肝癌检测的组合标志物及其应用 | |
CN107058623B (zh) | 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法 | |
US10953035B2 (en) | Compositions and methods for treating and preventing end stage renal disease | |
CN112301130B (zh) | 一种肺癌早期检测的标志物、试剂盒及方法 | |
CN112048556B (zh) | 原发性肝细胞肝癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用 | |
WO2011012074A1 (zh) | 肝癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
WO2013125691A1 (ja) | テスト体液サンプルの分類方法 | |
KR102577378B1 (ko) | 뇌경색의 리스크 평가 방법 | |
CN107119148B (zh) | 检测hiv-1 2-ltr dna的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 | |
CN110093411B (zh) | Saa1和或saa2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用 | |
CN114703288B (zh) | 用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker探针、引物组及其应用 | |
CN115418397B (zh) | 一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用 | |
WO2023105295A2 (zh) | 肾癌诊断用尿液miRNA标志物、诊断试剂及试剂盒 | |
CN115418394A (zh) | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 | |
CN114410795A (zh) | 基于miRNA特征标记的肝癌早期检测 | |
CN108018285B (zh) | 一种超敏感引物及其设计方法和应用 | |
CN107034312B (zh) | 核苷酸组合物、试剂盒及其用途 | |
CN113549707A (zh) | 用于hbv基因型检测的方法、寡核苷酸和试剂盒 | |
CN111718991A (zh) | 血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用 | |
CN107557464B (zh) | 用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型及检测试剂盒 | |
CN110592267A (zh) | 鲤春病毒血症病毒(svcv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
Ma et al. | Delayed full opening of bumped switchable molecular probe enables repeated generation of target analogues for mix-to-signaling determination of microRNAs | |
CN116515995B (zh) | 一种检测噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的血清microRNA标志物及其应用 | |
CN117344061B (zh) | 一种同时检测五种人源病毒ebv、hbv、hcv、hiv、hpv的方法、试剂盒、引物和探针及其应用 | |
CN102925579B (zh) | Idh2基因突变的快速检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |