JP4670039B2 - アポリポタンパクe遺伝子多型検出方法 - Google Patents
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James E. H. and Daniel T. V. Restriction of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI. J. Lipid. Res .1990; 31: 545-548 「細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド(2)遺伝子解析の基礎」、秀潤社、p.117 「バイオ実験トラブル解決超基本Q&A」p.96−97、羊土社
本発明の他の態様によると、アポリポタンパクE遺伝子に特異的なプライマー対を用いてDNAを増幅する工程、増幅されたDNAを2種類の制限酵素を用いてアポリポタンパクE遺伝子のコドン112の一塩基多型部位を含む認識配列での第1の切断位置及びアポリポタンパクE遺伝子のコドン158の一塩基多型部位を含む認識配列での第2の切断位置で切断する工程、切断されたDNA断片を分離する工程、分離されたDNA断片を検出する工程、を有し、前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う1回目の増幅段階と2回目の増幅段階とを備え、前記1回目の増幅段階は、ヒトからの検体をDNA抽出操作を行わずに試料としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記2回目の増幅段階は、前記1回目の増幅段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記1回目の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記ポリメラーゼ連鎖反応におけるDNAの変性、プライマーアニーリング、DNAの伸長から成るサイクルの数は、前記2回目の増幅段階よりも、前記1回目の増幅段階の方が少なく、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より、60bp以上、136bp以下の上流の位置に5’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より70bp以上の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法が提供される。
上流側プライマーの5’末端の位置は、DNA断片AとDNA断片B(=145bp)との良好な分離が可能なように設定する(9bp以上、好ましくは20bp以上、更に好ましくは30bp以上の鎖長差を有する)。このことから、上流側プライマーの5’末端位置は、第1切断位置より136bp以下の上流の位置に設定するのが好ましい。この観点からは、より良好な分離が可能であるように、上流側プライマーの5’末端の位置は、第1切断位置よりも、より好ましくは130bp以下、更に好ましくは120bp以下の上流の位置とすることがより好ましい。
DNA断片BとDNA断片Dとを良好に分離することができるように、好ましくは、下流側プライマーの5’末端の位置は、第2の切断位置より30bp以上の下流の位置に設定する。又、下流側プライマーの5’末端の位置の選択範囲によって、E2、E3、E4の全ての多型について生成する、第2の切断位置より下流の配列(図中R)のみを含むDNA断片Rを、例えば制限酵素による切断反応(消化反応)の存否の確認等のために用いることができる。
5’−AATCGGAACTGGAGGAACAACTG−3’
AE−R1プライマー(配列番号2):
5’−GCCCGCACGCGGCCCTGTTC−3’
上記オリゴヌクレオチド配列のプライマー対によれば、ApoE遺伝子多型の2箇所の一塩基多型部位、即ち、ApoEのコドン112、ApoEのコドン158の一塩基多型部位を含み、75番目〜191番目のアミノ酸をコードするコドン領域にわたる352bpのオリゴヌクレオチド配列をPCR法によって増幅することができる。又、上記上流側プライマーの5’末端は、第1切断位置より106bp上流に位置し、下流側プライマーの5’末端の位置は、第2切断位置より101bp下流に位置する。斯かるオリゴヌクレオチド配列の各プライマーは、斯界にて周知のDNA合成方法、装置を用いて得ることができる。
まず、ヒト検体の血液を試料として、下記の条件にてPCR法によりApoE遺伝子の多型領域の1回目の増幅を行った。使用するプライマー対は、DNA合成装置により合成して得た。又、耐熱性DNAポリメラーゼとしては、KOD−plus−(東洋紡社)を用いた。
AE−F1(5’−AATCGGAACTGGAGGAACAACTG−3’)
・・・・・(配列番号1)
AE−R1(5’−GCCCGCACGCGGCCCTGTTC−3’)
・・・・・(配列番号2)
血液: 1μL
プライマー対: 0.3μM
dNTP: 200μM
緩衝液(10倍濃縮標準PCR緩衝液): 2μL
MgSO 4 : 1mM
Betaine(ベタイン): 2M
KOD−plus−ポリメラーゼ: 0.02units
総反応量: 20μL
94℃,2分間(変性)
次いで、下記のサイクルを10回繰り返す。
60℃,30秒(プライマーアニーリング)
68℃,30秒(伸長反応)
次いで、次の条件で2本鎖を形成する。
68℃,5分間(最終伸長反応)
1回目PCR増幅産物溶液: 1μL
プライマー対: 0.3μM
dNTP: 200μM
緩衝液(10倍濃縮標準PCR緩衝液): 1μL
MgSO 4 : 1mM
KOD−plus−ポリメラーゼ: 0.02units
総反応量: 10μL
94℃,1分間(変性)
次いで、下記のサイクルを30回繰り返す。
94℃,20秒(変性)
60℃,30秒(プライマーアニーリング)
68℃,30秒(伸長反応)
次いで、次の条件で2本鎖を形成する。
68℃,5分間(最終伸長反応)
上記で充分な増幅が確認されたApoE遺伝子多型領域のPCR増幅産物、制限酵素AflIII(New England biolabs社)(4units)及びHaeII(New England biolabs社)(2units)、1×NEB Buffer3、1×BSAを含む反応溶液を、全量が5μLになるように調製し、37℃で30分以上反応させた。その後、50mM EDTAを2.5μL加え、制限酵素を失活させた。各サンプルについて、上記PCR増幅産物の確認と同様の方法によりDNA制限酵素の分離、検出に供した。代表的なDNA切断断片の分離結果を図6(中段)〜図9(中段)に示す。
まず、ヒト検体の血液を試料として下記の条件にてPCR法によりApoE遺伝子の多型領域の単回増幅を行った。使用するプライマー対は、上記実施例と同一のものを使用した。
抽出したゲノムDNA: 50ng
プライマー対: 0.3μM
dNTP: 200μM
緩衝液(10倍濃縮標準PCR緩衝液): 2.5μL
MgSO 4 : 1mM
Betaine: 2M
KOD−plus−ポリメラーゼ: 0.02units
総反応量: 25μL
94℃,2分間(変性)
次いで、下記のサイクルを40回繰り返す。
94℃,20秒(変性)
60℃,30秒(プライマーアニーリング)
68℃,30秒(伸長反応)
次いで、次の条件で2本鎖を形成する。
68℃,5分間(最終伸長反応)
上記で充分な増幅が確認されたApoE遺伝子多型領域のPCR増幅産物を実施例と同様な方法によりRFLPおよび制限酵素切断断片の分離とゲノタイピングを行った。代表的なDNA切断断片の分離結果を図6(上段)〜図9(上段)に示す。
まず、ヒト検体の血液を試料として、DNA抽出操作を行い、精製DNA試料を得た。ここでは、DNAの抽出は、DNA Mini Kit(Qiagen社)を用いて行った。下記の条件にてPCR法によりApoE遺伝子の多型領域の単回増幅を行った。使用するプライマー対は、上記実施例と同一のものを使用した。
抽出したゲノムDNA: 50ng
プライマー対: 0.3μM
dNTP: 200μM
緩衝液(10倍濃縮標準PCR緩衝液): 2μL
MgSO 4 : 1mM
Betaine: 2M
KOD−plus−ポリメラーゼ: 0.02units
総反応量: 20μL
94℃,2分間(変性)
次いで、下記のサイクルを40回繰り返す。
94℃,20秒(変性)
60℃,30秒(プライマーアニーリング)
68℃,30秒(伸長反応)
次いで、次の条件で2本鎖を形成する。
68℃,5分間(最終伸長反応)
上記で充分な増幅が確認されたApoE遺伝子多型領域のPCR増幅産物を実施例と同様な方法によりRFLPおよび制限酵素切断断片の分離とゲノタイピングを行った。代表的なDNA切断断片の分離結果を図6(下段)〜図9(下段)に示す。
上記の実施例、比較例1および比較例2はそれぞれ全血の2回PCR法によるApoE遺伝子多型のゲノタイピング、全血の単回PCR法による同ゲノタイピングおよびゲノム抽出DNAの単回PCR法による同ゲノタイピングである。
通常のApoE遺伝子多型のゲノタイピングは比較例2で示すゲノムDNAを抽出した後、PCR増幅、RFLPおよびゲノタイピングによる方法が行われ、得られる結果の信頼性は高い。従って、比較例2で得られた結果を正診として、以下、実施例および比較例1と対比を行う。
本発明によれば、全血から直接DNA増幅を行うため、DNA抽出操作及び抽出時間は不要となり、検体採取からApoE遺伝子多型の検出結果を得るまでの操作および時間を大幅に低減または短縮することができる。比較例2ではDNA抽出操作を行った後にApoE遺伝子多型を検出しているため、正確なゲノタイピングが可能であるが、通常のDNA抽出操作では約1日、簡易抽出法でも30分程の時間を要する。これらの抽出法は数段階の操作で実施されるため、操作中に他試料など目的外物質の混入の危険性もあり、遺伝子多型検出結果へ影響を否定できない。引き続き実施されるPCRにおいては実施例、比較例2ともPCRサイクル所要時間は同等であり、双方とも良好なDNA増幅が確認されている。従って、実施例は比較例2より簡便かつ迅速なゲノタイピング法といえる。
本発明に従えば、遺伝子多型検出に際して必要とする全血は微少量であり、検体採取時の肉体的及び精神的負担を軽減できる。一般に全血よりDNA抽出操作を行う際には数mL、比較例2で示した簡易抽出法においても数百μLの血液が必要となる。実施例における、検体量は1μLであり検体採取時の負担を大幅に低減できる。
1)人の血液中にある微生物(細菌等)の特定を行うことによって、菌血症、敗血症の起炎菌の同定が簡便にかつ正確に行うことができる。
2)器官移植および異種細胞移植の場合において、血液等の体液中にそれらが存在することを本法において、正確に知りうることができる。そのことによって、移植後の状態を評価することが可能である。
3)血液および体液中の肝炎ウイルス、HIV、HITLV、HSV等のウイルス、あるいはカンジダ感染症などのウイルスおよび真菌症の存在の有無、またそのタイプを同定することが可能である。これらは、臨床診断や治療に有用な情報であり、それによって最大の治療効果を得ることができる。
4)白血病等の血液疾患において、減少あるいは、増加している特定の細胞の同定が可能となり、診断治療に有用である。
5)体毛の毛根、微量の体液からDNAの増幅が可能なため、法医学的な情報、人物同定等に有用な情報が本法によって簡便、正確かつ迅速に得られる。
Claims (23)
- アポリポタンパクE遺伝子に特異的なプライマー対を用いてDNAを増幅する工程、
増幅されたDNAを、アポリポタンパクE遺伝子のコドン112の一塩基多型部位を認識配列に含む第1の制限酵素と、アポリポタンパクE遺伝子のコドン158の一塩基多型部位を認識配列に含む第2の制限酵素と、を用いて、前記コドン112の一塩基多型部位を含む認識配列での第1の切断位置及び前記コドン158の一塩基多型部位を含む認識配列での第2の切断位置で切断する工程、
切断されたDNA断片を分離する工程、
分離されたDNA断片を検出する工程、
を有し、
前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う1回目の増幅段階と2回目の増幅段階とを備え、前記1回目の増幅段階は、ヒトからの検体をDNA抽出操作を行わずに試料としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記2回目の増幅段階は、前記1回目の増幅段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記1回目の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、
前記ポリメラーゼ連鎖反応におけるDNAの変性、プライマーアニーリング、DNAの伸長から成るサイクルの数は、前記2回目の増幅段階よりも、前記1回目の増幅段階の方が少なく、
前記プライマー対及び前記第1、第2の制限酵素は、それぞれのアポリポタンパクE遺伝子多型に特異的なそれぞれ100bp以上のDNA断片を生成し得るように選択され、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より、60bp以上、136bp以下の上流の位置に5’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より70bp以上の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。 - 前記第1、第2の制限酵素はいずれも、前記コドン112の一塩基多型部位を含む認識配列と、前記コドン158の一塩基多型部位を含む認識配列との間に切断位置を持たないことを特徴とする請求項1のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記第1の制限酵素は前記増幅したDNAにおいてアポリポタンパクE遺伝子のコドン112の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たず、前記第2の制限酵素の前記増幅したDNAにおいてアポリポタンパクE遺伝子のコドン158の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たないことを特徴とする請求項2のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記第1の制限酵素は塩基配列ACRYGT(RはA又はG、YはC又はT)を認識して切断し、前記第2の制限酵素は塩基配列RGCGCY(RはA又はG、YはC又はT)を認識して切断することを特徴とする請求項1、2又は3のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記第1の制限酵素はAflIII、前記第2の制限酵素はHaeIIであることを特徴とする請求項4のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- アポリポタンパクE遺伝子に特異的なプライマー対を用いてDNAを増幅する工程、
増幅されたDNAを2種類の制限酵素を用いてアポリポタンパクE遺伝子のコドン112の一塩基多型部位を含む認識配列での第1の切断位置及びアポリポタンパクE遺伝子のコドン158の一塩基多型部位を含む認識配列での第2の切断位置で切断する工程、
切断されたDNA断片を分離する工程、
分離されたDNA断片を検出する工程、
を有し、
前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う1回目の増幅段階と2回目の増幅段階とを備え、前記1回目の増幅段階は、ヒトからの検体をDNA抽出操作を行わずに試料としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記2回目の増幅段階は、前記1回目の増幅段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記1回目の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、
前記ポリメラーゼ連鎖反応におけるDNAの変性、プライマーアニーリング、DNAの伸長から成るサイクルの数は、前記2回目の増幅段階よりも、前記1回目の増幅段階の方が少なく、
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より、60bp以上、136bp以下の上流の位置に5’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より70bp以上の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。 - 前記2種類の制限酵素のうち一方は塩基配列ACRYGT(RはA又はG、YはC又はT)を認識して切断し、他方は塩基配列RGCGCY(RはA又はG、YはC又はT)を認識して切断することを特徴とする請求項6のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記2種類の制限酵素は、AflIII及びHaeIIであることを特徴とする請求項7のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- それぞれのアポリポタンパクE遺伝子多型に特異的なそれぞれ100bp以上のDNA断片が生成されることを特徴とする請求項6、7又は8のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より90bp以上の上流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜9のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より100bp以上の上流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜10のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第1の切断位置より120bp以下の上流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜11のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より202bp以下の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜12のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より100bp以上の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜13のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より185bp以下の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜14のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第2の切断位置より156bp以下の下流の位置に5’末端が設定されることを特徴とする請求項1〜15のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記プライマー対の各プライマーは、それぞれ下記の塩基配列、
AATCGGAACTGGAGGAACAACTG(配列番号1)
GCCCGCACGCGGCCCTGTTC(配列番号2)
を有するオリゴンヌクレオチドであることを特徴とする請求項1〜16のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。 - 切断したDNA断片を電気泳動で分離することを特徴とする請求項1〜17のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記1回目の増幅段階の前記サイクル数は15サイクル以下であることを特徴とする請求項1〜18のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記2回目の増幅段階における試料としての前記1回目の増幅段階の反応溶液は、前記2回目の増幅段階の反応溶液の総量の1/5以下であることを特徴とする請求項1〜19のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記1回目の増幅段階の試料は、体液、粘膜、生体排泄物、体毛の毛根、又はこれらに含まれる細胞であることを特徴とする請求項1〜20のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記1回目の増幅段階の試料は、全血、血液中の細胞、又はリンパ球であることを特徴とする請求項1〜20のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
- 前記1回目の増幅段階の試料は、全血であることを特徴とする請求項1〜20のいずれかの項に記載のアポリポタンパクE遺伝子多型検出方法。
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