CN101974524A

CN101974524A - 用于梅花鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN101974524A
Application number: CN 201010555571
Authority: CN
Inventors: 陈颖; 韩建勋; 邓婷婷; 林凤俊; 黄文胜; 吴亚君
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CN101974524B

Abstract

本发明涉及用于梅花鹿茸真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于梅花鹿茸真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于梅花鹿茸真伪鉴别的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及本发明的特异性寡核苷酸引物及探针在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。本发明的PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地鉴别梅花鹿茸的真伪。

Description

用于梅花鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于梅花鹿茸真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物及探针，包含本发明的特异性寡核苷酸引物及探针的试剂盒，用于鉴别梅花鹿茸真伪的实时荧光PCR检测方法，以及所述特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。

背景技术

鹿茸(Cornu Cervi Pantotrichum)是鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，习称花鹿茸、马鹿茸。鹿茸分锯茸(不具头骨的鹿茸)、砍茸(带头骨的鹿茸)和鹿茸片(鹿茸切制加工后而成的薄片)。鹿茸具有壮肾阳、益精血、强筋骨等功效，为名贵药材。

鹿的种类甚多，但有药用价值的主要指梅花鹿和马鹿，且认为梅花鹿茸较马鹿茸质优。目前我国仅有部分地区有少量野生梅花鹿，为保护资源，已将梅花鹿列为国家一级保护动物，马鹿列为国家二级保护动物，而药用鹿茸现主要取自人工饲养之鹿。梅花鹿茸主产于吉林、辽宁、河北等地，马鹿茸主产于黑龙江、吉林、内蒙古等地。

梅花鹿茸作为一种高级营养品，自古以来价格就比较昂贵。随着生活水平的提高，人们对鹿茸的消费量也在不断攀升。由于鹿茸的价格受到鹿茸的品种、产地等诸多因素的影响，一些不法厂商通过以假充真、以次充好的手段销售鹿茸，严重欺骗了消费者的知情权，影响了市场秩序。目前在市场上流通的梅花鹿掺假形式主要表现为三种情况：一、真皮假内：这种造假行为是将原枝梅花鹿茸末段经水处理后剥取外皮，然后用锯末、胶水、色素混合加压填入所剥取的皮内，再将皮粘紧，令人肉眼看不出来；二、注油加重：将质量较好、质地较疏松的原枝梅花鹿茸，排血烘干后顺排血孔道注入食用油，然后再将排血孔塞住，让油充分渗透到鹿茸枝体内；三、以马鹿茸片充当梅花鹿茸片：将本是黑褐色或褐色的马鹿茸片，根据需要采用不同浓度的双氧水浸泡制成淡黄色或淡棕色，然后挑选出形态与梅花鹿茸片相似的混到梅花鹿茸片中销售，从中获取更大的利润。

面对多种多样的掺假形式，为了维护消费者的利益以及良好的市场秩序，国内外许多学者采用了多种手段对梅花鹿茸的真伪进行鉴别。常用的方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。由于梅花鹿茸中含有的化学成分易受品种及产地等因素的影响，成分相对复杂；尤其是现在的食品掺伪水平和手段越来越高明，使许多鉴别真伪的传统方法不再有效。

现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析食品原料和产品的特性和来源，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明食品的真伪提供了真实、可靠的依据，给食品种类鉴别、产品溯源等食品鉴伪研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力的研究方向。但是，分子生物学技术在梅花鹿茸鉴伪方面的应用还处于初步探索阶段。

聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。实时荧光PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地鉴别保健品梅花鹿茸的方法。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的保健品梅花鹿茸的真伪鉴别方法，进行保健品梅花鹿茸真伪的鉴别。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供快速鉴别梅花鹿茸的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供快速鉴别梅花鹿茸的实时荧光PCR检测方法。

本发明的再一个目的在于，提供用于快速鉴别梅花鹿茸真伪的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于梅花鹿茸真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物对和探针。本发明以梅花鹿的DNA为检测基础，根据线粒体DNA(mtDNA)D-环(Displancement loop，D-Loop)区序列在不同鹿科物种中具有差异性的特点，克隆了梅花鹿线粒体DNA D-环区序列。根据这些序列设计引物及探针，利用实时荧光PCR法检测样品中的梅花鹿茸成分。

本发明的寡核苷酸引物对和探针是根据不同鹿科物种的线粒体DNAD-环区具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Mhual-F1：AGCACGTGATATAACCTTATGTGT(SEQ ID No.1)，所述下游引物为Mhual-R1：CCTATACACCGATTTTATGTACCA(SEQ ID No.2)；所述探针为Mhual-P：ATGCATTAAGGCACACATGTACAATGGT(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供鉴别梅花鹿茸真伪的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对梅花鹿茸的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对是根据不同鹿科物种的线粒体DNA D-环区序列具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，在本发明的梅花鹿茸真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法中，所使用的特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。本发明的发明人通过大量的筛选工作确定了本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针，并建立了稳定的PCR体系，从而特异且灵敏地鉴别梅花鹿茸的真伪。

在一个实施方案中，本发明的梅花鹿茸实时荧光PCR检测方法还进一步包括提取鹿茸样品总DNA的步骤。在一个实施方案中，在所述DNA提取步骤中，通过检测鹿科动物线粒体DNA D-环区序列，来测试样品总DNA的提取质量。在一个优选的实施方案中，检测线粒体DNA D-环区序列的通用引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为Luke-F：CATACGCAATYCTACGATCAATTCC(SEQ ID No.4)，所述下游引物的碱基序列为Luke-R：GCTACTARGATTCAGAATAGGCATTG(SEQ ID No.5)；所述探针的碱基序列为Luke-P：TGGTCGGAATATYATGCTGCGTTGTTTGG(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，5’端连接有一个荧光报告基团TAMRA。所述PCR扩增条件是95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，40个循环。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于快速鉴别梅花鹿茸真伪的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法鉴别梅花鹿茸真伪的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒的优选实施方案中，本发明的特异性寡核苷酸引物对是根据不同鹿科物种的线粒体DNA D-环区序列具有差异性的特点而设计的。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中包含的特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述试剂盒中包含的探针的碱基序列为SEQ IDNo.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速鉴别梅花鹿茸真伪的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是：95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，40个循环。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。在根据本发明的应用的优选实施方案中，所述特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针。

本发明以梅花鹿茸的DNA为检测基础，根据不同鹿科物种中线粒体DNA D-环区序列具有差异性的特点，克隆了梅花鹿线粒体DNA D-环区序列，根据这些序列设计引物及探针，利用实时荧光PCR法鉴别梅花鹿茸的真伪。

实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测梅花鹿茸成分。

本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上梅花鹿茸成分真伪的鉴别。

附图说明

图1是显示待测样品DNA提取效果的实时荧光PCR结果，其中使用鹿科动物通用引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5及探针SEQ ID No.6检测，所述荧光曲线的样品依次为1.梅花鹿(1)；2.梅花鹿(2)；3.梅花鹿(3)；4.梅花鹿(4)；5.梅花鹿(5)；6.梅花鹿(6)；7.梅花鹿(7)；8.梅花鹿(8)；9.梅花鹿(9)；10.梅花鹿(10)；11.梅花鹿(11)；12.梅花鹿(12)；13.梅花鹿(13)；14.梅花鹿(14)；15.梅花鹿(15)；16.梅花鹿(16)；17.梅花鹿(17)；18.梅花鹿(18)；19.梅花鹿(19)；20.梅花鹿(20)；21.梅花鹿(21)；22.梅花鹿(22)；23.梅花鹿(23)；24.马鹿(1)；25.马鹿(2)；26.马鹿(3)；27.马鹿(4)；28.马鹿(5)；29.马鹿(6)；30.马鹿(7)；31.黇鹿(1)；32.黇鹿(2)；33.空白对照(ddH₂O)。

图2是显示实时荧光PCR特异性检测鹿茸的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及探针SEQ ID No.3检测，其中荧光曲线的样品依次为1.梅花鹿(1)；2.梅花鹿(2)；3.梅花鹿(3)；4.梅花鹿(4)；5.梅花鹿(5)；6.梅花鹿(6)；7.梅花鹿(7)；8.梅花鹿(8)；9.梅花鹿(9)；10.梅花鹿(10)；11.梅花鹿(11)；12.梅花鹿(12)；13.梅花鹿(13)；14.梅花鹿(14)；15.梅花鹿(15)；16.梅花鹿(16)；17.梅花鹿(17)；18.梅花鹿(18)；19.梅花鹿(19)；20.梅花鹿(20)；21.梅花鹿(21)；22.梅花鹿(22)；23.梅花鹿(23)；24.马鹿(1)；25.马鹿(2)；26.马鹿(3)；27.马鹿(4)；28.马鹿(5)；29.马鹿(6)；30.马鹿(7)；31.黇鹿(1)；32.黇鹿(2)；33.空白对照(ddH₂O)。

图3是以梅花鹿为例，鉴别梅花鹿真伪的特异性引物和探针组合的灵敏度的结果，其中1-7为进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度，依次为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL以及空白对照，重复3次。

图4是以梅花鹿、马鹿为例，确定梅花鹿特异性引物和探针组合的相对检测限，其中1-6为用马鹿DNA将梅花鹿DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中梅花鹿DNA含量分别为10ng、1ng、0.1ng、100pg、10pg、1pg，重复三次，然后进行检测的结果。

图5是市售鹿茸样品检测结果，其中荧光曲线1为梅花鹿茸阳性对照品、荧光曲线2-17依次为市售梅花鹿茸样品(1)-(16)、荧光曲线18-38依次为市售马鹿茸样品(1)-(20)及空白对照(无菌水)。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本发明的发明人首次通过PCR克隆并测序了梅花鹿的线粒体DNA D-环区序列。

本实施例为通过PCR克隆测序获得的梅花鹿线粒体DNA D-环区序列。

根据线粒体DNA D-环区序列在不同鹿科动物中具有差异性的特点，设计上下游引物扩增梅花鹿线粒体DNA D-环区序列。按照Wizard GelExtraction Kit(Promega，美国)的操作说明对梅花鹿PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19-T Vector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将纯化产物与pMD19-T Vector连接，连接体系10μL，其反应组分为：pMD19-TVector 1μL、PCR产物2μL、ddH₂O 2μL、Solution I 5μL，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温(22-37℃)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物于50μLTOP感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800μL已灭过菌的脑心浸液，37℃、200r/min振荡培养1h。5000r/min低速离心1min，弃600μL上清，将沉淀混匀，取100μL混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37℃过夜培养后置于4℃冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200μg/mL的Amp的脑心浸液中在37℃、200r/min振荡过夜培养。

(1)阳性克隆鉴定：挑取单个白色克隆，进行菌落PCR反应，体系为25μL，其组份为：反应10×Buffer 2.5μL、dNTPs 1μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶0.2μL，挑取单菌落作为模板，加水补至25μL。反应程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，40个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(2)测序：确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200μg/mL Amp的5μL脑心浸液中在37℃、200r/min振荡过夜培养。取1mL菌液送生物公司进行测序鉴定。

PCR克隆测序得到的梅花鹿的线粒体DNA D-环区序列如下：

AGACTCAAGG AAGAAGCCAT AGCCCCACTA TCAACACCCA

AAGCTGAAGT TCTATTTAAA CTATTCCCTG ACGCTTATTA

ATATAGTTCC ATAAAAATCA AGAACTTTAT CAGTATTAAA

TTTCCAAAAA ATTTTAATAT TTTAATACAG CTTTCTACTC

AACATCCAAT TTACATTTTA TGTCCTACTA ATTACACAAC

AAAGCACGTG ATATAACCTT ATGTGTTTGT AGTACATAAA

ATTAATGCAT TAAGGCACAC ATGTACAATG GTACATAAAA

TCGGTGTATA GGACATATTA TGCATAATAG TAATAAATT

AAAGTATTAG GACATACTAT GTATAATAGT ACATTATATT

ATATGCCCCA TGCATAAAGC CTGGTTGCAA(SEQ ID No.7)。

实施例2

本实施例为通过使用通用引物对及探针测试样品总DNA的提取质量。

通过检测线粒体DNA D-环区序列，可以测试样品总DNA的提取质量。Taqman荧光探针法：TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，在普通PCR扩增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。定量步骤：①确定CT值(C表示循环数(Cycle)，T表示荧光域值(Threshold)，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。反应体系为：Mastermix 12.5c；探针(10μM)0.5μL；上、下游引物(10μM)各0.5μL；模板DNA 5μL；加ddH₂O至总体积为25μL。反应程序为95℃10min；95℃15s；60℃1min，40个循环。

本实施例中所使用的用于测试梅花鹿茸总DNA提取质量的通用引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.5；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，5’端连接有一个荧光报告基团TAMRA。

在本实施例中，检测了23份梅花鹿样本、7份马鹿样本、2份黇鹿样本。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI 7700 Applied Biosystems，USA))、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)等

检测主要试剂：

氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、0.02mol/L Na₂-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/LCTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl均为本实验自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)购于罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1DNA提取

待测鹿茸样品为：23份梅花鹿茸、7份马鹿茸、2份黇鹿茸。

称取0.1g鹿茸粉末至一洁净2.0mL离心管中，加入1.5mLCTAB裂解液，65℃2h，间期不断混匀几次；8000rpm 15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm 20min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500rpm 20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

2实时荧光PCR检测所用引物和探针

引物序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，探针序列为SEQ ID No.6，3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，5’端连接有一个荧光报告基团TAMRA。

3.实时荧光PCR反应体系：

Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5μL

探针(10μM)0.5μL

上游引物(10μM)0.5μL

下游引物(10μM)0.5μL

模板DNA 5μL

加ddH₂O至总体积为25μL

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4实时荧光PCR反应参数：

95℃ 10min

95℃ 15s

60℃ 1min

40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，用鹿科动物通用引物扩增待测样品的DNA时均能在基线以上出现荧光扩增曲线，表明所有待测样品DNA提取成功。

实施例3

本实施例通过如下试验对梅花鹿的引物对和探针进行了特异性和灵敏度验证。

通过检测线粒体DNA D-环区序列，可以确定梅花鹿引物和探针组合的特异性和检测灵敏度。反应体系为：Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)12.5μL；探针(10μM)0.5μL；上、下游引物(10μM)各0.5μL；模板DNA 5μL；加ddH₂O至总体积为25μL。反应程序为95℃10min；95℃15s；60℃1min，40个循环。

所使用鉴别梅花鹿茸真伪的引物及探针序列为：

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针序列为SEQ ID No.3，3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI7700 Applied Biosystems，USA))、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)等

检测主要试剂：

检测主要步骤：

1DNA提取

检测样本：(1)23份梅花鹿茸、7份马鹿茸、2份黇鹿茸用于特异性分析；(2)以梅花鹿为例，将提取的DNA溶液用无菌水分别稀释为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的浓度，用于分析引物和探针组合的绝对检测限；(3)以梅花鹿、马鹿为例，用马鹿DNA将梅花鹿DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中梅花鹿DNA含量分别为10ng、1ng、0.1ng、100pg、10pg、1pg，以确定梅花鹿特异性引物和探针组合的相对检测限。

称取0.1g样品粉末至一洁净2.0mL离心管中，加入1.5mLCTAB裂解液，65℃2h，间期不断混匀几次；8000rpm 15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm 20min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500rpm 20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

2实时荧光PCR检测所用引物和探针

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

探针序列为SEQ ID No.3，3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3实时荧光PCR反应体系：

Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)12.5μL

探针(10μM)0.5μL

上游引物(10μM)0.5μL

下游引物(10μM)0.5μL

模板DNA 5μL

加ddH₂O至总体积为25μL

4实时荧光PCR反应参数：

95℃ 10min

95℃ 15s

60℃ 1min

40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图2所示，利用实时荧光PCR特异性检测梅花鹿的线粒体DNA D-环区序列时，23种梅花鹿样品等均出现典型的扩增曲线，而其它样品：7份马鹿、2份黇鹿及空白对照(ddH₂O)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物和探针对梅花鹿样品表现较好的特异性。

为确定梅花鹿特异性引物和探针组合的绝对检测限，以梅花鹿为例，将提取的DNA溶液用无菌水分别稀释为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图3所示。梅花鹿DNA浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL时有特异性扩增曲线，而浓度降至1pg/μL以下时，无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出梅花鹿成分的含量为1pg/μL。

以梅花鹿、马鹿为例，用马鹿DNA将梅花鹿DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中梅花鹿DNA含量分别为10ng、1ng、0.1ng、100pg、10pg、1pg，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，以确定梅花鹿特异性引物和探针组合的相对检测限(结果见图4)。实验结果说明该方法检测梅花鹿成分的相对检测限为10pg。

实施例4

本发明的发明人通过如下试验对市售鹿茸样品进行了验证。

选取36种鹿茸样品(样品由本实验室提供)，其中16种梅花鹿样品、20种马鹿样品，进行实时荧光PCR反应，以确定所建立的实时荧光PCR方法是否具有可行性。

如图5所示，利用实时荧光PCR检测线粒体DNA D-环区序列时，梅花鹿阳性对照品、16份市售梅花鹿茸样品均在基线以上具有典型的荧光扩增曲线，而其他20份马鹿茸样品及空白对照扩增曲线均在基线位置，表明该方法能有效检测出梅花鹿茸成分。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.核酸，其碱基序列如SEQ ID No.7所示。

2.用于实时荧光PCR方法鉴别梅花鹿茸真伪的特异性寡核苷酸引物对及探针，所述引物对和探针基于权利要求1所述的核酸设计，其中所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.2，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3.用于实时荧光PCR方法鉴别梅花鹿茸真伪的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求2所述的特异性寡核苷酸引物对及探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含另外的通用引物对和探针，所述另外的通用引物对由碱基序列为SEQ ID No.4的上游引物和碱基序列为SEQ ID No.5的下游引物组成，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，5’端连接有一个荧光报告基团TAMRA。

5.梅花鹿茸真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求2所述的特异性寡核苷酸引物对及探针或权利要求3所述的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，还进一步包括提取鹿茸样品总DNA的步骤。

7.根据权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，通过使用通用引物对及探针检测样品DNA的提取质量，所述通用引物由碱基序列为SEQ ID No.4的上游引物和碱基序列为SEQ ID No.5的下游引物组成，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ2，5’端连接有一个荧光报告基团TAMRA。

8.根据权利要求1所述的核酸在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。

9.权利要求2所述的特异性寡核苷酸引物对及探针在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。

10.权利要求3或4所述的试剂盒在鉴别梅花鹿茸真伪中的应用。