CN102925579B - Idh2基因突变的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：在IDH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别设计了IDH2的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
背景技术：
异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)在三羧酸循环中将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸，从而为机体的能量代谢、生物合成以及抗氧化压力等方面发挥起重要作用。人体内有两种类型的IDH酶：需要以NAD为辅酶的IDH酶(EC1.1.1.41)，和需要NADP的IDH酶(EC1.1.1.42)；两者在不同亚细胞部位催化同一反应：在胞液中以NADP+为辅酶，在线粒体内膜中则以NAD+为辅酶。
血清IDH酶含量测定，临床上对诊断肝病有一定意义，尤其是恶性肿瘤病人血清IDH酶升高，往往是肝脏转移的信号。此外，人们发现急性髓系白血病(AML)患者存在的IDH基因突变，可能是AML患者的不良预后因素，因此检测IDH突变可能为白血病的分层治疗提供依据。更进一步地，通过全基因组测序，还发现IDH1和IDH2突变存在于AML、急性淋巴细胞白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)中，但在慢性粒细胞白血病(CML)中尚未检测到突变，有报道称IDH1和IDH2突变在CN-AML患者中的发生率分别为5.5-9.6％[10-14]和3-11％，并认为具有IDH1和IDH2突变的AML患者具有较低的CR，较高的RR和较短得OS。
除此之外，近年来也在神经胶质瘤中发现了IDH基因的点突变，导致酶原有活性下降，同时获得新的将α-酮戊二酸转化为2-羟戊二酸的功能；发生突变的酶还产生“2-羟基戊二酸”(2HG)，为一种潜在的致癌代谢物。IDH突变促进癌症形成的机制多样，如产生2HG的IDH突变体能阻止组蛋白去甲基化而抑制细胞分化，有助于细胞积累突变而最终导致肿瘤发生；而人原始星细胞中的IDH1突变诱导DNA超甲基化，并对“甲基化组”(methy lome)进行重塑，以模仿CIMP表现型(神经胶质瘤和其他固体肿瘤的一个共同特征)；此外，2HG的(R)—对映体(而不是〈S〉-2HG)能刺激“ELN脯氨酰4-羟化酶”的活性，导致“缺氧诱导因子”(HIF)水平下降，后者又能增强细胞增殖。这些研究成果为了解神经胶质瘤的形成建立了一个框架，同时也凸显了人类癌症中基因组变化与基因组以外的变化之间的相互作用。
高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。
SYBRTMGreen I对PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。
罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。
而PCR(Polymerase Cha in Reaction)即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括:
仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响
试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线
软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件
罗氏荧光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。
LightCycler Nano System是LightCycler480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：
第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；
第二：耗时长，一般需要2-3天；
第三：成本高。
鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实IDH2基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。
发明内容：
本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：
第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；
第二：耗时长，一般需要2-3天；
第三：成本高。
为了解决以上问题，本发明提供了一种丝裂原活化蛋白激酶1(MitogenActivated prote in Kinase Kinase1，IDH2/MAPKK1)基因突变的快速检测方法，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.
高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm
将纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。
将杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到不同峰形的熔解曲线.
即，为解决上述技术问题，本发明提供了一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：
一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：
在IDH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别设计了IDH2的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。
所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.
所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。
一种IDH2基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95℃变性60秒钟；40℃
变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s)。所述IDH2突变型目的片段的获取包括：
利用带有突变位点的突变引物IDH2F,IDH2MR；IDH2M,IDH2R获得突变位点前后两段突变片段；
将这两段突变片段连接起来，构成IDH2突变型目的片段。
所述IDH2突变型目的片段的获取包括：
突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以IDH2F,IDH2MR；以及IDH2M,IDH2R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；
突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL；
突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以IDH2F+IDH2R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
所述M/W＝1％阳性对照模板的获取：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。
所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板、IDH2F+IDH2R为引物进行实验，获得条带单一的特异性IDH2野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。
本发明的有益效果是：本发明分别设计了IDH2的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法(HRM法)；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
附图说明：
图1为本发明IDH2基因HRM检测分析结果示意图。
具体实施方式：
本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
如图1所示，我们分别设计了IDH2的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分。下面以IDH2为例，说明具体的操作。
1样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。
2DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。
3、qPCR-HRM检测的体系
1)对照的设立和检测重复孔
2)每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突变/野生＝1％)阳性对照。对照和样本均采用复孔。
3)10μL反应体系构成(引物序列见附表)如下(以4管反应为例)：
4)A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4.5μL加至每管8联管中，计4管：
| MasterMix组成： | (1x) | (5x) |
| 25mM MgCl2 | 1.2μl | 6μl |
| 2μM IDH2F primer | 1μl | 5μl |
| 2μM IDH2R primer | 1μl | 5μl |
| H2O | 1.3μl | 6.5μl |
| Σ＝ | 4.5μl | 22.5μl |
5)B向每管中加入0.5μL(约5-10ng)模板DNA。
6)C向每管中加入5μL2xHRM荧光Master(罗氏Cat#04 909 631001)；Σ＝10μL。
7)混合均匀，盖上8联管盖。
8)将8联管置于LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。
4、qPCR-HRM检测的程序：
1)95℃变性10分钟；
2)95℃变性10秒钟；
3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；
4)72℃延伸30秒钟；
5)重复第2步到第四步45个循环；
6)95℃变性60秒钟；
7)40℃变性60秒钟；
8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s)。
5、结果分析：
1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。
2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。
3)结果判定
在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
4)获取结果图。
6、野生型目的片段的获取：
以已知未突变基因组为模板，IDH2-2F+IDH2-2R为引物进行实验，参照步骤3及步骤4的反应体系及程序，获得条带单一的特异性野生型目的片段。
将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。
7、IDH2突变型目的片段的获取
突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物(IDH2F,IDH2MR；IDH2M,IDH2R)获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成IDH2突变型目的片段。
突变第一步PCR
以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以IDH2F,IDH2MR；以及IDH2M,IDH2R为引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得两个条带单一的片段。
突变第一步产物稀释
将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
突变第二步PCR
以稀释后的第一步两段产物为模板，以IDH2F+IDH2R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得条带单一的片段。
突变第二步产物稀释
将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
8、结果分析
M/W＝1％阳性对照模板的获取
混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。
附表：IDH2_R172GA>G_HRM检测引物序列：
| 引物 | 引物序列(5’-3’) |
| IDH2F | AAAACATCCCACGCCTAGTCC |
| IDH2R | ACTGCAGAGACAAGAGGATGG |
| IDH2M | tc accattggcGGGcacgccca t |
| IDH2MR | atgggcgtgCCCgccaatggtga |
与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！
上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一致的最宽泛的范围。
Claims (2)
1.一种I DH2基因突变的快速检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
qPCR-HRM检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验；包括野生型阴性对照和突变M/野生W＝1％阳性对照；对照和样本均采用复孔；
在I DH2基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
所述野生型引物是I DH2 F和I DH2 R，所述突变型引物是I DH2 M和I DH2 MR；
所述野生型引物I DH2 F的核苷酸序列为：AAAACATCCCACGCCTAGTCC，
所述野生型引物I DH2 R的核苷酸序列为：ACTGCAGAGACAAGAGGATGG，
所述突变型引物I DH2 M的核苷酸序列为：TCACCATTGGCGGGCACGCCCAT，
所述突变型引物I DH2 MR的核苷酸序列为：AAAACATCCCACGCCTAGTCC；
所述野生型引物和突变型引物分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板、I DH2 F和I DH2 R为引物进行实验，获得条带单一的特异性I DH2野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照用；
所述突变型目的片段的获取包括：利用引物I DH2 F和I DH2 MR，以及引物I DH2 M和I DH2 R获得突变位点前后两段突变片段；将这两段突变片段连接起来，构成I DH2突变型目的片段；
所述I DH2突变型目的片段的获取步骤包括：突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以I DH2 F,I DH2 MR；以及I DH2 M,I DH2 R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；
突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为10ng/mL；
突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以I DH2 F和I DH2 R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为10-20ng/mL；
所述M/W＝1％阳性对照的获取：混合99μL野生型目的片段和1μL突变型目的片段，配制100μL突变型/野生型＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照；
2)10μL反应体系检测：在八连管中依照次序加入各试剂：25mM MgCl21.2μl,2μM I DH2 F primer 1μl，2μM I DH2 R primer 1μl，H2O 1.3μl，0.5μl模板DNA，5μl 2×HRM荧光master，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：在高分辨率溶解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM检测的程序包括：1)95℃变性10分钟；2)95℃变性10秒钟；3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；4)72℃延伸30秒钟；5)重复第2步到第4)步45个循环；6)95℃变性60秒钟；7)40℃变性60秒钟；8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s。
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