CN104073548A - 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒 - Google Patents
基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及试剂盒，包括：在同一PCR扩增体系中，通过PCR对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增以及针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点。在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测；在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。
Description
技术领域
本发明属于基因工程中单核苷酸多态性和单碱基突变的检测领域，特别涉及一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性（SNPs）是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。随着人类基因组测序工作完成，SNPs筛选及检测已经成为研究者们广泛关注的焦点。目前用于SNPs检测的方法大多以PCR技术为基础，与荧光、质谱法、基因芯片或直接测序等方法结合，并已进入SNPs检测的高通量时代。但这些方法大多操作复杂、价格昂贵、检测时间长，因此并不适合于大规模使用。本发明利用PCR&AS-PCR核酸扩增技术和DNA溶解曲线技术发明的一种操作简单、价格低廉的检测技术。因此，可广泛地应用于与单核苷酸多态性检测相关的领域。
以下是现有的几种SNP检测技术，如1、限制性酶切片断长度多态（RFLP）：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNPs位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据琼脂糖凝胶电泳的结果就可以判断是否有SNPs位点以及出现的碱基替换的类型。2、寡核苷酸连接分析（Oligos Ligation Assay,OLA）：OLA技术是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸来完成的。寡核苷酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基以共价连接。连接产物可以通过凝胶电泳或固相印迹杂交的方法进行检测，根据这些检测结果就可以进行SNPs的分型。3、基因芯片（Gene chip）：基因芯片，又称为DNA微探针阵列（Micro-array）。虽然仅用一张芯片，就可以通过芯片上密集排列的已知序列的探针，与若干靶序列进行互补匹配杂交，从而达到同时检测多个基因的多态性的目的。4、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitive PCR）：根据荧光共振（Fluorescenceresonance）的原理，利用荧光检测装置检测供试者-接受者（donor-acceptor）之间的荧光变化，从而进行SNPs的分型。5．DNA测序法：DNA Sanger测序能够准确、直接反应序列的差异，但是从操作周期来看，该方法从样品的处理到给出报告至少需要3-4天，而且价格也比较昂贵。6、荧光偏振检测技术（Fluorescencepolarization）：对目的基因进行PCR扩增，然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交，使探针的3’可在聚合酶的作用下，依据其互补链上的待测碱基连接上一个标有特定荧光素的ddNTP，然后检测该3’端带有荧光素的探针，根据检测到的荧光素种类和偏振光强度判定待测点是何种碱基。7、杂交双探针荧光PCR技术：杂交双探针荧光PCR技术除常规的一对引物外，还在PCR反应体系中另加有两个能与PCR产物杂交的横跨突变位点的荧光标记探针。通过熔解曲线(melting curve)的分析而对DNA变性过程的监控实现点突变的检测。
随着人基因组测序的完成，各种SNPs数据库不断的建成，SNPs的功能研究逐步转为科学家们研究的重点。同时，越来越多的研究证明很多遗传病都与基因组上存在单碱基突变相关。因此针对不同特定DNA区域上的不同的SNPs类型在特定群体的序列验证和频率分析以及基因片段上的突变位点与特定生理或病理状态关系正成为研究的热点。但目前市场上，针对多个基因片段中的多个基因位点上的单碱基点突变的检测方法大多需要专门的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂，所以在应用上受到了一定的限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点。因此可在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测；在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。
本发明的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，包括：
（1）在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A，通过PCR对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增；通过位点特异性引物B，针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
所述扩增引物A能对包含SNPs位点和单碱基突变位点的DNA序列进行特异性的扩增，其退火温度在60～75℃，因此可形成长度为A的DNA双链产物；能针对不同SNPs位点和单碱基突变位点的基因型设计位点特异性引物B，其退火温度为35～55℃；只有当引物B与模板序列完全互补的时候，引物B才能在DNA聚合酶的作用下进行延伸；并形成长度为B的双链产物；
所述扩增引物A的退火温度优选为65～70℃，引物B的退火温度优选为35～45℃。
所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料等。
所述的PCR扩增体系为：
模板2-6微升；
正向引物A：0.025～0.5微摩；
反向引物A：0.025～0.5微摩；
特异性引物B：0.025～0.5微摩（一条特异性引物B的加入量）；
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～30毫摩
KCl：10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～30毫摩
Triton-100：1.0%～2%
MgCl2：2.5～5毫摩
荧光染料：0.1～3X；
DNA聚合酶：0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
优选的PCR扩增体系为：
模板3-4微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B：0.03～0.3微摩；
dNTP：0.2～0.3毫摩
(NH4)2SO4：10～20毫摩
KCl：10～20毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～20毫摩
Triton-100：1.0%
MgCl2：2.5～3毫摩
荧光染料：0.2～2X；
DNA聚合酶：0.5～2单位；
总体积为30～40微升。
所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环；
优选的PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：92～95℃保温2～4分钟；
第二阶段：92～94℃保温10～20秒，66～72℃保温20～30秒，共35～45个循环：
第三阶段：92～94℃保温10～15秒，45～50℃保温15～30秒，共10～15个循环。
所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/秒；然后在40℃～60℃进行冷却；优选的溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；45℃～48℃复性1分钟；然后从初始溶解温度55℃～58℃开始升温至90℃～92℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次每秒；然后在50℃～55℃进行冷却。
本发明的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测试剂盒，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A，对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增；
（4）-20℃保存的特异性引物B，针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
其中，所述的阳性对照液为含有可以产生阳性信号的模板序列，阴性对照为不含产生阳性信号的模板序列的液体。
本发明还涉及相关试剂盒在病原体已知耐药突变基因的检测、亲子鉴定或者肿瘤相关基因突变检测中的应用，如：1）与SNPs直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；2）人群中可以确定人类健康遗传基础的SNPs的筛查与分型；3）人体药物反应差异性检测与筛查；4）人群中某种疾病易感基因的筛查；5）病原体已知耐药基因的检测。
本发明检测SNPs和单碱基突变的方法，主要包括3个步骤：
1）通过PCR对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增。PCR反应的退火温度在66～72℃之间，循环数为35～45。该步骤PCR扩增步骤并不对单碱基突变的碱基类型进行区分，只是为了达到富集靶序列的目的，PCR扩增的引物的Tm应该在66～72℃左右。
2）针对SNPs位点的碱基类型进行AS-PCR。AS-PCR反应的退火温度在40～55℃之间，共5～20个循环。通过控制AS-PCR的反应退火温度和位点特异性引物的退火温度，使得只有当参与AS-PCR扩增的引物与靶模板完全互补的时候，位点特异性引物才能得以延伸。因此，可针对SNPs位点的不同碱基类型设计不同的位点特异性引物进行特异性扩增，从而达到区分SNPs不同基因类型的目的。设计引物时，可将所需检测的位点设计在位点特异性引物的靠近3，末端位置。位点特异性引物的Tm在40～55℃，以避免其参与到步骤1）中，从而提高反应的特异性。
3）扩增产物溶解曲线分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。如果扩增反应中只有步骤1的PCR扩增产物而没有AS-PCR扩增产物时，在进行扩增产物溶解曲线分析，将只出现所引物A所扩增产物的特异性曲线；如果扩增反应中既有步骤1的PCR扩增产物又有步骤2的AS-PCR扩增产物时，在进行扩增产物溶解曲线分析，将同时出现由引物A所扩增得到的产物的特异性曲线和引物B所扩增得到的产物的特异性曲线，由于引物A和引物B所扩增的产物在长度和碱基的组成上存在比较大的差异，因此可以比较容易从荧光强度与时间曲线上进行区分。而不同的SNPs基因类型可通过设计不同的位点特异性引物也可对SNPs的不同基因类型从荧光强度与时间曲线上进行区分，从而得到SNPs和单碱基突变位点的基因类型检测结果。
本发明的检测方法通过在相关领域的应用，具体包括如下4个技术方案：
技术方案一：克拉霉素耐药位点A2143G、A2142G和A2142C的检测方法，包括：
（1）抽取样品的基因组DNA，在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A进行目标靶模板扩增，以及特异性引物B1、B2、B3对A2143G、A2142G和A2142C突变位点的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
所述扩增引物A的序列为：
A正向引物：5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG(SEQ ID NO:1)
A反向引物：5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2)。
所述特异性引物B1、B2、B3的序列为：
位点特异性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO:3)
位点特异性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)
位点特异性引物B35-CGGCAAGACGGAGA(SEQ ID NO:5)。
所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料等。
所述的PCR扩增体系为：
模板2-6微升；
正向引物A：0.025～0.5微摩；
反向引物A：0.025～0.5微摩；
引物B1：0.025～0.5微摩；
引物B2：0.025～0.5微摩；
引物B3：0.025～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～30毫摩
KCl：10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～30毫摩
Triton-100：1.0%～2%
MgCl2：2.5～5毫摩
荧光染料：0.1～3X；
DNA聚合酶：0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
优选的PCR扩增体系为：
模板3-4微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.1～0.5微摩；
引物B2：0.1～0.5微摩；
引物B3：0.1～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.3毫摩
(NH4)2SO4：10～20毫摩
KCl：10～20毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～20毫摩
Triton-100：1.0%
MgCl2：2.5～3毫摩
荧光染料：0.2～2X；
DNA聚合酶：0.5～2单位；
总体积为30～40微升。
所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环；
优选的PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：92～95℃保温2～4分钟；
第二阶段：92～94℃保温10～20秒，66～72℃保温20～30秒，共35～45个循环：
第三阶段：92～94℃保温10～15秒，45～50℃保温15～30秒，共10～15个循环。
所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/s；然后在40℃～60℃进行冷却；优选的溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；45℃～48℃复性1分钟；然后从初始溶解温度55℃～58℃开始升温至90℃～92℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次每秒；然后在50℃～55℃进行冷却。
克拉霉素耐药位点A2143G、A2142G和A2142C的检测试剂盒，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG(SEQ ID NO:1)
A反向引物：5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测A2143G、A2142G和A2142C突变位点
位点特异性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO:3)
位点特异性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)
位点特异性引物B35-CGGCAAGACGGAGA(SEQ ID NO:5)；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
其中，所述的阳性对照液为含有可以产生阳性信号的模板序列，阴性对照为不含产生阳性信号的模板序列的液体。
技术方案二：克拉霉素耐药位点Asn87Lys和Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)的检测方法，包括：
（1）抽取样品的基因组DNA，在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A进行目标靶模板扩增，以及特异性引物B1、B2、B3、B4、B5对Asn87Lys和Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)突变位点的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
所述扩增引物A的序列为：
A正向引物：5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT(SEQ ID NO:6)
A反向引物：5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)；
所述特异性引物B1、B2、B3、B4、B5的序列为：
位点特异性引物B15-CCATGGCGATAAAG(SEQ ID NO:8)
位点特异性引物B25-CCATGGCGATAAGG(SEQ ID NO:9)
位点特异性引物B35-ACGCGGTTTATTA(SEQ ID NO:10)
位点特异性引物B45-ACGCGGTTTATAA(SEQ ID NO:11)
位点特异性引物B55-ACCGGTTTATGGT(SEQ ID NO:12)；
所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料等。
所述的PCR扩增体系为：
模板2-6微升；
正向引物A：0.025～0.5微摩；
反向引物A：0.025～0.5微摩；
引物B1：0.025～0.5微摩；
引物B2：0.025～0.5微摩；
引物B3：0.025～0.5微摩；
引物B4：0.025～0.5微摩；
引物B5：0.025～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～30毫摩
KCl：10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～30毫摩
Triton-100：1.0%～2%
MgCl2：2.5～5毫摩
荧光染料 0.1～3X；
DNA聚合酶：0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
优选的PCR扩增体系为：
模板3-4微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.1～0.5微摩；
引物B2：0.1～0.5微摩；
引物B3：0.1～0.5微摩；
引物B4：0.1～0.5微摩；
引物B5：0.1～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.3毫摩
(NH4)2SO4：10～20毫摩
KCl：10～20毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～20毫摩
Triton-100：1.0%
MgCl2：2.5～3毫摩
荧光染料：0.2～2X；
DNA聚合酶：0.5～2单位；
总体积为30～40微升。
所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环；
优选的PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：92～95℃保温2～4分钟；
第二阶段：92～94℃保温10～20秒，66～72℃保温20～30秒，共35～45个循环：
第三阶段：92～94℃保温10～15秒，45～50℃保温15～30秒，共10～15个循环。
所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/s；然后在40℃～60℃进行冷却；优选的溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；45℃～48℃复性1分钟；然后从初始溶解温度55℃～58℃开始升温至90℃～92℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次每秒；然后在50℃～55℃进行冷却。
克拉霉素耐药位点Asn87Lys和Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)的检测试剂盒，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT(SEQ ID NO:6)
A反向引物：5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测AGC→AAC，AGC→ACC突变位点
位点特异性引物B15-CCATGGCGATAAAG(SEQ ID NO:8)
位点特异性引物B25-CCATGGCGATAAGG(SEQ ID NO:9)
位点特异性引物B35-ACGCGGTTTATTA(SEQ ID NO:10)
位点特异性引物B45-ACGCGGTTTATAA(SEQ ID NO:11)
位点特异性引物B55-ACCGGTTTATGGT(SEQ ID NO:12)；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
其中，所述的阳性对照液为含有可以产生阳性信号的模板序列，阴性对照为不含产生阳性信号的模板序列的液体。
技术方案三：Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性检测方法，包括：
（1）抽取样品的基因组DNA，在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A进行目标靶模板扩增，以及特异性引物B1对G11778A突变位点的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
所述扩增引物A的序列为：
A正向引物：5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO:13)
A反向引物：5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG(SEQ ID NO:14)。
所述特异性引物B1的序列为：
位点特异性引物B15-CACTCACAGTCGC(SEQ ID NO:15)。
所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料等。
所述的PCR扩增体系为：
模板2-6微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.025～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～30毫摩
KCl：10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～30毫摩
Triton-100：1.0%～2%
MgCl2：2.5～5毫摩
荧光染料：0.1～3X；
DNA聚合酶：0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
优选的PCR扩增体系为：
模板3-4微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.1～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.3毫摩
(NH4)2SO4：10～20毫摩
KCl：10～20毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～20毫摩
Triton-100：1.0%
MgCl2：2.5～3毫摩
荧光染料：0.2～2X；
DNA聚合酶：0.5～2单位；
总体积为30～40微升。
所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环；
优选的PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：92～95℃保温2～4分钟；
第二阶段：92～94℃保温10～20秒，66～72℃保温20～30秒，共35～45个循环：
第三阶段：92～94℃保温10～15秒，45～50℃保温15～30秒，共10～15个循环。
所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/s；然后在40℃～60℃进行冷却；优选的溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；45℃～48℃复性1分钟；然后从初始溶解温度55℃～58℃开始升温至90℃～92℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次每秒；然后在50℃～55℃进行冷却。
Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括：
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO:13)
A反向引物：5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG(SEQ ID NO:14)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测G11778A突变位点
位点特异性引物B15-CACTCACAGTCAC(SEQ ID NO:15)
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
其中，所述的阳性对照液为含有可以产生阳性信号的模板序列，阴性对照为不含产生阳性信号的模板序列的液体。
技术方案四：载脂蛋白E基因C112R单核苷酸多态性的检测方法，包括：
（1）抽取样品的基因组DNA，在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A进行目标靶模板扩增，以及特异性引物B1对载脂蛋白E基因C112R突变位点的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
所述扩增引物A的序列为：
A正向引物：5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO:16)
A反向引物：5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO:17)；
所述特异性引物B1的序列为：
位点特异性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO:18)
所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料等。
所述的PCR扩增体系为：
模板2-6微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.025～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～30毫摩
KCl：10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～30毫摩
Triton-100：1.0%～2%
MgCl2：2.5～5毫摩
荧光染料：0.1～3X；
DNA聚合酶：0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
优选的PCR扩增体系为：
模板3-4微升；
正向引物A：0.2～0.4微摩；
反向引物A：0.2～0.4微摩；
引物B1：0.1～0.5微摩；
dNTP：0.2～0.3毫摩
(NH4)2SO4：10～20毫摩
KCl：10～20毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0）：10～20毫摩
Triton-100：1.0%
MgCl2：2.5～3毫摩
荧光染料：0.2～2X；
DNA聚合酶：0.5～2单位；
总体积为30～40微升。
所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环；
优选的PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：92～95℃保温2～4分钟；
第二阶段：92～94℃保温10～20秒，66～72℃保温20～30秒，共35～45个循环：
第三阶段：92～94℃保温10～15秒，45～50℃保温15～30秒，共10～15个循环。
所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/s；然后在40℃～60℃进行冷却；优选的溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；45℃～48℃复性1分钟；然后从初始溶解温度55℃～58℃开始升温至90℃～92℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次每秒；然后在50℃～55℃进行冷却。
载脂蛋白E基因C112R单核苷酸多态性的检测试剂盒，包括：
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO:16)
A反向引物：5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO:17)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：
位点特异性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO:18)
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
其中，所述的阳性对照液为含有可以产生阳性信号的模板序列，阴性对照为不含产生阳性信号的模板序列的液体。
本发明提供的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时。同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点，因此可在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测。在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。
表1为本方法与目前比较常见的SNPs检测技术的比较：
| 比较项目 | 基因芯片 | 基因测序 | HRM技术 | 本方法 |
| 纯合子/杂合子检测 | 能 | 能 | 能 | 能 |
| 一次性测定的基因 | 多个 | 多个 | 一个 | 多个 |
| 操作周期 | 4-5小时 | 三天 | 2-3小时 | 2-3小时 |
| 操作复杂性 | 较高 | 高 | 较高 | 低 |
| 对实验条件的要求 | 高 | 很高 | 高 | 高 |
有益效果
本发明通过结合聚合酶链式反应（polymerase Chain Reaction,PCR）和DNA溶解曲线技术，实现了对已知SNPs位点或单碱基突变的检测；该检测方法具有操作简单、价格低廉、高通量化，以及结果准确等优点。
附图说明
图1为检测A2142G和野生型菌株的实时荧光结果；
图2为对溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果；
图3为对不同菌株进行检测的结果；
图4为检测Asn87Lys和野生型菌株的实时荧光结果；
图5为检测Asn87Lys和野生型菌株时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析图；
图6为检测Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)和野生型菌株的实时荧光结果；
图7为检测Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)突变和野生型菌株时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析图；
图8为为检测Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性检测时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析图；
图9为Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性的测序结果；
图10为检测载脂蛋白E基因C112R单核苷酸多态性检测所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
荧光定量PCR仪：LightCycler480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI750（美国应用生物系统公司，纽约，美国）、ABI7500FAST（美国应用生物系统公司，纽约，美国）、ABI7900HT FAST（美国应用生物系统公司，纽约，美国）、QiagenRotor-Gene6000(德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner（美国Idaho公司，爱达荷州，美国）。
DNA聚合酶：NEB（瑞士），Qiagen(德国)，ABI（美国），TaKaRa(日本)。
实施例1
在幽门螺杆菌克拉霉素耐药检测中的应用
本实施例将针对常见的克拉霉素耐药的位点进行检测，如A2143G、A2142G和A2142C。
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG(SEQ ID NO:1)
A反向引物：5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测A2143G、A2142G和A2142C突变位点
位点特异性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO:3)
位点特异性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)
位点特异性引物B35-CGGCAAGACGGAGA(SEQ ID NO:5)；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
2、具体检测方法如下：
1）取样：取检者胃粘膜组织1～5克，应用相应的病原体DNA提取试剂盒（市售）进行对幽门螺杆菌核酸提取，用以基因扩增；
2）PCR反应体系，包括：
A正向引物：5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG(SEQ ID NO:1)0.1～0.5微摩
A反向引物：5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2)0.1～0.5微摩
用于检测A2143G、A2142G和A2142C突变的位点特异性引物B：
位点特异性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO:3)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B25-CGGCAAGACGGAGA(SEQ ID NO:5)0.1～0.5微摩
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～15毫摩
KCl：10～15毫摩
Tris-HCL（PH9.0）：10～15毫摩
Triton-100：1.0%～2.0%
MgCl2：2.5～5毫摩
Taq DNA聚合酶：0.5～2单位
SYBR Green染料：0.2～2X
总体积20～40微升；
3）PCR&AS-PCR反应程序
第一阶段：95℃，2分钟；
第二阶段：94℃，10-25秒；66-72℃，10-30秒；35-50循环；
第三阶段：94℃，10-25秒；40-55℃，10-30秒；5-20循环。
4）DNA溶解曲线分析程序
溶解曲线分析的变化主要在于溶解的起始温度、终止温度和每秒钟监测荧光的次数。本实施例的DNA溶解曲线分析程序的起始温度为60-66℃，终止温度为90-95℃，监测荧光次数为20～40次/秒。
根据本实施例所述的反应条件，经荧光定量PCR仪上的序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否含有单峰，得到分型图谱。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入野生型和突变型对照，进行PCR反应和DNA溶解曲线分析技术，即可区分野生型和突变型。
5）检测结果：对采集到溶解曲线荧光数据进行导数分析，如果只在83±1℃出现一个峰时，为野生型；如果同时在83±1℃和79±1℃出现一个峰时，则为突变型。
图1为检测A2142G和野生型菌株的实时荧光结果；2-曲线为野生型，1-曲线为突变型菌株；
图2为对不同临床样本的溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果；由于2-曲线只在83±1℃出现一个峰，因此为野生型；而1-曲线同时在83±1℃和79±1℃出现一个峰，因此为突变型菌株；
图3为对不同临床样本进行检测的结果；只在83±1℃出现一个峰，均为野生型；而同时在83±1℃和79±1℃出现一个峰，均为突变型菌株。
实施例2
在幽门螺杆菌喹诺酮类药物耐药检测中的应用
本实施例将针对常见的克拉霉素耐药的位点进行检测，如Asn87Lys和Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)。
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT(SEQ ID NO:6)
A反向引物：5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测Asn87Lys和Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)突变位点
位点特异性引物B15-CCATGGCGATAAAG(SEQ ID NO:8)
位点特异性引物B25-CCATGGCGATAAGG(SEQ ID NO:9)
位点特异性引物B35-ACGCGGTTTATTA(SEQ ID NO:10)
位点特异性引物B45-ACGCGGTTTATAA(SEQ ID NO:11)
位点特异性引物B55-ACCGGTTTATGGT(SEQ ID NO:12)；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
2、具体检测方法如下：
1）取样：取检者胃粘膜组织1～5克，应用相应的病原体DNA快速提取试剂盒（市售）进行对幽门螺杆菌核酸提取，用以基因扩增；
2）PCR反应体系，包括：
A正向引物：5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT(SEQ ID NO:6)0.1～0.5微摩
A反向引物：5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)0.1～0.5微摩
用于检测AGC→AAC，AGC→ACC突变的位点特异性引物B：
位点特异性引物B15-ccatggcgataaAg(SEQ ID NO:8)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B25-ccatggcgataaGg(SEQ ID NO:9)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B35-acgcggtttatTa(SEQ ID NO:10)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B45-acgcggtttatAa(SEQ ID NO:11)0.1～0.5微摩
位点特异性引物B55-accggtttatgGt(SEQ ID NO:12)0.1～0.5微摩
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～15毫摩
KCl：10～15毫摩
Tris-HCL（PH9.0）：10～15毫摩
Triton-100：1.0%～2.0%
MgCl2：2.5～5毫摩
Taq DNA聚合酶：0.5～2单位
Eve Green染料：0.2～2X
总体积20～40微升。
3）3）PCR&AS-PCR反应程序
第一阶段：95℃，2分钟；
第二阶段：94℃，10-25秒；66-72℃，10-30秒；35-50循环；
第三阶段：94℃，10-25秒；40-55℃，10-30秒；5-20循环。
4）DNA溶解曲线分析程序
溶解曲线分析的变化主要在于溶解的起始温度、终止温度和每秒钟监测荧光的次数。本试剂盒优选的DNA溶解曲线分析程序的起始温度为60-66℃，终止温度为90-95℃，监测荧光次数为20～40次/秒。
根据本实施例所述的反应条件，经荧光定量PCR仪上的序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否含有单峰，得到分型图谱。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入野生型和突变型对照，进行PCR反应和DNA溶解曲线分析技术，即可区分野生型和突变型。
5）检测结果：对采集到溶解曲线荧光数据进行导数分析，如果只在81±1℃出现一个峰时，为野生型；如果同时在81.5±1℃和72±1℃出现一个峰时，则为Asp91Gly/Tyr/Asn突变；如果同时在81.5±1℃和76±1℃出现一个峰时，则为Asn87Lys突变；如果同时在81.5±1℃、76±1℃和72±1℃出现一个峰时，则为Asn87Lys和Asp91Gly/Tyr/Asn共同突变。
图4为检测Asn87Lys和野生型菌株在溶解曲线分析时，实时荧光结果；1-曲线为野生型，2-曲线为突变型菌株；
图5为检测Asn87Lys和野生型菌株时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果；1-曲线只在81±1℃出现一个峰，因此为野生型；2-曲线同时在81.5±1℃和76±1℃出现一个峰时，因此为Asn87Lys突变菌株；图6为检测Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)和野生型菌株的实时荧光结果；1-曲线只在81±1℃出现一个峰，因此为野生型；2-曲线同时在81.5±1℃和72±1℃出现一个峰时，因此为Asp91Gly/Tyr/Asn为突变型菌株；
图7为检测Asp(GAT)91Gly(GGT)/Tyr(TAT)/Asn(AAT)突变和野生型菌株时候得到的溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果，1-曲线为野生型，2-曲线为突变型菌株。
实施例3
在Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性检测中的应用
Leber’s遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是一种母性遗传的双眼视神经疾病。1988年W allace等人首先报告线粒体DNA(mtDNA)第11778核苷酸位点原发性突变（G→A）可引起LHON。鉴于对于线粒体G11778A位点分型对于Leber’s遗传性视神经病的诊断意义，本实施例对G11778A位点多态性进行检测。
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO:13)
A反向引物：5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG(SEQ ID NO:14)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：用于检测G11778A突变位点
位点特异性引物B15-CACTCACAGTCAC(SEQ ID NO:15)
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
2、具体检测方法如下：
1）取样：取检者全血100～500微升克，应用相应的人基因组核酸提取试剂盒（市售）进行提取，用以基因扩增；
2）PCR反应体系，包括：
A正向引物：5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO:13)0.1～0.5微摩
A反向引物：5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG(SEQ ID NO:14)0.1～0.5微摩
用于检测G11778A突变位点：
位点特异性引物B15-CACTCACAGTCGC(SEQ ID NO:15)0.1～0.5微摩
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～15毫摩
KCl：10～15毫摩
Tris-HCL（PH9.0）：10～15毫摩
Triton-100：1.0%～2.0%
MgCl2：2.5～5毫摩
Taq DNA聚合酶：0.5～2单位
Eve Green染料：0.2～2X
总体积20～40微升。
3）PCR&AS-PCR反应程序
第一阶段：95℃，2分钟；
第二阶段：94℃，10-25秒；66-72℃，10-30秒；35-50循环；
第三阶段：94℃，10-25秒；40-55℃，10-30秒；5-20循环。
4）DNA溶解曲线分析程序
溶解曲线分析变化主要在于溶解的起始温度、终止温度和每秒钟监测荧光的次数。本试剂盒优选的DNA溶解曲线分析程序的起始温度为60-66℃，终止温度为90-95℃，监测荧光次数为20～40次/秒。
根据本实施例所述的反应条件，经荧光定量PCR仪上的序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否含有单峰，得到分型图谱。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入野生型和突变型对照，进行PCR反应和DNA溶解曲线分析技术，即可区分野生型和突变型。
5）检测结果：对采集到溶解曲线荧光数据进行导数分析，如果只在84±1℃出现一个峰时，为野生型；如果同时在84±1℃和80±1℃出现一个峰时，则代表样本含有G11778A突变。
图8为检测Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性检测时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果；1-曲线只在84±1℃出现一个峰时，因此为野生型；2-曲线同时在84±1℃和80±1℃出现一个峰时，则为样本含有线粒体DNA G11778A突变。
图9为Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性的测序结果，划线的碱基为所要检测的位点。图9-a的测序结果表明11778位点为A；图9-b的测序结果表明11778位点为G。
实施例4
载脂蛋白E基因C112R单核苷酸多态性的检测与分型
载脂蛋白E基因位于第19号染色体上，全长3.7kb，含4个外显子，具有6种遗传表现型，即3种纯合子表现型E2/E2，E3/E3，E4/E4；和3种杂合子表现型E2/E3，E3/E4，E2/E4。E3，载脂蛋白E3/3分别是最常见的等位基因和遗传表现型。载脂蛋白E与脑缺血、阿尔茨海默病、淀粉样脑血管病所致的脑出血等相关。鉴于以上载脂蛋白E基因C112R，SNPs分型的意义，本实施例对载脂蛋白E第112位点多态性进行检测。
1、检测试剂盒组成，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A：
A正向引物：5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO:16)
A反向引物：5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO:17)；
（4）-20℃保存的特异性引物B：
位点特异性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO:18)
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
2、具体检测方法如下：
1）取样：取检者全血100～500微升克，应用相应的人基因组核酸提取试剂盒（市售）进行提取，用以基因扩增；
2）PCR反应体系，包括：
A正向引物：5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO:16)0.1～0.5微摩
A反向引物：5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO:17)0.1～0.5微摩
用于检测C112R突变位点：
位点特异性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO:180.1～0.5微摩
dNTP：0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4：10～15毫摩
KCl：10～15毫摩
Tris-HCL（PH9.0）：10～15毫摩
Triton-100：1.0%～2.0%
MgCl2：2.5～5毫摩
Taq DNA聚合酶：0.5～2单位
SYTO9染料：0.2～2X
总体积20～40微升。
3）3）PCR&AS-PCR反应程序
第一阶段：95℃，2分钟；
第二阶段：94℃，10-25秒；66-72℃，10-30秒；35-50循环；
第三阶段：94℃，10-25秒；40-55℃，10-30秒；5-20循环。
4）DNA溶解曲线分析程序
溶解曲线分析的变化主要在于溶解的起始温度、终止温度和每秒钟监测荧光的次数。本试剂盒优选的DNA溶解曲线分析程序的起始温度为60-66℃，终止温度为90-95℃，监测荧光次数为20～40次/秒。
根据本实施例所述的反应条件，经荧光定量PCR仪上的序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否含有单峰，得到分型图谱。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入野生型和突变型对照，进行PCR反应和DNA溶解曲线分析技术，即可区分野生型和突变型。
5）检测结果：对采集到溶解曲线荧光数据进行导数分析，如果只在85±1℃出现一个峰时，为野生型；如果同时在85±1℃和81±1℃出现一个峰时，则代表样本含有C112R突变。
图10为检测载脂蛋白E基因C112R单核苷酸多态性检测时所得溶解曲线实时荧光数据进行导数分析的结果；1-曲线只在85±1℃出现一个峰时，因此为野生型；2-曲线同时在85±1℃和81±1℃出现一个峰时，则为样本含有C112R突变。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。
Claims (9)
1.一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，包括：
（1）在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A，通过PCR对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增；通过位点特异性引物B，针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；
（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。
2.根据权利要求1所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述扩增引物A的退火温度在60～75℃，特异性引物B的退火温度为35～55℃。
3.根据权利要求2所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述扩增引物A的退火温度为65～70℃，特异性引物B的退火温度为35～45℃。
4.根据权利要求1所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述的荧光染料为SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYTO9染料。
5.根据权利要求1所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增体系为：
模板 2-6微升；
正向引物A 0.025～0.5微摩；
反向引物A 0.025～0.5微摩；
特异性引物B 0.025～0.5微摩；
dNTP 0.2～0.5毫摩
(NH4)2SO4 10～30毫摩
KCl 10～30毫摩
Tris-HCL（PH8.5～9.0） 10～30毫摩
Triton-100 1.0%～2%
MgCl2 2.5～5毫摩
荧光染料 1～3X；
DNA聚合酶 0.5～3单位；
总体积为20～50微升。
6.根据权利要求1所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增体系的反应条件为：
第一阶段：90～98℃保温1～5分钟；
第二阶段：90～96℃保温5～25秒，65～75℃保温10～60秒，共30～50个循环；
第三阶段：90～96℃保温5～25秒，40～55℃保温10～45秒，共5～20个循环。
7.根据权利要求1所述的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶解曲线分析程序，其溶解检测条件为：90℃～95℃变性1分钟；40℃～50℃复性1分钟；然后从初始溶解温度50℃～66℃开始升温至90℃～95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，20～40次/秒；然后在40℃～60℃进行冷却。
8.一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测试剂盒，包括：
（1）-20℃保存的阳性对照液；
（2）-20℃保存的阴性对照液；
（3）-20℃保存的扩增引物A，对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增；
（4）-20℃保存的特异性引物B，针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；
（5）荧光染料及扩增反应体系所需试剂；
（6）-20℃保存的ddH2O。
9.根据权利要求8所述的试剂盒在病原体已知耐药突变基因的检测、亲子鉴定或者肿瘤相关基因突变检测中的应用。
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