KR100673071B1

KR100673071B1 - 파이로시퀀싱법을 이용한 녹용의 종간 유전자 감별 키트

Info

Publication number: KR100673071B1
Application number: KR1020050096242A
Authority: KR
Inventors: 서정철; 임강현; 정주호; 신동훈; 정승기; 양재하; 김상찬
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2007-01-22

Abstract

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 녹용의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것으로써, 상세하게는 파이로시퀀싱법에 의하여 매화록(Cervus nippon Temminck), 마록(Cervus elaphus), 대록(Cervus canadensis) 및 순록(Rangifer tarandus)의 유전자형을 분석하고, 녹용의 종간 특이적 시퀀싱 프라이머를 이용하여 녹용의 종간 연관성과 유전적 변이를 평가하기 위한 감별 키트에 관한 것이다. 본 발명의 감별 키트를 통하여 녹용의 종을 판별함으로써 정확한 녹용 원료를 공급할 수 있으며, 녹용의 품질관리 방법으로 활용할 수 있다.

녹용, 매화록, 마록, 대록, 순록, 파이로시퀀싱, 감별 키트

Description

파이로시퀀싱법을 이용한 녹용의 종간 유전자 감별 키트 {A kit for discriminating genetical identification among Cervus species by Pyrosequencing methods}

도 1 은 매화록의 녹용에 대해 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 2 는 마록(뉴질랜드산)의 녹용에 대해 파이로시퀀싱법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 3 은 대록의 녹용에 대해 파이로시퀀싱법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 4 는 순록의 녹용에 대해 파이로시퀀싱법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 5 는 마록 중 러시아산 녹용에 대해 파이로시퀀싱법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 6 은 마록 중 중국산 녹용에 대해 파이로시퀀싱법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 녹용의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것이다.

녹용(Cornu Cervi Pantotrichum)은 녹과(사슴과 ; Cervidae)에 속한 동물인 매화록(梅花鹿, Cervus nippon Temminck), 마록(馬鹿, C. elephus L.) 및 동속 근연동물의 미골화(未骨化)된 어린 뿔을 잘라 건조한 것으로, 신농본초경(神農本草經) 상품(上品)에 “주루하악혈(主漏下惡血), 한열경간 (寒熱驚), 익기강지(益氣强志), 생치불로(生齒不老).”라고 처음 기재된 이래, 달고 따뜻한 성미(性味)와 장원양(壯元陽), 보기혈(補氣血), 익정수 (益精髓), 강근골(强筋骨)의 효능으로 임상에서 상용되는 한약재이다 (지형준 외, 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해 제2개정, 한국메디칼인덱스사, 서울, pp154-155, 1999 ; 전국한의과대학 본초학교수 공편저, 본초학, 영림사, 서울, pp545-546, 1991).

국내에서 소비되는 녹용은 마록(Cervus elaphus), 매화록(Cervus nippon Temminck) 및 대록(Cervus canadensis) 등이 있으며, 이 중 주로 마록과 대록이 사용되고 있는데, 주로 뉴질랜드를 중심으로, 러시아, 중국, 캐나다 등에서 수입되고 있다 (한대석, 녹용의 생산 및 유통현황, 녹용에 관한 심포지움, pp1-11, 1996).

녹용의 수입량은 1978년에 1,913 ㎏에서 1983년 22,339 ㎏, 1988년 44,428 ㎏, 1993년 117,582 ㎏으로 점차 증가하고 있으며, 90년대 들어 우리나라의 평균 녹용 소비량은 전 세계 생산량 175톤 중 140톤을 차지하고 있다. 95년도 국내 녹용 수입규모는 4,275만 달러로 전 세계 녹용 무역량 5,350만 달러의 79.9 %를 차지하 여, 우리나라가 전 세계 녹용 생산량의 80 %를 소비하는 최대 소비국으로 나타났다. 1993년의 품종별 수입현황을 보면, 러시아에서 원용(元茸) 17,592 ㎏, 매화록 98 ㎏, 순록(馴茸) 8,332 ㎏이 수입되었고, 중국에서 마록 17,128 ㎏, 매화록 5,512 ㎏이 수입되었으며, 뉴질랜드에서 적록(赤茸) 66,609 ㎏, 미국에서 대록 1,761 ㎏, 마록 400 ㎏이 수입되어, 그 품목이 원용, 매화록, 순록, 적록, 대록 등 매우 다양함을 알 수 있다 (한대석, 녹용의 생산 및 유통현황, 녹용에 관한 심포지움, pp1-11, 1996 ; 강희정, 일부지역의 녹용 복용율과 인식도 분석, 중앙대학교 사회개발대학원 석사학위논문, 1996).

녹용으로 사용되는 종들은 이렇게 매우 다양한데도 불구하고, 현재 녹용은 대부분 형태적으로 동정 (identification)되고 있다. 전형 (whole form)으로 유통될 때는 그 감별이 그래도 수월한 편이나, 절편된 상태에서는 그 형태가 매우 유사하여 전문가라도 정확한 감별을 하기가 쉽지 않다. 녹용에 대하여 진 등 (진대현 et al., 中藥材, 22(9), pp441-444, 1999 ; 진대현 et al., 中藥材, 22(10), pp504-506, 1999)의 형태학적 감별법에 대한 보고가 있기는 하지만, 그 서술은 매우 주관적이어서 이를 통하여 감별한다는 것은 쉬운 일이 아니다.

한약재의 감별에 대한 연구로 방풍류 한약재 (최호영 et al., 생약학회지, 28(1), pp1-8, 1997) 및 인삼류 한약재 (최호영, 대한본초학회지, 13(1), pp147-159, 1998)에서 각각 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) 방법과 RFLP (restriction flagment length polymorphism) 방법을 이용하여 그 감별방법의 타당성을 제시한 바 있으며, 드래취 등 (Dratch P et al., R. Soc . N. Z. Bull ., 22, pp37-40, 1985 ; Polziehn R O et al., Molecular Phylogenetics and Evolution, 10, pp249-258, 1998)은 28 loci의 단백질 데이터를 UPGMA 방법으로 분석하여 와피티(wapiti)와 마록(C. elaphus)을 분석하였으며, 크로닌(Cronin M, J. Mammal, 73, pp70-82, 1992)은 mtDNA분석을 통하여 몽고의 와피티(wapiti)와 북아메리카의 와피티(wapiti)를 구분한 바 있다.

녹용은 대부분 절편 상태로 유통되므로 확인하는 것이 매우 어려우며, 화학적 측면의 분석을 통한 확인 또한 사육 조건, 기후, 영양적 요소 등의 다양성 때문에 녹용 종의 구분이 매우 어려운 실정이다.

이에 본 발명자들은 최근 유전적 변이를 평가하는데 널리 사용되는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 이용하여 녹용 종들로부터 추출된 DNA로부터 단일 염기 형태의 변이를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 유전자 분석법인 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 녹용의 종간 유전적 변이를 분석하여 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹용의 종간 유전적 변이를 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 녹용의 종 감별방법 및 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 녹용 종 감별 방법은 녹용 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1 단계; 추출된 DNA 및 프라이머(primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3단계; 상기 증폭된 DNA의 전체 염기서열을 분석하는 제 4단계; 증폭된 DNA를 조합하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법을 수행함으로써 얻어진 유전자형 분석(genotyping)을 통하여 녹용의 종을 감별하는 제 5단계;를 포함하는 녹용 종 감별 방법을 제공한다.

상기 센스 프라이머는 서열번호 1을 포함하는 바이오틴 결합성 프라이머임을 특징으로 하고, 상기 안티센스 프라이머는 서열번호 2를 포함함을 특징으로 하는 감별방법을 제공한다.

또한, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱법에 사용되는 시퀀싱 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 사용하여 수행됨을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1로 기재되는 바이오틴 결합성 프라이머는 20 염기로 구성된 서열(CCCTAGATCA CGAGCTTAAT)로 고안됨을 특징으로 한다.

또한, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법에 사용되는 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 녹용 시료의 종간 특이성 시퀀싱(sequencing) 프라이머로서 유전자형 분석에 사용됨을 특징으로 한다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 17 염기서열(TTAAATAGCT ACCCCCA)로써 2차 구조(secondary structure)가 형성되지 않게 돌연변이 자리(mutation site)로부터 조금 떨어지게 고안하여 첨가함을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법을 수행 시, 신장되는 DNA 가닥에서 뉴클레오티드 가 합성될 때 빛이 발생되며, 이러한 과정을 통하여 녹용의 다형성(polymorphism)이 자동적으로 유전자형이 판별됨을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법은 15분 안에 시료의 동시 분석이 가능한 자동화된 미세역가를 기초로 한 파이로시퀀서 기구(microtiter-based pyrosequencer instrument)로 실행되며, 각 뉴클레오티드의 제조는 약 1분정도 걸리므로, 유전적 변이의 정확한 서열(sequence)의 측정에 빠른 방법으로 이용될 수 있다.

본 발명은 DNA 추출시약, 서열번호 1의 센스 프라이머 또는 서열번호 2의 안티센스 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 서열번호 3의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 녹용의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 감별키트는 PCR반응, 파이로시퀀싱에 요구되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. PCR반응, 파이로시퀀싱에 요구되는 성분으로 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염, 시쿼나제(sequenase) 또는 파이로시퀀싱법에 의해 얻어진 분석결과에 따른 종별 녹용 비교를 위한 표준 분석도 및 이를 분석한 분석표 등을 들 수 있다.

본 발명의 감별 키트는 소량의 시료를 이용하여 단시간 내에 감별이 가능하며, 겔을 이용하지 않는 방법(non-gel based method)으로써 주관적인 요소가 배재된 보다 정확한 진단이 가능하다.

상기 감별 키트를 위한 녹용 시료로는 매화록(Cervus nippon), 뉴질랜드산, 중국 산, 또는 러시아산 마록(Cervus elaphus), 대록(Cervus canadensis)과 순록(Rangifer tarandus)의 뿔, 혈액 또는 기타 신체 조직 등이 가능하다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹용 시료의 준비

녹용 시료 준비를 위해 매화록(Cervus nippon)은 중국에서, 마록(Cervus elaphus)은 뉴질랜드, 러시아, 중국에서, 대록(Cervus canadensis)은 캐나다에서, 순록(Rangifer tarandus)은 알라스카에서 사육된 것을 한국의약품수출입협회로부터 검열 받은 표준화된 포장으로 구입하여 사용하였다. 모든 시료는 본초학 전공 교수가 확인한 것을 제공 받아 사용하였다.

실시예 2. 녹용의 DNA 정제

뿔 부분 전체가 포함된 형태의 녹용 3 g을 멸균된 작은 칼로 잘게 썰고, 멸균된 분쇄기로 분쇄하여 분말화 하였다. DNA 분리를 위해 키트 (DNeasy Tissue kit, No. 69504, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하였으며 이때 제조사의 사용설명을 약간 변형하여 실행하였다. 분말화 된 녹용 시료 300 ㎎은 세정과정을 거쳐 사용하였다. 시료를 용출(elution)하기 전에, 컬럼(column)은 남은 에탄올을 증발시키기 위해 5분 동안 37 ℃에서 건조시켰다. 시료들은 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0))를 사용하여 총 부피 200 ㎕에서 용출시켰다.

실시예 3. PCR 법을 이용한 DNA 증폭

추출된 DNA의 증폭은 PCR법에 의하여 수행되었다. 각 녹용 시료의 미토콘드리아 게놈 내 D-루프(loop) 구역을 증폭하기 위한 DNA 25 ng, 각 프라이머 (센스 프라이머: 서열번호 1, 안티센스 프라이머: 서열번호 2) 5 pmol을 사용하여 증폭되었다. PCR 증폭은 0.5 단위(unit) 태그 중합효소 (Taq polymerase ; HT Biotechnology Ltd., Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합물 30 ㎕는 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1.5 mM 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), 50 mM 염화칼륨 (potassium chloride), 0.1% 트리톤-X 100 (triton-X 100), 0.01 % [v/v] 안정제 (stabilizer), 디옥시뉴클레오티드 삼인산 (deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 각 0.25 mM, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer) 각 0.1 mM로 구성되었다. PCR 과정은 PCR 시스템 (PCR System, Astec, Japan)을 이용하여 95 ℃에서 5분간 전 과정을 거친 후, 1회당 95 ℃에서 30초간 변성(denaturation), 60 ℃에서 30초간 결합 (annealing), 72 ℃에서 30초간 연장(extension)의 구성으로 30회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.5 % 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기 영동하여 확인하였다.

실시예 4. 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법에 의한 유전자형 분석(Genotyping)

파이로시퀀싱을 위한 DNA 조합(preparation)(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden) 은 제조사의 표준 프로토콜(protocol)을 따라 수행되었다. 스트렙트아비딘 세파로즈 비즈(streptavidin sepharose beads, Streptavidin Sepharose HP, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)는 PCR 산물에 고정되었다. 녹용 시료의 시퀀싱 프라이머는 서열번호 3으로 기재된 서열이고, 이것은 파이로시퀀싱 AB(Pyrosequencing AB)로부터 변종(mutation)의 기부에 바로 가까이 인접한 말단 잔기 혼성화에 의해 제작되었다(http://www.pyrosequencing.com). 10분 동안 실온에 방치한 후, 바이오틴결합성 PCR 산물 20 ㎕는 스트렙트아비딘 코팅된 세파로즈 비즈에 고정되었고, 고정된 PCR 산물은 96-웰 필터에 옮겨졌다(Millipore, Bedford, MA, USA). 비즈는 웰에 남겨지고 다른 용액과 시약들을 제거하고 순수한 단일가닥 DNA를 얻기 위해 진공(vacuum)을 사용하였다. 시퀀싱 프라이머 0.35 uM이 포함된 4M 아세트산(acetic acid) 55 ㎕에 주형(template)이 고정된 비즈를 다시 담그고, 부유물의 45 ㎕를 PSQ 96 플레이트(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. PSQ 96 샘플 프렙 열플레이트(PSQ 96 Sample Prep Thermoplate)를 사용하여, 시료가 포함된 PSQ 96 플레이트를 시퀀싱 프라이머를 결합(annealing)하기 위해 90 ℃에서 5분동안 열을 가하고, 10분 동안 실온에 옮겨놓은 후, PSQ 96 플레이트는 PSQ 96 기구의 작동 챔버(process chamber, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. 효소(enzyme)와 기질(substrate), 뉴클레오티드(nucleotide)는 PSQ 96 SNP 시약 키트(PSQ 96 SNP Reagent Kit, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 웰 안에서 시약 카세트(reagent cassette)로부터 제조되었다. 신장되는 DNA 가닥에서 뉴클레오티드가 합성될 때 빛이 발생된다. 이 러한 과정으로부터 녹용의 다형성(polymorphism)은 자동적으로 유전자형이 판별되었다.

상기 실험예 2에서 네 가지 녹용의 종을 구별하기 위하여 파이로시퀀싱 법에 의하여 동정하였고, 그 결과, 매화록, 마록(뉴질랜드산), 대록, 순록은 서로 비교하여 다른 형태를 보여 명백한 차이를 나타내었다. 이 결과는 녹용의 종간 감별 염기서열에서 매화록은 CGATTCATGGG(서열번호 4)이고, 마록(뉴질랜드산)은 CAGTTCATGGG(서열번호 5)이고, 대록은 CGGTTTATGGG(서열번호 6)이고, 순록은 CAGTATATGGG(서열번호 7)인점을 잘 반영하는 것이다.(도 1 내지 도 4 참조) 또한 마록 중 산지별로 감별하기 위한 실험에서 러시아산 마록과 중국산 마록은 뉴질랜드산 마록과 다른 형태를 보여 명백한 차이를 나타내었다. 이 결과는 러시아산 마록은 CGAGTTCATGGG(서열번호 8)이고 중국산 마록은 CGATCTATGGG(서열번호 9)인 점을 잘 반영하는 것이다.(도 5 및 도 6)

따라서 매화록, 마록, 대록, 순록을 비교하기 위한 본 발명의 녹용의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머가 적합하게 고안되었음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 녹용에 대하여 파이로시퀀싱법을 이용하여 유전자형을 분석하고, 녹용의 종간 특이적 시퀀싱 프라이머를 고안하여 매화록, 마록, 대록, 순록 녹용의 종간 연관성과 유전적 변이를 감별하는 녹용의 종간 확인시험법을 이용한 감별 키트를 제공함으로써 정확한 녹용 원료를 공급하며, 녹용의 품질관리 방법의 일환으로 활 용할 수 있으며, 녹용 외에 기타 한약재 자원에 대한 신물질 탐색이나 품종간 감별에 대한 기초 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

녹용 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA , 서열번호 1로 기재되는 센스 프라이머(CCCTAGATCA CGAGCTTAAT) 및 서열번호 2로 기재되는 안티센스 프라이머(TGTCTGATAA AATTCATTAA ATAGC)로 구성되는 프라이머(primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 PCR을 통해 증폭시키는 제 3단계; 상기 증폭된 DNA의 전체 염기서열을 분석하는 제 4단계; 증폭된 DNA를 조합하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법을 수행함으로써 얻어진 유전자를 도 1(CGATTCATGGG, 매화록), 도 2(CAGTTCATGGG, 마록;뉴질랜드산), 도 3(CGGTTTATGGG, 대록) 및 도 4(CAGTATATGGG, 순록)에 나타난 서열과 비교함으로써, 매화록, 마록(뉴질랜드산), 대록 및 순록 녹용의 종을 감별하는 방법 및 도 5(CGAGTTCATGGG, 러시아산 마록) 및 도 6(CGATCTATGGG, 중국산 마록)에 나타난 서열을 비교함으로써, 러시아산 마록과 중국산 마록 녹용의 종을 감별하는 제 5단계를 포함하는 녹용 종 감별 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱법에 사용되는 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 감별 방법.
DNA 추출시약, 서열번호 1의 센스 프라이머 또는 서열번호 2의 안티센스 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 서열번호 3의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 녹용의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트.